本申請是申請日為2012年9月4日、申請?zhí)枮?01280053386.1、發(fā)明名稱為“檢測過敏原的系統(tǒng)和方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。

本發(fā)明一般來說涉及使用質(zhì)譜對試樣(例如食物試樣)中的過敏原進行檢測和定量的試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

食物過敏可誘發(fā)有害免疫反應(yīng)，例如，如皮炎、哮喘、胃腸損傷、過敏性休克等。用于對食物試樣中的過敏原進行檢測和/或定量的常規(guī)方法一般采用免疫分析，其可具有許多缺點。例如，一種稱作酶聯(lián)免疫吸附分析(elisa)的此類方法需要使用昂貴的試劑盒并且最多進行半定量。另外，常規(guī)免疫分析在每次篩選中一般限于單一過敏原并且因缺乏特異性而頻繁地造成假陽性。

因此，所屬領(lǐng)域內(nèi)需要對食物試樣中的過敏原進行檢測和定量的改進的試劑盒和方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)各實施例，本文提供使用質(zhì)譜對試樣中的過敏原進行檢測和/或定量的方法和試劑盒。如下文所述，這些方法和試劑盒可使得能夠通過利用所關(guān)注過敏原所特有的一種或一種以上氨基酸序列來對試樣中的至少一種過敏原(例如，卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低分子量麥谷蛋白、小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果，包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)進行檢測和/或定量。例如，可使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來檢測過敏原特有的胰蛋白酶肽。在許多實施例中，可觀察每一肽中的所選多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)轉(zhuǎn)換以使得能夠?qū)缡澄镌嚇又械倪^敏原進行可靠定量。

根據(jù)各實施例，揭示各種過敏原所特有的一組肽。例如，可使用所述過敏原所特有的經(jīng)分離肽來對過敏原卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(同種型s1和s2)、乳球蛋白、含有高和低分子量麥谷蛋白的谷蛋白、小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果中的每一者進行檢測和/或定量。在一些情況下，這些過敏原術(shù)語為廣泛定義，其涵蓋來自不同蛋白質(zhì)的各種類型的肽且在一些情況下涵蓋不同屬和/或種的過敏原。例如，術(shù)語芥子涵蓋從蕓苔屬(brassica)和芥屬(sinapis)兩者中的種獲得的過敏原，這兩個屬均應(yīng)理解為芥子的形式。舉例來說，在雞卵中發(fā)現(xiàn)的過敏原卵白蛋白所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seqidno:1-7中的一者或一者以上。也在雞卵中發(fā)現(xiàn)的過敏原溶菌酶所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seqidno:8-11中的一者或一者以上。牛乳蛋白質(zhì)酪蛋白s1所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.12-18中的一者或一者以上。牛乳蛋白質(zhì)酪蛋白另一同種型酪蛋白s2所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.24-29中的一者或一者以上。大麥蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.30-33中的一者或一者以上。低分子量麥谷蛋白所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.34-59中的一者或一者以上。高分子量麥谷蛋白所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.60-79中的一者或一者以上。歸類為芥子的各物種的蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.80-112中的一者或一者以上。燕麥蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.113-116中的一者或一者以上。黑麥蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.117-123中的一者或一者以上。芝麻蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.124-132中的一者或一者以上。小麥蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.133-138中的一者或一者以上。巴西堅果蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.139-155中的一者或一者以上。榛子蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.156-172中的一者或一者以上。澳大利亞堅果蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.173-181中的一者或一者以上?；ㄉ鞍踪|(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.182-187中的一者或一者以上。阿月渾子堅果蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno.188-203中的一者或一者以上并且最后核桃蛋白質(zhì)所特有的經(jīng)分離肽可具有氨基酸序列seq.idno204-212中的一者或一者以上。

上述肽中的每一者可使用與每一過敏原特有肽相關(guān)的特定mrm轉(zhuǎn)換來檢測和/或定量。根據(jù)各實施例，每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文論述于表1-19中。

在一個方面中，提供篩選試樣中的過敏原的方法。所述方法包括獲得試樣和用至少一種蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)消化所述試樣以將所述試樣中存在的至少一種過敏原(如果有)片段化成多種肽。所述過敏原可為以下蛋白質(zhì)中的至少一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麥谷蛋白和從小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種類型的堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)獲得的蛋白質(zhì)。所述方法另外包括通過使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)測定至少一種肽的量來對至少一種過敏原進行定量。多種肽中的至少一者具有如序列表中所顯示的氨基酸序列seqidno:1-212，所述序列的全部內(nèi)容以引用方式并入本文中。

在一些實施例中，上述過敏原中的兩者或兩者以上是通過經(jīng)由lc-ms/ms檢測多種肽(例如上文所論述的那些)來檢測和/或定量，其中對于每一肽片段來說，監(jiān)測多個mrm轉(zhuǎn)換，例如上文所論述的那些。已發(fā)現(xiàn)過敏原(例如，卵蛋白質(zhì)(例如卵白蛋白)、溶菌酶或牛乳蛋白質(zhì)(例如酪蛋白和乳球蛋白)、高和低麥谷蛋白、從小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果獲得的蛋白質(zhì))的精確鑒別和/或定量可通過使用lc-ms/ms對過敏原的一組特有肽(例如本文所揭示的那些)的至少一種且優(yōu)選若干種(例如，全部)和每一肽的特定mrm轉(zhuǎn)換(例如本文所揭示的那些)進行監(jiān)測和定量來完成。

在一個實施例中，可監(jiān)測多種肽中的每一者的至少一個所選mrm轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測所述肽中的每一者的兩個、三個或任一其它數(shù)量的mrm轉(zhuǎn)換。在一個實施例中，可例如使用相同輪次的串聯(lián)質(zhì)譜儀來對兩種或兩種以上過敏原進行檢測和/或定量。在另一實施例中，測定兩種或兩種以上肽的的量以對所關(guān)注過敏原進行定量。

在一些實施例中，所述方法可包含在消化所述試樣之前添加已知量的以下蛋白質(zhì)中的至少一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麥谷蛋白、來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻、澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子的蛋白質(zhì)。例如，可在消化試樣之前將已知量的卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白和乳球蛋白中的每一者添加到所述試樣。

本文還揭示檢測試樣中的卵白蛋白的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分卵白蛋白(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:1-7的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對卵白蛋白的所選肽進行檢測和/或定量。例如，可監(jiān)測一個所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:1-7的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表1中。可通過lc-ms/ms來監(jiān)測卵白蛋白的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的溶菌酶的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分溶菌酶(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:8-11的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對溶菌酶的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:8-11的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表2中?？赏ㄟ^lc-ms/ms來監(jiān)測溶菌酶的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的酪蛋白(例如，酪蛋白同種型s1或s2)的方法。在一個實施例中，所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分酪蛋白同種型s1(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:12-18的肽。在另一實施例中，所述方法可包括將蛋白水解酶添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分酪蛋白同種型s2(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:19-23的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對酪蛋白的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:12-23的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表3或4中?？赏ㄟ^lc-ms/ms來監(jiān)測酪蛋白的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的乳球蛋白的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分乳球蛋白(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:24-29的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對乳球蛋白的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:24-29的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表5中。可通過lc-ms/ms來監(jiān)測乳球蛋白的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的大麥的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分大麥蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:30-33的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對大麥蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:30-33的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表6中。可通過lc-ms/ms來監(jiān)測大麥的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的高和低分子量麥谷蛋白的方法。在一個實施例中，所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分高或低分子量麥谷蛋白(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:34-79的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對低或高分子量麥谷蛋白的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:34-79的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表7和8中。可通過lc-ms/ms來監(jiān)測高或低分子量谷蛋白的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測高或低分子量麥谷蛋白的一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的芥子的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分芥子蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:80-112的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對芥子蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:80-112的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表9中?？赏ㄟ^lc-ms/ms來監(jiān)測芥子的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的燕麥的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分燕麥蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:113-116的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對燕麥蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:113-116的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表10中。可通過lc-ms/ms來監(jiān)測燕麥的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的黑麥的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分黑麥蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:117-123的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對黑麥蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:117-123的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表11中?？赏ㄟ^lc-ms/ms來監(jiān)測黑麥的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的芝麻的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分芝麻蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:124-132的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對芝麻蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:124-132的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表12中?？赏ㄟ^lc-ms/ms來監(jiān)測芝麻的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的小麥的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分小麥蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:133-138的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對小麥蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:133-138的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表13中?？赏ㄟ^lc-ms/ms來監(jiān)測小麥的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的巴西堅果的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分巴西堅果蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:139-155的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對巴西堅果蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:139-155的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表14中?？赏ㄟ^lc-ms/ms來監(jiān)測巴西堅果的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的榛子的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分榛子蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:156-172的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對榛子蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:156-172的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表15中。可通過lc-ms/ms來監(jiān)測榛子的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的澳大利亞堅果的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分澳大利亞堅果蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:173-181的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對澳大利亞堅果蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:173-181的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表16中。可通過lc-ms/ms來監(jiān)測澳大利亞堅果的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的花生的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分花生蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:182-187的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對花生蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:182-187的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表17中?？赏ㄟ^lc-ms/ms來監(jiān)測花生的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的阿月渾子堅果的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分阿月渾子堅果蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:188-203的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對阿月渾子堅果蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:188-203的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表18中。可通過lc-ms/ms來監(jiān)測阿月渾子堅果的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

本文還揭示檢測試樣中的核桃的方法。所述方法可包括將蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)添加到試樣以將試樣中存在的至少一部分核桃蛋白質(zhì)(如果有)裂解成多種肽，所述肽具有至少一種具有氨基酸序列seqidno:203-212的肽。然后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來測定所述至少一種肽是否在所述試樣中。

