本發(fā)明屬于檢測(cè)分析領(lǐng)域，具體涉及一種含果膠的樣品的前處理方法，還涉及樣品中果膠的測(cè)定方法、半乳糖醛酸的測(cè)定方法、試劑盒及用途。
背景技術(shù)：
：煙葉尤其是上部煙葉中含有相當(dāng)數(shù)量的果膠，約占煙葉干質(zhì)量的6％-20％。煙葉燃吸過程中，高含量的果膠給煙氣帶來刺激性，不利于吸煙的安全性，同時(shí)，高含量的果膠還會(huì)導(dǎo)致卷煙的焦油含量上升。因此，準(zhǔn)確測(cè)定果膠含量對(duì)于煙草或煙草制品的品質(zhì)把控具有重要意義，果膠含量己成為評(píng)價(jià)煙草或煙草制品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。按照測(cè)定原理，果膠含量的檢測(cè)方法主要有四類：第一類，重量法。用草酸銨溶液提取出樣品中的果膠，再加鹽酸的乙醇溶液沉淀出果膠，然后用稀氨水溶解沉淀，得到果膠，再加入氫氧化鈉使所有果膠被水解，變成可溶解的果膠酸鹽，最后用氯化鈣沉淀為果膠酸鈣，以果膠酸鈣的含量表示果膠的含量(參見國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T10742-2008)，這種方法不依賴于復(fù)雜設(shè)備，但操作較為復(fù)雜且重復(fù)性差。第二類，將果膠水解為半乳糖醛酸，再用化學(xué)顯色劑顯色的方法。這一方法的原理在于：煙葉中的果膠主要由乳糖、阿拉伯糖、多聚糖、糖酸甲酯等組成，以游離和鈣鹽兩種形式存在；果膠在酸、堿或酶條件下能進(jìn)一步分解為半乳糖醛酸，而半乳糖醛酸作為還原性化合物能與許多顯色劑反應(yīng)顯色。這類方法主要包括3,5二硝基水楊酸法、硫酸咔唑法和對(duì)間羥基聯(lián)苯顯色法，但這些方法都存在一定的缺點(diǎn)：3,5二硝基水楊酸法中，煙葉本身所含的還原糖會(huì)形成一些干擾，雖然經(jīng)樣品預(yù)處理可提前去除部分中性還原糖，但預(yù)處理過程中也不可避免地會(huì)損失掉一部分果膠物質(zhì)，導(dǎo)致檢測(cè)的準(zhǔn)確性不高。硫酸咔唑法中，半乳糖醛酸遇酸容易形成內(nèi)酯物質(zhì)，導(dǎo)致檢測(cè)誤差，而且，酸性條件下果膠還容易釋放出一些中性還原糖，干擾了半乳糖醛酸與咔唑的反應(yīng)。對(duì)間羥基聯(lián)苯顯色法中，因顯色劑是對(duì)間羥基聯(lián)苯，與干擾物質(zhì)—中性還原糖的反應(yīng)程度低，因此聯(lián)合連續(xù)流動(dòng)分析儀使其成為一種主要的果膠含量分析方法；但該方法的顯色反應(yīng)中還要有濃硫酸存在，當(dāng)樣品含大量中性糖時(shí)，極易與濃硫酸形成棕色的顯色干擾組分，因此，通常采用去除煙葉的中性還原糖或乙醇沉淀純化果膠的方法來減少中性還原糖的干擾，但這種處理要經(jīng)過多次回流和過濾，操作極為繁瑣。第三類方法，將果膠用酶水解為半乳糖醛酸，采用電位滴定法測(cè)定半乳糖醛酸的含量。酶解—電位滴定法消除了濃硫酸對(duì)顯色反應(yīng)的干擾，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，回收率高，設(shè)備投資小，能滿足煙草樣品果膠含量的批量測(cè)定，但是，對(duì)于樣品中的中性還原糖對(duì)電位滴定的影響，目前還沒有進(jìn)行深入的評(píng)估。第四類方法，采用色譜法檢測(cè)果膠降解后產(chǎn)生的半乳糖醛酸或其衍生物的含量。如離子交換色譜法，采用酶降解果膠產(chǎn)生半乳糖醛酸，離子交換柱分離半乳糖醛酸和中性還原糖后，安培檢測(cè)器分別測(cè)定各組分含量。還有一種方法，是采用酸降解果膠產(chǎn)生半乳糖醛酸，然后再用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)進(jìn)行衍生，這樣就能用常見的碳十八柱配合紫外檢測(cè)器來對(duì)半乳糖醛酸含量進(jìn)行檢測(cè)(CN102507760A)。這類方法除了色譜檢測(cè)外，還需離子交換分離、衍生化等步驟，操作較為繁瑣。目前，尚需一種簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的測(cè)定煙草和/或煙草制品中果膠含量的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)了一種含果膠的樣品的前處理方法，該方法能較大程度地將煙草和/或煙草制品中的果膠轉(zhuǎn)化為半乳糖醛酸，產(chǎn)生較少的副產(chǎn)物。