本發(fā)明涉及一種中藥的檢測方法，特別涉及一種中藥香加皮的指紋圖譜的建立及有關(guān)成分的含量測定方法

背景技術(shù)：
：

香加皮為蘿摩科植物杠柳Periploca sepium Bge.的干燥根皮，辛、苦，溫；有毒。歸肝、腎、心經(jīng)。具有利水消腫，祛風(fēng)濕，強(qiáng)筋骨之功效，目前臨床上也常用于治療慢性心衰。香加皮原植物杠柳為野生，未有規(guī)范種植基地，藥材質(zhì)量很難控制，其中所含強(qiáng)心苷類物質(zhì)(杠柳毒苷等)既為有效成分，又為有毒成分，臨床應(yīng)用中亦常出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。2010版《中國藥典》只對4-甲氧基水楊醛進(jìn)行了含量測定，指標(biāo)單一，難以控制香加皮的整體質(zhì)量。但香加皮在應(yīng)用中存在著混用嚴(yán)重，誤用、過量或長期服用均易產(chǎn)生中毒現(xiàn)象，存在安全隱患。

毒性未受重視。香加皮具有多種藥理作用，近年來，香加皮作為傳統(tǒng)中藥常用于治療慢性充血性心衰，但在用藥中常見不良反應(yīng)和致死性病例的報(bào)道，這與其自身毒性有關(guān)。2010版中國藥典中雖注明香加皮有毒，但其含量測定項(xiàng)下只有4-甲氧基水楊醛一個(gè)指標(biāo)，此成分是香加皮的主要香氣成分，無法代表香加皮的藥效和毒性，因此不能對香加皮的質(zhì)量進(jìn)行有效控制。近年來，香加皮作為傳統(tǒng)中藥治療慢性充血性心衰有其獨(dú)特優(yōu)勢，目前應(yīng)用也越來越多，但強(qiáng)心苷安全窗小，藥材含量波動(dòng)大，作用強(qiáng)，一直以來頻有中毒現(xiàn)象發(fā)生。香加皮的安全監(jiān)管勢在必行。

有毒成分波動(dòng)大。香加皮原植物杠柳多生于山野、河邊、砂質(zhì)地，采收期為春、秋兩季，主產(chǎn)地為山東、山西、河北、河南4省，其中以山西、河南產(chǎn)量最大，此外四川、甘肅、湖南、遼寧、吉林、江蘇等地亦有產(chǎn)。產(chǎn)地分布范圍大，采收期也有春、秋之別，使得香加皮藥材中各成分差異大，質(zhì)量波動(dòng)不穩(wěn)定。

近年來，關(guān)于香加皮質(zhì)控的文獻(xiàn)有：同時(shí)測定4-甲氧基水楊醛和杠柳毒苷，同時(shí)測定4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷和異香草醛。同時(shí)測定香加皮中以4-甲氧基水楊醛、綠原酸和杠柳毒苷的含量未報(bào)道過。目前對于指紋圖譜的研究僅有李丹毅進(jìn)行了香加皮HPLC指紋圖譜研究，針對香加皮化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究多為單一成分為指標(biāo)的含量測定分析，李丹毅等開展了香加皮指紋圖譜的研究，但所建立的HPLC指紋圖譜檢測時(shí)間為80分鐘，分析耗時(shí)長，損耗試劑多，不利于進(jìn)行多批次樣本的分析。

因此，急需建立一種檢測更加全面、更快速的香加皮質(zhì)量評價(jià)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明提供一種香加皮有效成分的測定方法、超高液相指紋圖譜的建立方法以及采用此方法得到的超高效液相標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜。

根據(jù)本發(fā)明所提供的香加皮的有效成分測定方法，包括以下步驟：

(1)對照品溶液的制備

稱取綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷對照品，加甲醇制得混合對照品溶液；

(2)供試品溶液的制備

取香加皮干燥粉碎，過篩，精密稱取，加入甲醇溶液，提取20-50min，放冷，離心，取上清液，即得供試品溶液；

(3)測定法：

吸取混合對照品溶液和供試品溶液，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量。

其中，超高效液相色譜儀的色譜條件如下：

色譜柱選自：C18色譜柱，

流動(dòng)相：0.1％-1％磷酸水溶液-甲醇流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相的流速為0.1-0.5mL/min，柱溫30-40℃，

檢測波長：220-230nm。

根據(jù)本發(fā)明的測定方法，步驟(1)中混合對照品溶液中綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷的濃度范圍分別為0.332mg·L^-1-33.2mg·L^-1、1.61mg·L^-1-161.1mg·L^-1、0.968mg·L^-1-96.8mg·L^-1。

