本發(fā)明涉及分析化學(xué)和代謝組學(xué)領(lǐng)域。是一種用于大規(guī)模代謝組學(xué)數(shù)據(jù)校正的方法。

背景技術(shù)：

代謝組學(xué)是研究生物體內(nèi)源性小分子代謝物動態(tài)變化的一門學(xué)科，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后，系統(tǒng)生物學(xué)的又一重要分支。代謝物是基因調(diào)控的最終產(chǎn)物，是聯(lián)系基因型和生物表型的紐帶，通過對小分子代謝物的定性和定量分析可直接反映機體當(dāng)前的生理狀態(tài)。近年來，隨著分析技術(shù)的發(fā)展，代謝組學(xué)應(yīng)用已拓展至疾病的早期診斷和治療、臨床標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)、藥物篩選和毒性評價、藥物質(zhì)量控制、功能基因組學(xué)、植物學(xué)等多個生命科學(xué)研究領(lǐng)域。為了更深入地研究和驗證與疾病、藥物治療等相關(guān)的代謝變化，今年來大規(guī)模樣品的分析越來越受到重視。而大量樣品的分析需要消耗較長的分析時間，長時間的分析會造成儀器靈敏度的下降，因此通常需要將大量的樣品分成多個批次進行測試，每個批次間根據(jù)儀器響應(yīng)的狀態(tài)，需要更換一些必須的配件(如進樣墊、襯管等)、色譜柱及不同的儀器等。在這些操作過程中，通常會造成不同批次間的代謝數(shù)據(jù)存在隨機誤差及系統(tǒng)誤差，而難以實現(xiàn)大規(guī)模數(shù)據(jù)整合；為了實現(xiàn)來自不同批次，不同儀器的多個批次數(shù)據(jù)的整合，我們建立了一種大規(guī)模數(shù)據(jù)校正的方法，該方法可以同時校正隨機誤差和系統(tǒng)誤差，實現(xiàn)多個批次的整合，滿足大規(guī)模代謝組學(xué)分析的要求。

本發(fā)明通過計算相鄰兩個QC樣本中代謝物響應(yīng)強度的比值，將其從小到大排序后，篩選總比值個數(shù)的5％作為離散點，將這5％的離散點平均分配到排序后比值的兩端，從而篩選出代謝組數(shù)據(jù)中的隨機誤差，利用比值的線性擬合模型對隨機誤差進行校正。然后利用線性回歸模型構(gòu)建虛擬QC方法，實現(xiàn)大規(guī)模代謝數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)誤差校正。通過對上述過程的集成化處理，可以準(zhǔn)確、高效、高通量的校正大規(guī)模代謝組數(shù)據(jù)的隨機誤差和系統(tǒng)誤差，改善代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的質(zhì)量，實現(xiàn)大規(guī)模數(shù)據(jù)的整合。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于建立一種通用的大規(guī)模代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的校正方法。該方法可以同時校正隨機誤差和系統(tǒng)誤差，具有校正過程簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、通路高等特點，可廣泛地應(yīng)用于大規(guī)模代謝組學(xué)的研究中。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種通用的大規(guī)模代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的校正方法，首先通過計算相鄰兩個QC樣本中代謝物響應(yīng)強度的比值，建立模型篩選隨機誤差，然后利用線性擬合模型對隨機誤差進行校正。最后利用線性回歸模型構(gòu)建虛擬QC方法，實現(xiàn)大規(guī)模代謝組數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)誤差校正。

具體步驟如附圖1所示：

1)QC樣本的制作：分別從所有將進行化學(xué)輪廓分析的樣本中準(zhǔn)確稱量或移

取等量樣本并均勻混合成一個大的樣本，即QC樣本；

2)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的獲?。好?-20個待測樣本插入一個QC樣本，QC樣本和代測樣本按照完全相同條件進行樣本預(yù)處理和基于色譜-質(zhì)譜方法的代謝組學(xué)分析；

3)相鄰兩個QC樣品中代謝組數(shù)據(jù)比值的獲取：計算同一個代謝物在相鄰兩個QC樣品中的響應(yīng)強度的比值；

4)構(gòu)建模型篩選隨機誤差(附圖2)：將相鄰兩個QC樣品中代謝物的比值從小到大排序后，篩選總比值個數(shù)的5％作為離散點，將這5％的離散點平均分配到排序后比值的兩端，從而篩選出隨機誤差；

5)兩個相鄰QC樣品中正常比值的獲?。汉Y選到隨機誤差后，去除含有隨機誤差的代謝特征，計算不含有隨機誤差的正常代謝特征在相鄰兩個QC樣品中的比值；

6)線性擬合模型的構(gòu)建：將正常代謝特征在兩個相鄰QC樣本中的比值，進行從小到大排序，并進行線性擬合，獲得線性擬合模型的公式，將含有隨機誤差的代謝特征j帶入線性擬合模型的公式中，獲得校正因子其中AQC_nj和AQC'_(n-1)j分別代表特征j在QC_n中未校正的響應(yīng)值和在QC_(n-1)中校正后的響應(yīng)值；