本發(fā)明人還獲得了一種測(cè)定果膠的方法，該方法通過測(cè)定果膠所轉(zhuǎn)化成的半乳糖醛酸的含量，能夠準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出煙草和/或煙草制品中的果膠含量，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人還提出了一種測(cè)定半乳糖醛酸的方法、一種試劑盒和該試劑盒的用途。本發(fā)明第一方面涉及一種含果膠的樣品的前處理方法，包括如下步驟：(1)用酸性醇溶液浸漬樣品，分離出殘?jiān)黄渲?，酸性醇溶液的pH值為2～2.52(酸性醇溶液中的氫離子濃度為0.003～0.01mol/L)；(2)向步驟(1)得到的殘?jiān)屑尤胨崛芤哼M(jìn)行水解，分離得到液體和殘?jiān)黄渲?，酸溶液的pH值為1～1.52(酸溶液中的氫離子濃度為0.03～0.1mol/L)；(3)將步驟(2)得到的液體的pH值調(diào)整為3～5，加入第一果膠酶溶液進(jìn)行酶解，分離得到第一上清液。本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的前處理方法還包括如下步驟：(4)向步驟(2)得到的殘?jiān)屑尤氲诙z酶溶液進(jìn)行酶解，分離得到第二上清液。本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的前處理方法還包括下述步驟：(5)將第一上清液和第二上清液進(jìn)行混合，得到混合提取液。本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品為煙草和/或煙草制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品選自煙葉、煙絲、煙葉組合物和卷煙中的一種或多種。本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(1)中形成醇溶液酸性的物質(zhì)選自鹽酸溶液、硝酸溶液和硫酸溶液中的一種或多種，優(yōu)選為鹽酸溶液。本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述前處理方法包括如下1)至20)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng)：1)步驟(1)中，所述酸性醇溶液的pH值為2～2.3，優(yōu)選為2.3(酸性醇溶液中的氫離子濃度為0.005～0.01mol/L，優(yōu)選為0.005mol/L)；2)步驟(1)中，浸漬的料液比為1:(10～200)(g/mL)，優(yōu)選為1:(50～150)(g/mL)，更優(yōu)選為1:100(g/mL)；3)步驟(1)中，所述醇溶液選自乙醇溶液、異丙醇溶液和甲醇溶液中的一種或多種，優(yōu)選為乙醇溶液；優(yōu)選地，所述醇溶液為醇水溶液；4)步驟(1)中，所述醇溶液的濃度為60％～90％(W/W)，優(yōu)選為70％～85％(W/W)，更優(yōu)選為70％(W/W)、75％(W/W)、78％(W/W)、80％(W/W)或85％(W/W)；5)步驟(1)中，分離的方式為過濾，優(yōu)選為砂芯漏斗過濾；6)步驟(1)還包括，在浸漬之前，將樣品進(jìn)行粉碎的步驟；優(yōu)選地，將樣品粉碎至粒徑為40目；7)步驟(2)中，所述酸溶液的pH值為1～1.3，優(yōu)選為1.3(酸溶液中的氫離子濃度為0.05～0.1mol/L，優(yōu)選為0.05mol/L)；優(yōu)選地，所述酸溶液為酸水溶液；8)步驟(2)中，所述酸溶液的用量為80～120mL/(g樣品)，優(yōu)選為90～110mL/(g樣品)，更優(yōu)選為100mL/(g樣品)；9)步驟(2)中，所述酸溶液選自鹽酸溶液、硝酸溶液和硫酸溶液中的一種或多種，優(yōu)選為鹽酸溶液；10)步驟(2)還包括，在水解之前，用乙醇溶液洗滌步驟(1)得到的殘?jiān)牟襟E；優(yōu)選地，乙醇溶液的濃度為60％～90％(W/W)，更優(yōu)選為70％～85％(W/W)，進(jìn)一步優(yōu)選為70％(W/W)、75％(W/W)、78％(W/W)、80％(W/W)或85％(W/W)；優(yōu)選地，乙醇溶液的溫度為70℃～80℃；11)步驟(1)的浸漬和/或步驟(2)的水解在回流條件下進(jìn)行；優(yōu)選地，回流溫度為60℃～100℃，回流時(shí)間為0.5～6小時(shí)；更優(yōu)選地，回流溫度為70℃～90℃，回流時(shí)間為1～5小時(shí)；進(jìn)一步優(yōu)選地，回流溫度為70℃或80℃，回流時(shí)間為1小時(shí)；12)步驟(3)中，將步驟(2)得到的液體的pH值調(diào)整為4；13)步驟(3)中，通過向步驟(2)得到的液體中加入固體堿或堿溶液調(diào)整pH值，優(yōu)選加入堿溶液；優(yōu)選地，所述堿溶液選自氫氧化鈉溶液和氫氧化鉀溶液；優(yōu)選地，所述堿溶液的濃度為1～10mol/L，更優(yōu)選為10mol/L；14)每毫升第一果膠酶溶液或每毫升第二果膠酶溶液中的酶活為800～5000U，優(yōu)選為1000～4000U，更優(yōu)選為1000U或4000U；15)步驟(3)和/或步驟(4)酶解體系中的酶活為40000～500000U，優(yōu)選為50000～400000U、40000～70000U或300000～500000U，更優(yōu)選為40000U、50000U、60000U、70000U、330000U或400000U；16)步驟(3)和步驟(4)酶解體系中的酶活不同；優(yōu)選地，步驟(4)酶解體系中的酶活大于步驟(3)酶解體系中的酶活；更優(yōu)選地，步驟(4)酶解體系中的酶活為步驟(3)酶解體系中酶活的6-10倍，進(jìn)一步優(yōu)選為8倍；17)步驟(3)和/或步驟(4)中，酶解溫度為35℃～70℃，酶解時(shí)間為0.5～10小時(shí)；優(yōu)選地，酶解溫度為45℃～65℃，酶解時(shí)間為1～8小時(shí)；更優(yōu)選地，酶解溫度為45℃、50℃或55℃，酶解時(shí)間為1小時(shí)、2小時(shí)或3小時(shí)；18)第一果膠酶溶液和/或第二果膠酶溶液為含果膠酶的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液；優(yōu)選地，乙酸/乙酸鈉緩沖溶液的pH值為3～5，更優(yōu)選為4；優(yōu)選地，乙酸/乙酸鈉緩沖溶液的濃度為0.05～0.3mol/L，更優(yōu)選為0.2mol/L；19)步驟(3)和/或步驟(4)中，通過離心進(jìn)行分離；優(yōu)選地，離心轉(zhuǎn)速為8000～12000r/min，離心時(shí)間為5～20分鐘；更優(yōu)選地，離心轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時(shí)間為5分鐘；20)步驟(3)和/或步驟(4)還包括，在分離之前，將酶解體系中的酶進(jìn)行滅活的步驟；優(yōu)選地，采用沸水浴進(jìn)行滅活；優(yōu)選地，滅活時(shí)間為10～30分鐘，更優(yōu)選為20分鐘。不拘于理論的限制，步驟(4)的酶解體系采用與步驟(3)的酶解體系相同的較低的酶活時(shí)，步驟(2)得到殘?jiān)械墓z轉(zhuǎn)化為半乳糖醛酸的轉(zhuǎn)化率較低，而且還會(huì)產(chǎn)生大量雜質(zhì)，干擾測(cè)定的準(zhǔn)確度。故相比于步驟(3)的酶解體系，步驟(4)的酶解體系采用較高的酶活。本發(fā)明第二方面涉及一種測(cè)定樣品中果膠含量的方法，包括按照本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)所述的前處理方法得到第一上清液、第二上清液或混合提取液的步驟；以及對(duì)第一上清液、第二上清液或混合提取液中的半乳糖醛酸的含量進(jìn)行測(cè)定的步驟，或者對(duì)由第一上清液、第二上清液或混合提取液定容之后得到的液體中的半乳糖醛酸的含量進(jìn)行測(cè)定的步驟。本發(fā)明第二方面的一個(gè)實(shí)施方式中，采用液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明第二方面的一個(gè)實(shí)施方式中，還包括，根據(jù)所述半乳糖醛酸的含量的測(cè)定結(jié)果，計(jì)算樣品中以半乳糖醛酸計(jì)的果膠含量的步驟。本發(fā)明第二方面的一個(gè)實(shí)施方式中，還包括，在測(cè)定之前，將第一上清液、第二上清液、混合提取液或者由第一上清液、第二上清液或混合提取液定容之后得到的液體進(jìn)行過濾的步驟；優(yōu)選地，過濾所用濾膜的孔徑為0.22μm或0.45μm。本發(fā)明第二方面的一個(gè)實(shí)施方式中，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的操作條件包括如下i)至iv)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng)：i)漂移管溫度為35～55℃，優(yōu)選為45℃；ii)噴霧器為冷卻狀態(tài)；iii)氣體壓強(qiáng)為26～42psi，優(yōu)選為35psi；iv)增益為1～7，優(yōu)選為1或7。