本發(fā)明屬于食品分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及食物過敏原及其致敏性殘基含量的高靈敏檢測方法。
背景技術(shù)：
牛乳具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，也經(jīng)常添加到其他食品中，是人們?nèi)粘Ｉ钪薪?jīng)常攝入的物質(zhì)，同時(shí)牛乳作為八大類過敏食物之一，牛乳過敏在人群中的發(fā)病率為0.3%～7.5%，而在兒童中的發(fā)病率達(dá)0.1～7.5%，其中在一歲以下的嬰幼兒中的發(fā)病率達(dá)到2%～3%。食品法典委員會(huì)（Codex Alimentarius Commission）、歐洲食品標(biāo)簽指導(dǎo)委員會(huì)（European Food Labeling Directive）和美國食品藥品管理局（FDA）都規(guī)定食品標(biāo)簽中必須列出各類致敏成分，其中就包括牛乳及乳制品。對(duì)食物過敏原的檢測是食物過敏管理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以便對(duì)過敏食物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、生產(chǎn)和標(biāo)示。牛乳中過敏原成分復(fù)雜，其中β-乳球蛋白約占牛乳蛋白含量的10%，約占乳清蛋白總量的50%，且IgE介導(dǎo)的牛奶過敏中82%的病人對(duì)β-乳球蛋白過敏。因此，開展β-乳球蛋白的檢測，是保護(hù)牛乳過敏人群合法權(quán)益的關(guān)鍵舉措，也有利于生產(chǎn)低致敏食品，從而提高牛乳過敏患者的生活質(zhì)量。
目前，食物過敏原的檢測技術(shù)有基于蛋白檢測的免疫學(xué)技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)、液相/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等，及基于核酸檢測的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)等，其中免疫學(xué)技術(shù)最成熟、最常用?？贵w在免疫學(xué)方法檢測食物過敏原中起著關(guān)鍵作用?？贵w包括單克隆抗體和多克隆抗體，其中單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞分泌，抗體具有高特異性、均一性特點(diǎn)。雖然多克隆抗體具有制備簡單、經(jīng)濟(jì)，但相對(duì)于單克隆抗體，多克隆抗體的特異性和均一性較差，且產(chǎn)量有限。
蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，作為食物過敏原的蛋白，過敏原表位是引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，包括線性表位和構(gòu)象性表位。食品在加工及工業(yè)應(yīng)用中常常會(huì)經(jīng)過加熱、發(fā)酵、酶解等處理，這使過敏原構(gòu)象性表位易被破壞，但線性表位則相對(duì)穩(wěn)定，不易被破壞。合成牛乳β-乳球蛋白主要IgE線性表位肽，通過雜交瘤技術(shù)制備特異性識(shí)別該表位肽的單克隆抗體。
由于金屬納米顆粒具有比表面積大、易與抗體偶聯(lián)等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于高靈敏檢測方法中。目前，應(yīng)用較多的納米金屬有膠體金、納米銀、免疫磁珠等，而膠體金是應(yīng)用最廣泛的納米材料。另外， KOH可以羥基化修飾酶標(biāo)板，可以進(jìn)一步共價(jià)結(jié)合抗體，縮短包被時(shí)間，提高檢測效率。因此，對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行羥基化修飾，并共價(jià)固定單克隆抗體，利用β-乳球蛋白多克隆抗體與膠體金制備膠體金探針，并建立基于膠體金探針的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進(jìn)行高靈敏、高效率地檢測食品中β-乳球蛋白及其致敏性殘基的含量，同時(shí)可評(píng)價(jià)食物樣品致敏性的強(qiáng)弱，評(píng)估食品安全風(fēng)險(xiǎn)的高低，也為食品過敏原標(biāo)示提供更可靠的檢測方法。目前，在我國，結(jié)合共價(jià)固定抗體的高效率、膠體金的高靈敏和IgE表位單克隆抗體的特異性對(duì)食品中過敏原及其致敏性殘基的定量檢測還是空白。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的主要目的在于提出一種基于膠體金探針檢測牛乳β-乳球蛋白及其致敏性殘基的方法，建立一種基于膠體金探針高靈敏的IgE線性表位識(shí)別檢測食品中β-乳球蛋白及其致敏性殘基的方法。該方法準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性好、回收率高、檢測時(shí)間短。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
