專利名稱：一種鄰苯二甲酸二異辛酯的酶聯(lián)免疫檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種酞酸酯殘留檢測方法，具體的說是對鄰苯二甲酸二異辛酯 的一種酶聯(lián)免疫檢測方法，屬于免疫檢測技術領域。
背景技術：
鄰苯二甲酸二異辛酯(Diethylhexylphthalate， DEHP )是酞酸酯的一種。酞酸 酯作為增塑劑在塑料的加工生產中尤其是聚氯乙烯(PVC)的加工生產中被廣泛 的使用。由于酞酸酯增塑劑與塑料基質之間沒有形成共價鍵，而是以氫鍵和范 德華力連接，彼此保持各自獨立的化學性質，因而在接觸到包裝食品中所含的 水、油脂時便會溶出。經過研究發(fā)現(xiàn)酞酸酯是一種環(huán)境激素物質，它干擾生物 為保持體內平衡并調節(jié)生長過程的正常激素的產生、釋放、轉移、代謝、反應 和消除，或在未受損的生物后代中引起不良的健康影響和內分泌功能的改變。 鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯，又稱鄰苯二甲酸二異辛酯，是鄰苯二甲酸酯類 增塑劑中用量最大的一種，應用廣泛，在塑料中的含量可達60%。目前，國內 外有關鄰苯二甲酸二異辛酯的檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法 (GC)、氣-質聯(lián)用法(GC-MS)、液-質聯(lián)用法(LC-MS)等，但這些方法不僅需要昂 貴的儀器設備，專業(yè)的操作人員，對檢材的要求也比較高，并且需要進一步的 樣本前處理才能進行，這已經不能達到現(xiàn)代檢測對快速、方便、準確的要求。 近年來，國內外已經開展了對酞酸酯類免疫分析方法的研究，但國內外尚沒有 針對鄰苯二甲酸二異辛酯的酶聯(lián)免疫檢測的報道，為了彌補這一空白，有必要 針對鄰苯二甲酸二異辛酯建立一種酶聯(lián)免疫檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測鄰苯二甲酸二異辛酯殘留的免疫學檢 測方法并且有較高的靈敏度和特異性。
本發(fā)明的技術方案如下利用胥傳來、徐麗廣、馬偉等(一種鄰苯二甲酸二 異辛酯人工抗原的制備方法)合成的免疫原免疫得到多克隆抗體，以鄰苯二甲酸
二異辛酯半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立了鄰苯二甲酸二異辛酯殘
留的間接競爭酶聯(lián)免疫法。
本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn)
(1)以0.05M的碳酸鹽緩沖溶液將包被抗原以1:5000 l:8000進行稀釋，加入酶標板中，每孔加100pL。 4。C孵育過夜，然后用含0.1%明膠的上述碳酸 鹽緩沖液200pL/孔作為封閉液，封閉2h;
(2) 將O.Ol， 0.1， 0.5， 1， 5， 10， 20ng/mL系列濃度梯度的鄰苯二甲酸 二異辛酯標準品或處理好的樣品到各自的酶標孔中，每孔加50|iL;同時加入 以抗體稀釋液稀釋1:6000 1:9000的抗血清，每孔50jiL。 37。C競爭lh后以 PBST洗滌液洗滌3 5次。
(3) 將辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(GAR-HRP)用抗體稀釋液以1:3000 1:5000進行稀釋，每孔加100(iL， 37。C作用lh后以PBST洗滌液洗滌3 5 次。
(4) 配置顯色液A: 0.933 g檸檬酸，3.68 g Na2HP04'12H20， 18 )iL 30%11202用超純水定容至100 mL;
B: 60mg3乂5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中； 使用前將A與B以5:1體積比混合。
(5) 每孔加入顯色液100pL， 37。C顯色15min;最后加入終止液2M硫 酸溶液，每孔lOOpL;酶標儀450nm測吸光值A45Q，與所作標準曲線對比算 出待測樣品的鄰苯二甲酸二異辛酯濃度。
更詳細的步驟為 主要溶液配制
1) 配制磷酸鹽0.01M(PBS)緩沖液 Na2HP04-12H20 3.62 g KH2P04 0.2 g NaCl 0.2g KC1 8.0g 加超純水稀釋至1000 mL。
2) 配制(0.05M) pH9.6碳酸鹽(CBS)緩沖溶液 Na2C03 1.59g
NaHC03 2.93g 加超純水稀釋至1000 mL。
3) 配制PBST溶液含0.05% Tween-20的PBS溶液。
4) 配制封閉液含0.1%明膠的碳酸鹽緩沖液。
5) 配制抗體稀釋液含0.P/。明膠的PBST溶液。
6) 顯色液
A液:0.933 g擰檬酸，3.68gNa2HP04-12H20， 18 (iL 30%H2O2用超純水定容至100 mL。