本發(fā)明第三方面涉及一種測(cè)定半乳糖醛酸的方法，包括采用液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定液態(tài)樣品中的半乳糖醛酸的步驟；其中，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的操作條件包括如下i)至iv)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng)：i)漂移管溫度為35～55℃，優(yōu)選為45℃；ii)噴霧器為冷卻狀態(tài)；iii)氣體壓強(qiáng)為26～42psi，優(yōu)選為35psi；iv)增益為1～7，優(yōu)選為1或7。本發(fā)明第二方面或第三方面的一個(gè)實(shí)施方式中，采用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定；優(yōu)選地，外標(biāo)物為半乳糖醛酸。本發(fā)明第二方面或第三方面的一個(gè)實(shí)施方式中，液相色譜的操作條件包括如下a至f中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng)：a.液相色譜儀為waterse2695；b.色譜柱為AminexHPX-87糖分析柱；c.流動(dòng)相由乙腈和水組成，其中乙腈和水的體積比為(60～80):(20～40)，優(yōu)選為60:40；d.流動(dòng)相的流速為0.2～1mL/min，優(yōu)選為0.8mL/min；e.柱溫為40～55℃，優(yōu)選為45℃；f.進(jìn)樣量為5～22μL，優(yōu)選為20μL。本發(fā)明第四方面涉及一種試劑盒，包含pH值為1～1.5的鹽酸水溶液、pH值為2～2.52的乙醇水溶液、含果膠酶的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液、孔徑為0.22μm或0.45μm的濾膜和AminexHPX-87糖分析柱。本發(fā)明第四方面的一個(gè)實(shí)施方式中，乙醇水溶液的濃度為60％～90％(W/W)，優(yōu)選為70％～85％(W/W)，更優(yōu)選為70％(W/W)、75％(W/W)、78％(W/W)、80％(W/W)或85％(W/W)。本發(fā)明第四方面的一個(gè)實(shí)施方式中，乙酸/乙酸鈉緩沖溶液的濃度為0.05～0.3mol/L，優(yōu)選為0.2mol/L。本發(fā)明第四方面的一個(gè)實(shí)施方式中，乙酸/乙酸鈉緩沖溶液的pH值為3～5，優(yōu)選為4。本發(fā)明第五方面涉及本發(fā)明第四方面任一所述試劑盒在含果膠的樣品的前處理或者在測(cè)定樣品的果膠中的用途；優(yōu)選地，所述樣品為煙草或煙草制品；更優(yōu)選地，所述樣品選自煙葉、煙絲、煙葉組合物和卷煙中的一種或多種。本發(fā)明中，術(shù)語“果膠”是指存在于高等植物細(xì)胞壁及細(xì)胞間隙的一種復(fù)雜多糖。由半乳糖醛酸以α-1,4方式連結(jié)起來的一種直鏈多糖,半乳糖醛酸分子中的羧基常甲基化。在酸性溶液中能凝結(jié)成胨。是制造果醬、膠胨、化妝品、乳化劑、脫水劑等的原料。術(shù)語“果膠酶”是指催化果膠降解的酶，促使單糖之間的糖苷鍵斷裂。例如，山東泰安信得利生物工程有限公司銷售的食品級(jí)果膠酶、鄭州藍(lán)馳實(shí)業(yè)有限公司銷售的食品級(jí)果膠酶、江蘇銳陽生物科技有限公司銷售的食品級(jí)果膠酶、南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司銷售的食品級(jí)果膠酶和濟(jì)寧和美生物工程有限公司銷售的食品級(jí)果膠酶。術(shù)語“浸漬”是指用液體泡、浸泡、滲透。術(shù)語“煙草”是指茄科，煙草屬(NicotianaL.)，一年生或多年生草本，嗜好類作物。本屬約有60多個(gè)種，大多是野生種。主要栽培種有紅花煙草和黃花煙草。二者均原產(chǎn)南美洲,都是自然產(chǎn)生的雙二倍體。紅花煙草又稱普通煙草,是世界性商品生產(chǎn)用煙種。又因調(diào)制方法及種源、地區(qū)、栽培措施不同而形成多種類型：烤煙、白肋煙、馬里蘭煙、雪茄煙、熏煙、香料煙、曬紅煙、曬黃煙等。每一類型中又有很多栽培品種。黃花煙草以前蘇聯(lián)和印度栽培較多，中國新疆、甘肅等地有少量栽培。本屬中的花煙草(N.alataLinkandOtta)和粉藍(lán)煙草(N.glaucaGraham)栽種供觀賞。術(shù)語“煙草制品”是指全部或部分由煙葉為原材料生產(chǎn)的、供抽吸、吸吮、咀嚼或鼻吸的制品。所述煙草制品包括但不限于卷煙和嚼煙。術(shù)語“砂芯漏斗”是指耐酸玻璃濾過儀器，系采用優(yōu)良硬質(zhì)高硼玻璃組成，具有較高的理化性能。產(chǎn)品適用于化學(xué)分析、衛(wèi)生檢驗(yàn)、石油工業(yè)、制藥工業(yè)、染料工業(yè)等方面。