在一個方面中，可監(jiān)測所選mrm轉(zhuǎn)換以對核桃蛋白質(zhì)的所選肽進行檢測或定量。例如，可監(jiān)測所選前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。對應(yīng)于seqidno:203-212的每一肽的優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換在下文提供于表19中。可通過lc-ms/ms來監(jiān)測核桃的肽的任一數(shù)量的優(yōu)化轉(zhuǎn)換。例如，可監(jiān)測一個、兩個、三個或任選地所有優(yōu)化mrm轉(zhuǎn)換。

在一些實施例中，上述方法可利用氨基酸序列與所選肽相同的至少一種同位素富集肽來校準(zhǔn)所述肽的定量。在一些實施例中，可利用具有已知濃度的所選肽的標(biāo)準(zhǔn)物來校準(zhǔn)所選肽的定量。在一些實施例中，可在添加蛋白水解酶之前將已知量的所關(guān)注過敏原(例如，卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麥谷蛋白或來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì))添加到試樣以校準(zhǔn)所選所關(guān)注的肽和/或蛋白質(zhì)的定量。在一些實施例中，可在添加蛋白水解酶之前將已知量的以下蛋白質(zhì)中的每一者添加到試樣：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麥谷蛋白、來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)。

試樣可來自多種來源。在一個實施例中，例如，試樣可為食物試樣。

在另一實施例中，所述方法包含監(jiān)測至少一個具有與選自由以下組成的群組的特定氨基酸序列相關(guān)的指定m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換：i)seqidno:113，m/z值為約989/998、989/1085或989/1234；ii)seqidno:114，m/z值為約777/984、777/1112或777/1226；iii)seqidno:115，m/z值為約627/642或627/1013；iv)seqidno:116，m/z值為約419/642。

在又一實施例中，所述方法包含監(jiān)測至少一個具有與選自由以下組成的群組的特定氨基酸序列相關(guān)的指定m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換：i)seqidno:124，m/z值為約465/472、465/728或465/815；ii)seqidno:125，m/z值為約397/679、397/417或397/580；iii)seqidno:126，m/z值為約717/743、717/957或717/372；iv)seqidno:127，m/z值為約380/589、380/476或380/377；v)seqidno:128，m/z值為約419/522、419/637或419/409；vi)seqidno:129，m/z值為約582/795、582/866或582/980；vii)seqidno:130，m/z值為約806/869、806/1070或806/957；viii)seqidno:132，m/z值為約685/901、685/1089或685/1238。

在又一實施例中，所述方法包含監(jiān)測至少一個具有與選自由以下組成的群組的特定氨基酸序列相關(guān)的指定m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換：i)seqidno:156，m/z值為約582/666、582/852或582/999；ii)seqidno:157，m/z值為約514/729、514/800或514/914；iii)seqidno:158，m/z值為約882/1033、882/580或882/806；iv)seqidno:159，m/z值為約567/449、567/684或567/799；v)seqidno:160，m/z值為約539/763、539/948或539/635；vi)seqidno:161，m/z值為約374/619、374/490或374/304；vii)seqidno:162，m/z值為約576/689、576/852或576/588；viii)seqidno:163，m/z值為約721/900、721/1014或721/484；ix)seqidno:164，m/z值為約502/703、502/816或502/575；x)seqidno:165，m/z值為約807/874、807/988或807/1089；xi)seqidno:166，m/z值為約700/984、700/464或700/365；xii)seqidno:167，m/z值為約679/841、679/600或679/713；xiii)seqidno:168，m/z值為約815/906、815/835或815/724；xiv)seqidno:169，m/z值為約424/589、424/718或424/488；xv)seqidno:170，m/z值為約601/973、601/616或601/731；xvi)seqidno:171，m/z值為約791/935或791/1212；和xvii)seqidno:172，m/z值為約528/614。

在又一實施例中，所述方法包含監(jiān)測至少一個具有與選自由以下組成的群組的特定氨基酸序列相關(guān)的指定m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換：i)seqidno:173，m/z值為約729/921或729/1050；ii)seqidno:174，m/z值為約438/626或438/725；iii)seqidno:175，m/z值為約585/892或585/763；iv)seqidno:176，m/z值為約545/821或545/952；v)seqidno:177，m/z值為約537/786或537/935；vi)seqidno:178，m/z值為約493/743或493/580；vii)seqidno:179，m/z值為約344/500或344/401；viii)seqidno:180，m/z值為約392/566或392/437；和ix)seqidno:181，m/z值為約500/743或500/580。

在又一實施例中，所述方法包含監(jiān)測至少一個具有與選自由以下組成的群組的特定氨基酸序列相關(guān)的指定m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換：i)seqidno:188，m/z值為約397/515、397/572或397/416；ii)seqidno:189，m/z值為約518/556或518/797；

iii)seqidno:190，m/z值為約802/1078、802/802或802/931；iv)seqidno:191，m/z值為約746/1157、746/941或746/683；v)seqidno:192，m/z值為約569/821、569/557、569/658；vi)seqidno:193，m/z值為約713/1012或713/470；vii)seqidno:194，m/z值為約502/703、502/816或502/575；

viii)seqidno:195，m/z值為約479/680、479/809或479/381；ix)seqidno:196，m/z值為約702/790、702/904或702/1088；x)seqidno:197，m/z值為約838/1020、838/835或838/906；xi)seqidno:198，m/z值為約961/1027、961/899或961/671；xii)seqidno:199，m/z值為約790/1054、790/492或790/925；xiii)seqidno:200，m/z值為約777/694、777/807或777/579；xiv)seqidno:201，m/z值為約279/500或279/274；xv)seqidno:202，m/z值為約837/1080、837/966、837/753；和xvi)seqidno:203，m/z值為約598/747、598/848、598/634。

在又一實施例中，所述方法包含監(jiān)測至少一個具有與選自由以下組成的群組的特定氨基酸序列相關(guān)的指定m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換：i)seqidno:204，m/z值為約813/1142；ii)seqidno:205，m/z值為約805/900、805/623或805/345；iii)seqidno:206，m/z值為約698/820、698/949或698/461；iv)seqidno:207，m/z值為約683/1136、683/796、683/925、683/1039或683/569；v)seqidno:208，m/z值為約515/729、515/487或515/616；vi)seqidno:209，m/z值為約955/692、955/905或955/577；vii)seqidno:210，m/z值為約502/703、502/816或502/575；viii)seqidno:211，m/z值為約792/904或792/1017；ix)seqidno:212，m/z值為約529/1017。

本文還揭示用于質(zhì)譜測試試樣中的過敏原的試劑盒。所述試劑盒可包括至少一種用于將試樣中存在的至少一種過敏原(如果有)片段化成多種肽的蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶)。過敏原可例如為卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低分子量麥谷蛋白、來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)，并且多種肽中的至少一者可為具有氨基酸序列seqidno:1-212的肽。試劑盒還可包括至少一種使用質(zhì)譜儀對所述多種肽中的至少一者的試劑進行定量。

在一個方面中，用于對多種肽中的至少一者進行定量的試劑可為氨基酸序列與多種肽中的一者相同的同位素富集肽。在一個實施例中，同位素富集肽可包括例如c13或n15中的至少一者。在另一方面中，用于對至少一種所述多種肽進行定量的試劑可包括所選濃度的用于校準(zhǔn)質(zhì)譜儀的多種肽中的至少一者。在一些實施例中，用于對至少一種所述多種肽進行定量的試劑可包含用于校準(zhǔn)質(zhì)譜儀的以下蛋白質(zhì)中的至少一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低分子量麥谷蛋白、來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)。例如，試劑盒可包括已知量的以下蛋白質(zhì)中的每一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低分子量麥谷蛋白、來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)。在其它實施例中，僅包括一些過敏原。

試劑盒可另外包括用于制備將使用質(zhì)譜儀分析的試樣、運行所制備的試樣穿過lc柱或執(zhí)行質(zhì)譜的各種試劑。作為非限制性實例，試劑盒可包括例如將用作標(biāo)準(zhǔn)物的以下蛋白質(zhì)中的一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麥谷蛋白、來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)。試劑盒還可包括烷基化劑(例如，甲烷硫代磺酸甲酯(mmts)、碘乙酰胺)和/或還原劑。

在一個方面中，試劑盒可包括關(guān)于使用質(zhì)譜儀對至少一種過敏原進行定量的說明書。舉例來說，試劑盒可包括關(guān)于待用作質(zhì)譜儀中的設(shè)置的轉(zhuǎn)換對或所預(yù)計片段離子的信息。

根據(jù)不同方面，提供可控制過程和/或執(zhí)行本文所述的計算的軟件。例如，所述軟件可向質(zhì)譜儀提供指令以監(jiān)測一個或一個以上特定前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換或片段離子。

具體實施方式

所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本文所述的方法和試劑盒是非限制性實例性實施例并且申請者揭示內(nèi)容的范圍僅由權(quán)利要求書界定。盡管結(jié)合各實施例對申請者的教示內(nèi)容進行了說明，但并不打算將申請者的教示內(nèi)容限定于所述實施例。相反，申請者的教示內(nèi)容涵蓋各種替代、修改和等效形式，如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所應(yīng)了解。結(jié)合一個實例性實施例說明或描述的特征可與其它實施例的特征組合使用。所述修改和變化形式打算包括在申請者的揭示內(nèi)容的范圍內(nèi)。

根據(jù)各實施例，提供使用質(zhì)譜通過檢測一種或一種以上所關(guān)注過敏原所特有的氨基酸序列來篩選試樣中以下蛋白質(zhì)的存在或量的方法：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(同種型s1和s2)、乳球蛋白、高或低麥谷蛋白和來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子的蛋白質(zhì))。例如，可使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)來檢測過敏原特有肽?？捎^察每一肽中的所選mrm轉(zhuǎn)換以使得能夠?qū)υ嚇又械倪^敏原進行定量。

