本發(fā)明涉及一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。該方法主要應(yīng)用于microRNA表達(dá)譜分析、microRNA臨床診斷、microRNA研究檢測和microRNA相關(guān)藥物研究以及篩選。

背景技術(shù)：

microRNA(miRNA)是一類長度為19～25個核苷酸(nt)的單鏈RNA序列，該序列具有內(nèi)源性，不編碼蛋白質(zhì)，且高度保守。miRNA可與蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體。游離在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的miRNA,當(dāng)其與目標(biāo)mRNA完全互補(bǔ)配對時，會造成mRNA降解，當(dāng)其與目標(biāo)mRNA不完全互補(bǔ)配對時，會抑制mRNA翻譯蛋白質(zhì)，通過這種特殊作用，來實現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控的作用。已有研究證明，miRNA在動物、植物和真菌中的表達(dá)存在明顯的差異性，從而影響細(xì)胞生長和發(fā)育過程。近年來，科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)人體中存在的miRNA有2千多種，約占人類基因組的1％，但卻參與調(diào)控約30％基因的表達(dá)。miRNA不僅影響人體內(nèi)的細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡等生理過程，而且與人類心臟病、癌癥、神經(jīng)性疾病等密切相關(guān)。

目前，已經(jīng)報道多種方法檢測miRNA。傳統(tǒng)的檢測手段包括三種，第一種是Northern Bloting法，這種方法被認(rèn)為是最經(jīng)典的檢測方法，但是該方法要求樣品量多，特異性低，分析時間長，靈敏度低且不可區(qū)分序列差別少的miRNA。第二種是Microarray技術(shù)，該方法靈敏度和特異性有所提高，所需樣品量也有所減少，但是Microarray技術(shù)的分析時間較長，靈敏性和特異性仍有待提高。第三種RT-PCR技術(shù)常被用來進(jìn)行miRNA的定量分析，檢測靈敏度得到大幅度提高，可以實現(xiàn)單分子高通量檢測，但是RT-PCR技術(shù)分析鏈長較短的miRNA會使得實驗設(shè)計非常復(fù)雜，理想的擴(kuò)增技術(shù)也需要非常精確的循環(huán)溫度控制。近期報道了一些檢測miRNA的新方法，例如基于生物發(fā)光的檢測、基于納米顆粒的檢測、基于酶方法的檢測、基于修飾引物入侵法的檢測、基于核酸序列的檢測等。

毛細(xì)管流體動力色譜法是一種基于流體動力學(xué)的分離方法，即在窄內(nèi)徑、未經(jīng)修飾的毛細(xì)管內(nèi)達(dá)到多種樣品分離的方法，該方法以低樣品量、高選擇性、高靈敏度、分析時間短、檢測成本低等優(yōu)點在分離聚合物顆粒、膠體顆粒和蛋白等得到廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種同時分離檢測多組microRNA的方法。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析時間短、檢測成本低。

本發(fā)明是將毛細(xì)管流體動力色譜法引入到分子生物分析檢測領(lǐng)域，首次利用流體動力色譜法分離檢測多組microRNA。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用流體動力色譜分離檢測多組microRNA的方法，包括以下步驟：

1)確定幾組待分離檢測的microRNA，設(shè)計與其互補(bǔ)的ssDNA；

其中假設(shè)幾組待分離檢測的microRNA依次為microRNA-1、microRNA-2、以此類推直到microRNA-n，則與microRNA-1、microRNA-2……microRNA-n互補(bǔ)的ssDNA以此為ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n；

ssDNA-1完全與microRNA-1互補(bǔ)，不添加其他堿基；ssDNA-2除了完全與microRNA-2互補(bǔ)的序列之外，另添加一定長度的堿基序列；ssDNA-3完全與microRNA-3互補(bǔ)的序列之外，還添加了相對ssDNA-2具有一定長度的的堿基序列，以此類推，ssDNA-n相對ssDNA-n-1增加有一定長度的堿基序列，在ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n中增加的堿基序列可以相同也可以不同，但ssDNA-1、ssDNA-2……ssDNA-n均不互相雜交纏繞；以此類推，ssDNA-n總是比ssDNA-n-1多出一定數(shù)量的堿基，構(gòu)成分離標(biāo)簽；

ssDNA-n總是比ssDNA-n-1多出至少10個堿基；

2)設(shè)計好的ssDNA分別與microRNA雜交，雜交條件：95℃變性5min，溫度降至42℃退火25min；雜交后得到雜交雙鏈；雜交后加入核酸熒光染料，反應(yīng)10min；

3)雜交后加入核酸熒光染料的體系在高純氮?dú)?如不低于99.9％)低壓下進(jìn)樣，在未經(jīng)任何修飾的裸微納毛細(xì)管內(nèi)分離；分離后，在毛細(xì)管尾端進(jìn)行激光誘導(dǎo)熒光檢測器定量。