術(shù)語“水解”是指物質(zhì)加水或吸水引起的分解作用。術(shù)語“回流”是指為了加快有些反應(yīng)速度很慢或難以進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，常常需要使反應(yīng)物較長時(shí)間保持沸騰。這種情況下，就需要冷凝裝置，使蒸汽不斷地在冷凝管內(nèi)冷凝而返回反應(yīng)器中，以防止反應(yīng)器中物質(zhì)逸失?；蛴袝r(shí)反應(yīng)物具有揮發(fā)性，為了不使反應(yīng)物揮發(fā)太快而損失，通常在反應(yīng)容器上方安裝冷凝管，這樣蒸汽將遇冷回流入反應(yīng)容器內(nèi)。術(shù)語“酶活”也稱為酶活力(enzymeactivity)、酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示，酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。術(shù)語“滅活”是指具有生物學(xué)活性的物質(zhì)(酶、激素、抗體等)經(jīng)變性，即失去原有的活性。通常熱、光、酸堿、酒精等可使蛋白質(zhì)變性。術(shù)語“半乳糖醛酸”是果膠酸的組成單位，果膠的主要成分。存在于植物的粘液、樹膠和細(xì)菌多糖中，多數(shù)為甲酯。分子式為C6H10O7。本發(fā)明取得的有益效果：1、本發(fā)明含果膠的樣品的前處理方法，能較大程度地將煙草和/或煙草制品中的果膠轉(zhuǎn)化為半乳糖醛酸，產(chǎn)生較少的雜質(zhì)和副產(chǎn)物。2、本發(fā)明測(cè)定果膠的方法，通過檢測(cè)果膠所轉(zhuǎn)化成的半乳糖醛酸的含量，能準(zhǔn)確、快速地測(cè)定出煙草和/或煙草制品中的果膠含量，檢測(cè)靈敏度高，操作簡(jiǎn)便。附圖說明為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中：圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中溶液A的色譜圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中溶液B的色譜圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中0.5g/L半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中半乳糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖5為本發(fā)明對(duì)比例1中溶液E的色譜圖。圖6為本發(fā)明對(duì)比例2中溶液F的色譜圖。圖7為本發(fā)明對(duì)比例3中0.5g/L半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1煙葉中果膠的測(cè)定1、前處理(1)將新鮮煙葉在40℃下烘干至恒重，準(zhǔn)確稱取烘干的煙葉1.0000g置于250ml圓底燒瓶中，每份樣品設(shè)四個(gè)平行試樣。(2)向煙葉中加入100ml的80％(W/W)乙醇水溶液，乙醇水溶液含鹽酸的濃度為0.005mol/L，80℃下熱回流1小時(shí)去除水溶性糖，趁熱砂芯漏斗抽濾后，用80℃的80％(W/W)乙醇水溶液清洗煙葉殘?jiān)椤?3)向煙葉殘?jiān)屑尤?00ml的0.05mol/L鹽酸水溶液，80℃下回流1小時(shí)，趁熱砂芯漏斗抽濾，收集濾液和煙葉殘?jiān)虏矫附狻?4)將步驟(3)的濾液用10mol/L的NaOH水溶液調(diào)整至pH值為4，加入50ml用pH值為4、濃度為0.2mol/L的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液配制的果膠酶酶液，所用果膠酶為山東泰安信得利生物工程有限公司銷售的食品級(jí)果膠酶，每毫升果膠酶酶液中的酶活達(dá)1000U，在50℃水浴下酶解3小時(shí)，酶解結(jié)束后，沸水浴20分鐘，以10000r/min轉(zhuǎn)速離心5分鐘，得上清液A，定容至250ml，得到溶液A。(5)向步驟(3)的濾渣中加入100ml用pH值為4、濃度為0.2mol/L的乙酸/乙酸鈉緩沖液配制的果膠酶酶液，所用果膠酶為山東泰安信得利生物工程有限公司銷售的食品級(jí)果膠酶，每毫升果膠酶酶液中的酶活為4000U，在50℃水浴下酶解3小時(shí)，酶解結(jié)束后，沸水浴20分鐘，以10000r/min轉(zhuǎn)速離心5分鐘，得上清液B，定容至100ml，得到溶液B。2、檢測(cè)將溶液A和溶液B過0.22μm的微孔濾膜，然后采用液相色譜進(jìn)行分析，得到的色譜圖如圖1-2所示。