7)校正隨機誤差：某一含有隨機誤差的代謝物j在QC_n中響應(yīng)值為AQ_nj，其校正后的響應(yīng)值A(chǔ)QC'_nj可以通過如下公式獲得；

8)利用所建立的篩選和校正代謝組學(xué)數(shù)據(jù)隨機誤差的方法對所有的QC樣本進行隨機誤差的篩選和校正；

9)線性回歸模型的構(gòu)建：應(yīng)用每個代謝特征在相鄰兩個QC樣品中的響應(yīng)強度值，構(gòu)建代謝特征的線性回歸模型；

10)虛擬QC方法(附圖3)的建立：根據(jù)兩個相鄰QC樣本間，實際分析地樣本的個數(shù)，將上述所構(gòu)建的某一代謝特征j的線性回歸模型進行均等分，每個實際樣品i均獲得一個虛擬的QC樣品，其響應(yīng)值A(chǔ)QC_{v_ij}的計算公式如下：

式中，a和b代表線性回歸模型的斜率和節(jié)距，i代表實際樣品在線性回歸模型中的位置；

11)系統(tǒng)誤差校正：利用上述所得到的實際樣品i中代謝特征j的虛擬QC的響應(yīng)值A(chǔ)QC_{v_ij}，對其實測響應(yīng)強度Ax_ij進行系統(tǒng)誤差的校正，校正后的響應(yīng)值A(chǔ)x'_ij，可以通過如下公式獲得：

本發(fā)明具有的效果是：有效、準(zhǔn)確地校正代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中的隨機誤差和系統(tǒng)誤差，該數(shù)據(jù)處理過程簡單方便、通量高、校正效果明顯，可以顯著地改善代謝組數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

附圖說明

從下面結(jié)合附圖的詳細描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中：

圖1隨機誤差和系統(tǒng)誤差校正方法的基本流程示意圖。

圖2篩選隨機誤差的示意圖。

圖3虛擬QC校正方法的示意圖。

圖4是實施例中的實驗設(shè)計。

圖5是實施列中我們建立的校正隨機誤差和系統(tǒng)誤差的方法與傳統(tǒng)的內(nèi)標(biāo)校正和總峰面積校正方法比較的結(jié)果。其中(A)PCA分析中QC樣品的歐式距離和皮爾森相關(guān)系數(shù)，(B)QC樣本的RSD分布圖，圖(B)中，使用圓圈對曲線進行標(biāo)記，圓圈曲線從上至下依次為隨機+系統(tǒng)誤差校正；內(nèi)標(biāo)校正；總峰面積校正。

具體實施方式

下面通過實例進一步闡釋本發(fā)明，實例僅限于說明本發(fā)明以便于理解，而非對本發(fā)明的限定。

實施例1

采用氣相色譜-單四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-Q-MS)測定來自云南、河南、貴州三個產(chǎn)地的新鮮中部煙葉共1197個。所有的樣品在2臺不同的GC-MS儀器(GC-MS QP2010和QP2010-plus)及9個不同批次的實驗中被分析，其中批次1有188個樣本，批次2有209個樣本,批次3有25個樣,批次4有25個樣,批次5有156個樣,批次6有97個樣,批次7有84個樣,批次8有354個樣,批次9有59個樣本，不同的批次間進行了儀器配件的更換、質(zhì)譜參數(shù)的調(diào)諧及色譜柱的更換等操作。附圖4列出了本實施例的實驗設(shè)計。

1.樣品

以新鮮煙葉樣本為例，采集不同產(chǎn)地的新鮮中部煙葉，-196℃液氮保存，運輸，液氮條件下研磨，低溫凍干，-80℃冰箱儲存。每個煙末樣本中分別稱量0.5g，均勻混合，生成一個新的樣本，即質(zhì)量控制(QC)樣本。QC樣本可以用于建立氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)擬靶標(biāo)代謝組學(xué)方法、評價分析方法的重復(fù)性及校正實際樣品代謝組數(shù)據(jù)的誤差。

2.隨機誤差的篩選和校正方法：

2.1GC-MS代謝組學(xué)分析

(1)樣品預(yù)處理：

煙草鮮葉樣本從-80℃冰箱中取出，4℃冰箱過夜放置后，室溫下放置1小時。準(zhǔn)確稱取10mg煙草鮮葉樣本，加入1.5mL乙腈/異丙醇/水(3/3/2,v/v/v),此時內(nèi)標(biāo)十三酸的的濃度相當(dāng)于1.3μg/ml,渦旋振蕩提取4分鐘后，14000rpm離心10分鐘，取0.5mL上清，低溫減壓干燥。衍生采用肟化反應(yīng)和硅烷化反應(yīng)兩步法，第一步加入100μL甲氧胺鹽酸鹽-吡啶溶液(20mg/mL)，37℃水浴衍生90分鐘；第二步加入80mL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺進行硅烷化反應(yīng)，反應(yīng)時間60分鐘。取上清1μL用于進樣。

