本公開涉及臨床檢驗領(lǐng)域；更具體涉及一種檢測胰島素的競爭法膠乳增強免疫透射比濁試劑盒。
背景技術(shù)：
：胰島素是胰島β細胞分泌的一種激素，由51個氨基酸組成，分子量大約為6000道爾頓，是人體內(nèi)最主要的降糖激素。胰島素由a、b兩個肽鏈組成(見圖1)。其中a7(cys)-b7(cys)、a20(cys)-b19(cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使a、b兩鏈連接起來。此外a鏈中a6(cys)與a11(cys)之間也存在一個二硫鍵。胰島素對機體各種組織的代謝過程發(fā)揮著重要的影響力，是促進機體合成代謝的重要激素，在調(diào)節(jié)機體糖、脂肪、蛋白質(zhì)等能量物質(zhì)代謝上發(fā)揮著重要作用：1)安排糖分的貯藏和使用：當血糖濃度升高時，胰島素分泌增加，加速血液的糖分進入肝臟、肌肉等組織，并以糖原的形式貯藏。當血糖水平下降時，胰島素分泌減少，可以使儲存的糖原重新回到血液里為身體提供能量。2)幫助脂肪的合成和貯存：胰島素可以促進肝臟合成脂肪酸，使三酰甘油合成增多，極低密度脂蛋白合成增快。它還可以抑制脂解酶的活性，從而抑制脂肪的分解。3)幫助蛋白質(zhì)的合成：胰島素可以促使氨基酸進入組織細胞內(nèi)，使蛋白質(zhì)合成增加。胰島素還可抑制蛋白質(zhì)的分解，使組織細胞釋放入血的氨基酸減少。血液胰島素檢查可以判定糖尿病患者是1型患者還是2型患者。主要適合于沒有使用胰島素治療的患者，可在空腹及餐后2小時抽血進行測定，正常情況下空腹胰島素水平應(yīng)該為5-30μiu/ml，而餐后水平應(yīng)比空腹高出4-5倍。如果患者的胰島素水平明顯降低，就稱之為絕對缺乏，可見于1型糖尿??；如果并沒有明顯減少，而表現(xiàn)為血糖升高，就稱為相對缺乏，是因為胰島素發(fā)揮作用的環(huán)節(jié)出現(xiàn)故障，常見于存在胰島素抵抗的2型糖尿病患者。目前臨床實驗室檢測胰島素的方法均采用免疫方法，常用的方法有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、發(fā)光免疫分析法。免疫學方法是利用蛋白多肽藥物抗原決定簇部位的單克隆或多克隆抗體特異地識別被檢物，再以放射計數(shù)、比色等方法予以定量，即將特異的抗原抗體反應(yīng)配以靈敏檢測的方法。a)放射免疫分析法(immunoradiometrecassay，irma)的測定原理是：被測物先與固定相上的抗體形成復(fù)合物，再與標記(125i)抗體結(jié)合，形成夾心復(fù)合物。由于兩次識別，這就大大增加了方法的特異性，是一種靈敏度高而變異低的測定方法。不足之處在于對標記抗體的純度要求很高，同時存在放射污染；b)酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)的原理與irma相似，只是第二個抗體不是用放射性同位素標記，而是用可以與底物發(fā)生顯色反應(yīng)的酶來標記，根據(jù)酶催化反應(yīng)產(chǎn)物與胰島素之間量的比例關(guān)系來定量胰島素。與上述兩法相比，elisa具有使用壽命長，重復(fù)性好，無輻射源的優(yōu)點。但是該種方法用時較長、準確度和重復(fù)性欠佳；c)發(fā)光免疫分析法(luminescentimmunoassay，lia)一般可分為熒光、磷光和化學發(fā)光三種。利用發(fā)光分子作為示蹤劑與抗體或抗原偶聯(lián)，根據(jù)發(fā)光分子的發(fā)光強度測定被測胰島素含量。不足之處在于：一般發(fā)光不穩(wěn)定，為問斷的、閃爍性發(fā)光，而且在反應(yīng)過程中易發(fā)生裂變，導致反應(yīng)結(jié)果不穩(wěn)定；此外。檢測時需對結(jié)合相、游離相進行分離，操作步驟多，測試成本高。