所述方法可利用所屬領(lǐng)域內(nèi)已知的多種質(zhì)譜技術(shù)。例如，質(zhì)譜技術(shù)可為串聯(lián)質(zhì)譜(ms/ms)技術(shù)和/或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)技術(shù)。在一些實施例中，所述技術(shù)包含lc-ms/ms技術(shù)和使用三相四極儀器和多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)。

根據(jù)一些實施例，所述方法可包含通過檢測卵白蛋白所特有的至少一種經(jīng)分離肽(例如，一種或一種以上具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:1-7的肽)來對試樣中的卵白蛋白進行檢測和/或定量。例如，lc-ms/ms可用于測定試樣中卵白蛋白特有肽的存在和/或量。在一個實例性實施例中，三相四極質(zhì)譜儀可用于監(jiān)測所選多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)轉(zhuǎn)換。在一些實施例中，卵白蛋白特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:1，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約391/504、391/667或391/433的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換，其中如本文所使用的術(shù)語“約”意指在+/-一(1)原子質(zhì)量單位范圍內(nèi)。在其它實施例中，卵白蛋白特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:2，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約762/1036、762/487、762/1150的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，卵白蛋白特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:3，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約605/419、605/621或605/749的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，卵白蛋白特有肽可具有氨基酸序列seqidno:4，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約673/1096、673/1024、673/1209、449/526、449/608或449/639的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，卵白蛋白特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:5，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約791/1052、791/951或791/1239的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，卵白蛋白特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:6，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約844/666、844/1332或844/1121的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，卵白蛋白特有肽可具有氨基酸序列seqidno:7，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約930/1017、930/1118、930/1303或930/888的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

在一個實例性實施例中，所述方法可包括監(jiān)測與每一卵白蛋白特有肽相關(guān)的多個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。舉例來說，具有氨基酸序列seqidno:1的卵白蛋白特有肽可通過監(jiān)測具有約391/504、391/667或391/433的m/z值的任兩個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換來鑒別。在一個實施例中，可監(jiān)測所有三個所鑒別的前體-產(chǎn)物離子對。

在一個實施例中，對試樣中的卵白蛋白進行檢測或定量的方法可包括檢測多種卵白蛋白特有肽。作為非限制性實例，卵白蛋白可通過使用具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:1-7的肽的任一組合或全部來定量。如上文所論述，對于每一肽來說，可監(jiān)測一個或一個以上前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

下表1顯示根據(jù)申請者的教示內(nèi)容測定為卵白蛋白所特有的肽的序列seqidno:1-7，以及其最佳mrmq1,q3轉(zhuǎn)換。根據(jù)各實施例，這些觀察的肽和轉(zhuǎn)換可用于使得能夠?qū)υ嚇又写嬖诘穆寻椎鞍走M行可靠定量。卵白蛋白所特有的額外mrm轉(zhuǎn)換顯示于附錄a、b和d中，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文中。

在下表中，片段離子具有對電荷以及常規(guī)片段化命名的引用。例如，標(biāo)記2y4將指示帶雙電荷并且為y4片段(來自c-末端的4個單元)的片段。同樣，標(biāo)記2b4將指示帶雙電荷并且為b4片段(來自n-末端的4個單元)的片段。這些命名規(guī)則為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知。

表1

根據(jù)一些實施例，所述方法可包含通過檢測溶菌酶所特有的至少一種經(jīng)分離肽(例如，一種或一種以上具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:8-11的肽)來對試樣中的溶菌酶進行檢測和/或定量。例如，三相四極質(zhì)譜儀可用于監(jiān)測所選多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)轉(zhuǎn)換以測定試樣中溶菌酶特有肽的存在和/或量。在一些實施例中，溶菌酶特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:8，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約438/737、438/452或438/680的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，溶菌酶特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:9，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約497/621、497/847或497/807的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，溶菌酶特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:10，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約715/804、715/951或715/1065的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，溶菌酶特有肽可具有氨基酸序列seqidno:11，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約878/901、878/1064或878/1178的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

在一個實例性實施例中，所述方法可包括監(jiān)測與每一溶菌酶特有肽相關(guān)的多個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。舉例來說，具有氨基酸序列seqidno:8的溶菌酶特有肽可通過監(jiān)測具有約438/737、438/452或438/680的m/z值的任兩個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換來鑒別。在一個實施例中，可監(jiān)測所有三個所鑒別的前體-產(chǎn)物離子對。

在一個實施例中，對試樣中的溶菌酶進行檢測或定量的方法可包括檢測多種溶菌酶特有肽。作為非限制性實例，溶菌酶可通過使用具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:8-11的肽的任一組合或全部來定量。如上文所論述，對于每一肽來說，可監(jiān)測一個或一個以上前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

下表2顯示根據(jù)本教示內(nèi)容測定為溶菌酶所特有的肽的序列seqidno:8-11，以及其最佳mrmq1,q3轉(zhuǎn)換。根據(jù)各實施例，這些觀察的肽和轉(zhuǎn)換可用于使得能夠?qū)υ嚇又写嬖诘娜芫高M行可靠定量。溶菌酶所特有的額外mrm轉(zhuǎn)換顯示于附錄a、b和d中，其在此處以引用方式并入其表2中。

表2

根據(jù)一些實施例，所述方法可包含通過檢測酪蛋白所特有的至少一種經(jīng)分離肽(例如，一種或一種以上具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:12-23的肽)來對試樣中的酪蛋白進行檢測和/或定量。例如，所述方法可包含通過檢測酪蛋白s1所特有的經(jīng)分離肽(例如，一種或一種以上具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:12-18的肽)來對試樣中的酪蛋白s1同種型進行檢測和/或定量。舉例來說，三相四極質(zhì)譜儀可用于監(jiān)測所選多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)轉(zhuǎn)換以測定試樣中酪蛋白s1特有肽的存在和/或量。在一些實施例中，酪蛋白s1特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:12，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約693/921、693/992或693/1091的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，酪蛋白s1特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:13，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約584/763、584/706、584/650或438/600的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，酪蛋白s1特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:14，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約416/488、416/587或416/702的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，酪蛋白s1特有肽可具有氨基酸序列seqidno:15，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約634/992、634/771或634/934的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，酪蛋白s1特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:16，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約880/1325、880/1495、880/1438、880/436、587/758、587/871或587/790的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，酪蛋白s1特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:17，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約345/590、345/476或345/573的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，酪蛋白s1特有肽可具有氨基酸序列seqidno:18，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約416/488、416/587或416/702的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

在一個實例性實施例中，所述方法可包括監(jiān)測與每一酪蛋白s1特有肽相關(guān)的多個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。舉例來說，具有氨基酸序列seqidno:12的酪蛋白s1特有肽可通過監(jiān)測具有約693/921、693/992或693/1091的m/z值的任兩個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換來鑒別。在一個實施例中，可監(jiān)測所有三個所鑒別的前體-產(chǎn)物離子對。

在一個實施例中，對試樣中的酪蛋白s1同種型進行檢測或定量的方法可包括檢測多種酪蛋白s1特有肽。作為非限制性實例，酪蛋白s1可通過使用具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:12-18的肽的任一組合或全部來定量。如上文所論述，對于每一肽來說，可監(jiān)測一個或一個以上前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

下表3顯示根據(jù)申請者的教示內(nèi)容測定為酪蛋白s1同種型所特有的肽的序列seqidno:12-18，以及其最佳mrmq1,q3轉(zhuǎn)換。根據(jù)各實施例，這些觀察的肽和轉(zhuǎn)換可用于使得能夠?qū)υ嚇又写嬖诘睦业鞍譻1同種型進行可靠定量。酪蛋白s1同種型所特有的額外mrm轉(zhuǎn)換顯示于附錄a、b和d中，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文中。

表3

根據(jù)一些實施例，所述方法可包含通過檢測酪蛋白s2所特有的至少一種經(jīng)分離肽(例如，一種或一種以上具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:19-23的肽)來對試樣中的酪蛋白s2同種型進行檢測和/或定量。舉例來說，三相四極質(zhì)譜儀可用于監(jiān)測所選多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)轉(zhuǎn)換以測定試樣中酪蛋白s2特有肽的存在和/或量。在一些實施例中，酪蛋白s2特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:19，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約373/534或373/437的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，酪蛋白s2特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:20，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約598/912、598/701、598/814、598/436的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，酪蛋白s2特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:21，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約438/629、438/558或438/445的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，酪蛋白s2特有肽可具有氨基酸序列seqidno:22，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約490/648、490/761、490/833的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，酪蛋白s2特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:23，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約694/1187、694/811或694/940的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

在一個實例性實施例中，所述方法可包括監(jiān)測與每一酪蛋白s2特有肽相關(guān)的多個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。舉例來說，具有氨基酸序列seqidno:19的酪蛋白s2特有肽可通過監(jiān)測兩個具有約373/534或373/437的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換來鑒別。關(guān)于具有氨基酸序列seqidno:20的酪蛋白s2特有肽，可監(jiān)測任兩個、三個或全部具有約598/912、598/701、598/814或598/436的m/z值的經(jīng)鑒別前體-產(chǎn)物離子對。

在一個實施例中，對試樣中的酪蛋白s2同種型進行檢測或定量的方法可包括檢測多種酪蛋白s2特有肽。作為非限制性實例，酪蛋白s2可通過使用具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:19-23的肽的任一組合或全部來定量。如上文所論述，對于每一肽來說，可監(jiān)測一個或一個以上前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

下表4顯示根據(jù)申請者的教示內(nèi)容測定為酪蛋白s2同種型所特有的肽的序列seqidno:19-23，以及其最佳mrmq1,q3轉(zhuǎn)換。根據(jù)各實施例，這些觀察的肽和轉(zhuǎn)換可用于使得能夠?qū)υ嚇又写嬖诘睦业鞍譻2同種型進行可靠定量。