1、β-乳球蛋白IgE線性表位單克隆抗體的制備。
合成文獻(xiàn)報(bào)道的β-乳球蛋白主要IgE線性表位AA127-144（EVDDEALEKFDKALKALP），并在其N端加上一個(gè)半胱氨酸（C），然后與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)制備免疫原。以制備的免疫原免疫 BALB/c 小鼠，采用腹部皮下多點(diǎn)注射方式免疫，利用細(xì)胞融合技術(shù)將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合獲得可分泌抗體的細(xì)胞株，通過篩選得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，并借助小鼠體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，最后用Protein G親和柱純化的得到β-乳球蛋白IgE線性表位單克隆抗體。
2、β-乳球蛋白多克隆抗體的制備。
以牛乳β-乳球蛋白為抗原，通過常規(guī)方法制備獲得β-乳球蛋白多克隆抗體。
3、抗體的純化。
把β-乳球蛋白與CNBr-Sepharose 4B柱材偶聯(lián)，制備免疫親和柱。兔抗β-乳球蛋白抗血清與等體積PBS混合，將血清加入Sepharose 4B親和柱中，室溫下孵育30 min，再循環(huán)上樣一次；用20倍柱體積的PBS進(jìn)行非特異性洗脫，再用10倍柱體積的3 M MgCl2進(jìn)行特異性洗脫得到牛乳β-乳球蛋白特異性多克隆抗體。純化后，用截留分子量為3 kDa的超濾管對(duì)抗體進(jìn)行除鹽，并濃縮至合適的體積。
4、β-乳球蛋白多克隆抗體的生物素化。
把純化得到的β-乳球蛋白多克隆抗體與長鏈生物素按1：20的摩爾比混合，冰浴2 h，用脫鹽柱除去多余的生物素。
5、膠體金探針的制備。
取1 mL膠體金溶液（粒徑為20 nm），再加40 μL 濃度為1mg/mL的生物素化β-乳球蛋白多克隆抗體，25 °C偶聯(lián)1 h。然后加100 μL 10%的BSA，25 °C孵育1 h，封閉膠體金表面未結(jié)合抗體的位點(diǎn)。接著用低溫離心機(jī)14,000×g 4°C離心30 min，去除未結(jié)合的游離抗體，加入1 mL保存液（含1% BSA，1 % PEG 20000，5%蔗糖，0.25% Tween-20的PBS，pH 6.5）重懸沉淀標(biāo)記抗體的膠體金探針。
6、共價(jià)固定單克隆抗體。
聚苯乙烯酶標(biāo)板中每孔加入200 μL 1%的KOH，37 °C孵育5 min進(jìn)行羥基化修飾，再用超純水洗5次。加10 μL EDC（4 mg/mL，溶于0.1 M MES，pH 4.7）到990 μL單克隆抗體（8 μg/mL），37 °C孵育5-10 min活化抗體。活化的抗體與等體積4%的APTES混合，然后加100 μL抗體到羥基修飾的酶標(biāo)板中，37 °C孵育1 h，再用PBST清洗3次。
7、基于膠體金探針夾心ELISA法檢測β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
往共價(jià)固定有單克隆抗體的酶標(biāo)板中每孔加入250 μL 2%的明膠溶液（含0.1% Tween-20），37 °C封阻1 h。清洗后，每孔加入100 μL已知濃度梯度的β-乳球蛋白，37 °C孵育1.5 h。清洗后，每孔加入100 μL膠體金探針，37 °C孵育1.5 h。清洗后，每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，37 °C孵育1.5 h。清洗后，每孔加入100 μL TMB溶液，與37 °C避光孵育15 min后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測吸光值，根據(jù)吸光值和抗原濃度的關(guān)系繪制β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。
8、樣品預(yù)處理。
（1）液態(tài)乳制品：取一定量的液態(tài)乳制品于離心管中，用低溫離心機(jī)10,000g，4 °C離心15 min，去除脂肪層和沉淀，上清用封阻液稀釋至檢測線性范圍內(nèi)作為待檢樣品。
（2）粉狀乳制品：稱一定量的樣品用PBS稀釋，溶解后離心，去除沉淀和脂肪，上清用封阻液稀釋至檢測線性范圍內(nèi)作為待檢樣品。
（3）固態(tài)乳制品：稱一定量的樣品，磨成均勻粉末，取1g 粉末加入到20 mL提取液（20 mmol/L Tris-HCl, 2% Tween-20, pH 8.0），4 °C攪拌過夜提取蛋白。再經(jīng)10,000×g 4 °C離心10 min，去除沉淀和脂肪，上清用封阻液稀釋至檢測線性范圍內(nèi)作為待檢樣品。
9、樣品檢測。
