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一種利用流體動力色譜同時分離檢測多組microRNA的方法與流程

文檔序號:12268220閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)確定幾組待分離檢測的microRNA,設(shè)計與其互補(bǔ)的ssDNA;

其中假設(shè)幾組待分離檢測的microRNA依次為microRNA-1、microRNA-2、以此類推直到microRNA-n,則與microRNA-1、microRNA-2……microRNA-n互補(bǔ)的ssDNA以此為ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n;

ssDNA-1完全與microRNA-1互補(bǔ),不添加其他堿基;ssDNA-2除了完全與microRNA-2互補(bǔ)的序列之外,另添加一定長度的堿基序列;ssDNA-3完全與microRNA-3互補(bǔ)的序列之外,還添加了相對ssDNA-2具有一定長度的的堿基序列,以此類推,ssDNA-n相對ssDNA-n-1增加有一定長度的堿基序列,在ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n中增加的堿基序列可以相同也可以不同,但ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n均不互相雜交纏繞;以此類推,ssDNA-n總是比ssDNA-n-1多出一定數(shù)量的堿基,構(gòu)成分離標(biāo)簽;

2)設(shè)計好的ssDNA分別與microRNA雜交,雜交條件:95℃變性5min,溫度降至42℃退火25min;雜交后得到雜交雙鏈;雜交后加入核酸熒光染料,反應(yīng)10min;

3)雜交后加入核酸熒光染料的體系在高純氮?dú)獾蛪合逻M(jìn)樣,在未經(jīng)任何修飾的裸微納毛細(xì)管內(nèi)分離;分離后,在毛細(xì)管尾端進(jìn)行激光誘導(dǎo)熒光檢測器定量。

2.按照權(quán)利要求1所述的一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法,其特征在于,ssDNA-n比ssDNA-n-1多出至少10個堿基。

3.按照權(quán)利要求1所述的一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法,其特征在于,設(shè)計的ssDNA自身不會雜交纏繞,不會形成發(fā)卡或者其他結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)最小自由能為零,具有穩(wěn)定的單鏈結(jié)構(gòu)且與人體中已發(fā)現(xiàn)的基因組保持最小相似度。

4.按照權(quán)利要求1所述的一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法,其特征在于,雜交時,microRNA溶于DEPC處理水中,ssDNA溶于1×TE,兩互補(bǔ)雜交單鏈摩爾比1:1。

5.按照權(quán)利要求1所述的一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法,其特征在于,所述微納毛細(xì)管內(nèi)徑在400-1100nm之間,總長度40-70cm,有效長度35-65cm。

6.按照權(quán)利要求1所述的一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法,其特征在于,所用緩沖溶液1×TE溶液,濃度10-100mM,pH7.5-8.5。

7.按照權(quán)利要求1所述的一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法,其特征在于,所述核酸熒光染料為YoYo-1、或具有結(jié)合在雙鏈之間后發(fā)出熒光的核酸染料。

8.按照權(quán)利要求1所述的一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法,其特征在于,步驟3)進(jìn)樣時低壓控制在20-300psi,進(jìn)樣時間控制在5-60s,分離時高壓控制在700-1600psi。

9.按照權(quán)利要求1所述的一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法,其特征在于,激光功率采用10-50mW,光電倍增器采用200-700mV。

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