液相色譜的條件如下：色譜儀為waterse2695；檢測(cè)器為waters2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；色譜柱為AminexHPX-87糖分析柱；流動(dòng)相為乙腈：水＝60:40(V/V)，流動(dòng)相的流量為0.8ml/min；柱溫為45℃；進(jìn)樣量為20μL。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件：漂移管溫度為45℃；噴霧器處于冷卻狀態(tài)；氣體壓強(qiáng)為35.0psi；增益為1。3、計(jì)算(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取1.0000g半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(購買自上海源葉生物科技有限公司，D-半乳糖醛酸，純度≥97％)，用水溶解定容于100ml容量瓶中，配制成半乳糖醛酸含量為1g/L的標(biāo)準(zhǔn)母液，稀釋成0.2g/L，0.33g/L，0.4g/L，0.5g/L，0.67g/L，0.8g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用2中的方法進(jìn)行檢測(cè)，其中，0.5g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖3所示。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，以半乳糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝92009100x-18484800，相關(guān)系數(shù)R2＝0.99788，表明半乳糖醛酸濃度為0.2～0.8g/L時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。(2)根據(jù)溶液A和溶液B的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出溶液A和溶液B中半乳糖醛酸的含量(分別為CA和CB)。根據(jù)下式計(jì)算出煙葉的果膠含量(以半乳糖醛酸計(jì))，結(jié)果見表1。其中，W-煙葉中果膠的重量百分?jǐn)?shù)(％)；CA-溶液A中半乳糖醛酸的濃度(g/L)；VA-溶液A的體積(0.25L)；CB-溶液B中半乳糖醛酸的濃度(g/L)；VB-溶液B的體積(0.1L)；M-煙葉樣品的質(zhì)量(1g)。4、用流動(dòng)分析法(方法如下)對(duì)溶液A和溶液B進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果亦列于表1中。移取溶液A和溶液B各1.0mL放入流動(dòng)分析儀樣品盤的試管中，分別加入5.0mL四硼酸鈉的硫酸溶液，混勻，加熱5分鐘，冷卻后，分別加入1.5mg/mL的間羥基聯(lián)苯溶液100μL，混勻。以1mL水同上操作制得空白液調(diào)零。在524nm處測(cè)定吸光度。對(duì)上面0.2g/L，0.33g/L，0.4g/L，0.5g/L，0.67g/L，0.8g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液采用同上的方法測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到溶液A和溶液B中的半乳糖醛酸含量，進(jìn)而計(jì)算得到煙葉中果膠的含量。表1本發(fā)明方法比流動(dòng)分析法更加簡(jiǎn)便、高效，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性更高。兩種方法所測(cè)定的煙葉中果膠含量較為接近。實(shí)施例2煙末中果膠的測(cè)定1、前處理(1)將新鮮煙葉在40℃下烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎后，過40目篩網(wǎng)，得到煙末。準(zhǔn)確稱取煙末1.0000g置于250ml搖瓶中，每份樣品設(shè)三個(gè)平行試樣。(2)向煙末中加入100ml的80％(W/W)乙醇水溶液，乙醇水溶液中含鹽酸的濃度為0.005mol/L，70℃下熱回流1小時(shí)以除去水溶性糖，趁熱砂芯漏斗抽濾后，用70℃的80％(W/W)乙醇水溶液清洗煙葉殘?jiān)椤?3)向煙葉殘?jiān)屑尤?00ml的0.05mol/L鹽酸水溶液，70℃下回流1小時(shí)，趁熱砂芯漏斗抽濾。