將待檢測的食品進(jìn)行預(yù)處理，制備檢測樣。根據(jù)上述方法經(jīng)共價(jià)固定抗體、封閉及清洗后，每孔加入100 μL預(yù)處理的樣品，孵育清洗后，按步驟[0021]依次加入膠體金探針、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素、TMB溶液，經(jīng)H2SO4終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀檢測吸光值，把吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被檢樣品中β-乳球蛋白及其致敏性殘基的含量。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1、本發(fā)明利用牛乳β-乳球蛋白表位肽制備單克隆抗體，具有特異性識(shí)別β-乳球蛋白IgE表位的優(yōu)點(diǎn)；2、本發(fā)明利用膠體金和抗體制備探針，具有高靈敏的優(yōu)點(diǎn)；3、本發(fā)明利用羥基化修飾的酶標(biāo)板共價(jià)固定單克隆抗體，具有反應(yīng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)；4、基于表位抗體及膠體金探針定量檢測乳產(chǎn)品中β-乳球蛋白及其致敏性殘基的夾心ELISA方法，具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，便于高通量檢測；5、本發(fā)明所建立的方法將為高通量、高靈敏快速分析檢測多種食品中相關(guān)過敏原及其致敏性殘基提供了一種有效的方法，具有良好的推廣和應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1為所建夾心ELISA法檢測β-乳球蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明將通過以下具體實(shí)例作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1：定量檢測陽光純牛奶中過敏原β-乳球蛋白含量。
1. 樣品預(yù)處理。
取1 mL陽光純牛奶10,000×g，4 °C離心15min，去除脂肪，上清用封阻液稀釋10,000倍后作為檢測樣。
2. 樣品檢測。
（1）共價(jià)固定：將EDC活化的單克隆抗體（8 μg/mL）與等體積的4%APTES混合后，每孔100 μL加到羥基化修飾的酶標(biāo)板中，37 °C共價(jià)固定1 h。
（2）洗滌：用PBST（含0.1%吐溫-20）洗滌3次，每次3 min，扣干。
（3）封阻：用PBS配2%明膠（含0.1%吐溫-20）封阻液，每孔加250 μL，37 °C孵育0.5 h。封阻結(jié)束后，用PBST洗滌3次，每次3 min，扣干。
（4）加抗原：用封阻液將β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在31.25–16,000 ng/mL范圍內(nèi)梯度稀釋，每孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品，一式三份，37 °C孵育2 h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌3次，每次3 min，扣干。
（5）加檢測抗體：用封阻液將膠體金探針稀釋200倍后，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌4次，每次3 min，扣干。
（6）加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素：用封阻液將辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素稀釋60倍，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌4次，每次3 min，扣干。
（7）加顯色液：每孔加100 μL TMB溶液，37 °C避光孵育15 min。
（8）測吸光值：孵育結(jié)束后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測吸光值，吸收波長為450 nm，根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程和樣品吸光值計(jì)算樣品中β-乳球蛋白的含量，三次檢測的平均值為最終檢測含量。
3. 結(jié)果。
檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.80378x-0.90867，r2=0.9966，靈敏度為0.24 ng/mL。陽光純牛奶中β-乳球蛋白的含量為3.21 mg/mL，而牛乳中β-乳球蛋白的含量約為3-4 mg/mL，說明所建立的檢測方法是可行的。
實(shí)施例2：定量檢測多美滋優(yōu)階倍護(hù)部分水解嬰幼兒奶粉中β-乳球蛋白致敏性殘基含量。
1. 樣品預(yù)處理。
稱取0.2 g多美滋優(yōu)階倍護(hù)部分水解嬰幼兒奶粉，加入封阻液并充分溶解，使蛋白濃度為5 mg/mL。10,000×g于4 °C 離心15min，去除脂肪和沉淀，用封阻液將上清稀釋至250 μg/mL, 50 μg/mL及10 μg/mL，作為檢測樣。
2. 樣品檢測。
（1）共價(jià)固定：將EDC活化的單克隆抗體（8 μg/mL）與等體積的4%APTES混合后，每孔100 μL加到羥基化修飾的酶標(biāo)板中，37 °C共價(jià)固定1 h。
（2）洗滌：用PBST（含0.1%吐溫-20）洗滌3次，每次3 min，扣干。