許多研究顯示不同檢測方法或檢測系統(tǒng)在檢測靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等方面均存在顯著差異。臨床上采用這樣的胰島素測定結(jié)果進行診斷或治療，將會帶來偏差。造成胰島素檢測結(jié)果差異的原因是多方面的，包括免疫技術(shù)差異、參考標準試劑差異、患者樣本中多種成分的干擾(尤其胰島素自身抗體等)、以及其它樣本的特殊性問題。胰島素類似物、抗胰島素抗體和異嗜性抗體等與胰島素檢測抗體的交叉反應(yīng)在不同的分析方法中差異較大。膠乳增強透射免疫比濁檢測(petia)技術(shù)是在膠乳凝集定性試驗基礎(chǔ)上發(fā)展建立的一種非放射性均相免疫測定法。該方法先將抗體(或抗原)和膠乳顆粒結(jié)合，當抗原(或抗體)與結(jié)合了抗體(或抗原)的膠乳顆粒反應(yīng)時，形成了抗原-抗體-膠乳顆粒(或抗體-抗原-膠乳顆粒)復(fù)合物，從而產(chǎn)生濁度，計算標本中抗原(或抗體)的含量。利用生化分析儀進行比濁測定，使得整個分析過程只需幾分鐘。與上述三種檢測方法相比，petia兼顧了較高的靈敏度、重復(fù)性、相關(guān)性、檢測速度快等方面的優(yōu)點，適合門急診檢測，值得臨床推廣應(yīng)用。技術(shù)實現(xiàn)要素：因此，根據(jù)本公開的一些實施方式，提供一種能檢測血液樣本中的胰島素試劑盒，具體而言涉及一種檢測胰島素的競爭法膠乳增強免疫透射比濁試劑盒。該試劑盒適于檢測血液樣本，包括血清、血漿、和全血。在一些實施方式中，提供一種檢測胰島素的競爭法膠乳增強免疫透射比濁試劑盒，其包括試劑1和試劑2，其中試劑1含有胰島素單克隆抗體、促聚劑、緩沖液；試劑2含有包被有胰島素的膠乳顆粒、多聚物、緩沖液。在本公開的一些實施方式中，胰島素單克隆抗體選自：兔抗人、雞抗人、鼠抗人單克隆抗體。在一個具體實施方式中，胰島素單克隆抗體是鼠抗人單克隆抗體。本公開的試劑盒并不限于具體的單克隆株，任何適當?shù)氖惺垡葝u素單克隆抗體、或者按本領(lǐng)域公知方法制備的單克隆抗體均可用于本公開。在一些實施方式中，試劑1中胰島素單克隆抗體濃度為0.01-0.2mg/ml，優(yōu)選0.05-0.15mg/ml，更優(yōu)選0.08-0.15mg/ml。在一個具體實施方式中，試劑1中胰島素單克隆抗體濃度為0.08mg/ml；在另一個具體實施方式中，試劑1中胰島素單克隆抗體濃度為0.15mg/ml。在一些實施方式中，試劑2中包被到膠乳顆粒上的胰島素抗原選自：豬胰島素、牛胰島素、半合成胰島素、生物合成胰島素。在一個具體實施方式中，是生物合成胰島素。生物合成胰島素是指通過生物技術(shù)人工合成的胰島素。任何適當?shù)氖惺凵锖铣梢葝u素均可用于本公開。在一些實施方式中，試劑2中所述包被有胰島素的膠乳顆粒是通過如下步驟制備的：在含有0.1至1mg/ml(優(yōu)選0.5mg/ml)edac和0.1至1mg/ml(優(yōu)選0.5mg/ml)s-nhs的10至100mm(優(yōu)選30至50mm)hepes緩沖液(ph7.2)中，將1％膠乳顆粒(w/v)于37℃活化10-30分鐘(優(yōu)選20分鐘)，向上述混合物的溶液中加入胰島素，使其濃度為0.05-0.8mg/ml，優(yōu)選0.25至0.5mg/ml，于37℃振蕩反應(yīng)1-4小時，優(yōu)選3小時，使胰島素包被至膠乳顆粒上，離心去上清，收獲包被有胰島素的膠乳顆粒。用10-100mm(優(yōu)選30至50mm)的tris緩沖液(ph6.0)重懸包被有胰島素的膠乳顆粒，冰浴超聲30分鐘。在一些實施方式中，采用化學交聯(lián)法使胰島素包被至膠乳顆粒上。在一些實施方式中，采用交聯(lián)劑edc和s-nhs使胰島素包被至膠乳顆粒上，且膠乳顆粒是羧基修飾的聚苯乙烯顆粒。在一些實施方式中，包被時膠乳顆粒的濃度范圍為0.2-1.0％(w/v)。在一些實施方式中，膠乳顆粒的粒徑范圍為100-250nm。在一個具體實施方式中，膠乳顆粒的粒徑為200nm。在一些實施方式中，試劑2中的多聚物選自peg2000、peg4000、peg6000、tween20、tween40及其組合。在一些實施方式中，試劑2中的多聚物濃度范圍為1.0-10％(w/v)。在一個具體實施方式中，多聚物濃度范圍為1.0-2.0％。在一些實施方式中，試劑1中的促聚劑選自peg2000、peg4000、peg6000、tween20、tween40及其組合；濃度范圍為1.0-10％(w/v)，優(yōu)選1.0-2％(w/v)。在一些實施方式中，試劑1和試劑2中的緩沖液可以相同，也可以不同。在一些實施方式中，試劑1和試劑2中的緩沖液獨立地選自mes、tris、mops及其組合。在一個具體實施方式中，緩沖液是mes。在另一個具體實施方式中，緩沖液是tris。在一些實施方式中，緩沖液濃度是0.10-0.3mol/l。在一些實施方式中，緩沖液濃度是0.15-0.25mol/l。在一些實施方式中，試劑1的ph范圍是5.0-8.0，優(yōu)選7.0-7.5；試劑2的ph范圍是6.0-8.5，優(yōu)選6.0-7.0。在一些實施方式中，試劑1或試劑2中還含有防腐劑，選自疊氮鈉和pc300的一種或多種。在一些實施方式中防腐劑濃度范圍在0.02-0.5％(w/v)，0.05至0.15％，優(yōu)選0.1-0.2％。在一些實施方式中，根據(jù)需要，本公開的試劑盒還可以配備有校準品。技術(shù)人員理解，校準品通常用于試劑定標。用本申請的試劑盒測量校準品，獲得讀值并繪制標準曲線。當測量樣本時，就可以將樣本的讀值在這條曲線上找到對應(yīng)的胰島素含量。因此，任何市售的適當單項或多項校準品都可用于本公開，也可以自行配制校準品。在一些實施方式中，校準品含有已知濃度的胰島素。實際上，技術(shù)人員知道最少僅需兩個點就可以確定一條直線。然而在一些實施方式中，校準品優(yōu)選涉及至少5個不同的濃度。在一個具體實施方式中，當用于檢測血清時，校準品為血清基質(zhì)，并含有濃度分別為400uiu/ml、150uiu/ml、70uiu/ml、20uiu/ml、10uiu/ml、0uiu/ml的胰島素以及(w/v)0.01-0.5％的疊氮鈉。在一個具體實施方案中，提供一種檢測胰島素的競爭法膠乳增強免疫透射比濁試劑盒，其包含試劑1、試劑2和校準品，試劑1包含：0.08mg/ml單克隆抗體，其為鼠抗人抗體，效價大于1:30000，具有高親和性，tris緩沖液0.20mol/lph＝7.5，tween401.5％(w/v)，nan30.2％(w/v)，試劑2包含：tris緩沖液0.25mol/lph＝6.0，包被有胰島素的膠乳顆粒200nm，0.45％(w/v)，其中胰島素相當于0.35mg/ml，其為生物合成胰島素，peg40002.0％(w/v)校準品：血清基質(zhì)，濃度分別為400、150、70、20、10、0uiu/ml。在另一個具體實施方案中，提供一種檢測胰島素的競爭法膠乳增強免疫透射比濁試劑盒，其包含試劑1、試劑2和校準品，試劑1包含：mes緩沖液0.15mol/lph＝7.0，單克隆抗體0.15mg/ml，其為鼠抗人抗體，效價大于1:20000，具有高親和性，peg20001.0％(w/v)，nan30.1％(w/v)，試劑2包含：mes緩沖液0.25mol/lph＝6.0，包被有胰島素的膠乳顆粒250nm，0.90％(w/v)，其中胰島素的濃度為0.55mg/ml，其為生物合成胰島素，tween202.0％(w/v)校準品：血清基質(zhì)，濃度分別為400、150、70、20、10、0uiu/ml。在一些實施方案中，提供了一種制備包被有胰島素的膠乳顆粒的方法，包括步驟：1)在含有0.1至1mg/ml(優(yōu)選0.5mg/ml)edac和0.1至1mg/ml(優(yōu)選0.5mg/ml)s-nhs的10至100mmhepes緩沖液中將膠乳顆粒于37℃活化10至30分鐘，2)向步驟1)所得的溶液中加入胰島素，使其濃度為0.05-0.8mg/ml，3)于37℃振蕩反應(yīng)1至4小時優(yōu)選3小時，使胰島素包被至所述膠乳顆粒上，4)離心去上清，收獲包被有胰島素的膠乳顆粒。