本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種人載脂蛋白c-iii的雙抗體夾心elisa檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

載脂蛋白c-iii是由79個(gè)氨基酸組成的小分子糖蛋白，是載脂蛋白c族中含量最豐富的一類，主要在肝臟中合成，僅小部分在小腸合成，載脂蛋白c-iii主要分布于乳糜微粒、極低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中。載脂蛋白c-iii基因位于11號(hào)染色體長(zhǎng)臂q23區(qū)，在載脂蛋白a-i和載脂蛋白a-iv之間，三者共同組成一個(gè)基因家族。載脂蛋白c-iii的轉(zhuǎn)錄受胰島素及過氧化物酶體增殖物激活受體等多種因素調(diào)控。

載脂蛋白c-iii具有抑制脂蛋白脂酶和肝脂酶活性的功能，可抑制肝臟攝取富含甘油三酯的脂蛋白及脂類分解，是血漿甘油三酯水平的主要調(diào)節(jié)因子。載脂蛋白c-iii在血漿高密度脂蛋白和極低密度脂蛋白之間相互轉(zhuǎn)移，在血脂正常個(gè)體的血清中，載脂蛋白c-iii大部分與高密度脂蛋白結(jié)合，而在高甘油三酯血癥患者血清中，則大部分與極低密度脂蛋白結(jié)合。高甘油三酯血癥是我國(guó)最常見的脂質(zhì)代謝異常疾病，是引起冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。隨著我國(guó)肥胖人群的增加，高甘油三酯血癥患者的數(shù)量也在逐年增加，其發(fā)病主要是由于富含甘油三酯的脂蛋白代謝障礙引起，患者血漿中載脂蛋白c-iii含量顯著高于正常人群，載脂蛋白c-iii已成為高甘油三酯血癥發(fā)生發(fā)展的有效標(biāo)志物。獲得靈敏度高的載脂蛋白c-iiielisa檢測(cè)試劑盒對(duì)高甘油三酯血癥的臨床診斷和科學(xué)研究具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種載脂蛋白c-iii雙抗體夾心elisa檢測(cè)試劑盒；

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供載脂蛋白c-iii雙抗體夾心elisa檢測(cè)試劑盒的使用方法；

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供載脂蛋白c-iii雙抗體夾心elisa檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)高甘油三酯血癥患者血漿中載脂蛋白c-iii含量中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方式實(shí)現(xiàn)：

提供一種人載脂蛋白c-iii的雙抗體夾心elisa檢測(cè)試劑盒，其組成包括預(yù)包被單克隆抗體的酶標(biāo)板、生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親合素(hrp-streptavidin)、載脂蛋白c-iii標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、洗滌液、tmb底物顯色液及終止反應(yīng)液。

所述包被單克隆抗體為人載脂蛋白c-iii單克隆抗體，由保藏號(hào)為cctccno.c2015191的雜交瘤細(xì)胞株wlc001分泌獲得。雜交瘤細(xì)胞wlc001保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏日期為2015年11月18日；

所述生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體為人載脂蛋白c-iii多克隆抗體，由純化的人血漿載脂蛋白c-iii免疫新西蘭兔后分離血清純化后經(jīng)生物素標(biāo)記得到；

所述載脂蛋白c-iii標(biāo)準(zhǔn)品為sigma公司生產(chǎn)的純化的人血漿載脂蛋白c-iii；

所述tmb底物顯色液由10mla液、100μlb液和5μlc液按比例混合，其中a液為檸檬酸0.255g與nahpo4.12h2o0.92g溶于50ml水，b液為0.01gtmb溶于500μldmso，c液為30％h2o2。

所述樣品稀釋液為1％pbs，所述洗滌液為pbst溶液，由1000mlpbs與500μltween-20配制而成，所述終止反應(yīng)液為2mh2so4。

一種載脂蛋白c-iii的雙抗體夾心elisa檢測(cè)方法，包括以下步驟：

將100μl不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品加入到預(yù)包被載脂蛋白c-iii單克隆抗體的酶標(biāo)板中，37℃孵育1h，洗滌后加入生物素標(biāo)記的載脂蛋白c-iii多克隆抗體，37℃孵育1h，洗滌后加入hrp標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育1h，洗滌后加入tmb底物顯色液，37℃避光孵育15min，加入2mh2so4終止液后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔o(hù)d值。繪制載脂蛋白c-iii標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中載脂蛋白c-iii的濃度。

本發(fā)明在傳統(tǒng)的elisa基礎(chǔ)上采用了生物素-鏈霉親合素放大系統(tǒng)，能顯著提高載脂蛋白c-iii的檢測(cè)靈敏度，為高甘油三酯血癥患者的臨床診斷提供幫助。

附圖說明

圖1為人載脂蛋白c-iii標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明。在不脫離本發(fā)明的技術(shù)方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：人載脂蛋白c-iii單克隆抗體的制備

人載脂蛋白c-iii單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株wlc001分泌得到。雜交瘤細(xì)胞株wlc001是以載脂蛋白c-iii多肽作為抗原制備得到，載脂蛋白c-iii的多肽序列為：kfsefwdldpevrpts(如seqidno：1所示)。雜交瘤細(xì)胞株wlc001保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏日期為2015年11月18日，保藏編號(hào)為cctccno.c2015191，保藏地址為湖北省武漢市武漢大學(xué)。雜交瘤細(xì)胞株wlc001的具體制備方法記載于申請(qǐng)?zhí)枮?01510860436.2的專利中，專利名稱為：載脂蛋白c-iii單克隆抗體的制備及應(yīng)用。