（3）封阻：用PBS配2%明膠（含0.1%吐溫-20）封阻液，每孔加250 μL，37 °C孵育0.5 h。封阻結(jié)束后，用PBST洗滌3次，每次3 min，扣干。
（4）加抗原：用封阻液將β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在31.25–16,000 ng/mL范圍內(nèi)梯度稀釋，每孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品，一式三份，37 °C孵育2 h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌3次，每次3 min，扣干。
（5）加檢測抗體：用封阻液將膠體金探針稀釋200倍后，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌4次，每次3 min，扣干。
（6）加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素：用封阻液將辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素稀釋60倍，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌4次，每次3 min，扣干。
（7）加顯色液：每孔加100 μL TMB溶液，37 °C避光孵育15 min。
（8）測吸光值：孵育結(jié)束后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測吸光值，吸收波長為450 nm，根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程和樣品吸光值計(jì)算樣品中β-乳球蛋白的含量，三次檢測的平均值為最終檢測含量。
3. 結(jié)果。
檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.80378x-0.90867，r2=0.9966，靈敏度為0.24 ng/mL。多美滋優(yōu)階倍護(hù)部分水解嬰幼兒奶粉中β-乳球蛋白及其致敏性殘基的含量為45.48 mg/kg。
實(shí)施例3：定量檢測Leibniz Choco Minis巧克力中β-乳球蛋白含量。
1. 樣品預(yù)處理。
把Leibniz Choco Minis巧克力磨成粉末，稱取1.0 g粉末，加20 mL提取液（20 mmol/L Tris-HCl, 2% Tween-20, pH 8.0），4 °C攪拌過夜提取蛋白。將提取液于10,000 g 4 °C 離心15min，去除脂肪和沉淀，用封阻液將上清稀釋500倍，作為檢測樣。
2. 樣品檢測。
（1）共價(jià)固定：將EDC活化的單克隆抗體（8 μg/mL）與等體積的4%APTES混合后，每孔100 μL加到羥基化修飾的酶標(biāo)板中，37 °C共價(jià)固定1 h。
（2）洗滌：用PBST（含0.1%吐溫-20）洗滌3次，每次3 min，扣干。
（3）封阻：用PBS配2%明膠（含0.1%吐溫-20）封阻液，每孔加250 μL，37 °C孵育0.5 h。封阻結(jié)束后，用PBST洗滌3次，每次3 min，扣干。
（4）加抗原：用封阻液將β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在31.25–16,000 ng/mL范圍內(nèi)梯度稀釋，每孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品，一式三份，37 °C孵育2 h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌3次，每次3 min，扣干。
（5）加檢測抗體：用封阻液將膠體金探針稀釋200倍后，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌4次，每次3 min，扣干。
（6）加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素：用封阻液將辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素稀釋60倍，每孔加100 μL，37 °C孵育1 h。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌4次，每次3 min，扣干。
（7）加顯色液：每孔加100 μL TMB溶液，37 °C避光孵育15 min。
（8）測吸光值：孵育結(jié)束后，每孔加入50 μL 2 M 的H2SO4終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測吸光值，吸收波長為450 nm，根據(jù)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程和樣品吸光值計(jì)算樣品中β-乳球蛋白的含量，三次檢測的平均值為最終檢測含量。
3. 結(jié)果。
檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.80378x-0.90867，r2=0.9966，靈敏度為0.24 ng/mL。Leibniz Choco Minis巧克力中β-乳球蛋白的含量為2.38 g/kg。