本發(fā)明涉及一種快速測(cè)定食品中L-谷氨酸的方法，特別是涉及一種基于谷氨酸脫氫酶和心肌黃酶雙向控制的氧化還原反應(yīng)原理，結(jié)合光吸收酶標(biāo)儀快速檢測(cè)L-谷氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-谷氨酸廣泛存在于動(dòng)植物的機(jī)體中，是食品中天然存在的營(yíng)養(yǎng)成份。目前關(guān)于L-谷氨酸的檢測(cè)方法很多，包括旋光法、紫外分光光度計(jì)法、中和滴定法、茚三酮法、瓦氏呼吸儀法和氨基酸自動(dòng)儀法等。其中旋光法、紫外分光光光度計(jì)法、中和滴定法、茚三酮法不具專一性，只適用于成分較單一的味精中谷氨酸的檢測(cè)；瓦氏呼吸分析儀法因反應(yīng)過程由L-谷氨酸脫羧酶控制，具有專一性，但操作比較復(fù)雜，稍不注意，很容易引入誤差；氨基酸自動(dòng)分析儀法是改良的茚三酮法，適用于全氨基酸分析，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性好，但儀器和耗材昂貴，且每次只能檢測(cè)一個(gè)樣品，未能實(shí)現(xiàn)高通量。因此很有必要開發(fā)一種專一性好、操作簡(jiǎn)便且檢測(cè)儀器價(jià)格和耗材成本能為大眾所接受的食品中L-谷氨酸快速高通量檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提出一種快速測(cè)定食品中L-谷氨酸的方法。利用L-谷氨酸在谷氨酸脫氫酶(GIDH)存在的條件下將煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸(NAD+)還原成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，NADH在心肌黃酶的作用下與碘四唑硝基氯(INT)反應(yīng)生成甲瓚的原理，結(jié)合光吸收酶標(biāo)儀，在490nm處測(cè)定甲瓚的吸收峰，利用外標(biāo)法，根據(jù)甲瓚吸光值計(jì)算樣品中L-谷氨酸含量。由于光吸收酶標(biāo)儀能同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品，且可自動(dòng)完成檢測(cè)讀數(shù)和導(dǎo)出結(jié)果，因此可實(shí)現(xiàn)高通量快速檢測(cè)。
本發(fā)明解決所述技術(shù)問題可以通過采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
包括以下步驟：
(1)固體或半固體樣品采用合適的工具碾碎或絞爛；
稱取適量已碾碎或絞爛的樣品，加入一定量1.0mol/L稀高氯酸溶液或5-磺基水楊酸溶液進(jìn)行均質(zhì)提取，提取時(shí)間為5～10分鐘(注：該提取方法所得L-谷氨酸為游離L-谷氨酸；若希望提取液包括構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的L-谷氨酸，則需增加蛋白水解步驟)；
利用離心機(jī)對(duì)樣品提取液進(jìn)行分離，在1000g離心力下離心5～10分鐘；
取中層清液，用中速濾紙過濾；
液體樣品無需上述前處理，直接移取適量樣品，用中速濾紙過濾即可；
(2)取適量濾液，調(diào)pH至8.0～9.0，并稀釋至一定體積，作為樣品檢測(cè)液，樣品檢測(cè)液L-谷氨酸濃度控制在0.006g/L～0.06g/L范圍內(nèi)；
(3)設(shè)置光吸收酶標(biāo)儀檢測(cè)參數(shù)：檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm，讀板方式為按排逐孔檢測(cè)，讀數(shù)時(shí)間為0.5秒/孔；
(4)分別吸取50μL水、L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、樣品檢測(cè)液到透明96孔板相應(yīng)檢測(cè)孔中；
(5)往每個(gè)相應(yīng)檢測(cè)孔中加入100μL檢測(cè)試劑A，成分為試劑A1、A2、 A3的混合物，試劑A1：pH8～9的三乙醇胺磷酸鹽緩沖液、曲拉通；試劑A2：心肌黃酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)；試劑A3：碘四唑硝基氯(INT)，振蕩混勻，用光吸收酶標(biāo)儀進(jìn)行第一次吸光值測(cè)定；
(6)往每個(gè)相應(yīng)檢測(cè)孔中加入50μL檢測(cè)試劑B，成分為谷氨酸脫氫酶(GLDH)，振蕩混勻，反應(yīng)10～20分鐘后，用光吸收酶標(biāo)儀進(jìn)行第二次吸光值測(cè)定；
(7)根據(jù)前后兩次測(cè)定的吸光值差，建立L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品檢測(cè)液吸光值差代入L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，求得樣品檢測(cè)液L-谷氨酸濃度，乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，即為樣品L-谷氨酸含量。