在一些實施方式中，所述的胰島素單克隆抗體選自：兔抗人、雞抗人、鼠抗人單克隆抗體；優(yōu)選胰島素單克隆抗體是鼠抗人單克隆抗體。在一些實施方式中，胰島素選自：豬胰島素、牛胰島素、半合成胰島素、生物合成胰島素；優(yōu)選生物合成胰島素。在一些實施方式中，所述的胰島素單克隆抗體效價大于1:30000。在一些實施方式中，膠乳顆粒的粒徑為100nm至250nm，優(yōu)選200nm。在一些實施方式中，包被反應(yīng)時，膠乳顆粒的濃度范圍按w/v計為0.2至1.0％，優(yōu)選1％。在一些實施方式中，提供一種包被有胰島素的膠乳顆粒，其是通過本公開的方法制備所得的。在一些實施方式中，提供本公開的包被有胰島素的膠乳顆粒在制備檢測試劑中的用途。在一些實施方式中，檢測試劑是膠乳增強免疫透射比濁試劑。在一些實施方式中，檢測試劑是用于檢測胰島素的試劑。附圖說明圖1：胰島素結(jié)構(gòu)。圖2：本公開胰島素試劑盒1的定標曲線。圖3：本公開胰島素試劑盒1與國外化學發(fā)光試劑盒檢測血清測定結(jié)果的相關(guān)圖。橫坐標為uiu/ml；縱坐標為吸光度。圖4：本公開胰島素試劑盒1與國外化學發(fā)光試劑盒檢測血漿測定結(jié)果的相關(guān)圖。橫坐標為uiu/ml；縱坐標為吸光度。具體實施方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本公開精神的情況下，可以對本公開做出許多修改，這樣的修改也落入本公開的范圍。實施例實施例1：包被有胰島素的膠乳顆粒的制備方法在含有0.5mg/mledac(購自merck)和0.5mg/mls-nhs(購自merck)的10ml的50mmhepes緩沖液(ph7.2)中將1％濃度的膠乳顆粒(粒徑200nm或250nm，購自jsr，表面羧基修飾)于37℃活化20分鐘，向上述溶液中加入胰島素(購自fitzgerald)，使其濃度達到0.25mg/ml，在37℃，振蕩反應(yīng)3小時，使胰島素包被至膠乳顆粒上，離心去上清，收獲包被有胰島素的膠乳顆粒。用50mm的tris緩沖液(ph6.0)重懸包被有胰島素的膠乳顆粒，冰浴超聲30分鐘后儲存?zhèn)溆?。實施?：胰島素試劑盒1的制備1.試劑1的制備：按照如下組成配制試劑1：單克隆抗體0.08mg/ml，鼠抗人，效價>1:30000(購自：fitzgerald)tris緩沖液0.20mol/lph＝7.5，tween401.5％(w/v)，nan30.2％(w/v)。2.試劑2的制備：按照如下組成配制試劑2：tris緩沖液0.25mol/l，ph＝6.0，實施例1所制備的膠乳顆粒0.45％(w/v)peg40002.0％(w/v)，3.校準品的制備：人血清基質(zhì)，添加胰島素(購自fitzgerald)濃度別為400、150、70、20、10、0uiu/ml，以及0.09％(w/v)的疊氮鈉。實施例3.胰島素試劑盒2的制備1.試劑1的制備：按照如下組成配制試劑1：單克隆抗體0.15mg/ml，鼠抗人，效價>1:30000(購自：fitzgerald)mes緩沖液0.15mol/l，ph＝7.0，peg20001.0％(w/v)，nan30.1％(w/v)；2.試劑2的制備：按照如下組成配制試劑2：mes緩沖液0.25mol/l，ph＝6.0，實施例1所制備的膠乳顆粒0.90％(w/v)tween202.0％(w/v)。3.校準品的制備：正常人血清基質(zhì)，添加胰島素(購自fitzgerald)濃度別為400、150、70、20、10、0uiu/ml，以及0.09％(w/v)的疊氮鈉。測試例測試例1.標準曲線的繪制試劑盒1采用奧林巴斯au400定標曲線，結(jié)果見圖2。