大豆主要過敏原Gly m Bd 28K的IgG結(jié)合表位的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物信息學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及大豆主要過敏原 GlymBd28K蛋白的IgG結(jié)合表位。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆蛋白作為主要的植物蛋白資源之一，富含人體所必需的氨基酸，且不含膽固 醇，具有很高的營養(yǎng)價值，但是有少部分人卻不能從中獲益，因為他們對大豆及其制品過 敏，通常的癥狀為起疹子、皮膚發(fā)癢、腹瀉。有調(diào)查顯示，大約1%~6%的嬰兒受到大豆過 敏的影響，且隨著豆制品消費量的增加，成年人大豆過敏的發(fā)病率不斷上升。
[0003] 過敏原表位是引發(fā)食物過敏反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，表位通常位于分子表面，大 小相當于抗體的結(jié)合部位，一般由5-7個氨基酸、單糖或核苷酸組成。根據(jù)過敏原表位結(jié)合 現(xiàn)象的不同，表位又有不同的稱謂，與抗體結(jié)合的稱為B細胞表位，其中包括IgE結(jié)合表位 和IgG結(jié)合表位，被Tc細胞、Th細胞、NK細胞識別的分別由稱為Tc細胞表位、Th細胞表 位、NK細胞表位；根據(jù)表位結(jié)構(gòu)的不同，又可分為不連續(xù)過敏原表位（構(gòu)象型表位）和連續(xù) 性過敏原表位（線性表位）。
[0004] 過敏反應(yīng)是一種復(fù)雜的變態(tài)反應(yīng)疾病，受各種因素的影響，其中IgE、IgG抗體在 過敏反應(yīng)中均發(fā)揮著重要作用。IgE抗體為致敏性抗體已得到公認，而IgG抗體在過敏反應(yīng) 中的作用也相當關(guān)鍵。根據(jù)免疫學(xué)變態(tài)反應(yīng)的機理，變態(tài)反應(yīng)包括I、II、III、IV四個類型， 從理論而言，食物過敏都可能涉及這些機理，而且在食物過敏中可能同時存在。在過敏反應(yīng) 中，特異性IgG抗體參與了四種過敏類型的前三種：I、II以及III型，由此可見IgG抗體在 過敏反應(yīng)中的重要作用。但是，關(guān)于大豆蛋白是如何致敏，大豆蛋白哪一部分與IgG抗體結(jié) 合，大豆蛋白與IgG抗體結(jié)合的結(jié)構(gòu)和氨基酸組成有何特點等的相關(guān)報道甚少。
[0005] 目前，普遍認為大豆中的主要過敏蛋白是GlymBd30k(P34)、GlymBd28k和 (6-伴球蛋白的a亞基，其中GlymBd30k能被65%的大豆過敏病人血清識別，是大豆中 致敏性最強的蛋白。GlymBd28K是大豆中致敏性僅次于GlymBd30K的蛋白，GlymBd 28K屬于Cupin蛋白家族，有一個普通的0 -桶形結(jié)構(gòu)。免疫篩選大豆種子成熟中期cDNA 文庫得到了該蛋白的全長cDNA。該cDNA克隆全長1567bp，含一個1419bp的開放閱讀框和 148bp的3' -非翻譯區(qū)域，帶有多聚腺苷酸尾巴。cDNA開放閱讀框編碼一個含473個氨基 酸的多肽，其中包括N末端21個氨基酸的端信號肽，隨后的多肽部分在加工成熟過程中被 剪切成兩個完整的蛋白，含220個氨基酸殘基的28K和含232個氨基酸殘基的23K，23K蛋 白被進一步證實為新的過敏原。
[0006] 在大豆過敏原蛋白中除了HosoyamaH等用鼠的單克隆抗體定位了GlymBd30K蛋白的IgG結(jié)合表位外，大豆其他過敏原的IgG結(jié)合表位目前未見報道，而在過敏病患者血 清過敏原特異性IgG抗體的檢測中，過敏疾病患者血清大豆過敏原特異性IgG抗體明顯升 高，GlymBd28K是大豆中致敏性僅次于GlymBd30K的蛋白，提示過敏原蛋白28K也存 在IgG結(jié)合表位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供大豆過敏蛋白Glym Bd 28K的IgG結(jié)合表位，探明食物過敏 產(chǎn)生的分子機制，了解過敏原在食物過敏反應(yīng)中的作用，開展無過敏和低過敏的食品研究。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容是：
[0009] -種大豆主要過敏原GlymBd28K蛋白的IgG結(jié)合表位，其氨基酸序列為：2%-Gly-Asp-Lys-Lys-Ser-Pro-Lys-Ser-Leu-Phe-Leu-Met-Ser-Asn-Ser-OH42。