本發(fā)明最優(yōu)選的對照品溶液的制備方法為：分別取綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷對照品適量，精密稱定，甲醇溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為33.2mg·L^-1、161.1mg·L^-1、96.80mg·L^-1的混合對照品貯備液，存貯于4℃冰箱中備用。精密量取混合對照品貯備溶液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為含量測定用混合對照溶液，綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷質(zhì)量濃度分別為16.62mg·L^-1、8.05mg·L^-1、4.84mg·L^-1，存貯于4℃冰箱中備用。

根據(jù)本發(fā)明，流動(dòng)相為0.1％磷酸水溶液-甲醇，梯度程序如下：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式之一，梯度程序優(yōu)選為：0～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇；13～19min,57％～90％甲醇；19～20min,90％甲醇。

根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，梯度程序可以為：

根據(jù)本發(fā)明的測定方法，所述步驟(3)中溶液的進(jìn)樣量可以為0.5-2μL。

根據(jù)本發(fā)明，最優(yōu)選的色譜條件為：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動(dòng)相0.1％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫：0～3min,10％～25％B；3～8min,25％～37％B；8～11.5min,37％～45％B；11.5～13min,45％～57％B；13～19min,57％～90％B；19～20min,90％B。流速0.3mL·min^-1；檢測波長220nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量1μL。3種成分的理論塔板數(shù)均不低于6000，此色譜條件檢測時(shí)間短，信息量豐富，亦用于指紋圖譜的分析，對照品及樣品圖譜見附圖1。

根據(jù)本發(fā)明的測定方法，所述步驟(2)中提取方法可以為超聲提取、回流提取或索氏提取。

根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，步驟(2)中香加皮的稱樣量為0.125g-1.000g。

根據(jù)本發(fā)明，最優(yōu)選的供試品溶液的制備方法為：樣品干燥粉碎，分別取各樣品粉末(過三號篩)0.25g，精密稱定，置于25mL容量瓶中，加入30％甲醇溶液20mL，超聲提取40min(功率500W，頻率40kHz，水溫在25℃以下)，放冷，30％甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，取適量至離心管中，于15000r·min^-1下高速離心10min，取上清液，即得。

供試品的提取時(shí)間會(huì)影響最終圖譜的出峰情況，40min的出峰個(gè)數(shù)最多，信息豐富，而提取時(shí)間低于10min則提取不完全。因此，在步驟(2)中最優(yōu)選的提取時(shí)間為40min。

根據(jù)本發(fā)明的測定方法，采用該方法得到的指紋圖譜相對保留時(shí)間為：

本發(fā)明的另一目的是提供一種香加皮超高液相指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：

(1)對照品溶液的制備

分別取綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷對照品，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為0.332mg·L^-1-33.2mg·L^-1、1.61mg·L^-1-161.1mg·L^-1、0.968mg·L^-1-96.8mg·L^-1的混合對照品貯備液。

(2)供試品溶液的制備

取香加皮干燥粉碎，過篩，精密稱取，加入30％甲醇溶液，采用超聲提取、回流提取或者索氏提取40min，放冷，離心，取上清液，即得供試品溶液。

(3)獲得色譜圖

以對照品溶液作為參照物，將供試品溶液和對照品溶液注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，

其中，所述超高效液相色譜儀的色譜條件如下：

色譜柱選自：C18色譜柱，

流動(dòng)相：0.1％磷酸水溶液-甲醇流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。梯度程序?yàn)?～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇；13～19min,57％～90％甲醇；19～20min,90％甲醇。流動(dòng)相的流速為0.3mL/min，柱溫35℃。

檢測波長：220nm。

香加皮藥材的UPLC圖參見附圖1。

(4)生成對照指紋圖譜：

選擇合格的多批香加皮樣品的指紋圖譜，以綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷峰為參比峰，得到17個(gè)共有峰的圖譜，(參見附圖2)按中位數(shù)法計(jì)算生成標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜(參見附圖3)，其中，指紋圖譜相對保留時(shí)間為：

