專利名稱：一種檢測(cè)伊維菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)伊維菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
伊維菌素(Ivermectin)是一個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它能使氯離子穿過細(xì)胞膜匯集起來(lái)，從而造成多種線蟲及節(jié)肢動(dòng)物麻痹，在獸醫(yī)領(lǐng)域中有多種用途，伊維菌素對(duì)節(jié)肢動(dòng)物及線蟲具有毒性。但高劑量的使用伊維菌素能使宿主對(duì)血液中的線蟲或節(jié)肢動(dòng)物產(chǎn)生快速清除炎癥應(yīng)答，產(chǎn)生治療的不良反應(yīng)。2002年12月我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)文規(guī)定在所有食品動(dòng)物的肌肉中最高殘留量為10μg/kg，在脂肪中的最高殘留量為40μg/kg。因此，在獸藥中檢測(cè)伊維菌素的殘留量非常重要。
目前，常用于伊維菌素殘留檢測(cè)的方法主要有微生物法和儀器分析法。微生物檢測(cè)法雖然經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便，但在樣本中有其他微生物抑制劑存在時(shí)，其靈敏度和特異性受到限制；高效液相色譜分析法、氣譜、氣質(zhì)聯(lián)機(jī)法等單純的儀器分析方法，雖然靈敏度高，但樣本前處理及測(cè)定操作煩瑣，費(fèi)用高，不適宜于大量樣本篩查，可以作為殘留的確證分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)動(dòng)物組織中伊維菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)伊維菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括伊維菌素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或伊維菌素抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)伊維菌素半抗原；當(dāng)所述包被原為伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)伊維菌素半抗原。
所述伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過混合酸酐法或活性酯法將伊維菌素半抗原和載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述伊維菌素半抗原是將伊維菌素經(jīng)二溴丁二酸法和戊二酸酐法合成得到的。
所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選堿性磷酸酯酶；堿性磷酸酯酶標(biāo)記抗抗體可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法如戊二醛法或過碘酸鈉法將酶交聯(lián)在抗抗體上；堿性磷酸酯酶標(biāo)記的伊維菌素半抗原可采用混合酸酐法將堿性磷酸酯酶與伊維菌素半抗原偶聯(lián)得到。所述伊維菌素半抗原是將伊維菌素經(jīng)二溴丁二酸法和戊二酸酐法合成得到的。酶標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；所述酶標(biāo)記物工作液所用的稀釋液為含有0.1‰(質(zhì)量濃度)甘油(可防止放入-20℃環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長(zhǎng)時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1％的硫柳汞防腐劑(便于保存)溶液。
所述伊維菌素特異性抗體可為伊維菌素單克隆抗體或伊維菌素多克隆抗體；它們均是用伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述伊維菌素單克隆抗體為伊維菌素鼠單克隆抗體，所述伊維菌素多克隆抗體優(yōu)選為伊維菌素兔多克隆抗體。所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體，優(yōu)選為羊抗兔抗抗體?？贵w形式可為凍干粉、濃縮液、工作液；抗體工作液所用的抗體稀釋液為pH7.9的0.2mol/L，含有3‰(質(zhì)量濃度)的N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
所述伊維菌素單克隆抗體優(yōu)選為伊維菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-2 CGMCCNo.1612分泌的抗體。
伊維菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-2 CGMCC No.1612已于2006年2月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)。
以上抗體均可以用伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按常規(guī)方法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白等常用載體蛋白；所述伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將伊維菌素半抗原和載體蛋白用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述伊維菌素半抗原是將伊維菌素經(jīng)二溴丁二酸法和戊二酸酐法合成得到的。
為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。
所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為含有伊維菌素藥物六個(gè)濃度梯度的溶液，所用的伊維菌素藥物稀釋液為pH 8.3，0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液。
所述濃縮洗滌液為20倍濃縮，pH 7.4，0.01～0.05mol/L含有0.8％～1.2％吐溫80，3‰(質(zhì)量濃度)疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。
當(dāng)酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶時(shí)，所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；當(dāng)酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶是堿性磷酸酯酶時(shí)，所述顯色劑為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。
所述濃縮復(fù)溶液可為pH 8.3，0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液。
所述終止液為1～2mol/L的硫酸、氫氧化鈉或鹽酸緩沖液。
所述包被緩沖液為pH8.2，0.5mol/L硼砂—硼酸緩沖液；所述封閉液含有3-10％馬血清，1％酪蛋白的磷酸鹽緩沖溶液。
所用的包被伊維菌素抗原或抗抗體的固相載體物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等，載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)伊維菌素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當(dāng)樣品為動(dòng)物組織時(shí)，用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，稱取5g±0.1g樣本，加入10ml無(wú)水甲醇混合，混勻，3000g以上，15℃離心10-15分鐘，取上清液，用稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液(濃縮復(fù)溶液用去離子水按1∶1稀釋)稀釋10倍；2)利用上述檢測(cè)伊維菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)樣品。
