鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-lr的方法
【專利摘要】鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，屬免疫分析化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。以Pd納米顆粒為晶種子制備出具有中空結(jié)構(gòu)的Pd-Au雙金屬納米籠，用于標(biāo)記微囊藻毒素-LR單克隆抗體噴涂到結(jié)合墊，于檢測(cè)線上噴涂BSA偶聯(lián)微囊藻毒素-LR，以羊抗鼠IgG噴涂控制線制得用于快速檢測(cè)水體中微囊藻毒素-LR的免疫層析片條，用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法，通過(guò)讀取檢測(cè)線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對(duì)試樣中微囊藻毒素-LR進(jìn)行定量分析。由于合金中兩種金屬元素的協(xié)同作用，Pd-Au合金對(duì)蛋白質(zhì)分子中的巰基和氨基結(jié)合力高于單金屬金納米籠的結(jié)合力，因此在用Pd-Au合金納米籠標(biāo)記微囊藻毒素抗體時(shí)，比用金納米籠標(biāo)記時(shí)更容易，形成的Pd-Au合金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物更穩(wěn)定。
【專利說(shuō)明】鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬免疫分析化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重的淡水湖泊，每年夏天氣溫上升均要引起藍(lán)藻爆發(fā)，造成嚴(yán)重污染。在藍(lán)藻大家族中，有一些種類會(huì)分泌較強(qiáng)的毒素[見(jiàn)史紅星，曲久輝，王愛(ài)民等，官?gòu)d水庫(kù)藍(lán)綠藻及藻毒素初步研究，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2005, 26 (9): 1650-1652]，而微囊藻毒素(microcystins，MCs)是其中的典型代表。其中2，4位上含亮氨酸和精氨酸的MCs-LR是已知的最易出現(xiàn)和毒性最強(qiáng)的環(huán)狀七肽肝毒素，是淡水藻類植物中的促癌因子[見(jiàn)Yu
S.Z., Chen G., Zhi X.L., et al.Primary liver cancer:natural toxins and prevention inChina (J).Toxicol Sci, 1998, 23 (Suppl2): 143-148 ；以及見(jiàn)俞順章，趙寧,資曉林等，飲水中微囊藻毒素與我國(guó)原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究，(J).中華腫瘤雜志，2001，23(2):96-99]，具有腎毒性、免疫毒性和明顯的肝毒性，動(dòng)物飲用藻類毒素污染的水可發(fā)生中毒甚至死亡[見(jiàn) Carmichael ff.ff., Jones C.L.A., Mahmood N.A., et al.Algal toxins and waterbased disease (J).CRC Crit, Rev.Environ.Control 1985 ； 15:275-313]。同時(shí)，微囊藻毒素是蛋白磷酸酶的抑制劑，它能夠激活人體內(nèi)的癌基因，同時(shí)抑制抗癌基因，使抗癌基因失活，使癌癥發(fā)生的可能性提高近10倍。有研究表明，長(zhǎng)期通過(guò)喝水接觸此類毒素可能會(huì)誘發(fā)原發(fā)性肝癌，提高腫瘤的活性引發(fā)死亡[見(jiàn)陳剛，俞順章，衛(wèi)國(guó)榮等.肝癌高發(fā)區(qū)飲用水型中微囊藻毒素含量調(diào)查(J)中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1996 ;30(1):6-9;以及見(jiàn)Gupta N., Pant S.C., Vijayaraghavan R., et al, Comparative toxicity evaluation ofcyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants(LR, RR, YR)in mice (J), Toxicology, 2003, 188 (2-3): 285 - 296.以及 Puerto M, Pichardo S, Jos A, et al, Comparisonof the toxicity induced by microcystin-RR and microcystin—YR in differentiated andundifferentiated Caco_2cells (J), Toxicon, 2009, 54 (2): 161-169.]