本發(fā)明優(yōu)選的方法、色譜條件和溶劑提取方法，是經(jīng)過篩選得到的，篩選過程如下：

1儀器與試藥

1.1儀器 超高效液相色譜系統(tǒng)(ACQUITY UPLC，美國Waters公司，包括二元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、TUV檢測器、Empower2工作站)，電子天平(XS205，瑞士METTLER TOLEDO公司)，粉碎機(jī)(MF10，德國IKA公司)，高速冷凍離心機(jī)(ST16R，美國Thermo公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)，超聲波清洗器(KQ-500DV，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2藥品與試劑 杠柳毒苷(批號111793-200901，純度93.8％)，4-甲氧基水楊醛(批號110790-201303，純度98.8％)，綠原酸(批號110753-201314，純度96.6％)對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院。甲醇(色譜純，德國Merck公司)，磷酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，超純水(Milli-Q制備)。

1.3藥材樣本采集 30批不同來源的香加皮藥材均為春季野生采集，樣品經(jīng)中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院秦民堅(jiān)教授鑒定，均為蘿摩科植物杠柳Periploca sepium Bge.的干燥根皮。藥材詳細(xì)信息見表1。

表1 30批香加皮藥材樣品信息

3結(jié)果

3.1香加皮3種成分含量測定

3.1.1線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.1，0.5，1，2，4，5，6，8mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別將此8種對照品溶液及混合對照貯備液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量均為1μL，測定 峰面積。結(jié)果以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對照品溶液質(zhì)量濃度X(mg·L^-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表2，各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.2定量限與檢測限 將對照品溶液逐級稀釋后，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，信噪比(S/N)為3時(shí)的質(zhì)量濃度(mg.L^-1)為檢測限(LOD)，信噪比(S/N)為10時(shí)的質(zhì)量濃度(mg.L^-1)為定量限(LOQ)，結(jié)果見表2。

表2 3種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限、檢測限

3.1.3精密度試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液1μL，在2.1項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算3種成分的RSD(n＝6)，考察精密度。4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷的RSD值分別為1.1％，1.0％，1.7％，儀器精密度良好。

3.1.4重復(fù)性試驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液(樣品H1)，2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以3種成分含量為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察方法的重復(fù)性。綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷的RSD值分別為0.9％，1.3％，1.9％，重復(fù)性良好。

3.1.5穩(wěn)定性 按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液(樣本H1)，室溫放置，按

2.1項(xiàng)下色譜條件分別在0,1,2,4,8,12,18,24h進(jìn)樣分析，以峰面積值為指標(biāo)計(jì)算3種成分的RSD，考察穩(wěn)定性。綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷的RSD值分別為1.7％，1.1％，1.5％，表明樣品24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.6加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量(樣本H1)的香加皮藥材樣品6份，每份0.125g，精密稱定，置于25mL容量瓶中，分別精密加入對照品溶液適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算3種成分的加樣回收率。綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷平均回收率分別為96.78％，96.49％，99.01％；RSD分別為1.16％，1.24％，1.36％。

3.1.7樣品的含量測定 按2.2.2項(xiàng)下方法制備30批供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件分別測定30批香加皮樣品中綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 30批香加皮中3種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n＝2)

mg.g^-1

注：1.綠原酸；2. 4-甲氧基水楊醛；3.杠柳毒苷。

3.2香加皮的指紋圖譜研究

從香加皮的UPLC圖可見，香加皮所含成分復(fù)雜，受對照品等因素限制，前文中僅對含量較高的綠原酸、4-甲氧基水楊醛和毒性成分杠柳毒苷3種成分進(jìn)行了含量測定。但僅用幾種成分來控制藥材質(zhì)量較片面，香加皮藥材中其他成分同樣有可能對藥材質(zhì)量產(chǎn)生不同程度的影響。故本發(fā)明進(jìn)一步建立了香加皮的UPLC指紋圖譜。

3.2.1指紋圖譜方法學(xué)

3.2.1.1精密度 按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液(樣本H1)，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，考察各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時(shí)間RSD<0.4％，相對峰面積RSD<2.3％。表明儀器穩(wěn)定，精密度良好。

3.2.1.2重復(fù)性 按2.2.2項(xiàng)方法平行制備供試品溶液(樣本H1)6份，按2.1

項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，考察各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時(shí)間RSD<0.5％，相對峰面積RSD<2.6％。表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.1.3穩(wěn)定性 按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液(樣本H1)，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0,2,4,6,12,24h測定其指紋圖譜，考察各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時(shí)間RSD<1.3％，相對峰面積RSD<2.4％。表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.2.2指紋圖譜測定 按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄30批香加皮樣品的色譜圖(圖2)，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件對香加皮指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，確定共有峰17個(gè)，生成對照指紋圖譜(圖3)，各產(chǎn)地香加皮藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜比對，相似度結(jié)果見表4。