優(yōu)選方案包括：
所述試劑A1為pH8～9的三乙醇胺磷酸鹽緩沖液，其中含曲拉通(Triton X-100)0.5％～1.0％；試劑A2中心肌黃酶的酶活力單位為1U～3U/mL，NAD+濃度為10mg/mL～15mg/mL；試劑A3碘四唑硝基氯(INT)的濃度為1mg/mL～3mg/mL。
試劑A1、試劑A2、試劑A3使用前按3:1:1混合。
用2mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)樣品檢測(cè)液、試劑A1的pH至8.6。
所述檢測(cè)試劑B的酶活力單位為≥30U/mL，反應(yīng)時(shí)間為10～20分鐘。
本發(fā)明的技術(shù)效果在于：
1、提出一種基于谷氨酸脫氫酶和心肌黃酶雙向控制的氧化還原反應(yīng)原理，結(jié)合光吸收酶標(biāo)儀快速檢測(cè)食品中L-谷氨酸的方法；
2、具有專一性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)；
3、具有操作簡(jiǎn)便、快速、高通量的特點(diǎn)。
4、儀器價(jià)格和檢測(cè)試劑成本相對(duì)低廉，易于推廣。
附圖說明
圖1是本發(fā)明的L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明：
本發(fā)明包含如下步驟：
1.樣品檢測(cè)液的制備：
固體或半固體樣品用碾碎機(jī)或絞肉機(jī)碾碎或絞爛，取50g放入均質(zhì)杯加入100mL 1.0mol/L的稀高氯酸溶液進(jìn)行均質(zhì)提取5分鐘(注：該提取方法所得L-谷氨酸為游離L-谷氨酸，若希望提取液包括構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的L-谷氨酸，則需增加蛋白水解步驟)，將混合物轉(zhuǎn)移到50mL離心管，于1000g離心力下離心5分鐘，小心撥開上層漂浮物，取中層清液，用中速濾紙過濾(液體樣品無需上述前處理，直接過濾即可)，取適量濾液，用2mol/L的氫氧化鉀溶液調(diào)pH至8.0～9.0，并稀釋至一定體積，作為樣品檢測(cè)液，樣品檢測(cè)液L-谷氨酸濃度控制在0.006g/L～0.06g/L范圍內(nèi)。
2.檢測(cè)試劑的準(zhǔn)備：
試劑A1：成分為pH8.0～9.0的磷酸鹽/三乙醇胺緩沖液，其中含曲拉通(Triton X-100)0.5％～1.0％。該溶液在2℃～8℃條件下保存，保存期限為2個(gè)月。
試劑A2：成分為心肌黃酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，其中心肌黃酶的酶活力為1U～3U/mL，NAD+濃度為10mg/mL～15mg/mL。該溶液在2℃～8℃ 條件下保存，保存期限為1個(gè)月。
試劑A3：成分為碘四唑硝基氯(INT)，濃度為1mg/mL～3mg/mL。該溶液在2℃～8℃條件下避光保存，保存期限為1個(gè)月。
使用前分別取試劑A1、試劑A2、試劑A3適量，按3:1:1混合，配成檢測(cè)試劑A?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
檢測(cè)試劑B：成分為谷氨酸脫氫酶(GLDH)，酶活力單位為≥30U/mL。該溶液在2℃～8℃條件下保存，保存期限為1個(gè)月。
3.檢測(cè)儀器的準(zhǔn)備
檢測(cè)前大約10分鐘啟動(dòng)儀器，進(jìn)行預(yù)熱。進(jìn)入檢測(cè)界面，設(shè)置檢測(cè)參數(shù)：檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm，讀板方式為按排逐孔檢測(cè)，讀數(shù)時(shí)間為0.5秒/孔。
4.測(cè)定
1)分別吸取50μL水、L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、樣品檢測(cè)液到透明96孔板相應(yīng)檢測(cè)孔中；
2)往每個(gè)相應(yīng)檢測(cè)孔中加入100μL檢測(cè)試劑A，振蕩混勻，進(jìn)行第一次吸光值測(cè)定；
3)往每個(gè)相應(yīng)檢測(cè)孔中加入50μL檢測(cè)試劑B，振蕩混勻，反應(yīng)10～20分鐘后，進(jìn)行第二次吸光值測(cè)定；
4)根據(jù)前后兩次測(cè)定的吸光值差，建立L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品檢測(cè)液吸光值差代入L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，求得樣品檢測(cè)液L-谷氨酸濃度，乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，即為樣品L-谷氨酸含量。
下面以具體實(shí)施例對(duì)一種快速測(cè)定食品中L-谷氨酸的方法進(jìn)行說明。
實(shí)施例一
1.樣品檢測(cè)液的制備