。而自來(lái)水廠的氯消毒過(guò)程不僅不能除去藻類毒素，反而有可能增加其致突活性[見(jiàn)崔瑩，徐祖信，尹海龍.水中藻類污染物及其藻毒素分析方法研究進(jìn)展(J).安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2008，36 (29):12873-12875，12878]。WHO和我國(guó)限定飲用水中微囊藻毒素MC-LR含量不得大于l.0yg/mL(GB5749-2006)。因此，建立靈敏、特異的水中微囊藻毒素檢測(cè)方法具有重要的意義。
[0003]微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR)，分子式為C49H74NltlO12,分子量為9%D(道爾頓)，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。
[0004]微囊藻毒素的檢測(cè)方法可分為生物測(cè)試法、化學(xué)分析法、生化分析法等。；化學(xué)檢測(cè)包括毛細(xì)管電泳(CE)、核磁共振(NMR)、色質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等，其中使用最為廣泛和成熟的方法是高效液相色譜(HPLC)。生化分析法包括酶聯(lián)免疫吸附法和蛋白磷酸酶抑制法，如Camp'as等采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法和絲網(wǎng)印刷電極實(shí)現(xiàn)了對(duì)微囊藻毒素的安培檢測(cè)。鞠煶先等將抗體共價(jià)結(jié)合到富含羧基的碳納米角上構(gòu)建了靈敏的競(jìng)爭(zhēng)型微囊藻毒素電化學(xué)免疫傳感器。以上方法不僅依賴大型儀器設(shè)備，而且需要具有專門操作技術(shù)人員，不能用于現(xiàn)場(chǎng)分析，限制了這些方法的普及應(yīng)用。
[0005]近幾年隨著生化免疫技術(shù)以及酶聯(lián)免疫技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，快速、簡(jiǎn)便、易操作的免疫層析技術(shù)法開始被廣泛地應(yīng)用到水體中微囊藻素的檢測(cè)中。但所用標(biāo)記物金溶膠存在容易團(tuán)聚，不易保存等缺點(diǎn)。
[0006]本專利 申請(qǐng)人:在此以前申請(qǐng)?zhí)枮?01310610348.8的中國(guó)專利申請(qǐng)，公開了一種免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，通過(guò)一步制備法制得具有中空結(jié)構(gòu)的金納米籠(Au NCs)，將其標(biāo)記到Anti MC-LR上制得金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物,將BSA偶聯(lián)的微囊藻毒素-LR、IgG分別噴涂于硝酸纖維素膜上作檢測(cè)線以及控制線制得免疫層析片條；利用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法，通過(guò)讀取檢測(cè)線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對(duì)試樣中微囊藻毒素-LR進(jìn)行定量分析。不但克服了試紙條技術(shù)中金溶膠不易保存的缺點(diǎn)，而且操作簡(jiǎn)單，抗體的修飾需要的時(shí)間較短。由于技術(shù)在不斷進(jìn)步，還需要在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)出更好的免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法。
[0007]合金納米材料又稱二元或多元金屬納米材料，是由兩種或兩種以上的金屬或非金屬所組成的具有金屬特性的物質(zhì)。由于合金中兩種金屬元素的協(xié)同作用而導(dǎo)致合金的催化活性大大增加并且具有許多獨(dú)特的性能，近年來(lái)引起了國(guó)內(nèi)外眾多研究者的興趣。Zhang等首先利用水熱法合成了平均由147個(gè)Pd原子組成的Pd納米顆粒，然后在N2的保護(hù)下將Au原子從溶液中置換到Pd納米顆粒上，成功合成的Pd-Au雙金屬納米顆粒，它的化學(xué)催化性能和生物相容性比單一的Pd、Au金屬納米顆粒的更加令人滿意[Zhang H, Watanabe T, Okumura M, et al.Catalytically highly active top gold atom onpalladium nanocluster [J].Nature materials, 2012, 11 (I):49-52.]