表1：吸光度濃度(uiu/ml)吸光度a400685150150070312520561310687207900測試例2：本申請試劑盒1的靈敏度性能評價儀器：奧林巴斯au400，化學發(fā)光儀。表2：參數(shù)設(shè)置對照試劑盒：雅培胰島素檢測試劑(化學發(fā)光法)檢測原理：胰島素的測定是一種直接化學發(fā)光技術(shù)和雙抗體兩點夾心免疫分析法相結(jié)合的測定方法。第一體稱為標識抗體，是由單克隆抗胰島素抗體標記吖啶酯形成的；第二抗體稱為固相化抗體，是由單克隆抗胰島素抗體以共價鍵的方式與順磁性顆粒相結(jié)合形成的。血清中的胰島素與相應(yīng)抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后產(chǎn)生光量子，其光量子數(shù)的多少與血清中胰島素的濃度成正比，經(jīng)標準曲線即可求得血清胰島素的濃度水平。檢測過程：取血清于樣品杯中，置全自動化學發(fā)光免疫分析儀上，調(diào)整好檢測參數(shù)：血清25μl+第一試劑50μl于37℃孵育5min，加第二試劑250μl于37℃孵育2.5min，用蒸餾水對反應(yīng)杯進行分離、抽吸、清洗，最后分別加300μl酸試劑和堿試劑到反應(yīng)系統(tǒng)中進行反應(yīng)發(fā)光，讀取光量子數(shù)，再根據(jù)標準曲線，計算出結(jié)果。標準曲線制備：采用兩點定標法，將標準血清0.0uiu/ml和138.0uiu/ml安放于儀器的定標位置上，編入測定程序，上機測定自動打印出標準曲線。測試例3：靈敏度評價將濃度合適的血清用去離子水稀釋，使某一濃度接近靈敏度限制，每天檢測兩次，持續(xù)10天，記錄原始數(shù)據(jù)，如下表進行計算。(1)試劑盒1靈敏度性能評價，結(jié)果見表3。表3：試劑盒1靈敏度測值天數(shù)濃度一濃度二濃度三11.632.273.6121.192.383.4931.422.113.6841.292.243.2951.332.413.5661.542.333.6271.462.243.4981.392.013.6791.552.153.46101.222.033.34均值1.402.223.52sd0.150.140.13cv(％)10.436.283.77(2)對照試劑盒靈敏度評價，結(jié)果見表4。表4：對照試劑盒靈敏度測值天數(shù)濃度一濃度二濃度三11.022.093.7221.211.913.3831.291.893.6741.012.233.4150.952.013.3961.542.113.6471.692.313.5180.932.353.3891.552.463.69101.342.033.26均值1.252.143.51sd0.280.190.16cv(％)21.978.974.65評價標準：日間的cv小于20％結(jié)論：本公開的檢測胰島素的檢測試劑盒1的靈敏度是1.40uiu/ml，對照試劑盒的靈敏度為2.14uiu/ml，本公開試劑盒1的靈敏度優(yōu)于對照試劑盒的靈敏度。測試例4.本申請試劑盒1的相關(guān)性(血清樣本)試劑、校準品、參數(shù)均同上；對照試劑為雅培胰島素檢測試劑(化學發(fā)光法)；樣本為血清。表5：檢測數(shù)據(jù)對所獲得的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性作圖，結(jié)果見圖3。對照試劑檢測2.14uiu/ml以下的血清樣本時有時會出現(xiàn)負值；自配試劑與進口試劑的相關(guān)系數(shù)大于0.99，具有良好的相關(guān)性。測試例5：本申請試劑盒1的相關(guān)性(血漿樣本)試劑、校準品、參數(shù)均同上；對照試劑為雅培胰島素檢測試劑(化學發(fā)光法)；樣本為血漿。