(4)將步驟(3)的濾液用10mol/L的NaOH水溶液調(diào)整至pH值為4，加入50ml用pH值為4、濃度為0.2mol/L的乙酸/乙酸鈉緩沖液配制的果膠酶酶液，所用果膠酶為山東泰安信得利生物工程有限公司銷售的食品級(jí)果膠酶，每毫升果膠酶酶液中的酶活達(dá)1000U，在50℃水浴下酶解3小時(shí)，酶解結(jié)束后，沸水浴20分鐘，以10000r/min轉(zhuǎn)速離心5分鐘，得上清液C，定容至250ml，得到溶液C。(5)向步驟(3)的濾渣中加入100ml用pH值為4、濃度為0.2mol/L的乙酸/乙酸鈉緩沖液配制的果膠酶酶液，所用果膠酶為山東泰安信得利生物工程有限公司銷售的食品級(jí)果膠酶，每毫升果膠酶酶液中的酶活為4000U，在50℃水浴下酶解3小時(shí)，酶解結(jié)束后，沸水浴20分鐘，以10000r/min轉(zhuǎn)速離心5分鐘，得上清液D，定容至100ml，得到溶液D。2、檢測(cè)將溶液C和溶液D過0.45μm微孔濾膜，然后采用液相色譜進(jìn)行分析。液相色譜的條件如下：色譜儀為waterse2695；檢測(cè)器為waters2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；色譜柱為AminexHPX-87糖分析柱；流動(dòng)相為乙腈：水＝60:40(V/V)，流動(dòng)相流速0.6ml/min；柱溫為45℃；進(jìn)樣量為20μL。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件：漂移管溫度為45℃；噴霧器處于冷卻狀態(tài)；氮?dú)鈮簭?qiáng)為35.0psi；增益為1。3、計(jì)算(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線：以半乳糖醛酸做外標(biāo)，稱取半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(購買自上海源葉生物科技有限公司，D-半乳糖醛酸，純度≥97％)0.1g，用水溶解定容于100ml容量瓶中，配制成半乳糖醛酸含量為1g/L的標(biāo)準(zhǔn)母液，稀釋成0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L，0.5g/L，0.6g/L，0.8g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用實(shí)施例2的2中的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，以半乳糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)根據(jù)溶液C和溶液D的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到溶液C和溶液D中半乳糖醛酸含量(分別為CC和CD)。根據(jù)下式計(jì)算出煙末的果膠含量(以半乳糖醛酸計(jì))，結(jié)果見表2。其中，W-煙末中果膠的重量百分?jǐn)?shù)(％)；CC-溶液C中半乳糖醛酸的濃度(g/L)；VC-溶液C的體積(0.25L)；CD-溶液D中半乳糖醛酸的濃度(g/L)；VD-溶液D的體積(0.1L)；M-煙末樣品的質(zhì)量(1g)。4、用硫酸咔唑法(方法如下)對(duì)對(duì)溶液C和溶液D進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果亦列于表2。移取溶液C和溶液D各1.0mL放入試管中，分別加入6.0mL濃硫酸，邊加邊用水冷卻，冷至室溫后加入0.15％咔唑的無水乙醇溶液0.50mL，搖勻，在室溫下暗處放置30分鐘后，以空白試劑為參比，在530nm處測(cè)定其吸光度。對(duì)上面0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L，0.5g/L，0.6g/L，0.8g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液采用同上的方法測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算溶液C和溶液D中的半乳糖醛酸含量，進(jìn)而計(jì)算得到煙末中果膠的含量。表2本發(fā)明方法比硫酸咔唑法更簡(jiǎn)便、高效，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性更高。兩種方法測(cè)定的果膠含量有顯著性差異，硫酸咔唑法的測(cè)量結(jié)果偏大，可能與分析過程中的中性還原糖干擾有關(guān)。