表4 30批香加皮藥材UPLC指紋圖譜共有峰的相似度

4指紋圖譜結(jié)合成分含量的質(zhì)量對比分析

4.1直觀分析 分析表3中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，河南省與山西省樣品中3個(gè)成分均有不同程度的差異，其中杠柳毒苷在2省中的差異尤為明顯，RSD相差2倍以上，說明與河南省相比，山西省杠柳毒苷含量差異較小，毒性成分含量較穩(wěn)定，安全性較高。分析表4中數(shù)據(jù)，同樣發(fā)現(xiàn)與河南相比，山西省樣品相似度數(shù)據(jù)較集中，說明基于指紋圖譜數(shù)據(jù)直觀分析，山西省香加皮質(zhì)量較均一。

4.2顯著性差異分析 為了更客觀地分析4個(gè)指標(biāo)(綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷和相似度)在河南省、山西省之間的差異，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對兩個(gè)省中的4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異分析。4個(gè)指標(biāo)不能同時(shí)滿足正態(tài)分布(Shapiro-Wilk test)和方差齊次(Levene’s test)，均采取非參數(shù)檢驗(yàn)(Kolmogorov-Smirnov test)，顯著性水平為0.05。結(jié)果顯示，杠柳毒苷含量在河南、山西省間有顯著性差異，其余3個(gè)指標(biāo)無顯著性差異，與直觀分析結(jié)果一致?！吨袊幍洹?010年版規(guī)定香加皮的含測指標(biāo)只有4-甲氧基水楊醛，而上述分析發(fā)現(xiàn)，僅此一種成分無法有效反映和控制香加皮的真實(shí)質(zhì)量和毒性。為了驗(yàn)證已建立的香加皮質(zhì)量評價(jià)方法，同時(shí)進(jìn)一步說明2省香加皮的內(nèi)在品質(zhì)差異，本發(fā)明運(yùn)用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

4.3系統(tǒng)聚類分析 以表3中30份樣品的3種成分含量、各成分含量比值和表4相似度為變量，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對樣品進(jìn)行聚類分析。采用利差平方 和法(Ward法)，以歐式距離平方(Squared euclidean distance)作為樣品測度，聚類樹狀圖見圖4。

由系統(tǒng)聚類樹狀圖可以看出，30批香加皮樣品被分為兩類，與樣品原產(chǎn)地基本一致。表明兩產(chǎn)區(qū)香加皮基于3種成分(綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷)及相似度的綜合評價(jià)數(shù)據(jù)有差異，此評價(jià)方法可用于香加皮藥材的質(zhì)量評價(jià)及比較。

4.4主成分分析 在聚類分析的基礎(chǔ)上，對原變量進(jìn)行主成分分析。提取2個(gè)主成分PC1和PC2，累計(jì)貢獻(xiàn)率為72.69％，其中PC1貢獻(xiàn)38.51％，PC2貢獻(xiàn)34.17％。PC1主要反映了綠原酸、相似度、綠原酸與4-甲氧基水楊醛的含量比。PC2主要反映了4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷、4-甲氧基水楊醛與杠柳毒苷的含量比、杠柳毒苷與綠原酸的含量比?；究梢哉f明各指標(biāo)的所有信息。根據(jù)兩主成分(PC1、PC2)的得分系數(shù)，計(jì)算每個(gè)樣本PC1、PC2的得分變量值，并繪出PC1、PC2得分變量的散點(diǎn)圖，見圖5。

從圖5中可以看出，30個(gè)樣品被分為2組，與聚類分析結(jié)果一致。同時(shí)由圖可知，與河南省相比，山西省樣本分布較集中，與直觀分析結(jié)果一致，進(jìn)一步說明山西省香加皮質(zhì)量較均一。

本發(fā)明運(yùn)用UPLC同時(shí)測定香加皮中3種成分，并建立了香加皮UPLC指紋圖譜。檢測成分在20min內(nèi)即可達(dá)到較好分離和測定，較HPLC指紋圖譜的80min，大大縮短了分析時(shí)間，且信息量大，可同時(shí)進(jìn)行成分定量及指紋圖譜研究，對于大樣本量的分析更有優(yōu)勢，因此更適合工業(yè)化大生產(chǎn)的檢測。

在流動(dòng)相的選擇上，加入磷酸可以改善拖尾，且酸性條件下可見峰個(gè)數(shù)明顯增加，信息更豐富。因乙腈洗脫能力較強(qiáng)，乙腈-磷酸水體系對極性差異小的成分間分離效果不理想，故本發(fā)明嘗試采用甲醇-磷酸水進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果顯示分離效果明顯提高?？疾觳煌釢舛燃皟上啾壤?，最終確定甲醇-0.1％磷酸水為最佳流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