表6：檢測數(shù)據(jù)樣本編號試劑盒1對照試劑樣本編號試劑盒1對照試劑131282133292171622222632.331.562326244124120241614511212125283162422267.315.977171527877986.586.79285451924212919221031343010111155315.575.011221.51325451133836332125146765342.581.25153332351413163.251.89362122175655372.361.25182423381.58-0.25199697398.528.12202825409.259.25對所獲得的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性作圖，結(jié)果見圖4。對照試劑檢測2.14uiu/ml以下的血漿樣本時有時會出現(xiàn)負值；自配試劑與進口試劑的相關(guān)系數(shù)大于0.99，具有良好的相關(guān)性。測試例6：本申請胰島素試劑盒2的組分及其測試結(jié)果將試劑盒2按照上述測試例3-5的方法進行檢測，結(jié)果表明其在靈敏度、相關(guān)性性能方面與試劑盒1均類似。表7：試劑盒2靈敏度測值天數(shù)濃度一濃度二濃度三11.232.353.6521.292.283.5831.222.243.6841.182.253.4451.282.443.6761.442.183.4971.522.253.4581.292.183.4791.452.063.58101.322.073.38均值1.322.233.54sd0.110.120.11cv(％)8.455.213.02表8：血清檢測數(shù)據(jù)樣本編號試劑盒2對照試劑樣本編號試劑盒2對照試劑1282721282921716222324314152328284252424151653826253030665266.586.5479392272.051.01810794281281209656029117123101001023022251131.51311818122224326.596.55135154334.024147879343.552.2215254249353.071.8916365334361.07-0.09174.174.16372.04-0.02181312381.05-1.23192727391.08-0.07203030400.58-0.28表9：血漿檢測數(shù)據(jù)樣本編號試劑盒2對照試劑樣本編號試劑盒2對照試劑130282132292181622252632.451.562328244118120241414511812125303162222266.585.977151527787986.666.7928525192221292022103534309111165315.655.01122.051.51325251133536332225146865342.681.25153132351313163.581.89362222175455372.581.25182323381.44-0.25199597398.688.12202525409.149.25本公開采用競爭免疫反應(yīng)，由于采用膠乳增強法使單克隆抗體與已經(jīng)結(jié)合到膠乳顆粒上的胰島素反應(yīng)形成的結(jié)合物體積較大，在特定波長下吸光度能夠明顯變化。血清或血漿中胰島素的存在形成競爭，造成包被于膠乳顆粒的胰島素與單克隆抗體結(jié)合減少，特定波長下濁度降低，待測胰島素的細微變化都能導致吸光度的明顯變化。所以本試劑盒的另一顯著特點是靈敏度高，能夠靈敏的反映出待測血清或血漿胰島素的含量。市場上有多種免疫透射比濁方法的試劑盒，但是不能應(yīng)用于生化分析儀，檢測時間相對較長，影響檢測結(jié)果的及時性。本公開采用競爭法膠乳增強免疫透射比濁法，適用于生化分析儀。所以本試劑盒的一個特點是縮短檢測時間，提高檢測速度。當前第1頁12