。Xia 等通過(guò)相繼將HAuCl4和Na2PdCl4加到Ag納米立方體中還原得到Ag/Au/Pd三金屬納米籠[Cobley, C.M.；Campbell, D.J.;Xia，Y.Tailoring the optical and catalytic properties of gold-silvernanoboxes and nanocages by introducing palladium.Adv.Mater.2008，20(4): 748-752]。他們還通過(guò)先合成Pd納米立方體，以此為晶種子，再加入HAuCl4用抗壞血酸在Pd晶種子上還原出金制得Pd-Au合金納米立方體[Lim B.K., Li Z.Y., Xia Y., et.al.Synthesisof Pd-Au bimetallic nanocrystals via controlled overgrowth[J].J.Am.Chem.Soc.2010, 132(8): 2506-2507.]。但到目前為止，未見(jiàn)有將Pd-Au合金納米顆粒應(yīng)用于免疫層析技術(shù)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是克服目前常用著色標(biāo)記物金納米顆粒溶膠不宜保存的缺點(diǎn)，提供相比申請(qǐng)?zhí)枮?01310610348.8的中國(guó)專利申請(qǐng)技術(shù)性能更好的方法，即一種鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法。
[0009]本發(fā)明方法如下:首先以Pd納米顆粒為晶種子制備出具有中空結(jié)構(gòu)的Pd-Au雙金屬納米籠，并用于標(biāo)記微囊藻毒素-LR單克隆抗體噴涂到結(jié)合墊，于檢測(cè)線上噴涂BSA偶聯(lián)微囊藻毒素-LR，以羊抗鼠IgG噴涂控制線制得用于快速檢測(cè)水體中微囊藻毒素-LR的免疫層析片條，用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法，通過(guò)讀取檢測(cè)線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對(duì)試樣中微囊藻毒素-LR進(jìn)行定量分析。[0010]所說(shuō)以Pd納米顆粒為晶種子制備具有中空結(jié)構(gòu)的Pd-Au雙金屬納米籠，其方法雖然為現(xiàn)有技術(shù)，但最好按如下過(guò)程進(jìn)行:將54~56mL PVP, 298~302mgL_抗壞血酸、1498~1502mg KBr和284~286mg氯鈀酸混合并加熱至沸騰，在勻速攪拌下反應(yīng)2.9~3.5小時(shí)，冷卻到室溫后，離心分離產(chǎn)物，并用無(wú)水乙醇和去離子水反復(fù)沖洗三到五次，以除去其中溶解的溴化物，所得產(chǎn)物密封保存做下一步合成的種子；用以上一步合成的Pd納米籠作為晶種子合成Pd-Au納米籠顆粒,取19~21ml的去離子水,加入0.48~0.51ml已濃縮好的Pd納米立方體溶液，4.9~5.1mgPVP和2.9~3.1mgL^1抗壞血酸，將此混合液加熱到沸騰反應(yīng)19~21min，并保持勻速攪拌，將10_12mg氯金酸分散到1.9~2.1ml的去離子水中，并逐滴加入到上述反應(yīng)液中，再將該混合液加熱至沸騰狀態(tài)反應(yīng)14~16min，待溫度冷卻到室溫，離心分離產(chǎn)物，用無(wú)水乙醇和去離子水洗滌，濃縮即得。
[0011]考察了 Pd-Au NCs/Anti MC-LR結(jié)合物的用量以及檢測(cè)底液等條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。在最優(yōu)條件下，片條對(duì)微囊藻毒素-LR濃度響應(yīng)范圍為0.1ng/mL至50ng/mL,檢測(cè)下限為 0.03ng/mL。
[0012]該方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需大型儀器或?qū)I(yè)技術(shù)人員，可用于微囊藻毒素的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
[0013]本發(fā)明方法與申請(qǐng)?zhí)枮?01310610348.8的中國(guó)專利申請(qǐng)技術(shù)使用性能對(duì)比如下=Pd-Au雙金屬納米籠狀顆粒的光吸收截面高于金納米籠的吸收截面，因此基于Pd-Au雙金屬納米籠狀顆粒制備的免疫層析片條檢測(cè)微囊藻毒素的靈敏度比申請(qǐng)?zhí)枮?01310610348.8的中國(guó)專利申請(qǐng)技術(shù)的靈敏度高，響應(yīng)信號(hào)明顯增強(qiáng)。圖2為不同標(biāo)記物制作的免疫層析片條對(duì)相同濃度微囊藻毒素的灰度響應(yīng)值比較，從圖中可看出，Pd-Au雙金屬納米籠為標(biāo)記物的片條的響應(yīng)明顯大于用金納米籠為標(biāo)記物的片條的響應(yīng)。