表4

根據(jù)一些實施例，所述方法可包含通過檢測對乳球蛋白所特有的至少一種經(jīng)分離肽(例如，一種或一種以上具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:24-29的肽)來對試樣中的乳球蛋白進行檢測和/或定量。例如，三相四極質(zhì)譜儀可用于監(jiān)測所選多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)轉(zhuǎn)換以測定試樣中乳球蛋白特有肽的存在和/或量。在一些實施例中，乳球蛋白特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:24，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約533/853、533/754或533/641的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，乳球蛋白特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:25，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約458/803、458/688或458/504的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，乳球蛋白特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:26，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約1158/1453、1158/1581、1158/1255、772/1026、772/977或772/912的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，乳球蛋白特有肽可具有氨基酸序列seqidno:27，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約623/573、623/918、623/819、623/1047的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，乳球蛋白特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:28，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約561/806、561/935或561/692的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，乳球蛋白特有肽可具有氨基酸序列seqidno:29，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約419/653、419/556或419/425的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

在一個實例性實施例中，所述方法可包括監(jiān)測與每一乳球蛋白特有肽相關(guān)的多個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。舉例來說，具有氨基酸序列seqidno:24的乳球蛋白特有肽可通過監(jiān)測具有約533/853、533/754或533/641的m/z值的任兩個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換來鑒別。在一個實施例中，可監(jiān)測所有三個所鑒別的前體-產(chǎn)物離子對。

在一個實施例中，對試樣中的乳球蛋白進行檢測或定量的方法可包括對多種乳球蛋白特有肽進行檢測和/或定量。作為非限制性實例，乳球蛋白可通過使用具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:24-29的肽的任一組合或甚至全部來定量。如上文所論述，對于每一肽來說，可監(jiān)測一個或一個以上前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

下表5顯示根據(jù)申請者的教示內(nèi)容測定為乳球蛋白所特有的肽的序列seqidno:24-29，以及其最佳mrmq1,q3轉(zhuǎn)換。根據(jù)各實施例，這些觀察的肽和轉(zhuǎn)換可用于使得能夠?qū)υ嚇又写嬖诘娜榍虻鞍走M行可靠定量。乳球蛋白所特有的額外mrm轉(zhuǎn)換顯示于附錄a、b和d中，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文中。

表5

根據(jù)一些實施例，所述方法可包含通過檢測至少一種大麥所特有的經(jīng)分離肽(例如b1-大麥醇溶蛋白或b3-大麥醇溶蛋白)來對試樣中的大麥(barley,hordeumvulgare)進行檢測和/或定量，所述試樣可具有例如一種或一種以上具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:30-33的肽。例如，三相四極質(zhì)譜儀可用于監(jiān)測所選多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)轉(zhuǎn)換以測定試樣中大麥特有肽的存在和/或量。在一些實施例中，大麥特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:30，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約835/948、835/1097或835/1228的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，大麥特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:31，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約336/515、336/554或336/497的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，大麥特有肽可具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:32，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約820/1097、820/548或820/713的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。在其它實施例中，大麥特有肽可具有氨基酸序列seqidno:33，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有約499/785、499/575或499/393的m/z值的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

在一個實例性實施例中，所述方法可包括監(jiān)測與每一大麥特有肽相關(guān)的多個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。舉例來說，具有氨基酸序列seqidno:30的大麥特有肽可通過監(jiān)測具有約835/948、835/1097或835/1228的m/z值的任兩個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換來鑒別。在一個實施例中，可監(jiān)測所有三個所鑒別的前體-產(chǎn)物離子對。同樣，氨基酸序列seqidno:31-33可以類似方式使用。

在一個實施例中，對試樣中的大麥進行檢測或定量的方法可包括檢測多種大麥特有肽。作為非限制性實例，大麥可通過使用具有本文所鑒別的氨基酸序列seqidno:30-33的肽的任一組合或全部來定量。如上文所論述，對于每一肽來說，可監(jiān)測一個或一個以上前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

下表6顯示根據(jù)本教示內(nèi)容測定為大麥所特有的肽的序列seqidno:30-33，以及其最佳mrmq1,q3轉(zhuǎn)換。根據(jù)各實施例，這些觀察的肽和轉(zhuǎn)換可用于使得能夠?qū)υ嚇又写嬖诘拇篼湹鞍踪|(zhì)進行可靠定量。

表6

所屬領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在一些情況下，所述序列中存在的個別氨基酸可通過在試樣制備過程中使用常規(guī)方法來修飾。在另一實施例中，還打算捕獲所述經(jīng)修飾序列。例如，seqidno:30含有可在試樣制備過程中利用封端劑封端的半胱氨酸部分，所述封端劑例如甲烷硫代磺酸甲酯，其可產(chǎn)生其中半胱氨酸已經(jīng)封端而免于進一步反應(yīng)的序列。其它封端劑為所屬領(lǐng)域內(nèi)已知并且可包括碘乙酰胺。因此應(yīng)認(rèn)識到，seqidno:30-33在其范圍內(nèi)包括經(jīng)修飾的肽序列，其中個別氨基酸已經(jīng)修飾而包括所述封端劑。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，盡管序列將與封端劑的添加大體上類似，但質(zhì)量將相應(yīng)地改變。所述修飾也適合本文所揭示的所有過敏原的所有序列。

根據(jù)其它實施例，所述方法還可用于對除上文所揭示的過敏原以外的其它過敏原進行鑒別和定量，所述其它過敏原包括低和高分子量麥谷蛋白和來自芥子、燕麥、黑麥、芝麻、小麥、巴西堅果、榛子、澳大利亞堅果、花生、阿月渾子堅果和核桃的蛋白質(zhì)。如上文針對例如卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白同種型s1、酪蛋白同種型s2、乳球蛋白和大麥等過敏原所例示，此也可通過檢測過敏原所特有的至少一種經(jīng)分離肽序列(例如，一種或一種以上具有先前所述或如表7-19中所概述的特定過敏原的氨基酸序列的肽)來實現(xiàn)。

根據(jù)一些實施例，所述方法可包含通過檢測過敏原所特有的至少一種經(jīng)分離肽(例如，一種或一種以上具有表7-19中所揭示的特定過敏原的氨基酸序列的肽)來對所述過敏原進行檢測和/或定量。例如，三相四極質(zhì)譜儀可用于監(jiān)測所選多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)轉(zhuǎn)換以測定試樣中過敏原特有肽的存在和/或量。在一些實施例中，過敏原特有肽可具有表7-19中所述的氨基酸序列，并且所述方法可包括監(jiān)測至少一個具有所述過敏原所特有的m/z值且描述于表7-19中的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換，并且還可包括監(jiān)測如表7-19中所述的所述過敏原(如果可用)所特有的片段離子。

在一個實例性實施例中，當(dāng)每一過敏原特有肽具有一個以上與其相關(guān)的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換時，所述方法可包括監(jiān)測與其相關(guān)的多個前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。舉例來說，具有表7-19中所述的氨基酸序列的過敏原特有肽可通過監(jiān)測任兩個(如果可用)在表7-19中發(fā)現(xiàn)的特定過敏原的前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換來鑒別。在一個實施例中，且如果可用，如果可用，可監(jiān)測三個或三個以上所鑒別前體-產(chǎn)物離子對。

在一個實施例中，對其它過敏原(包括低和高分子量麥谷蛋白和來自芥子、燕麥、黑麥、芝麻、小麥、巴西堅果、榛子、澳大利亞堅果、花生、阿月渾子堅果和核桃的蛋白質(zhì))進行檢測或定量的方法可包括檢測多種過敏原特有肽。作為非限制性實例，過敏原可通過使用具有本文所鑒別的表7-19中所述的特定過敏原的氨基酸序列的肽的任一組合或全部來定量。如上文所論述，對于每一肽來說，可監(jiān)測一個或一個以上前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

下表7-19顯示根據(jù)本教示內(nèi)容測定為低和高分子量麥谷蛋白的過敏原和來自芥子、燕麥、黑麥、芝麻、小麥、巴西堅果、榛子、澳大利亞堅果、花生、阿月渾子堅果和核桃的蛋白質(zhì)的過敏原所特有的肽的序列，以及其最佳mrmq1,q3轉(zhuǎn)換和片段離子。根據(jù)各實施例，這些觀察的肽和轉(zhuǎn)換可用于使得能夠?qū)υ嚇又写嬖诘倪^敏原進行可靠定量。

為了進一步明晰，根據(jù)本教示內(nèi)容，表7-19中所述的每一過敏原顯示所測定的所述過敏原的肽的序列，以及其最佳mrmq1,q3轉(zhuǎn)換和片段離子信息。根據(jù)各實施例，這些觀察的肽和轉(zhuǎn)換可用于使得能夠?qū)υ嚇又写嬖诘乃鲞^敏原進行可靠定量。