實(shí)施例3加標(biāo)回收率測(cè)定準(zhǔn)確稱取兩份實(shí)施例1烘干后的煙葉1.0g分別置于兩個(gè)250ml圓底燒瓶中，其中一份中加入0.1g果膠(biosharp分裝，含量70％)，其余參照實(shí)施例1進(jìn)行，測(cè)得煙葉中的果膠含量和加標(biāo)煙葉中的果膠含量，計(jì)算出加樣回收率，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。表3煙葉中果膠含量(％)果膠加樣回收率(％)12.2102.512.698.412.3101.3由表3可知，本發(fā)明方法的回收率較高，準(zhǔn)確度較高。對(duì)比例11、前處理(1)準(zhǔn)確稱取實(shí)施例1中烘干后的煙葉1.0000g置于250ml圓底燒瓶中，每份樣品設(shè)四個(gè)平行試樣。(2)向煙葉中加入100ml的80％(W/W)乙醇水溶液，乙醇水溶液含鹽酸的濃度為0.005mol/L，80℃下熱回流1小時(shí)去除水溶性糖，趁熱砂芯漏斗抽濾后，用80℃的80％(W/W)乙醇水溶液清洗煙葉殘?jiān)鼣?shù)遍。收集煙葉，待酸解。(3)向煙葉殘?jiān)屑尤?00ml的0.05mol/L鹽酸水溶液，80℃下回流1小時(shí)，趁熱砂芯漏斗抽濾，收集濾液。(4)將步驟(3)的濾液用10mol/L的NaOH水溶液調(diào)整至pH值為4，定容至250ml，得到溶液E。2、檢測(cè)將溶液E過0.22μm微孔濾膜后，采用液相色譜分析，液相色譜的條件和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的條件同實(shí)施例1所示，得到的色譜圖如圖5所示。對(duì)比圖1和圖5的檢測(cè)結(jié)果可知，與僅對(duì)煙葉進(jìn)行酸水解得到的溶液相比，本發(fā)明對(duì)煙葉酸水解得到濾液，濾液進(jìn)一步用果膠酶水解后，所得溶液中半乳糖醛酸出峰峰型更佳，與前后雜峰能夠完全地分離開。對(duì)比例21、前處理(1)準(zhǔn)確稱取實(shí)施例1中烘干后的煙葉1.0000g置于250ml圓底燒瓶中，每份樣品設(shè)四個(gè)平行試樣。(2)向煙葉中加入100ml的80％(W/W)乙醇水溶液，乙醇水溶液含鹽酸的濃度為0.005mol/L，80℃下熱回流1小時(shí)去除水溶性糖，趁熱砂芯漏斗抽濾后，用80℃的80％(W/W)乙醇水溶液清洗煙葉殘?jiān)鼣?shù)遍。收集煙葉，待酶解。(3)向步驟(2)的煙葉殘?jiān)屑尤?00ml用pH值為4、濃度為0.2mol/L的乙酸/乙酸鈉緩沖液配制的果膠酶酶液，所用果膠酶為山東泰安信得利生物工程有限公司銷售的食品級(jí)果膠酶，每毫升果膠酶酶液中的酶活為4000U，在50℃水浴下酶解3小時(shí)，酶解結(jié)束后，沸水浴20分鐘，以10000r/min轉(zhuǎn)速離心5分鐘，得上清液，定容至100ml，得溶液F。2、檢測(cè)將溶液F用0.22μm微孔濾膜過濾后，采用液相色譜分析，液相色譜的條件和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的條件同實(shí)施例1所示，得到的色譜圖如圖6所示。對(duì)比圖2和圖6的檢測(cè)結(jié)果可知，與僅對(duì)煙葉進(jìn)行果膠酶水解得到的溶液相比，本發(fā)明對(duì)煙葉酸水解得到濾渣，濾渣進(jìn)一步用果膠酶水解后，所得溶液中半乳糖醛酸的出峰峰型更佳，與前后雜峰能夠完全分離開。對(duì)比例3對(duì)實(shí)施例1中配制的0.5g/L的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，得到的色譜圖如圖7所示。液相色譜條件為：色譜儀為waterse2695；檢測(cè)器為waters2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；色譜柱為AminexHPX-87糖分析柱；流動(dòng)相為乙腈：水＝70:30(V/V)，流動(dòng)相的流量為0.5ml/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為20μL。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件：漂移管溫度為40℃；噴霧器處于冷卻狀態(tài)；氣體壓強(qiáng)為35.0psi；增益為5。對(duì)比圖3和圖7可知，與對(duì)比例3檢測(cè)條件相比，采用本發(fā)明檢測(cè)條件，所得到半乳糖醛酸色譜峰的峰形有很大的改善。顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。當(dāng)前第1頁1 2 3