[0014]本發(fā)明的有益效果:和申請(qǐng)?zhí)枮?01310610348.8的中國(guó)專利申請(qǐng)技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:由于合金中兩種金屬元素的協(xié)同作用，Pd-Au合金對(duì)蛋白質(zhì)分子中的巰基和氨基結(jié)合力高于單金屬金納米籠的結(jié)合力，因此在用Pd-Au合金納米籠標(biāo)記微囊藻毒素抗體時(shí)，比用金納米籠標(biāo)記時(shí)更容易，形成的Pd-Au合金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物更穩(wěn)定。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為微囊藻毒素結(jié)構(gòu)式。
[0016]圖2不同標(biāo)記物的免疫層析片條對(duì)同濃度微囊藻毒素的響應(yīng)灰度值比較
[0017]圖3為實(shí)施例Pd-Au納米籠的透射電鏡圖。
[0018]圖4為免疫層析片條結(jié)構(gòu)示意圖。
[0019]圖5為實(shí)施例不同濃度的MC-LR的測(cè)試圖片。
[0020]圖6為實(shí)施例免疫層析片條的校準(zhǔn)曲線。
[0021]圖7為不同的展開底液對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響
[0022]圖8為檢測(cè)線噴涂次數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響
[0023]圖9為Pd-Au納米籠標(biāo)記單克隆抗體用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。
【具體實(shí)施方式】[0024]實(shí)施例，其步驟為:
[0025]I鈀-金合金納米籠Pd-Au NCs的制備
[0026]鈀-金合金納米籠按下述方法制備:參照修改過(guò)的Xia等的方法制備金納米籠[Lim B.K., Li Z.Y., Xia Y., et.al.Synthesis of Pd-Au bimetallic nanocrystals viacontrolled overgrowth (J).J.Am.Chem.Soc.2010, 132 (8):2506-2507.]。將 55mL PVP(MW=38000)，300mgL-抗壞血酸、1500mg KBr和285mg氯鈀酸混合并加熱到80°C (至沸騰)，在勻速攪拌下反應(yīng)3小時(shí)，冷卻到室溫后，離心分離產(chǎn)物，并用無(wú)水乙醇和去離子水反復(fù)沖洗三到五次，以除去其中溶解的溴化物。所得產(chǎn)物密封保存做下一步合成的種子。
[0027]以上一步合成的Pd納米籠作為晶種子合成Pd-Au納米籠顆粒。取20ml的去離子水，加入0.5ml已濃縮好的Pd納米立方體溶液，5mgPVP和SmgI/1抗壞血酸。將此混合液加熱到沸騰反應(yīng)20min，并保持勻速攪拌。將10-12mg的氯金酸分散到2ml的去離子水中，并逐滴加入到上述反應(yīng)液中，再將該混合液加熱至沸騰狀態(tài)反應(yīng)15min。待溫度冷卻到室溫，離心分離產(chǎn)物，用無(wú)水乙醇和去離子水洗滌，濃縮5倍，密封保存以后待用。圖3為制得的Pd-Au納米籠的透射電鏡圖。
[0028]2鈀-金合金納米籠標(biāo)記單克隆抗體結(jié)合物的制備及純化
[0029]通過(guò)參照Peng Zhaofeng 等[Gupta N., Pant S.C., Vijayaraghavan R., etal, Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxinmicrocystin variants (LR, RR, YR) in mice (J), Toxicology, 2003, 188 (2-3): 285 - 296.]的方法合成該結(jié)合物。將所合成的鈀-金合金納米籠用于標(biāo)記單克隆抗體制得結(jié)合物(Pd-AuNCs-Anti MC-LR)。取125 μ L經(jīng)五倍濃縮過(guò)的Pd-Au NCs溶液，用200mM碳酸鈉調(diào)節(jié)pH為9。加入1.2mg/mL Anti MC-LR抗體5 μ L，每次加I μ L，間隔三分鐘，滴加完成后，室溫振搖2h。為封閉Pd-Au NCs的多余的結(jié)合位點(diǎn)，將12.5 μ L BSA (10% )滴加進(jìn)混合溶液中繼續(xù)振搖0.5h。隨后以14000r/min轉(zhuǎn)速，低溫(12°C )離心15min，棄去上層清液，下層物質(zhì)用PBS洗滌兩次，最后分散在 0.5mL 洗脫液(20mmol/L Na3PO4.12H20, 5% BSA, 0.25% Tween20,和10%蔗糖)中。獲得的Pd-Au NCs/Anti MC-LR溶液4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0030]3免疫層析試紙條的制備