表7

表8

表9

表10

表11

表12

表13

表14

表15

表16

表17

表18

表19

在一些實施例中，上述過敏原中的兩者或兩者以上可通過經(jīng)由lc-ms/ms檢測每一過敏原所特有的一種或一種以上肽(例如上文所論述的那些)來檢測和/或定量，其中對于每一肽來說，可監(jiān)測多個mrm轉(zhuǎn)換，例如上文所論述的那些。在一個實施例中，例如，可通過監(jiān)測卵白蛋白所特有的兩種肽的多個mrm轉(zhuǎn)換(例如，監(jiān)測具有氨基酸序列seq.idno.1的肽的mrm轉(zhuǎn)換930/1116、930/888和930/1017和監(jiān)測具有氨基酸序列seq.idno.7的肽的mrm轉(zhuǎn)換390/667、390/504和390/433)和溶菌酶所特有的一種肽的多個mrm轉(zhuǎn)換(例如，監(jiān)測具有氨基酸序列seq.idno.8的肽的mrm轉(zhuǎn)換437/452、437/680和437/737)在試樣中檢測卵蛋白質(zhì)。在一個實施例中，例如，可通過監(jiān)測酪蛋白同種型s1所特有的兩種肽的多個mrm轉(zhuǎn)換(例如，監(jiān)測具有氨基酸序列seq.idno.12的肽的mrm轉(zhuǎn)換693/920、693/991和693/1090和監(jiān)測具有氨基酸序列seq.idno.16的肽的mrm轉(zhuǎn)換880/1324、880/436、587/758、587/871和587/790)、酪蛋白同種型s2所特有的一種肽的多個mrm轉(zhuǎn)換(例如，監(jiān)測具有氨基酸序列seq.idno.20的肽的mrm轉(zhuǎn)換598/911和598/456)和乳球蛋白所特有的一種肽的多個mrm轉(zhuǎn)換(例如，監(jiān)測具有氨基酸序列seq.idno.27的肽的mrm轉(zhuǎn)換623/1047、623/918、623/819)在試樣中檢測牛乳蛋白質(zhì)。在其它實施例中，表1到19中所揭示的任何過敏原的任一組合可使用類似程序進行檢測和/或定量。

根據(jù)一些實施例，提供用于質(zhì)譜測試試樣中以下蛋白質(zhì)中至少一者的試劑盒：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麥谷蛋白和來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)。試劑盒可包括以下物質(zhì)所特有的一種或一種以上經(jīng)分離肽：雞卵白蛋白、雞溶菌酶、牛酪蛋白或牛乳球蛋白、高或低麥谷蛋白、小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果，包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子。例如，試劑盒可包括一種或一種以上具有氨基酸序列seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6或seqidno:7的經(jīng)分離卵白蛋白特有肽。在一個方面中，試劑盒可包括一種或一種以上具有氨基酸序列seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10或seqidno:11的經(jīng)分離溶菌酶特有肽。在一個實施例中，試劑盒可包括一種或一種以上經(jīng)分離酪蛋白特有肽。例如，試劑盒可包括酪蛋白的s1同種型所有的一種或一種以上經(jīng)分離肽，例如那些具有氨基酸序列seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17或seqidno:18的肽?；蛘呋蛄硗猓噭┖锌砂ɡ业鞍椎膕2同種型所特有的一種或一種以上經(jīng)分離肽，例如那些具有氨基酸序列seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22或seqidno:23的肽。在一個實施例中，試劑盒可包括一種或一種以上具有氨基酸序列seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28或seqidno:29的經(jīng)分離乳球蛋白特有肽。在一些實施例中，試劑盒可包含以下蛋白質(zhì)中的每一者所特有的至少一種經(jīng)分離肽：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(s1和/或s2)、乳球蛋白、高或低麥谷蛋白和來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)。例如，試劑盒可包含每一本文所鑒別的對應(yīng)于seqidno:1-212的經(jīng)分離肽中的一者?；蛘?，試劑盒可包含一種選自對應(yīng)于seqidno.1-7的群組的肽、一種選自對應(yīng)于seqidno.8-11的群組的肽、一種選自對應(yīng)于seqidno.12-18的群組的肽、一種選自對應(yīng)于seqidno.19-23的群組的肽、一種選自對應(yīng)于seqidno.24-29的群組的肽和一種選自表6-19中的每一過敏原的肽。在一些實施例中，所述肽可經(jīng)同位素標(biāo)記(例如，使用¹⁵n、¹³c)。在其它實施例中，一種或一種以上肽可選自本文所揭示的一些但非全部過敏原。

根據(jù)一些實施例，提供用于質(zhì)譜測試試樣中以下蛋白質(zhì)中至少一者的試劑盒：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麥谷蛋白和來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)。試劑盒可包括例如至少一種用于將以下蛋白質(zhì)中的一者或一者以上片段化成多種肽的蛋白水解酶：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麥谷蛋白和來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)。例如，蛋白水解酶可效地將過敏原片段化成多種肽，其中至少一者具有氨基酸序列seqidno.1-212。試劑盒還可包括至少一種用于使用質(zhì)譜儀對多種肽中的至少一者進行定量的試劑，所述肽具有氨基酸序列seqidno:1-212。

各種方法和試劑可有效地制備用于質(zhì)譜分析的試樣和/或?qū)⑦^敏原片段化成多種肽。例如，在一個實例性實施例中，蛋白水解酶可為胰蛋白酶，其可將過敏原裂解成多種肽。在一些實施例中，試劑盒可包括lc柱，在其上面固定有蛋白水解酶，例如胰蛋白酶。試劑盒還可包含消化組份，包括緩沖液、酶、烷基化劑、還原劑和任選地其它試劑和/或組份。在一些實施例中，試劑盒可包含例如均勻分析，使得使用者只需要添加試樣。

在一些實施例中，試劑盒可包含校準(zhǔn)或歸一化試劑或標(biāo)準(zhǔn)物。例如，試劑盒可包含以下蛋白質(zhì)中的每一者所特有的至少一種肽：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(s1和/或s2)、乳球蛋白、高或低麥谷蛋白和來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)，其用于校準(zhǔn)過敏原特有肽的定量。作為非限制性實例，試劑盒可含有已知濃度的每一過敏原特有肽的溶液，使得可構(gòu)建校準(zhǔn)曲線。在一些實施例中，試劑盒可含有至少一種用于校準(zhǔn)過敏原特有肽或過敏原本身的定量的所關(guān)注過敏原(例如，卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麥谷蛋白和來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì))。例如，試劑盒可包括已知量的以下蛋白質(zhì)中的每一者：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麥谷蛋白和來自小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果(包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子)的蛋白質(zhì)?；蛘呋蛄硗?，可通過向試樣摻加氨基酸序列與所關(guān)注肽相同的至少一種同位素富集肽來執(zhí)行校準(zhǔn)。因此，試劑盒可包括一種或一種以上對應(yīng)于seqidno.1-212中的每一者或一些的同位素富集肽。

根據(jù)一些實施例，可根據(jù)各種因素使用不同轉(zhuǎn)換來測量和用基準(zhǔn)問題測試(benchmark)分析結(jié)果。因此，試劑盒可包含不同轉(zhuǎn)換值和/或建議設(shè)置，其可用于使得能夠在試樣與一種或一種以上對照試劑之間進行比較測量。試劑盒可包括與每一過敏原特有肽的q1和q3轉(zhuǎn)換值有關(guān)的信息。例如，在一個實施例中，試劑盒可包含每一本文所鑒別的經(jīng)分離肽seqidno:1-2，并且進一步可包含關(guān)于使用質(zhì)譜儀對至少一種肽進行定量的說明書。在試劑盒中還可包括關(guān)于可以或應(yīng)當(dāng)用于執(zhí)行分析的儀器設(shè)置的信息。試劑盒可包括關(guān)于試樣制備、操作條件、體積量、溫度設(shè)置等的信息。

根據(jù)一些實施例，可根據(jù)各種因素使用不同轉(zhuǎn)換來測量和用基準(zhǔn)問題測試分析結(jié)果。因此，試劑盒可包含不同轉(zhuǎn)換值和/或建議設(shè)置，其可用于在試樣與一種或一種以上對照試劑之間進行比較測量。試劑盒可包括測量特定轉(zhuǎn)換對值(例如，q1/q3轉(zhuǎn)換對或一個或一個以上不同轉(zhuǎn)換對的值)的說明書。

試劑盒可包裝在含有一個或一個以上試劑器皿和合適說明書的氣密密封容器中。電子媒介也可含于試劑盒內(nèi)并且可儲存和/或提供關(guān)于一種或一種以上分析、測量值、轉(zhuǎn)換對、操作說明書、用于實施操作的軟件、其組合等的電子信息。

根據(jù)一些方面，提供本文所述的可控制過程和/或執(zhí)行計算的軟件。例如，軟件可向質(zhì)譜儀提供指令以監(jiān)測一個或一個以上特定前體-產(chǎn)物離子對轉(zhuǎn)換。

軟件可包括例如基于對與試劑盒一起提供的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)譜分析生成校準(zhǔn)數(shù)據(jù)的模塊和接收并分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)(例如，lc-ms/ms數(shù)據(jù))以鑒別一種或一種以上上述肽和mrm轉(zhuǎn)換的模塊。在鑒別上述過敏原中一者所特有的一種或一種以上肽后，軟件可利用校準(zhǔn)數(shù)據(jù)來對那些肽和相關(guān)過敏原進行定量。

在其它實施例中，提供可實現(xiàn)針對過敏原篩選試樣的方法，其包含：獲得試樣；

用至少一種蛋白水解酶消化所述試樣以將所述試樣中存在的至少一種過敏原(如果有)片段化成多種肽，其中所述至少一種過敏原選自由以下組成的群組：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高分子量谷蛋白、低分子量谷蛋白、小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻、澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子；和通過使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)測定所述多種肽中至少一者的量來對所述試樣中存在的所述過敏原中的至少一者進行定量，其中所述多種肽中的至少一者包含具有氨基酸序列seqidno:1-212的肽。在其它實施例中，對兩種或兩種以上過敏原進行定量。在另一實施例中，測定所述多種肽中的兩者或兩者以上以對所述過敏原中的所述至少一者進行定量。在另一實施例中，監(jiān)測所述多種肽中每一者的所選mrm轉(zhuǎn)換中的至少一個。在替代實施例中，監(jiān)測所述多種肽中每一者的兩個或兩個以上所選mrm轉(zhuǎn)換。在又一實施例中，蛋白水解酶為胰蛋白酶。