稱取醬油樣品2g到燒杯中，精確至0.01g，用水稀釋，用2.0mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)pH至8.6，轉(zhuǎn)移到500mL容量瓶中，并定容至刻度，過濾，使醬油樣品檢測(cè)液L-谷氨酸濃度控制在0.006g/L～0.06g/L范圍內(nèi)。
2.檢測(cè)試劑的準(zhǔn)備
試劑A1：稱取三乙醇胺磷酸鹽1.488g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.172g，磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.4mg，用水溶解，用2mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至8.6，加入曲拉通(Triton X-100)0.5g，定容至100mL，配成pH為8.6的三乙醇胺磷酸鹽緩沖液。該溶液在2℃～8℃條件下保存，保存期限為2個(gè)月。
試劑A2：稱取心肌黃酶凍干粉(酶活力單位為25U/mg)0.08mg、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)20mg，溶于2mL水中，配成心肌黃酶酶活力單位為1U/mL、NAD+濃度為10mg/mL的溶液。該溶液在2℃～8℃條件下保存，保存期限為1個(gè)月。
試劑A3：稱取碘四唑硝基氯(INT)2mg，溶于2mL水中，配成濃度為1mg/mL的INT溶液。該溶液在2℃～8℃條件下避光保存，保存期限為1個(gè)月。
使用前分別取試劑A1 750μL、試劑A2 250μL、試劑A3 250μL，按3:1:1混合，配成檢測(cè)試劑A。現(xiàn)配現(xiàn)用。
檢測(cè)試劑B：稱取谷氨酸脫氫酶凍干粉(酶活力單位為35U/mg)2mg，溶于2mL水中，配成谷氨酸脫氫酶酶活力單位為35U/mL的溶液。該溶液在2℃～8℃條件下保存，保持期限為1個(gè)月。
3.檢測(cè)儀器的準(zhǔn)備
檢測(cè)前大約10分鐘啟動(dòng)儀器，進(jìn)行預(yù)熱。進(jìn)入檢測(cè)界面，設(shè)置檢測(cè)參數(shù)： 檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm，讀板方式為按排逐孔檢測(cè)，讀數(shù)時(shí)間為0.5秒/孔。
4.測(cè)定
分別吸取50μL水、L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、醬油樣品檢測(cè)液到透明96孔板相應(yīng)檢測(cè)孔中。
用連續(xù)移液器依次往每個(gè)相應(yīng)檢測(cè)孔中加入檢測(cè)試劑A 100μL；將96孔板放入光吸收酶標(biāo)儀讀板架上，振蕩10秒，使檢測(cè)孔內(nèi)溶液混勻，進(jìn)行第一次測(cè)定，儀器自動(dòng)記錄水空白吸光值(A1b)、L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液吸光值(A1s)和醬油樣品檢測(cè)液吸光值(A1醬油)。
將96孔板取出，用連續(xù)移液器依次往每個(gè)相應(yīng)檢測(cè)孔中加入檢測(cè)試劑B 50μL，將96孔板放回光吸收酶標(biāo)儀讀板架上，振蕩10秒，使檢測(cè)孔內(nèi)溶液混勻，反應(yīng)10分鐘后，進(jìn)行第二次測(cè)定，儀器自動(dòng)記錄水空白吸光值(A2b)、L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液吸光值(A2s)和醬油樣品檢測(cè)液吸光值(A2醬油)。檢測(cè)數(shù)據(jù)見表1。
表1 L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及醬油樣品檢測(cè)液吸光值差
5.結(jié)果計(jì)算
以L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值差為縱坐標(biāo)作圖，求得標(biāo) 準(zhǔn)曲線線性回歸方程y＝20.016x-0.0027(參見圖1)。
將醬油樣品檢測(cè)液吸光值差代入線性回歸方程y＝20.016x-0.0027，求得醬油樣品檢測(cè)液L-谷氨酸濃度為0.0262g/L，乘以稀釋倍數(shù)250(2g定容至500mL)，求得醬油樣品L-谷氨酸含量為6.55g/L。
實(shí)施例二：
1.樣品檢測(cè)液的制備
將約100g雞肉切成小塊，用絞肉機(jī)絞爛，稱取50g，精確至0.01g，放入均質(zhì)杯中，往均質(zhì)杯中加入100mL 0℃的1.0mol/L稀高氯酸溶液，均質(zhì)提取5分鐘(注：該提取方法所得L-谷氨酸為游離L-谷氨酸，若希望提取液包括構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的L-谷氨酸，則需增加蛋白水解步驟)，將均質(zhì)后混合物轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，在2000g離心力下離心5分鐘，小心除去上層脂膜，取中層清液，過濾。