[0031]樣品墊GF-08裁剪成16mmX30cm長(zhǎng)條，浸泡于預(yù)先配制好的樣品墊處理液中(0.25% Triton X-100, 0.05mol/L Tris - HCl,和 0.15mmol/L NaCl) 30min 后烘干備用。將玻璃纖維的金膠結(jié)合墊裁剪成0.8?1.0cmX 30cm長(zhǎng)條，同時(shí)將吸收墊裁剪成1.7cmX30cm長(zhǎng)條備用。
[0032]選取不同的硝酸纖維素膜Milliporel35或Milliporel80在噴條機(jī)BiodotXYZ3060上進(jìn)行噴片操作。將二抗(羊抗鼠IgG)稀釋成2mg/mL后用噴片機(jī)噴涂在距硝酸纖維素膜邊緣Icm處做為控制線(C線)，然后將Microcystins-BSA稀釋成0.2mg/mL噴涂在距硝酸纖維素膜另一邊Icm處作為檢測(cè)線(T線)，噴涂不同次數(shù)時(shí)，每次都要在37 C供干后再嗔涂。最后嗔涂完成后于37 C供干2h。片條按圖2所不組裝,其中I為樣品墊，2為硝酸纖維素膜，3為PVC底板，4為吸收墊，5為檢測(cè)線(T線)，6為控制線(C線)，7為結(jié)合物釋放墊，箭頭表示流向(見(jiàn)圖4)。
[0033]4樣品的測(cè)定
[0034]測(cè)試之前將3 μ L Pd-Au NCs-Anti MC-LR滴在金膠結(jié)合墊上并干燥lOmin。將微囊藻毒素-LR用0.0lmol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取80 μ L，將片條放入溶液中展開lOmin。溶液中的微囊藻毒素-LR抗原與一部分Pd-Au納米籠/抗體結(jié)合物(Pd-Au NCs/Anti MC-LR)結(jié)合形成 Pd-Au NCs/Anti MC-LR/MC-LR 免疫復(fù)合物，由于毛細(xì)管作用帶動(dòng)著未結(jié)合抗原的Pd-Au納米籠/抗體結(jié)合物(Pd-Au NCs/Anti MC-LR)一起流動(dòng)到T線上，此時(shí)T線上固定的BSA-MC-LR與溶液中的MC-LR競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Pd-Au NCs/Anti MC-LR，將還未結(jié)合抗原的Pd-Au NCs/Anti MC-LR捕獲在T線上形成Pd-Au NCs/AntiMC-LR/BSA-MC-LR免疫結(jié)合物，并在檢測(cè)線上聚積顯現(xiàn)出一條可見(jiàn)的色帶。Pd-Au NCs-AntiMC-LR結(jié)合溶液中抗原(MC-LR)所形成的Pd-Au NCs/Anti MC-LR/MC-LR免疫復(fù)合物繼續(xù)流動(dòng)，到固定有二抗(羊抗鼠IgG)的C線上被捕獲。此時(shí)，再加入30 μ L PBS沖洗片條。將片條放入讀條機(jī)中，即可用讀取片條上T/C線的灰度值。測(cè)試溶液中微囊藻毒素-LR的含量越高，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Pd-Au NCs-Anti MC-LR的可能性越大，則T線上結(jié)合Pd-Au NCs-Anti MC-LR的可能性就越低，顏色越淺。與此相反，固定有二抗(羊抗鼠IgG)的C線捕獲免疫復(fù)合物(Pd-Au NCs/Anti MC-LR)的可能性越大，顏色越深。根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液對(duì)應(yīng)著不同灰度值，即可獲得檢測(cè)微囊藻藻毒素-LR的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)未知水樣中的微囊藻毒素-LR進(jìn)行定量分析。
[0035]圖5為不同濃度的MC-LR的測(cè)試圖片。圖6為免疫層析片條的校準(zhǔn)曲線。
[0036]優(yōu)化條件的實(shí)驗(yàn)
[0037]測(cè)試底液對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響
[0038]考察了 PBS、PBS+BSA、PBS+Tween、PBS+BSA+Tween四種不同底液對(duì)片條檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。從中可以看出，PBS做檢測(cè)底液時(shí)檢測(cè)效果最好，所以選取PBS為測(cè)試底液。
[0039]檢測(cè)線噴涂次數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響