附圖說明

圖1顯示由面包的實例性“空白”試樣產(chǎn)生的實例性色譜圖。

圖2顯示由摻加有牛乳且含有牛乳肽的面包試樣產(chǎn)生的實例性色譜圖。

圖.3a、3b、3c描繪獲得的三種特定牛乳肽的信號。

圖4顯示含有芥子的試樣的質(zhì)譜。

圖5顯示肽eqidno.20的校準(zhǔn)線。

圖6顯示肽eqidno.16的校準(zhǔn)線。

圖7顯示肽eqidno.12的校準(zhǔn)線。

圖8顯示肽eqidno.27的校準(zhǔn)線。

圖9顯示肽eqidno.7的校準(zhǔn)線。

實例

申請者的教示內(nèi)容可參考下面的實例和所得數(shù)據(jù)得到甚至更全面地理解。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮本說明書和實踐本文所揭示的本教示內(nèi)容將明了申請者的教示內(nèi)容的其它實施例。這些實例僅打算視為實例性。

實例1

溶液的制備

提取緩沖液–將tris(2-氨基-2-羥甲基-丙烷-1,3-二醇，3.03g)和尿素(60g)溶解于水(480ml)中，制備50mmtris緩沖液/2m尿素提取溶劑。所得溶液具有約10的ph值。

消化緩沖液–將碳酸氫銨(3.16g)溶解于水(400ml)中。所得溶液具有約7.8的ph值。

酶溶液–將胰蛋白酶(1g)溶解于消化緩沖液(20ml)中，制備50mg/ml濃度的儲備液。將儲備液(100μl)進一步稀釋于10ml消化緩沖液中，制備500μg/ml溶液的最終胰蛋白酶溶液。所有酶溶液均在-20℃(或更低)下冷凍儲存并且在使用前解凍。

碘乙酰胺溶液–將碘乙酰胺(0.925g)添加到10ml水中并且進行聲波處理以溶解固體。在使用前新制備0.5m碘乙酰胺溶液并且在使用后丟棄。

混合過敏原摻加溶液的制備–將20.0mg(0.0200g)每一蛋白質(zhì)(卵溶菌酶、卵白蛋白、牛乳α-酪蛋白和牛乳β-乳球蛋白)于15ml聚丙烯離心管中溶解于10.0ml提取緩沖液中，制備含有2000μg/ml每一過敏原的組合摻加溶液。當(dāng)儲存于冷凍器中時，所得混合過敏原摻加溶液穩(wěn)定1個月。尚未測定更長期穩(wěn)定性。

試樣制備

如上文所論述，試樣可得自多種來源。在此實例中，從干烘食物獲得試樣。在離心管(50ml)中混合微細(xì)粉末試樣(5.0g)與30ml提取緩沖液并通過劇烈振蕩打碎混合物并且使用輥式混合器進一步攪動(60分鐘)。將離心管以3500rpm和15℃旋轉(zhuǎn)沉淀5分鐘。將200μl1mdtt溶液添加到6ml上清液。將試樣混合并在37℃下加熱60分鐘。然后將試樣冷卻到室溫并且添加2.0ml新制備的0.5m碘乙酰胺水溶液。振蕩試樣以進行混合并且避光儲存(30分鐘，在室溫下)。向每一試樣中添加6ml消化緩沖液(0.1m碳酸氫鈉)，之后添加400μl胰蛋白酶酶溶液(200μg總酶/試樣)。在37℃下將試樣培育過夜。離心試樣(5分鐘，10℃，以3000rpm)并且通過0.45μrc過濾器過濾。用0.5ml甲酸酸化濾液。

依次用6ml含有0.1％甲酸的乙腈和6ml含有0.5％tfa(三氟乙酸)的水對strata^tmxspe筒體進行條件處理。將來自經(jīng)離心試樣的上清液以1-2滴/秒的速率加載到spe筒體上。用3ml0.5％tfa水溶液洗滌spe筒體。用6ml乙腈洗脫過敏原肽并且使用離心蒸發(fā)器將其蒸發(fā)到干燥。

通過添加300μl水/乙腈溶液(95％具有5％乙腈和0.5％甲酸的水)將試樣殘余物重構(gòu)。將試樣渦旋20-30秒并且聲波處理30分鐘以完成材料的溶解。將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到1.5ml埃彭道夫管(eppendorftube)并且離心(5分鐘，以13000rpm)。移出上清液并且將其轉(zhuǎn)移到300μl帶有壓力配合帽的聚丙烯hplc小瓶中以供hplc分析。

使用島津卓越lc系統(tǒng)(shimadzuprominencelcsystem)，使用菲羅門分析柱(phenomenexanalyticalcolumn)(4μm)、賽內(nèi)吉海德魯-rp80a柱(synergihydro-rp80acolumn)(150×2.1mm)，使用1.00ml甲酸存于999ml水中和1.00ml甲酸存于999ml乙腈中的流動相溶液執(zhí)行色譜。流動速率為0.300ml/min，柱爐溫度為30℃。

使用離子源在應(yīng)用生物系統(tǒng)(appliedbiosystems)lc/ms/ms系統(tǒng)上分析試樣。使用mrm檢測窗口為90s且目標(biāo)掃描時間為0.40s的預(yù)定mrm(smrm)來分析化合物。將q1設(shè)定為低并且將q3設(shè)定為單位分辨率以獲得最大信號反應(yīng)。

實例2

此實例中描述了制備試樣的另一方法。納諾色譜10k亞米茄(nanosep10komega)(100/pk)和菲尼克斯(phenex)rc膜(0.45μm)，26mm注射器式過濾器。另外，利用以下hplc溶劑和消耗品：水、甲醇(meoh)、乙腈(can)、50ml聚丙烯離心管、15ml聚丙烯離心管、一次性玻璃培養(yǎng)管(13×100mm)、聚丙烯微型離心管(1.5ml)、錐形聚丙烯hplc小瓶和帽(300μl)、一次性注射器、10ml容量魯爾端(luerend)。此外，提取和試樣處理需要以下設(shè)備：用于50ml管的超速離心機、用于1.5ml管的微型離心機；用于試樣處理的spe歧管(具有真空泵)；強迫通風(fēng)培育器(設(shè)定為37℃)、輥式振蕩器、離心蒸發(fā)器/濃縮器。

溶液的制備

提取緩沖液–將tris(2-氨基-2-羥甲基-丙烷-1,3-二醇，3.03g)和尿素(60g)溶解于水(480ml)中并且攪拌直到完全溶解以制備50mmtris緩沖液/2m尿素提取溶劑。

消化緩沖液–將碳酸氫銨(3.16g)溶解于水(378ml)中。向其中添加2ml1m氯化鈣和20ml乙腈。ph值為約7.8。

酶溶液–將胰蛋白酶(1g)溶解于消化緩沖液(20ml)中以制備50mg/ml濃度的儲備液。將儲備液(100μl)進一步稀釋于10ml消化緩沖液中以制備500μg/ml溶液的最終胰蛋白酶溶液。所有酶溶液均在-20℃(或更低)下冷凍儲存并且在使用前解凍。

個別過敏原儲備液的制備–通過將30.0mg每一卵白蛋白、牛乳酪蛋白和乳球蛋白于5ml埃彭道夫管中溶解于3.0ml提取緩沖液中來制備10mg/ml儲備液。當(dāng)在-20℃或更低下儲存時，所得過敏原儲備液穩(wěn)定3個月，但尚未測定更長期穩(wěn)定性。

混合過敏原摻加溶液的制備–將1.0ml每一過敏原儲備液(10mg/ml)(卵白蛋白、牛乳酪蛋白和牛乳乳球蛋白)轉(zhuǎn)移到5ml埃彭道夫管中且向其中添加2.0ml提取緩沖液并且混合。混合過敏原儲備液含有2mg/ml每一過敏原并且當(dāng)在-20℃或更低下儲存時穩(wěn)定1個月，但尚未測定更長期穩(wěn)定性。

混合過敏原摻加溶液的制備–將100μl混合過敏原儲備液(2mg/ml)添加到2ml含有900μl提取緩沖液的埃彭道夫管。所得溶液含有200μg/ml每一過敏原蛋白質(zhì)。

試樣制備

將1.00g微細(xì)粉末試樣稱量到15ml離心管中。從下表20中的每一個別試樣制備來自每一個別試樣的連續(xù)添加校準(zhǔn)試樣。

表20

劇烈振蕩每一混合物以打碎混合物并且然后使用輥式混合器進一步攪動60分鐘。將離心管以3500rpm和15℃旋轉(zhuǎn)沉淀20分鐘。將500μl每一上清液添加到2ml埃彭道夫管和50μltcep溶液并且在60c下在培育中渦旋混合60分鐘。然后將管冷卻到室溫，并添加25μlmmts，再次渦旋以進行混合并培育10分鐘。將500μl消化緩沖液添加到每一試樣，之后添加20μl胰蛋白酶酶溶液(含有20μg總酶/試樣)。通過旋渦將溶液充分混合。然后在37℃下將試樣培育過夜。第二天，將30μl甲酸添加到每一試樣并充分混合。然后將試樣以13000rpm離心5分鐘。將500μl上清液加入10k-mwco過濾器中并且以13000rpm離心20分鐘。將200μl濾液轉(zhuǎn)移到合適的聚丙烯hplc自動取樣器小瓶中以供lc/ms/ms分析，將剩余部分儲存在-20℃下以供在需要時進行進一步分析。