[0010] -種大豆主要過敏原GlymBd28K蛋白的IgG結(jié)合表位，其氨基酸序列為：56!!-Leu-Lys-Ser-His-Gly-Gly-Arg-IIe-Phe-Tyr-Arg-His-Met-His-IIe-OH70 〇
[0011] -種大豆主要過敏原GlymBd28K蛋白的IgG結(jié)合表位，其氨基酸序列為：154!!-Glu-Thr-Phe-Gln-Ser-Phe-Tyr-IIe-Gly-Gly-Gly-Ala-Asn-Ser-HiS-OH168〇
[0012] 所述的GlymBd28K蛋白的IgG結(jié)合表位為合成多肽。
[0013] 所述的GlymBd28K蛋白的IgG結(jié)合表位為翻譯或轉(zhuǎn)錄該多肽的核苷酸序列。
[0014] 競爭ELISA方法測定多肽56H-Leu-Lys-Ser-His-Gly-Gly-Arg-Ile-Phe-Tyr-Arg-His-Met-His-Ile-OH?對GlymBd28K天然蛋白結(jié)合GlymBd28K單克隆抗體（mAb3F5) 的抑制效率。
[0015] GlymBd28K蛋白的IgG結(jié)合表位多肽56H-Leu-Lys-Ser-His-Gly-Gly-Arg-Ile -Phe-Tyr-Arg-His-Met-His-Ile-OH?上三個關(guān)鍵的IgG結(jié)合位點，分別為：64Phe、65Tyr、 66Arg〇
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：大豆過敏蛋白GlymBd28K的IgG結(jié)合表位多肽的發(fā)明， 對于探明食物過敏產(chǎn)生的分子機制，了解過敏原在食物過敏反應(yīng)中的作用，開發(fā)低過敏食 品以及預(yù)防過敏性疾病的發(fā)生具有重大意義。
[0017] 本發(fā)明利用生物信息學(xué)、多肽合成、細胞免疫學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)，以重疊多肽 掃描技術(shù)來鑒定分析大豆過敏蛋白GlymBd28K的IgG結(jié)合表位，對于探明食物過敏產(chǎn)生 的分子機制，了解過敏原在食物過敏反應(yīng)中的作用，開展無過敏和低過敏的食品研究，研究 過敏性疾病的發(fā)生具有重大意義。
【附圖說明】
[0018] 圖1是顯示重組蛋白的誘導(dǎo)表達與Westernblot鑒定；
[0019] 圖2是顯示復(fù)性蛋白經(jīng)Superdex-75層析柱純化；
[0020] 圖3是顯示SDS-PAGE分析Superdex-75層析柱洗脫峰蛋白；
[0021] 圖4為2號肽HPLC鑒定圖譜；
[0022] 圖5為2號肽MS鑒定圖譜；
[0023] 圖6為6號肽HPLC鑒定圖譜；
[0024] 圖7為6號肽MS鑒定圖譜；
[0025] 圖8為20號肽HPLC鑒定圖譜；
[0026] 圖9為20號肽MS鑒定圖譜；
[0027] 圖10是顯示合成多肽與BSA偶聯(lián)的結(jié)果；
[0028] 圖11是顯示合成多肽以及BSA與單克隆抗體反應(yīng)的結(jié)果；
[0029] 圖12是顯示陽性多肽對GlymBd28K天然蛋白的抑制；
[0030] 圖13是顯示突變多肽與mAb3F5的IgG反應(yīng)結(jié)果。
【具體實施方式】
[0031] 一、GlymBd28K重組蛋白的制備
[0032] IGlymBd28K重組蛋白的表達
[0033] 通過NCBIGenbank基因庫（登錄號：21619.2)中已知的GlymBd28K序列，設(shè) 計引物，進行PCR擴增。檢測、回收PCR產(chǎn)物，并與PMDT-19連接構(gòu)建克隆載體28K-T。將 28K-T和pET-28a質(zhì)粒分別用EcoRI和XhoI雙酶切，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28K，轉(zhuǎn)化大腸桿菌， IPTG誘導(dǎo)表達GlymBd28K重組蛋白。
[0034] 2Westernblot檢測
[0035] IPTG誘導(dǎo)的pET-28K全菌和未誘導(dǎo)全菌進行12%SDS-PAGE后，將SDS-PAGE電泳 分離的蛋白帶電轉(zhuǎn)到PVDF蛋白印跡膜，用5%脫脂奶粉37°C封閉lh，以Tris洗滌緩沖液充 分洗滌，加0.5yg/mLGlymBd28K多克隆抗體（多克隆抗體由實驗室制備、保存，方法參 照席俊等的論文，論文出處：席俊等.大豆主要過敏原GlymBd28K的分離純化及多抗血 清的制備?糧食與油脂[J]，2015, 28 (4) : 19-21.)，37°C孵育lh，TBST洗滌后，加0. 5yg/mL 的辣根過氧化物酶（HRP)標記的羊抗兔抗體，37°C作用lh，TBST充分洗滌，以3-氨基-9-乙 基咔唑（AEC)為底物顯色。