B液60 mg 3乂5,心四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中；
使用前將A與B以5:1體積比混合。
7)終止液2M的H2S04。
間接競爭ELISA實驗方法的步驟如下
預先將鄰苯二甲酸二異辛酯的標準品配制成1000(ag/mL的甲醇溶液作為工 作母液，在4。C保存待用。配制PBST溶液(0.01mol/L， pH 7.4， 0.15mol/LNaCl， 0.5%Tween-20)，以此為基礎配制系列反應液，用以稀釋競爭物標準液和抗血清。
a、 包被用設定濃度的包被原包被酶標板，lOOi^L/孔，4"C過夜。
b、 洗滌用PBST洗漆酶標板3次，每次3min，200iiL/ L，甩干酶標板。
c、 封閉含0.1%明膠的碳酸鹽緩沖液，200^iL/孔37。C封閉2h。
d、 洗滌同b。
e、 競爭用PBST將鄰苯二甲酸二異辛酯稀釋成O.Ol， 0.1， 0.5， 1， 5， 10， 20ng/mL系列濃度，另設一個PBST空白對照，50^iL/孔。然后每孔加入50pL 稀釋8000倍的抗血清，于37。C溫育lh。
f、 洗滌同b。
g、 加酶標二抗(羊抗兔GAR-HRP， 1:4000)， 100nL/孔，37C反應lh。
h、 洗漆同b。
i、 顯色加顯色液100pL/ L，顯色15min。 j、終止加終止液100(iL/孔。
k、測定用酶標儀檢測450nm的吸光值。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明建立了鄰苯二甲酸二異辛酯的間接ELISA方法， 為鄰苯二甲酸二異辛酯殘留檢測提供了一種快速高效的檢測手段，由于采用的 是多克隆抗體，費用較低且穩(wěn)定性和重復性較好。靈敏度為0.085 ng/mL，線性 范圍為0.1 25 ng/mL，半數(shù)抑制量(1(:5())為3.6 ng/mL。免疫反應的高特異性和 高親和性使ELISA具有極高的選擇性和靈敏性，樣本前處理過程簡單。


圖1鄰苯二甲酸二異辛酯的標準抑制曲線。 具體實施方案
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。
一、儀器
TGL - 40B臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠； KFLOW純水機，凱佛隆公司；ZD-9556水平搖床，太倉科教器材廠；
Costar96孔8xl2可拆酶標板，上海吉泰生物科技有限公司； MuLtiska Mks酶f示f義，Thermo Labsystems公司； 可調試移液器，Thermo Labsystems公司；
渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠。
二、 試劑
辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(GAR-HRP)，康成生物工程公司； 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，華美生物工程公司； 其他試劑均為分析純試劑。
三、 步驟
1.免疫原和包被原的合成
合成免疫原和包被原(鄰苯二甲酸二異辛酯半抗原與牛血清蛋白BSA或卵 清蛋白OVA偶聯(lián)物)，用重氮化法偶聯(lián)，具體步驟如下
① 制備A液取0.023mmol半抗原于25mL燒杯中，加入2mL 二甲基甲 酰胺、0.2mL水和0.2mL的lmol/L鹽酸，形成黃色溶液，冷卻至0-5。C。然后 逐步滴加lmol/L亞硝酸鈉溶液，用淀粉碘化鉀試紙監(jiān)測，直到試紙變藍灰色停 止滴加，低溫下攪拌lh，此液為A液。
② 制備B液稱取150mg的牛血清蛋白(或102mg的卵清蛋白)溶于6mL 的pH9.0硼酸鹽緩沖液，低溫保存，此液為B液。
硼酸鹽緩沖液..0.2mol/L硼酸硼酸12.37g加水至1000mL; 0.05mol/L硼 砂硼砂19.07g加水至1000mL;將上述兩溶液以體積比2:8的比例混合即為 pH9.0的硼酸鹽緩沖液。
③ 在低溫攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液，并用lmol/L的氫氧化鈉溶 液調節(jié)pH，使pH保持在9， 4"條件下攪拌過夜，即得到人工抗原混合液。
④ 將人工抗原混合液移入透析袋中，用6X1L的去離子水透析4-6天。最 后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原鄰苯二甲酸二異 辛酯-牛血清蛋白(或包被原鄰苯二甲酸二異辛酯-卵清蛋白)。
抗體效價測定步驟
1) 將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標板，100 ^L/孔，于4 °C 冰箱過夜。次日取出酶標板回至室溫，每孔注入200)iLPBST溶液，搖床上振 蕩3min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌2次。以下冼滌方 法相同。