使用島津卓越lc系統(tǒng)，使用菲羅門分析柱(4μm)、賽內(nèi)吉海德魯-rp80a柱(150×2.1mm)，使用1.00ml甲酸存于999ml水中和1.00ml甲酸存于999ml乙腈中的流動相溶液執(zhí)行色譜。系統(tǒng)也由系統(tǒng)控制器(cbm-20a)、2個等度泵lc-20ad(具有半微量50μl混合器)、自動取樣器sil-20ac和柱爐cto-20ac組成。另外，利用保護柱(菲羅門捕集筒體(trapcartridge)(4μm)、賽內(nèi)吉海德魯-rp80a墨丘利(mercury)(20×2.0mm))、筒體固定器(菲羅門墨丘利ms20mm筒體固定器)并且利用95:5(v:v)乙腈:水+0.05％tfa的針頭沖洗，其中流動速率：0.300ml/min，平衡時間：0.5min，柱爐溫度：30℃，和注入體積：30μl。自動取樣器針頭沖洗順序包括沖洗體積：1000μl，針頭行程：52mm，沖洗速度：35μl/sec，取樣速度：2.0μl/sec，沖洗浸漬時間：5sec，沖洗模式：抽吸之前和之后。

使用具有正極性的離子源在應(yīng)用生物系統(tǒng)lc/ms/ms系統(tǒng)上分析試樣。使用mrm檢測窗口為90s且目標(biāo)掃描時間為0.40s的預(yù)定mrm(smrm)來分析化合物。將q1設(shè)定為低并且將q3設(shè)定為單位分辨率以獲得最大信號反應(yīng)。所用其它參數(shù)包括來源/氣體參數(shù)is：5500，cur：30psi，tem：500℃，gs1：35psi，gs2：46psi，ihe：on，和cad：高。

化合物mrm參數(shù)和保留時間包括dp：可變，ep：10，cxp：可變，停留時間：可變，q1分辨率：低，q3和分辨率：單位

使用連續(xù)摻加試樣的面積對標(biāo)稱濃度的最小二乘方由回歸從絕對峰面積獲得校準(zhǔn)曲線。通過使用回歸方程反算每一摻加水平下的濃度來計算與回歸線的偏差。由未摻加試樣的表觀濃度計算的回歸曲線獲得靶肽的濃度。卵白蛋白、卵溶菌酶、牛乳酪蛋白和乳球蛋白中每一者的線性范圍在介于10μg/g與100μg/g之間的范圍內(nèi)。

每一試樣具有其特有的定量用線性范圍。應(yīng)從回歸中排除完整校準(zhǔn)曲線中的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物以滿足適用范圍。校準(zhǔn)曲線描繪于圖5到9中。

圖5描繪當(dāng)將200ppm摻加到面包中時，酪蛋白肽seqidno.20的校準(zhǔn)線。圖6描繪當(dāng)將200ppm摻加到面包中時，酪蛋白肽seqidno.16的校準(zhǔn)線。圖7描繪當(dāng)將200ppm摻加到面包中時，酪蛋白肽seqidno.12的校準(zhǔn)線。圖8描繪當(dāng)將200ppm摻加到面包中時，牛肽seqidno.27的校準(zhǔn)線。圖8描繪當(dāng)將200ppm摻加到面包中時，卵白蛋白肽seqidno.7的校準(zhǔn)線。

實例3

將一包芥子與100mmtris和2m尿素組合。使用氫氧化銨將ph調(diào)節(jié)到ph值為9和9.5以提取相關(guān)蛋白質(zhì)。使試樣經(jīng)受如實例1或2中所述的類似制備和分析技術(shù)與添加碘乙酰胺以封阻半胱氨酸的額外過程。分離半胱氨酸經(jīng)碘乙酰胺修飾的肽序列seqidno.103并進行分析。圖4描繪此試樣的質(zhì)譜。很明顯，于對應(yīng)于2/y4片段離子的380/499處、于對應(yīng)于2/y5片段離子的380/659處、于對應(yīng)于2/b5片段離子的380/584(次峰)處和于對應(yīng)于2/b4片段離子的380/487處鑒別質(zhì)譜峰。

所關(guān)注肽和/或過敏原的定量可利用各種校準(zhǔn)技術(shù)。例如，可在質(zhì)譜分析前將含有已知量的所選肽的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物添加到試樣以生成校準(zhǔn)曲線，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線允許對隨后運行經(jīng)過lc-ms/ms的試樣進行定量。在一些實施例中，可在制備用于質(zhì)譜分析的試樣前將已知量的所關(guān)注過敏原添加到試樣。舉例來說，可在用蛋白水解酶消化試樣前將已知量的以下蛋白質(zhì)中的一者或一者以上添加到所述試樣：卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麥谷蛋白、小麥、黑麥、燕麥、大麥、芥子、芝麻和各種堅果，包括澳大利亞堅果、阿月渾子堅果、巴西堅果、核桃、花生和榛子。通過向試樣中摻加已知濃度的所關(guān)注過敏原，可校準(zhǔn)過敏原或其特有肽的定量。在一些實施例中，可迭代地測試摻加有各種已知量的所關(guān)注過敏原的多種試樣以生成校準(zhǔn)曲線，例如，使用連續(xù)稀釋物或標(biāo)準(zhǔn)物添加方法進行。從質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)曲線可用于計算例如“未摻加”試樣中的肽和/或過敏原的表觀濃度。關(guān)于校準(zhǔn)方案的一個實施例的各種校準(zhǔn)曲線和進一步細(xì)節(jié)進一步顯示于圖5到9中，所述圖描繪各種肽的校準(zhǔn)曲線，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文中。

在一些實施例中，可例如通過同位素稀釋質(zhì)譜測定肽的量，其中向所制備的試樣中摻加所關(guān)注肽的同位素富集形式。在一個實例性實施例中，可將校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物“摻加”到試樣中，對于不同運行使用不同濃度(例如，連續(xù)稀釋)。從質(zhì)譜分析得到的數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)曲線可用于計算例如“未摻加”試樣的表觀濃度。

所屬領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述實施例將了解根據(jù)申請者的教示內(nèi)容的方法和系統(tǒng)的其它特征和優(yōu)點。因此，除非在所附權(quán)利要求書中指明，否則申請者的揭示內(nèi)容不受限于特別顯示和描述的內(nèi)容。本文所引用的所有出版物和參考文獻的全部內(nèi)容均以引用方式明確地并入本文中。

序列表

<110>dh科技發(fā)展私人貿(mào)易有限公司

<120>檢測過敏原的系統(tǒng)和方法

<130>abs-0047pct

<141>2012-xx-xx

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<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

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<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

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<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>85