[0036] 3重組蛋白的純化與復(fù)性
[0037] 將PET-28K表達菌體經(jīng)溶菌酶和超聲波裂解后，離心分離和洗滌包涵體，溶解于 6M鹽酸胍溶液，用快速稀釋法復(fù)性，然后用Superdex-75層析純化pET-28K復(fù)性蛋白，收集 含目標蛋白的洗脫組分，并對其進行SDS-PAGE分析鑒定。
[0038] 4 結(jié)果
[0039] 4.IGlymBd28K的誘導(dǎo)表達和Westernblot鑒定
[0040] 對重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達后，分別取未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的菌液進行SDS-PAGE分析，由圖 I.A可知，誘導(dǎo)后的菌液，在相對分子質(zhì)量29.IkD左右有蛋白表達條帶出現(xiàn)，而預(yù)測的重組 蛋白氨基酸是259個，推測其相對分子質(zhì)量是29.lkD，因此表達出的蛋白分子量與預(yù)期相 符。表達蛋白在PVDF膜上顯示一大小為29.IKD的蛋白印跡，而重組質(zhì)粒誘導(dǎo)前細菌裂解 液則沒有，表明表達蛋白能與GlymBd28K多克隆抗體特異結(jié)合（圖I.B)。
[0041] 4. 2重組蛋白的純化
[0042] 用Superdex-75層析純化pET_28K蛋白，由圖2可知，復(fù)性溶液在約75ml處形成 單一蛋白洗脫峰。用SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)，復(fù)性溶液中只有單條29.IkD左右的蛋白條帶，未 見其它雜蛋白（圖3)。由此可知，純化出的蛋白純度較高，可用于抗體制備。
[0043] 二、GlymBd28K單克隆抗體的制備
[0044] IGlymBd28K單克隆抗體的制備
[0045] 1.1小鼠免疫
[0046] 7周齡SPF級BALB/c雌性小鼠6只，對小鼠進行背部皮下多點注射抗原，免疫劑量 為40yg/只，用IOOyL無菌PBS稀釋GlymBd28K重組蛋白與等量弗氏完全佐劑混合， 充分乳化（4000r/min，5min)。四周后加強免疫，免疫劑量為第一次免疫的30%，用IOOyL 無菌PBS稀釋抗原與等量的弗氏不完全佐劑充分乳化，每間隔三周加強免疫一次，共三次。 四免IOd后斷尾采血，間接ELISA測小鼠抗體血清的效價，若效價達到1:3200,則進行最后 一次加強免疫：取200yL無菌PBS溶解40yg抗原，注射到小鼠體內(nèi)。
[0047] 1. 2細胞融合
[0048] 加強免疫96h后，取小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0以1:2-1:10的比例 在PEG的作用下進行細胞融合，加入適量含有HAT的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到96孔板上，置于 37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7-10d后，HAT培養(yǎng)基半量換液，取出的細胞上清采用間接 ELISA方法檢測篩選，以融合小鼠血清做陽性對照，以免疫前小鼠血清做陰性對照。14d后， 改用HT培養(yǎng)基半量換液，將篩選出的陽性孔轉(zhuǎn)移至24孔板擴大培養(yǎng)。待細胞長至1/2孔 時，再次取上清測效價，對陽性孔進行3次有限稀釋亞克?。ㄍ踝粤?苯巴比妥殘留免疫學(xué) 快速檢測技術(shù)研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006)。
[0049] 1. 3單克隆抗體的制備
[0050] 單克隆抗體的制備采用體內(nèi)誘生腹水法：提前2周注射0. 5ml液體石蠟于BALB/ c小鼠腹腔，然后將約IXIO6個的雜交瘤細胞注入到小鼠腹腔，一周后天天查看小鼠腹部變 化，當小鼠腹部鼓起變硬時收集腹水，室溫離心（3000r/min，5min)，取上清以飽和硫酸銨 提純抗體，以紫外吸收法測IgG含量。
[0051] 1.4單克隆抗體免疫學(xué)特性的鑒定
[0052] 參照史巧巧論文中的方法（史巧巧.苯并芘的免疫學(xué)快速檢測技術(shù)研究[D].河 南工業(yè)大學(xué)，2014)測定單克隆抗體的效價、敏感性、親和力、亞型以及特異性。
[0053] 2 結(jié)果
[0054] 通過細胞融合與亞克隆，成功篩選出三株雜交瘤細胞，分別命名為2D9、3F5和 3H6,其單克隆抗體分別命名為mAb2D9、mAb3F5和mAb3H6。經(jīng)測定，mAb2D9、mAb3F5和mAb3H6 與小麥麥谷