本發(fā)明涉及一種藥物質(zhì)量檢查方法，具體涉及一種用于急性咽炎及上呼吸道感染引起的咽喉疼痛的治療的小清咽顆粒HPLC指紋圖譜檢測方法。

背景技術：

國家對藥品的基本要求是“安全、有效、可控、穩(wěn)定”。近年來，隨著中藥現(xiàn)代化、國際化的深入發(fā)展，我國的藥學科研工作者越來越清醒地認識到，控制中藥的質(zhì)量是我們急待解決的關鍵問題之一。

小清咽顆粒一種用于急性咽炎及上呼吸道感染引起的咽喉疼痛的治療的藥物，具有滋陰潤肺，消腫利咽之效。主要用于急性咽炎及上呼吸道感染引起的咽喉疼痛的治療，對內(nèi)、外諸邪侵犯咽喉，如外感，風熱寒濕，溫邪時毒，內(nèi)傷飲食，辛辣煎煿，內(nèi)蘊痰熱等搏結氣血、蘊結成毒，引發(fā)的咽喉疾患，癥見咽喉紅腫疼痛，吞咽困難，廣泛潰爛，呼吸不利，咽癢咳嗽，聲音嘶啞，發(fā)熱惡寒等癥。

小清咽顆粒由以下數(shù)量份數(shù)的原料藥制成：桑葉390.6 g、板藍根390.6 g、射干260.4 g、玄參260.4 g、甘草260.4 g、薄荷素油 2.5 mL、可溶性淀粉 433~550 g；制成1000 g。

制法是：將處方五味飲片，加10倍量的水（第一次煎煮加水12.5倍），浸泡1小時，煎煮3次，每次0.5小時。合并煎液，濾過。濾液常壓濃縮至相對密度為1.35~1.40（60 ℃）的稠浸膏，至于80℃減壓干燥。干膏粉碎成細粉（過60目篩）與可溶性淀粉433~550 g混合均勻，95 %乙醇適量制軟材，14目篩制粒，60 ℃干燥，12目篩整粒，噴入薄荷素油2.5 mL，混勻，制成1000 g顆粒，分裝，即得。

目前沒有適用小清咽顆粒的質(zhì)量檢測方法，為了保證制劑的穩(wěn)定性和療效，需要對該藥物的HPLC指紋圖譜檢測進行研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題提供一種用于小清咽顆粒HPLC指紋圖譜檢測方法，以保證該小清咽顆粒的穩(wěn)定性和療效。

本發(fā)明的技術方案如下：

小清咽顆粒HPLC指紋圖譜檢測方法，該小清咽顆粒1000g由以下數(shù)量份數(shù)的原料藥制成：桑葉390.6 g、板藍根390.6 g、射干260.4 g、玄參260.4 g、甘草260.4 g、薄荷素油 2.5 mL、可溶性淀粉 433~550 g；該HPLC指紋圖譜檢測方法采用高效液相色譜法和二極管陣列檢測器，并包括如下步驟：首先制備供試品溶液和對照品溶液，按照設定的色譜條件，連續(xù)進樣進行測定；以質(zhì)控射干苷的色譜峰作為為參照，考察各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。

其中，該方法采用的色譜條件為：迪馬Diamonsil Plus C₁₈（250 × 4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）梯度洗脫（0~5 min，0 % A；5~30 min，0~10 % A；30~60 min，10~21 %；60~65 min，21 % A；65~90 min，21~31 % A；90~115 min，31~50 % A；115~120 min，50~0 % A），流速1 mL·min^-1，檢測波長266 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。

其中，該方法使用的對照品溶液的制備方法為：精密稱取射干苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液即得。供試品溶液的制備方法為：取小清咽顆粒，研細，混勻，精密稱取粉末2 g，置具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，搖勻，靜置30 min，稱定重量；超聲處理30 min，放冷，稱重用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過即得。

指紋圖譜作為中藥材單味藥和復方全組成及其提取物的質(zhì)量控制方法，已經(jīng)成為國際公認的控制中藥和天然藥物質(zhì)量的最有效手段。本發(fā)明采用高效液相色譜法和二極管陣列檢測器，建立了小清咽顆粒的指紋圖譜測定的方法，可為該制劑的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

附圖說明

圖1是小清咽顆粒共有指紋峰；

圖2是精密度試驗色譜圖；

圖3是重復性試驗色譜圖；

圖4是穩(wěn)定性試驗色譜圖；

圖5是小清咽顆粒對照指紋圖譜R及其共有指紋峰；

圖6是十批次小清咽顆粒HPLC色譜圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。

實施例1：

1 材料

1.1 儀器與試藥

Aglent 1260高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器（美國安捷倫）；分析天平-AG135（瑞士METTLER TOLEDO）；SG820OHPT型超聲震蕩儀（上海冠特超聲儀器有限公司）。

乙腈，色譜純（美國天地）。純水，哇哈哈純凈水（杭州哇哈哈集團有限公司）；甲醇，分析純，（天津市富宇精細化工有限公司）；磷酸，分析純，（重慶川東化工（集團）有限公司）。小清咽顆粒（批號：41101，41201，41202，41203，50101，50102，50301，50302，50401，50402），由貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院藥學部制劑室提供。射干苷，批號：111632-200501（中國食品藥品檢定研究院）。