本發(fā)明在多樣本量的基礎(chǔ)上，分析了產(chǎn)量較高的山西、河南產(chǎn)香加皮中3種成分的變化，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)對比，發(fā)現(xiàn)杠柳毒苷含量在兩省中有顯著性差異。由 于杠柳毒苷具有強(qiáng)心作用，同時(shí)又為毒性成分，所得數(shù)據(jù)可為臨床正確安全地選用香加皮提供一定參考依據(jù)。30批樣品的UPLC指紋圖譜，除H3、H11以外，相似度均在0.9以上，說明從指紋圖譜角度看，2省香加皮藥材質(zhì)量有差異也有共性，指紋圖譜可用于香加皮的質(zhì)量研究，但單獨(dú)使用在闡明差異方面尚顯不足。綜合以上兩方面，建立“指紋圖譜+多成分含量測定”評價(jià)方法，運(yùn)用聚類分析(HCA)和主成份分析(PCA)綜合多方面信息系統(tǒng)探討2省香加皮質(zhì)量的差異，驗(yàn)證本發(fā)明評價(jià)方法的可行性。聚類分析將30個(gè)供試品分成了2大類，與生藥學(xué)鑒定結(jié)果基本一致，同時(shí)主成份分析也進(jìn)一步精確驗(yàn)證了此分類結(jié)果，且可直觀看出，山西省較河南省質(zhì)量分布更集中，較穩(wěn)定。

UPLC“指紋圖譜+多成分含量測定”評價(jià)方法說明了兩省香加皮藥材質(zhì)量有差異，通過本發(fā)明可以為香加皮的產(chǎn)地選擇、臨床應(yīng)用及質(zhì)量快速評價(jià)提供參考指導(dǎo)作用。在此基礎(chǔ)上，若將藥效、毒性與物質(zhì)基礎(chǔ)結(jié)合起來，深入開展譜效學(xué)研究，則更有利于闡明中藥作用機(jī)制，為完善香加皮的質(zhì)量評價(jià)體系，確保用藥安全提供進(jìn)一步保障。

本發(fā)明運(yùn)用UPLC同時(shí)測定香加皮中3種成分，并建立了香加皮UPLC指紋圖譜。檢測成分在20min內(nèi)即可達(dá)到較好分離和測定，較HPLC指紋圖譜的80min，大大縮短了分析時(shí)間，且信息量大，可同時(shí)進(jìn)行成分定量及指紋圖譜研究，對于大樣本量的分析更有優(yōu)勢。

在流動(dòng)相的選擇上，加入磷酸可以改善拖尾，且酸性條件下可見峰個(gè)數(shù)明顯增加，信息更豐富。因乙腈洗脫能力較強(qiáng)，乙腈-磷酸水體系對極性差異小的成分間分離效果不理想，故本發(fā)明嘗試采用甲醇-磷酸水進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果顯示分離效果明顯提高。考察不同酸濃度及兩相比例，最終確定甲醇-0.1％磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

附圖說明

圖1香加皮藥材的UPLC圖

A.對照品；B.樣品；峰1.綠原酸；峰2.4-甲氧基水楊醛；峰3.杠柳毒苷。圖230批香加皮的UPLC指紋圖譜

圖3香加皮的對照指紋圖譜

圖4河南省、山西省香加皮系統(tǒng)聚類分析

圖5樣品主成分得分變量散點(diǎn)圖

圖6根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1所得色譜圖

圖7根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2所得色譜圖

圖8根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3所得色譜圖

圖9根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4所得色譜圖

圖10根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5所得色譜圖

圖11根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例6所得色譜圖

圖12根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例7所得色譜圖

具體實(shí)施方式：

以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

(1)對照品溶液制備

分別取綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷對照品適量，精密稱定，甲醇溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為33.24mg·L^-1、161.1mg·L^-1、96.80mg·L^-1的混合對照品貯備液，存貯于4℃冰箱中備用。精密量取混合對照品貯備溶液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為含量測定用混合對照溶液，綠原酸、4-甲氧基水楊醛、杠柳毒苷質(zhì)量濃度分別為16.62mg·L^-1、8.05mg·L^-1、4.84mg·L^-1，存貯于4℃冰箱中備用。