2) 充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標板，200 pL/孔，于37'C溫育箱內溫育2h后取出烘千待用。
3) 將陽性血清系列稀釋對應加入到酶標板的前7行列，第8行加入陰性血 清，100jiL/孔，37'C孵育lh后洗滌、拍干。
4) 每孔加入lOOjiL， 1:4000稀釋的標記的羊抗兔GAR-HRP， 37。C孵育lh 后洗滌、拍干。
5) 每孔加入100pL顯色液，暗處37。C反應15min，取出后每孔加入100pL 終止液(2mol/L的硫酸)，用酶標儀測定吸光值A450。
抗體特異性測定步驟
a、 包被用設定濃度的包被原包被酶標板，100pL/孔，4'C過夜。
b、 洗滌用PBST洗滌酶標板三次，每次3min， 200pL/孔，甩干酶標板。
c、 封閉含0.1%明膠的碳酸鹽緩沖液，200pL/孔，37'C封閉2h。
d、 洗滌同b。
e、 競爭用PBST將鄰苯二甲酸二異辛酯母液稀釋成0、0.1ng/mL、0.3 ng/mL、 0.9 ng/mL、 2.7 ng/mL、 8.1 ng/mL、 25 ng/mL的含10%乙醇的標準溶液系列濃度， 另設一個PBST空白對照，50pL/孔。然后每孔加入50piL稀釋4000倍的抗血清， 于37。C溫育lh。
f、 洗滌同b。
g、 加酶標二抗(羊抗兔GAR-HRP， 1:4000)， 100^iL/孔，37C反應lh。
h、 洗滌同b。
i、 顯色加顯色液100pL/孔，顯色15min。 j、終止加終止液IOOiiL/孔。
k、測定用酶標儀檢測450nm的吸光值。 試驗結果如下
1、 標準曲線本實驗所獲得的抗體檢測的線性范圍為0.1 25ng/mL。
2、 靈敏度靈敏度是所得90%最大吸光值所對應的標準品的濃度，即IC90 為0.085ng/mL。
權利要求
1、一種鄰苯二甲酸二異辛酯的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于利用合成的鄰苯二甲酸二異辛酯免疫原免疫得到多克隆抗體，以鄰苯二甲酸二異辛酯為標準品，以鄰苯二甲酸二異辛酯半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立動物性食品中的鄰苯二甲酸二異辛酯的間接競爭酶聯(lián)免疫方法；步驟如下(1)以0. 05M的碳酸鹽緩沖溶液將包被抗原以1∶5000～1∶8000進行稀釋，加入酶標板中，每孔加100μL，4℃孵育過夜，然后用含0.1％明膠的上述碳酸鹽緩沖液200μL/孔作為封閉液，封閉2h；(2)將0. 01，0.1，0.5，1，5，10，20ng/mL系列濃度梯度的鄰苯二甲酸二異辛酯標準品或處理好的樣品到各自的酶標孔中，每孔加50μL；同時加入以抗體稀釋液稀釋1∶6000～1∶9000的抗血清，每孔加50μL，37℃競爭1h后以PBST洗滌液洗滌3～5次；(3)以抗體稀釋液將辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP以1∶3000～1∶5000進行稀釋，每孔加100μL，37℃作用1h后以PBST洗滌液洗滌3～5次；(4)配置顯色液A液0. 933g檸檬酸，3.68g Na2HPO4·12H2O，18μL30％H2O2用超純水定容至100mL；B液60mg3，3/，5，5/-四甲基聯(lián)苯胺溶于100mL乙二醇中；使用前將A液與B液以5∶1體積比混合；(5)每孔加入顯色液100μL，37℃顯色15min；最后加入終止液2M硫酸溶液，每孔100μL；酶標儀450nm測吸光值A450，與所作標準曲線對比算出待測樣品的鄰苯二甲酸二異辛酯濃度。
全文摘要
一種鄰苯二甲酸二異辛酯的酶聯(lián)免疫檢測方法，屬于免疫檢測技術領域。本發(fā)明利用合成的鄰苯二甲酸二異辛酯免疫原免疫得到多克隆抗體，以鄰苯二甲酸二異辛酯為標準品，以鄰苯二甲酸二異辛酯半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立了鄰苯二甲酸二異辛酯的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法。本發(fā)明建立了鄰苯二甲酸二異辛酯的間接ELISA方法，為鄰苯二甲酸二異辛酯的殘留檢測提供了一種快速高效的檢測方法，由于采用的是多克隆抗體，費用較低且穩(wěn)定性和重復性好。靈敏度為0.085ng/mL，線性范圍為0.1～25ng/mL。免疫反應的高特異性和親和性使ELISA具有極高的選擇性和靈敏度。
文檔編號G01N33/543GK101419230SQ20081019534
公開日2009年4月29日 申請日期2008年10月14日 優(yōu)先權日2008年10月14日
發(fā)明者徐麗廣, 李灼坤, 胥傳來, 偉 馬 申請人:江南大學