實(shí)施例2：人載脂蛋白c-iii多克隆抗體的制備

人載脂蛋白c-iii多克隆抗體是由純化的人載脂蛋白c-iii(購自sigma公司)與弗氏佐劑等體積混勻后免疫新西蘭兔，期間進(jìn)行5次免疫，時(shí)間分別為第1天、第22天、第36天、第50天、第57天，待elisa檢測(cè)血清抗體效價(jià)達(dá)1∶16000后，頸動(dòng)脈采血，分離血清，親和層析法純化，sds-page電泳鑒定載脂蛋白c-iii多克隆抗體，分光光度計(jì)測(cè)定抗體濃度為3.8mg/ml。

實(shí)施例3：載脂蛋白c-iii單克隆抗體-抗原飽和曲線的建立

用包被液稀釋人載脂蛋白c-iii抗原為不同濃度，分別為1、5、20、50、100ng/ml，4℃包被過夜，洗滌3次，3％bsa封閉1h。重復(fù)洗滌后每孔加入100μl稀釋不同濃度的載脂蛋白c-iii單克隆抗體，37℃孵育1h，再加入hrp標(biāo)記的igg(1∶5000)孵育1h，洗滌后，加底物顯色；終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處od值。結(jié)果顯示當(dāng)抗原稀釋至50ng/ml時(shí)，od值趨于穩(wěn)定，說明抗原抗體的結(jié)合已達(dá)到飽和，得出載脂蛋白c-iii單克隆抗體-抗原飽和濃度為50ng/ml。

實(shí)施例4：包被抗體和檢測(cè)抗體最佳工作濃度的選擇

包被緩沖液將人載脂蛋白c-iii單克隆抗體稀釋至20、10、5、2.5、1.25μg/ml，包被微孔板，4℃過夜。多抗?jié)舛冗x取20、10、5、2.5、1.25μg/ml，按照方陣進(jìn)行加樣，用人載脂蛋白c-iii標(biāo)準(zhǔn)品做陽性對(duì)照，以pbs作為陰性對(duì)照，進(jìn)行雙抗體夾心elisa，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，選擇陽性孔o(hù)d450/陰性孔o(hù)d450(p/n)最大值所對(duì)應(yīng)的包被抗體和檢測(cè)抗體工作濃度為最佳工作濃度。結(jié)果顯示，包被抗體最佳工作濃度為10μg/ml，檢測(cè)抗體最佳工作濃度為5μg/ml。

實(shí)施例5：預(yù)包被抗體的酶標(biāo)板和生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體的制備

用人載脂蛋白c-iii單克隆抗體包被固相載體：用包被液將抗體稀釋至最佳工作濃度，加入96孔酶標(biāo)板(購自corning公司)中，每孔100μl，4℃過夜，洗板3次，拍干孔中液體，3％bsa封閉液封閉2h，每孔300μl，拍干孔中液體，晾干后鋁箔袋真空密封包裝，-20℃保存。

用人載脂蛋白c-iii多克隆抗體制備生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體：將人載脂蛋白c-iii多克隆抗體與nhs活化的生物素(購自sigma公司)以1：20摩爾比混合，室溫靜置1h后超濾去除過量未標(biāo)記上的生物素。

實(shí)施例6：構(gòu)建載脂蛋白c-iii雙抗體夾心elisa檢測(cè)體系

(1)加入稀釋后的不同濃度的載脂蛋白c-iii標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品至包被載脂蛋白c-iii單克隆抗體的酶標(biāo)板中，每孔100μl，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔，加入等體積樣品稀釋液，蓋上封板膜，37℃孵育1h，洗滌3次，拍干；

(2)加入生物素標(biāo)記的載脂蛋白c-iii多克隆抗體，每孔100μl，蓋上封板膜，37℃孵育1h，洗滌3次，拍干；

(3)加入hrp標(biāo)記的鏈霉親合素(購自thermofisher公司)，每孔100μl，蓋上封板膜，37℃孵育1h，洗滌3次，拍干；

(4)加入tmb底物顯色液，每孔100μl，37℃避光孵育15min，加入2mh2so4終止液終止反應(yīng)，每孔100μl；

(5)酶標(biāo)儀于450nm處讀取各孔o(hù)d值。

實(shí)施例7：試劑盒的靈敏度檢測(cè)

按照選定的最佳工作濃度檢測(cè)不同濃度的人載脂蛋白c-iii標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.12ng/ml、1.56ng/ml，以pbs作為陰性對(duì)照，按照實(shí)施例6中操作步驟，檢測(cè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品所對(duì)應(yīng)的od450值，與陰性對(duì)照od450值相比，得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的p/n值，以p/n大于2.1對(duì)應(yīng)的最低載脂蛋白c-iii濃度為最低檢測(cè)限度，為6.25ng/ml，見表1。以載脂蛋白c-iii標(biāo)準(zhǔn)品及對(duì)應(yīng)的od值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，在6.25-100ng/ml之間時(shí)，線性關(guān)系良好，見圖1。

表1靈敏度檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例8：人載脂蛋白c-iii雙抗體夾心elisa試劑盒在檢測(cè)人血漿載脂蛋白c-1ii含量中的應(yīng)用

將稀釋5000倍的人血漿樣本加入到包被抗體的酶標(biāo)板中，每孔100μl，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，37℃孵育1h，洗滌后加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃孵育1h，洗滌后加入hrp標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育1h，洗滌后加入tmb底物顯色液，37℃避光孵育15min，終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的od值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人血漿中載脂蛋白c-iii的含量為9.52mg/100ml。