優(yōu)選的是，設(shè)計的ssDNA自身不會雜交纏繞，不會形成發(fā)卡或者其他結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)最小自由能為零，具有相當(dāng)穩(wěn)定的單鏈結(jié)構(gòu)且與人體中已發(fā)現(xiàn)的基因組保持最小相似度，相關(guān)檢測干擾達(dá)到最低。

優(yōu)選的是，雜交時，microRNA溶于DEPC處理水中，ssDNA溶于1×TE，兩互補(bǔ)雜交單鏈摩爾比1:1。

優(yōu)選的是，所述微納毛細(xì)管內(nèi)徑在400-1100nm之間，總長度40-70cm，有效長度35-65cm。

優(yōu)選的是，所用緩沖溶液1×TE溶液，濃度10-100mM，pH7.5-8.5。

優(yōu)選的是，所述核酸熒光染料為YoYo-1、或具有結(jié)合在雙鏈之間后發(fā)出熒光的核酸染料。

優(yōu)選的是，步驟3)進(jìn)樣時低壓控制在20-300psi，進(jìn)樣時間控制在5-60s，分離時高壓控制在700-1600psi。

優(yōu)選的是，激光功率采用10-50mW，光電倍增器采用200-700mV。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和良好效果：

1)運(yùn)用流體動力色譜分離的原理，將多組microRNA混合物分離，實現(xiàn)多組份同時檢測。

2)高靈敏度：采用窄內(nèi)徑毛細(xì)管，低氣壓低濃度短時間進(jìn)樣，樣品量僅幾個納升，激光誘導(dǎo)熒光檢測大大提高了檢測的靈敏度

3)高特異性：采用完全互補(bǔ)的兩條單鏈，增加堿基識別的特異性，更有利于microRNA與ssDNA雜交，結(jié)合后的雙鏈更牢固。

4)分析時間短：整個分離檢測操作1小時內(nèi)完成。

5)檢測成本低：本方法采用了價格便宜的TE緩沖液和核酸熒光染料。

6)無污染：整個檢測過程不需要用到有機(jī)溶劑或有毒試劑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例分離標(biāo)簽的構(gòu)建示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例的整個流體動力色譜分離系統(tǒng)示意圖。

圖3為本發(fā)明實施例分離檢測三種microRNA所得到的色譜圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的內(nèi)容、目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合說明書附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟知的一般替換也涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實施例1(以檢測3組microRNA為例)

1.microRNAs檢測探針體系的設(shè)計

選定的三組目標(biāo)microRNA為

hsa-let-7a-5p：5’UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 3’

hsa-miR-99b-5p：5’CACCCGUAGAACCGACCUUGCG 3’

has-miR-182-5p：5’UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU3’

設(shè)計ssDNA：

ssDNA-1(與let7a互補(bǔ))：

5’AACTATACAACCTACTACCTCA 3’

ssDNA-2(與miR99b互補(bǔ)):

5’CGCAAGGTCGGTTCTACGGGTGATTGTGTCTCTCTGCAG3’

ssDNA-3(與miR182互補(bǔ)):

5’AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAATATTTCATCGCGCTGCCTATCCATTGTTGTC 3’

其中，需要說明的是，設(shè)計的ssDNA序列中下劃線部分為另外設(shè)計的分離標(biāo)簽序列，ssDNA自身不會纏繞在一起，不會形成發(fā)卡或者其他結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)最小自由能為零，具有相當(dāng)穩(wěn)定的單鏈結(jié)構(gòu)且與人體中已發(fā)現(xiàn)的基因組保持最小相似度，相關(guān)檢測干擾達(dá)到最低。

2.實驗部分

1)將訂購的microRNA干粉離心1min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為10000轉(zhuǎn)/分鐘，加入適量DEPC處理水，震蕩3min至充分溶解。

2)將訂購的ssDNA干粉離心1min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為10000轉(zhuǎn)/分鐘，加入適量1×TE緩沖液(pH＝8.0)，震蕩3min至充分溶解。

3)配制好的microRNA和ssDNA摩爾比1:1。兩條互補(bǔ)鏈分別雜交，雜交條件：95℃變性5min，溫度降至42℃退火25min。雜交后加入YoYo-1熒光染料，YoYo-1與雜交雙鏈的摩爾比為1:10。

4)將兩個雜交雙鏈混合，采用750nm內(nèi)徑，50cm總長，45cm有效長度毛細(xì)管，高純氮?dú)?00psi壓力下進(jìn)樣15s，1500psi壓力下分離。

5)流體動力色譜系統(tǒng)分離檢測過程(附圖2)，激光功率采用20mW，光電倍增器采用360mV。

6)系統(tǒng)分離檢測三組microRNA所得到的色譜圖(附圖3)。

盡管本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運(yùn)用，所述實施例僅為了便于說明而已，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下可作若干的更動與潤飾，本發(fā)明所主張的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書所述為準(zhǔn)。