glnvalservalcysprophelyslys

15

<210>86

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>86

proalaglypropheglyileprolys

15

<210>87

<211>19

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>87

glnglnleugluglnglnglyglnglnglyprohisleuglnhisval

151015

ileserarg

<210>88

<211>19

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>88

glnglnleugluglnglnglyglnglnglyprohisleuglnhisval

151015

ileserarg

<210>89

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>89

iletyrglnthralathrhisleuproarg

1510

<210>90

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>90

iletyrglnthralathrhisleuproarg

1510

<210>91

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>91

glnvalservalcyspropheglnlys

15

<210>92

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>92

glnvalservalcyspropheglnlys

15

<210>93

<211>13

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>93

valcysasnileproglnvalservalcysprophelys

1510

<210>94

<211>13

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>94

valcysasnileproglnvalservalcysprophelys

1510

<210>95

<211>14

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>95

valcysasnileproglnvalservalcysprophelyslys

1510

<210>96

<211>14

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>96

valcysasnileproglnvalservalcysprophelyslys

1510

<210>97

<211>19

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>97

glnglnleuglyglnglnglyglnglnglyproglnvalglnhisval

151015

ileserarg

<210>98

<211>19

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>98

glnglnleuglyglnglnglyglnglnglyproglnvalglnhisval

151015

ileserarg

<210>99

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>99

iletyrglnthralathrhisleuproarg

1510

<210>100

<211>5

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>100

alaglyprophearg

15

<210>101

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>101

alavallysglnglnilearg

15

<210>102

<211>19

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>102

glnglnglyglnglnglnglyglnglnglyglnglnleuglnhisglu

151015

ileserarg

<210>103

<211>6

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>103

valcysasnileproarg

15

<210>104

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>104

valserilecyspropheglnlys

15

<210>105

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>105

valserilecyspropheglnlys

15

<210>106

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>106

glupheargglnalaglnhisleuarg

15

<210>107

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>107

glupheargglnalaglnhisleuarg

15

<210>108

<211>6

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>108

glnalaglnhisleuarg

15

<210>109

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>109

alacysglnglntrpleuhisarg

15

<210>110

<211>18

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>110

glnglnvalargglnglnglyhisglnglnglnmetglnhisvalile

151015

serarg

<210>111

<211>18

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>111

glnglnvalargglnglnglyhisglnglnglnmetglnhisvalile

151015

serarg

<210>112

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從蕓苔屬和芥屬的混合物獲得

<400>112

iletyrglnthralathrhisleuproarg

1510

<210>113

<211>17

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從燕麥獲得

<400>113

glnpheleuvalglnglncysserprovalalavalvalpropheleu

151015

arg

<210>114

<211>13

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從燕麥獲得

<400>114

serglnileleuglnglnsersercysglnvalmetarg

1510

<210>115

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從燕麥獲得

<400>115

glnleugluglnileprogluglnleuarg

1510

<210>116

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從燕麥獲得

<400>116

glnleugluglnileprogluglnleuarg

1510

<210>117

<211>17

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從黑麥屬獲得

<400>117

asnvalleuleuglnglncysserprovalalaleuvalserserleu

151015

arg

<210>118

<211>17

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從黑麥屬獲得

<400>118

asnvalleuleuglnglncysserprovalalaleuvalserserleu

151015

arg

<210>119

<211>39

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從黑麥屬獲得

<400>119

gluglyvalglnileleuleuproglnserhisglnglnhisvalgly

151015

glnglyalaleualaglnvalglnglyileileglnproglnglnleu

202530

serglnleugluvalvalarg

35

<210>120

<211>17

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從黑麥屬獲得

<400>120

serleuvalleuglnasnleuprothrmetcysasnvaltyrvalpro

151015

arg

<210>121

<211>17

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從黑麥屬獲得

<400>121

serleuvalleuglnasnleuprothrmetcysasnvaltyrvalpro

151015

arg

<210>122

<211>19

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從黑麥屬獲得

<400>122

glncysserthrileglnalaprophealaserilevalthrglyile

151015

valglyhis

<210>123

<211>19

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從黑麥屬獲得

<400>123

glncysserthrileglnalaprophealaserilevalthrglyile

151015

valglyhis

<210>124

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從芝麻屬獲得

<400>124

ileserglyalaglnproserleuarg

15

<210>125

<211>6

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從芝麻屬獲得

<400>125

leuvaltyrilegluarg

15

<210>126

<211>19

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從芝麻屬獲得

<400>126

alapheaspalagluleuleuserglualapheasnvalproglnglu

151015

thrilearg

<210>127

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從芝麻屬獲得

<400>127

glyleuilevalmetalaarg

15

<210>128

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從芝麻屬獲得

<400>128

glualaaspilepheserarg

15

<210>129

<211>11

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從芝麻屬獲得

<400>129

serproleualaglytyrthrservalilearg

1510

<210>130

<211>22

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從芝麻屬獲得

<400>130

alametproleuglnvalilethrasnsertyrglnileserproasn

151015

glnalaglnalaleulys

20

<210>131

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從芝麻屬獲得

<400>131

hiscysmetglntrpmetarg

15

<210>132

<211>11

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從芝麻屬獲得

<400>132

metcysglymetsertyrprothrglucysarg

1510

<210>133

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從小麥屬獲得

<400>133

servalalavalserglnvalalaarg

15

<210>134

<211>16

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從小麥屬獲得

<400>134

gluhisglyalaglngluglyglnalaglythrglyalapheproarg

151015

<210>135

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從小麥屬獲得

<400>135

glnvalvalaspglnglnleualaglyarg

1510

<210>136

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從小麥屬獲得

<400>136

ilephetrpglyileproalaleuleulys

1510

<210>137

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從小麥屬獲得

<400>137

leuprotrpserthrglyleuglnmetarg

1510

<210>138

<211>11

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從小麥屬獲得

<400>138

tyraspprothralatyrasnthrileleuarg

1510

<210>139

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>139

glnglnmetleuserhiscysarg

15

<210>140

<211>21

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>140

glymetgluprohismetserglucyscysgluglnleugluglymet

151015

aspglusercysarg

20

<210>141

<211>5

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>141

metmetmetmetarg

15

<210>142

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>142

metglnglngluglumetglnproarg

15

<210>143

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>143

leualagluasnileproserarg

15

<210>144

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>144

cysasnleuserprometarg

15

<210>145

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>145

glnglnglnleuasnhiscysarg

15

<210>146

<211>6

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>146

metaspglumetcysarg

15

<210>147

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>147

cysasnleuserproglnarg

15

<210>148

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>148

cysalaglyvalalaalaleuarg

15

<210>149

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>149

leutyrtyrvalthrglnglyarg

15

<210>150

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>150

hisphepheleualaglyasnileglnarg

1510

<210>151

<211>12

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>151

glyglyglnglnileleualaaspasnvalphelys

1510

<210>152

<211>21

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>152

glypheasnmetglualaleualaaspvalleuglypheglymetasp

151015

thrgluthralaarg

20

<210>153

<211>14

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>153

glyvalleutyrgluasnalametmetalaproleutrparg

1510

<210>154

<211>12

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>154

glyileprovalglyvalleualaasnalatyrarg

1510

<210>155

<211>11

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從巴西堅果獲得

<400>155

aspglualavalleupheglnproglyserarg

1510

<210>156

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從歐榛獲得

<400>156

tyrpheglyglucysasnleuasparg

15

<210>157

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>157

leuasnalaleugluprothrasnarg

15

<210>158

<211>23

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>158

thrilegluproasnglyleuleuleuproglntyrserasnalapro

151015

gluleuiletyrilegluarg

20

<210>159

<211>14

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>159

hisphetyrleualaglyasnproaspaspgluhisglnarg

1510

<210>160

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>160

glnglyglnglnglnpheglyglnarg

15

<210>161

<211>5

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>161

glnglutrpgluarg

15

<210>162

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>162

alaaspiletyrthrgluglnvalglyarg

1510

<210>163

<211>13

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>163

ileasnthrvalasnserasnthrleuprovalleuarg

1510

<210>164

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>164

trpleuglnleuseralagluarg

15

<210>165

<211>15

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>165

glnglyglnvalleuthrileproglnasnphealavalalalys

151015

<210>166

<211>12

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>166

alaglusergluglypheglutrpvalalaphelys

1510

<210>167

<211>13

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>167

thrasnaspasnalaglnileserproleualaglyarg

1510

<210>168

<211>15

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>168

alaleuproaspaspvalleualaasnalapheglnileserarg

151015

<210>169

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>169

glngluthrthrleuvalarg

15

<210>170

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>170

valglugluileasphisalaasnphelys

1510

<210>171

<211>14

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>171

alavalglualatyrleuleualahisproaspalatyrcys

1510

<210>172

<211>14

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從榛屬獲得

<400>172

alavalglualatyrleuleualahisproaspalatyrcys

1510

<210>173

<211>12

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從澳大利亞堅果屬獲得

<400>173

glncysmetglnleugluthrserglyglnmetarg

1510

<210>174

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從澳大利亞堅果屬獲得

<400>174

cysvalserglncysasplys

15

<210>175

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從澳大利亞堅果屬獲得

<400>175

pheglugluaspileasptrpserlys

15

<210>176

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從澳大利亞堅果屬獲得

<400>176

hismetglnilecysglnglnarg

15

<210>177

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從澳大利亞堅果屬獲得

<400>177

hiscysgluglnglngluproarg

15

<210>178

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從澳大利亞堅果屬獲得

<400>178

leuglntyrglncysglnarg

15

<210>179

<211>6

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從澳大利亞堅果屬獲得

<400>179

gluglyvalileilearg

15

<210>180

<211>6

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從澳大利亞堅果屬獲得

<400>180

gluserglupheasparg

15

<210>181

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從澳大利亞堅果屬獲得

<400>181

glnglntyrglncysglnarg

15

<210>182

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從花生獲得

<400>182

asnleuproglnglncysglyleuarg

15

<210>183

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從花生獲得

<400>183

asnasnprophetyrpheproserarg

15

<210>184

<211>11

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從花生獲得

<400>184

thralaasnaspleuasnleuleuileleuarg

1510

<210>185

<211>13

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從花生獲得

<400>185

aspleualapheproglyserglygluglnvalglulys

1510

<210>186

<211>13

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從花生獲得

<400>186

serproaspiletyrasnproglnalaglyserleulys

1510

<210>187

<211>14

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從花生獲得

<400>187

valleuleuglugluasnalaglyglygluglnglugluarg

1510

<210>188

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>188

cysalaglyvalalavalalaarg

15

<210>189

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>189

histhrileglnproasnglyleuarg

15

<210>190

<211>14

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>190

ileleualagluvalpheglnvalgluglnserleuvallys

1510

<210>191

<211>12

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>191

glypheglusergluglugluserglutyrgluarg

1510

<210>192

<211>10

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>192

seraspiletyrthrprogluvalglyarg

1510

<210>193

<211>13

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>193

ilethrserleuasnserleuasnleuproileleulys

1510

<210>194

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>194

trpleuglnleuseralagluarg

15

<210>195

<211>7

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>195

pheglutrpileserphelys

15

<210>196

<211>14

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>196

alametileserproleualaglyserthrservalleuarg

1510

<210>197

<211>15

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>197

alametproglugluvalleualaasnalapheglnileserarg

151015

<210>198

<211>16

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>198

pheglnthrglncysglnileglnasnleuasnalaleugluprolys

151015

<210>199

<211>27

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>199

ilegluserglualaglyvalthrgluphetrpaspglnasngluglu

151015

glnleuglncysalaasnvalalavalphearg

2025

<210>200

<211>21

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>200

leuvalleuvalalaleualaaspvalglyasnsergluasnglnleu

151015

aspglntyrleuarg

20

<210>201

<211>5

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>201

glyileilevalarg

15

<210>202

<211>15

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>202

glyleuproleuaspvalileglnasnserpheaspileserarg

151015

<210>203

<211>11

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從阿月渾子獲得

<400>203

serglumetthrilephealaproglyserarg

1510

<210>204

<211>12

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從核桃獲得

<400>204

glnglnasnleuasnhiscysglntyrtyrleuarg

1510

<210>205

<211>19

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從核桃獲得

<400>205

glncyscysglnglnleuserglnmetaspgluglncysglncysglu

151015

glyleuarg

<210>206

<211>12

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從核桃獲得

<400>206

glygluglumetgluglumetvalglnseralaarg

1510

<210>207

<211>12

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從核桃獲得

<400>207

aspleuproasnglucysglyileserserglnarg

1510

<210>208

<211>9

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從核桃獲得

<400>208

leuaspalaleugluprothrasnarg

15

<210>209

<211>27

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從核桃獲得

<400>209

glyleuglyasnasnvalpheserglypheaspalaasppheleuala

151015

aspalapheasnvalaspthrgluthralaarg

2025

<210>210

<211>8

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從核桃獲得

<400>210

trpleuglnleuseralagluarg

15

<210>211

<211>15

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從核桃獲得

<400>211

alaleuproglugluvalleualathralapheglnileproarg

151015

<210>212

<211>15

<212>prt

<213>未知

<220>

<223>從核桃獲得

<400>212

alaleuproglugluvalleualathralapheglnileproarg

151015