(2)GC-MS分析條件：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的分析在島津QP2010氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)完成；色譜柱為安捷倫DB-5MS毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；氦氣作為載氣，流量1.2mL/min；進樣口溫度300℃，分流比10：1；程序升溫：初始70℃，保持3分鐘，5℃/min升至310℃，保持5分鐘。進樣量1μL。EI電離模式(70eV)，傳輸線溫度280℃，離子源240℃，質(zhì)量掃描范圍33-600m/z，GC-MS擬靶標(biāo)分析方法的建立流程主要包括以下幾個方面，首先采用ChromaTOF(Leco)和AMDIS(NIST)軟件對QC樣品的GC-MS全掃描數(shù)據(jù)進行去卷積和峰識別，確定輪廓分析的目標(biāo)化合物，通過計算相鄰化合物的保留時間，對所有待分析的化合物進行分組，進行組內(nèi)特征離子的選擇。根據(jù)化合物的特征離子、保留時間和分組信息建立基于GC-MS擬靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法，該方法包括50個分組，319個代謝物。擬靶標(biāo)分析方法的其他參數(shù)與全掃描模式相同。

2.2代謝組輪廓數(shù)據(jù)的生成

采集的原始代謝組輪廓數(shù)據(jù)由ChromaTOF(Leco)和AMDIS(NIST)軟件進行去卷積和峰識別。隨后，采用島津Postrun軟件進行色譜峰的匹配，保留時間窗口設(shè)為0.2min。

2.3構(gòu)建模型篩選隨機誤差

將相鄰兩個QC樣品中代謝物響應(yīng)強度的比值從小到大排序后，篩選總比值個數(shù)的5％作為離散點，將這5％的離散點平均分配到排序后比值的兩端(附圖2)，從而篩選出隨機誤差。

2.4構(gòu)建線性擬合模型校正隨機誤差

篩選到隨機誤差后，去除含有隨機誤差的代謝特征，計算不含有隨機誤差的正常代謝特征在相鄰兩個QC樣品中的比值，并對其進行從小到大排序，

然后建立線性擬合模型，獲得擬合模型的公式，將含有隨機誤差的代謝特征j帶入線性擬合模型的公式中，獲得校正因子其中AQC _nj和AQC'_(n-1)j分別代表特征j在QC_n中未校正的響應(yīng)值和在QC_(n-1)中校正后的響應(yīng)值。最后，某一含有隨機誤差的代謝物j在QC_n中響應(yīng)值為AQ_nj，其校正后的響應(yīng)值A(chǔ)QC'_nj的可以通過如下公式獲得；

2.5構(gòu)型虛擬QC方法校正系統(tǒng)誤差

應(yīng)用每個代謝特征在相鄰兩個QC樣品中的響應(yīng)強度值，構(gòu)建代謝特征的線性回歸模型(附圖3)。根據(jù)兩個相鄰QC樣本間，分析地實際樣本的個數(shù)，將上述所構(gòu)建的某一代謝特征j的線性回歸模型進行均等分，每個實際樣品i均獲得一個虛擬的QC樣品，其響應(yīng)值A(chǔ)QC_{v_ij}的計算公式如下：

式中，a和b代表線性回歸模型的斜率和節(jié)距，i代表實際樣品在線性回歸模型中的位置。

利用上述所得到的實際樣品i中代謝特征j的虛擬QC的響應(yīng)值A(chǔ)QC_{v_ij}，對其實測響應(yīng)強度Ax_ij進行系統(tǒng)誤差的校正，校正后的響應(yīng)值A(chǔ)x'_ij，可以通過如下公式獲得：

2.6與常用的內(nèi)標(biāo)校正和總峰面積校正的結(jié)果比較

與實施例1類似。將實驗所獲得的GC-MS擬靶標(biāo)代謝組數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)校正和總峰面積校正，輸出結(jié)果，并對所計算的結(jié)果進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與內(nèi)標(biāo)校正和總峰面積校正相比，我們建立的校正隨機誤差和系統(tǒng)誤差的方法，可以使所有的QC樣品，展現(xiàn)出較大的皮爾森相關(guān)系數(shù)、較小的歐式距離和RSD值(附圖5)，說明應(yīng)用我們建立的校正方法可以使所有的QC樣品在PCA中聚集的更緊密，并顯著地改善QC的重復(fù)性?？傊?，本發(fā)明給出了一種通用的大規(guī)模代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的校正方法。與傳統(tǒng)的內(nèi)標(biāo)校正和總峰面積校正方法相比，本發(fā)明同時校正了隨機誤差和系統(tǒng)誤差，可以實現(xiàn)不同批次、不同儀器大規(guī)模代謝數(shù)據(jù)的整合。首次采用相鄰兩組質(zhì)量控制樣品的比值篩選隨機誤差，然后利用線性擬合模型對隨機誤差進行校正。最后利用線性回歸模型構(gòu)建虛擬QC方法，實現(xiàn)大規(guī)模代謝組數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)誤差校正。采用本發(fā)明方法比傳統(tǒng)的內(nèi)標(biāo)校正和總峰面積校正方法有更好的校正效果，校正后數(shù)據(jù)重復(fù)性好、歐式距離小和皮爾森相關(guān)系數(shù)大。