(2)供試品溶液制備

香加皮樣品(表1之S5號樣品)干燥粉碎，分別取各樣品粉末(過三號篩)0.25g，精密稱定，置于25mL容量瓶中，加入30％甲醇溶液20mL，30％甲醇提取40min(功率500W，頻率40kHz，水溫在25℃以下)，放冷，30％甲醇 溶液稀釋至刻度，搖勻，取適量至離心管中，于15000r·min^-1下高速離心10min，取上清液，即得。

(3)測定，生成對照指紋圖譜

吸取混合對照品溶液和供試品溶液(S5)，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖(參見附圖6)計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量(參見表5)。

表5

色譜條件為：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動(dòng)相0.1％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序見表6。流速0.3mL·min^-1；檢測波長220nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量1μL。

表6

根據(jù)上述條件得到的指紋圖譜相對保留時(shí)間參見表7。

表7

實(shí)施例2

(1)對照品溶液制備

同實(shí)施例1

(2)供試品溶液制備

香加皮樣品為表1之H6號樣品，其他部分同實(shí)施例1。

(3)測定，生成對照指紋圖譜

吸取混合對照品溶液和供試品溶液(H6)，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖(參見附圖7)計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量(參見表8)。

表8

色譜條件為：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動(dòng)相0.2％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序見表9。流速0.4mL·min^-1；檢測波長225nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量0.5μL。

表9

根據(jù)上述條件得到的指紋圖譜相對保留時(shí)間參見表10。

表10

實(shí)施例3

(1)對照品溶液制備

同實(shí)施例1

(2)供試品溶液制備

香加皮樣品為表1之H4號樣品，其他部分同實(shí)施例1。

(3)測定，生成對照指紋圖譜

吸取混合對照品溶液和供試品溶液(H4)，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖(參見附圖8)計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量(參見表11)。

表11

色譜條件為：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動(dòng)相0.3％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序見表12。流速0.4mL·min^-1；檢測波長225nm；柱溫33℃；進(jìn)樣量0.8μL。

表12

根據(jù)上述條件得到的指紋圖譜相對保留時(shí)間參見表13。

表13

實(shí)施例4

(1)對照品溶液制備

同實(shí)施例1

(2)供試品溶液制備

香加皮樣品為表1之H4號樣品，其他部分同實(shí)施例1。

(3)測定，生成對照指紋圖譜

吸取混合對照品溶液和供試品溶液(H4)，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖(參見附圖9)計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量(參見表14)。

表14

色譜條件為：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動(dòng)相0.5％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序見表15。流速0.5mL·min^-1；檢測波長230nm；柱溫38℃；進(jìn)樣量1μL。

表15

根據(jù)上述條件得到的指紋圖譜相對保留時(shí)間參見表16。

表16

實(shí)施例5

(1)對照品溶液制備

同實(shí)施例1

(2)供試品溶液制備

香加皮樣品為表1之H2號樣品，其他部分同實(shí)施例1。

(3)測定，生成對照指紋圖譜

吸取混合對照品溶液和供試品溶液(H2)，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖(參見附圖10)計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量(參見表17)。

表17

色譜條件為：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動(dòng)相1％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序見表18。流速0.2mL·min^-1；檢測波長220nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量1.8μL。

表18

根據(jù)上述條件得到的指紋圖譜相對保留時(shí)間參見表19。

表19

實(shí)施例6

(1)對照品溶液制備

同實(shí)施例1

(2)供試品溶液制備

香加皮樣品為表1之H2號樣品，其他部分同實(shí)施例1。

(3)測定，生成對照指紋圖譜

吸取混合對照品溶液和供試品溶液(H2)，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖(參見附圖11)計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量(參見表20)。

表20

色譜條件為：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動(dòng)相1％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序見表21。流速0.4mL·min^-1；檢測波長230nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量2μL。

表21

根據(jù)上述條件得到的指紋圖譜相對保留時(shí)間參見表22。

表22

實(shí)施例7

(1)對照品溶液制備

同實(shí)施例1

(2)供試品溶液制備

香加皮樣品為表1之H2號樣品，其他部分同實(shí)施例1。

(3)測定，生成對照指紋圖譜

吸取混合對照品溶液和供試品溶液(H2)，注入超高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖(參見附圖12)計(jì)算供試品中相應(yīng)成分的含量(參見表23)。

表23

色譜條件為：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流動(dòng)相0.4％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序見表24。流速0.3mL·min^-1；檢測波長220nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量1.5μL。

表24

根據(jù)上述條件得到的指紋圖譜相對保留時(shí)間參見表25。

表25