[0040]由于吸附在硝酸纖維素膜上的BSA-MC-LR總量受噴涂次數(shù)的影，進(jìn)而對(duì)灰度值的檢測(cè)也有很大的影響。因此，實(shí)驗(yàn)選取同一批次制作的、且檢測(cè)線分別噴涂I次、2次、3次的片條對(duì)同一濃度的微囊藻毒素-LR溶液進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出，噴涂次數(shù)為2次時(shí)灰度值最大，檢測(cè)結(jié)果最好，故選取T線噴涂?jī)纱螢樽詈髼l件。
[0041]Pd-Au納米籠標(biāo)記單克隆抗體用量的影響
[0042]也考察了 Pd-Au納米籠標(biāo)記單克隆抗體(Pd-Au NCs/Anti MC-LR結(jié)合物)的不同滴加量對(duì)同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的影響。結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知，在金納米籠標(biāo)記單克隆抗體量為3 μ L時(shí)，檢測(cè)灰度值已經(jīng)很大，為節(jié)約用量，固定每次測(cè)試時(shí)滴加的金納米籠標(biāo)記單克隆抗體量為3 μ L。
[0043]硝酸纖維素膜的選擇
[0044]硝酸纖維素膜的不同，會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的靈敏度。實(shí)驗(yàn)選取了 HF135和HF180兩種不同硝酸纖維素膜在相同的實(shí)驗(yàn)條件下制作層析片條并對(duì)同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表I。由表I可知使用HF135的硝酸纖維素膜的片條檢測(cè)效果優(yōu)于使用HF180的硝酸纖維素膜的片條，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為4.77%。因此選取HF135型號(hào)的硝酸纖維膜制作片條。
[0045]表I兩種不同的硝酸纖維素膜檢測(cè)結(jié)果對(duì)比
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于:首先以Pd納米顆粒為晶種子制備出具有中空結(jié)構(gòu)的Pd-Au雙金屬納米籠，并用于標(biāo)記微囊藻毒素-LR單克隆抗體噴涂到結(jié)合墊，于檢測(cè)線上噴涂BSA偶聯(lián)微囊藻毒素-LR，以羊抗鼠IgG噴涂控制線制得用于快速檢測(cè)水體中微囊藻毒素-LR的免疫層析片條，用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法，通過(guò)讀取檢測(cè)線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對(duì)試樣中微囊藻毒素-LR進(jìn)行定量分析。
2.如權(quán)利要求1所述的鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法,其特征在于:將54~56mL PVP, 298~302mgL_抗壞血酸、1498~1502mg KBr和284~286mg氯鈀酸混合并加熱至沸騰，在勻速攪拌下反應(yīng)2.9~3.5小時(shí)，冷卻到室溫后，離心分離產(chǎn)物，并用無(wú)水乙醇和去離子水反復(fù)沖洗三到五次，以除去其中溶解的溴化物，所得產(chǎn)物密封保存做下一步合成的種子；用以上一步合成的Pd納米籠作為晶種子合成Pd-Au納米籠顆粒，取19~21ml的去離子水，加入0.48~0.51ml已濃縮好的Pd納米立方體溶液，4.9~5.1mgPVP和2.9~3.1mgL^1抗壞血酸，將此混合液加熱到沸騰反應(yīng)19~21min,并保持勻速攪拌，將10_12mg氯金酸分散到1.9~2.1ml的去離子水中，并逐滴加入到上述反應(yīng)液中，再將該混合液加熱至沸騰狀態(tài)反應(yīng)14~16min，待溫度冷卻到室溫，離心分離產(chǎn)物，用無(wú)水乙醇和去離子 水洗滌，濃縮即得。
3.如權(quán)利要求2所述的鈀-金合金納米籠免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于:以PBS為測(cè)試底液，T線噴涂?jī)纱?，每次測(cè)試時(shí)滴加的金納米籠標(biāo)記單克隆抗體量為3 μ L，以HF135型號(hào)的硝酸纖維膜制作片條。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103995122SQ201410262215
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】楊云慧, 王勤, 牛司朋, 唐賽賽, 尹寒蕊, 崔光鑫, 黃貴春, 鄭麗 申請(qǐng)人:云南師范大學(xué)