方法與結果

2.1 色譜條件

迪馬Diamonsil Plus C₁₈（250 × 4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）梯度洗脫（0~5 min，0 % A；5~30 min，0~10 % A；30~60 min，10~21 %；60~65 min，21 % A；65~90 min，21~31 % A；90~115 min，31~50 % A；115~120 min，50~0 % A），流速1 mL·min^-1，檢測波長266 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。

對照品溶液的制備

精密稱取射干苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液即得。

供試品溶液的制備

經(jīng)前期預實驗，取小清咽顆粒，研細，混勻，精密稱取粉末2 g，置具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，搖勻，靜置30 min，稱定重量。超聲處理30 min，放冷，稱重用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過即得。

方法學考察

2.4.1 精密度試驗及參照峰的選擇

取同一批制劑（批號：41202），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次進行測定。4號色譜峰（圖1-1）響應值較大，且已知為質(zhì)控射干苷的色譜峰，故設為參照（峰面積設為1）。考察各共有峰的相對峰面積和相對保留時間，結果各共有峰相對峰面積RSD均≤2.73%，共有峰相對保留時間RSD均≤0.29%，表明方法的精密度符合要求（圖1、2，表1、2、3）。

重復性試驗

取同一批制劑（批號：41202），分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次進行測定?？疾焖泄灿蟹宓南鄬Ψ迕娣e和相對保留時間，結果所有共有峰相對保留時間RSD均≤0.37%，表明方法的重復性符合要求（圖3，表4、5、6）。

穩(wěn)定性試驗

取同一批制劑（批號：41202），分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、8、12、16、24、36、48小時，按“2.1”項下色譜條件，進行進樣。考察所有共有峰的相對峰面積和相對保留時間，結果所有共有峰相對保留時間RSD均≤0.37%，表明供試品溶液在48小時內(nèi)穩(wěn)定（圖4，表7、8、9）。

建立指紋圖譜共有模式

取十批小清咽顆粒，（批號：41101，41201，41202，41203，50101，50102，50301，50302，50401，50402），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件實驗，記錄色譜圖。

將10批小清咽顆粒HPLC色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版）”，以對照譜圖上標示的色譜峰作為匹配點，經(jīng)多點校正，采用中位數(shù)方法，時間窗寬度為 0.5，進行自動匹配色譜峰，生成小清咽顆粒色譜指紋圖譜共有模式，標定了10個共有峰（圖5），十批小清咽顆粒指紋圖譜的相似度在0.951~0.997之間，平均值為0.9692，RSD值為1.69%（圖6，表10）。表明各批次小清咽顆粒之間無明顯差異性，本方法可用于鑒別小清咽顆粒的整體質(zhì)量。

討論

3.1 梯度洗脫條件的優(yōu)化和檢測波長的確定

由于制劑成分復雜，等度洗脫無法實現(xiàn)有效分離，只能采用線性梯度洗脫對其所含的各組分進行分離?？疾熘苿┲饕煞?，參考相關文獻^[2-3]，反復優(yōu)化梯度洗脫條件，分別考察了檢測波長（λ）358 nm、266 nm、245 nm、237 nm和210 nm下的指紋圖譜。結果表明，在266 nm、245 nm、237nm檢測波長下所得色譜峰紫外吸收較大，其中又以266 nm波長所得色譜基線較平穩(wěn)，吸收最大，故檢測波長確定為266 nm。

流動相的選擇

在梯度洗脫程序初步確定的條件下，參考相關文獻^[4]選用不同比例的乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-甲醇水作為不同流動相組合進行對比試驗。結果表明，乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)洗脫，色譜峰較多，且峰型和分離度效果較好，故采用流動相確定為乙腈-0.1%磷酸水。

色譜柱的選擇

采用反相色譜十八烷基硅烷鍵合相色譜柱。由于不同生產(chǎn)廠家不同牌號的色譜柱存在填料及性能上的差異，實驗中分別比較了四種牌號色譜柱的分離情況：色譜柱1：Thermo Hypersil Gold（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；色譜柱2：Phenomenex Synergi Hydro-RP 80A （250mm × 4.6 mm，5 μm）；色譜柱3：Agilent ZOBX C₁₈（250mm × 4.6 mm，5 μm）；色譜柱4：迪馬Diamonsil Plus C₁₈（250mm × 4.6 mm，5 μm）。結果表明，色譜柱1和3的分離效果較好，然而大極性部分仍無法分離，而色譜柱4可以達到良好的分離效果，故最終采用迪馬Diamonsil Plus C₁₈（250mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱。

柱溫的選擇

在不同的溫度下按同樣的洗脫程序進行試驗，選擇分離效果適宜的柱溫條件，確保圖譜有良好的分離度和穩(wěn)定性。結果表明，在室溫25℃和柱溫30℃（柱溫箱控溫，精度為±0.5℃）條件下，色譜峰的保留時間最大相差3 min，而且分離度也受到影響。為了排除溫度對色譜峰分離的影響，決定采用柱溫30℃作為分離的溫度條件。在控制柱溫后，保留時間保持不變，分離效果穩(wěn)定。

參考文獻

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當然，以上只是發(fā)明的具體應用范例，本發(fā)明還有其他的實施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發(fā)明所要求的保護范圍之內(nèi)。