吸取10mL濾液到燒杯中，用水稀釋，用2.0mol/L的氫氧化鉀溶液調(diào)pH至8.6，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，并定容至刻度，使雞肉樣品檢測(cè)液L-谷氨酸濃度在0.006g/L～0.06g/L范圍內(nèi)。
2.檢測(cè)試劑的準(zhǔn)備
試劑A1：稱取三乙醇胺磷酸鹽1.488g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.172g，磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.4mg，用水溶解，用2mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至8.6，加入曲拉通(Triton X-100)1g，定容至100mL，配成pH為8.6的三乙醇胺磷酸鹽緩沖液。該溶液在2℃～8℃條件下保存，保存期限為2個(gè)月。
試劑A2：稱取心肌黃酶凍干粉(酶活力單位為25U/mg)0.24mg、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)30mg，溶于2mL水中，配成心肌黃酶酶活力單位為3 U/mL、NAD+濃度為15mg/mL的溶液。該溶液在2℃～8℃條件下保存，保存期限為1個(gè)月。
試劑A3：稱取碘四唑硝基氯(INT)6mg，溶于2mL水中，配成濃度為3mg/mL的INT溶液。該溶液在2℃～8℃條件下避光保存，保存期限為1個(gè)月。
使用前分別取試劑A1 750μL、試劑A2 250μL、試劑A3 250μL，按3:1:1混合，配成檢測(cè)試劑A?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
檢測(cè)試劑B：稱取谷氨酸脫氫酶凍干粉(酶活力單位為35U/mg)2.8mg，溶于2mL水中，配成谷氨酸脫氫酶酶活力單位為49U/mL的溶液。該溶液在2℃～8℃條件下保存，保持期限為1個(gè)月。
3.檢測(cè)儀器的準(zhǔn)備
檢測(cè)前大約10分鐘啟動(dòng)儀器，進(jìn)行預(yù)熱。進(jìn)入檢測(cè)界面，設(shè)置檢測(cè)參數(shù)：檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm，讀板方式為按排逐孔檢測(cè)，讀數(shù)時(shí)間為0.5秒/孔。
4.測(cè)定
分別吸取50μL水、L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、雞肉樣品檢測(cè)液到透明96孔板相應(yīng)檢測(cè)孔中。
用連續(xù)移液器依次往每個(gè)相應(yīng)檢測(cè)孔中加入檢測(cè)試劑A 100μL；將96孔板放入光吸收酶標(biāo)儀讀板架上，振蕩10秒，使檢測(cè)孔內(nèi)溶液混勻。進(jìn)行第一次測(cè)定，儀器自動(dòng)記錄水空白吸光值(A1b)、L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液吸光值(A1s)和雞肉樣品檢測(cè)液吸光值(A1雞肉)。
將96孔板取出，用連續(xù)移液器依次往每個(gè)相應(yīng)檢測(cè)孔中加入檢測(cè)試劑B 50μL，將96孔板放回光吸收酶標(biāo)儀讀板架上，振蕩10秒，使檢測(cè)孔內(nèi)溶液混勻。反應(yīng)15分鐘后，進(jìn)行第二次測(cè)定，儀器自動(dòng)記錄水空白吸光值(A2b)、L-谷氨 酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液吸光值(A2s)和雞肉樣品檢測(cè)液吸光值(A2雞肉)。
由于雞肉樣品檢測(cè)液與醬油樣品檢測(cè)液為同一批次檢測(cè)，所以水空白和L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的檢測(cè)數(shù)據(jù)與實(shí)施例一相同(見表1)，雞肉樣品檢測(cè)液第一次測(cè)定吸光值為0.083，第二次測(cè)定的吸光值為0.305。
5.水分的測(cè)定
雞肉水分按GB/T9695.15-2008肉與肉制品水分含量測(cè)定，測(cè)得水分為57ml/100g。
6.結(jié)果計(jì)算
將雞肉樣品檢測(cè)液吸光值差代入線性回歸方程y＝20.016x-0.0027，求得雞肉樣品檢測(cè)液L-谷氨酸濃度為0.0100g/L，乘以稀釋倍數(shù)25.7(50g雞肉溶于100mL稀高氯酸溶液加上28.5mL來自雞肉的水的體系中，取10mL濾液定容至100mL)，求得雞肉樣品游離L-谷氨酸結(jié)果為0.257g/L。
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制，應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；因此，凡跟本發(fā)明權(quán)利要求范圍所做的均等變化與修飾，均應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求的涵蓋范圍。