伊維菌素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明半抗原的合成如下將伊維菌素經(jīng)二溴丁二酸法和戊二酸酐法合成伊維菌素半抗原，就是在伊維菌素的分子結(jié)構(gòu)上直接突出的4-羥基酯化成羧基，將伊維菌素藥物的主體結(jié)構(gòu)暴露，這樣就突出了伊維菌素類藥物的簇特征結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出的抗原制備的抗體是針對(duì)伊維菌素類藥物的簇抗體。再將伊維菌素采用混合酸酐法與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原。本發(fā)明的檢測(cè)伊維菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒可定性、定量檢測(cè)肝臟，肌肉等樣品中伊維菌素藥物的殘留量。半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過低或過高都對(duì)免疫不利，半抗原與OVA、RSA和MSA的結(jié)合摩爾比分別為12∶1、17∶1和17∶1。
本發(fā)明的檢測(cè)原理是當(dāng)微孔條上預(yù)包被伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液和伊維菌素抗體工作液后，樣本中殘留的伊維菌素和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合伊維菌素的抗體，加入酶標(biāo)記物進(jìn)行酶活性放大作用，顯色后終止；當(dāng)微孔條上包被羊抗鼠抗抗體時(shí)，加入伊維菌素抗體工作液后，再加入系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液和酶標(biāo)抗原，樣品殘留的伊維菌素和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合伊維菌素抗體，顯色；顯色終止后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)，樣本吸光度值與其殘留物伊維菌素的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物伊維菌素的含量。也可根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品溶液顏色的深淺，與系列濃度的伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)液顏色比較判斷樣品中伊維菌素的濃度范圍。
本發(fā)明的檢測(cè)伊維菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒，對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；主要試劑以工作液、濃縮液或凍干粉等形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，經(jīng)過對(duì)試劑盒的精密度和準(zhǔn)確度測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)，將在食品和飼料伊維菌素殘留量的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
本發(fā)明的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、便于攜帶，可用于動(dòng)物源性食品中伊維菌素的檢測(cè)；本發(fā)明的檢測(cè)伊維菌素的方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控及大量的樣本篩查，適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測(cè)。本發(fā)明簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的步驟，縮短了檢測(cè)的時(shí)間，具有可觀的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1為以伊維菌素抗原為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線2為以抗抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例的方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1以伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備及其檢測(cè)方法以伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有伊維菌素與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液用稀釋液(含有0.1‰(質(zhì)量濃度)甘油(可防止放入-20℃環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長(zhǎng)時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1％小牛血清，1％的硫柳汞防腐劑(便于保存)溶液)將堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體稀釋成蛋白濃度為0.1～1μg/L的酶標(biāo)記抗抗體工作液，12ml/瓶，1瓶。
(3)伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液用稀釋液將伊維菌素稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L，1～3ml/瓶。所用的伊維菌素稀釋液為pH 8.3，0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液。
(4)顯色劑4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。均為8ml/瓶。
(5)伊維菌素鼠單克隆抗體工作液用抗體工作液將伊維菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-2 CGMCC No.1612分泌的抗體稀釋成蛋白濃度為0.5～5.0μg/L抗體工作液，12ml/瓶，1瓶?？贵w工作液所用的抗體稀釋液為pH 7.9的0.2mol/L，含有3‰(質(zhì)量濃度)的N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
(6)濃縮洗滌液pH 7.4，0.01～0.05mol/L，含有0.8～1.2％吐溫80，3‰(質(zhì)量濃度)疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。40ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液1mol/L氫氧化鈉，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液pH8.3，0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液，為正常使用濃度的2倍，30ml/瓶，1瓶。
制備酶標(biāo)板時(shí)所需試劑(1)包被緩沖液pH8.2，0.5mol/L硼砂—硼酸緩沖液。
(2)封閉液含有3-10％的馬血清，1％酪蛋白的磷酸鹽緩沖溶液。
其中，伊維菌素與載體蛋白偶聯(lián)物、伊維菌素特異性抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔抗抗體的制備方法如下一、酶標(biāo)板的制備1、伊維菌素半抗原的合成方法伊維菌素半抗原的制備原理將伊維菌素經(jīng)二溴丁二酸法和戊二酸酐法合成伊維菌素半抗原，就是在伊維菌素的分子結(jié)構(gòu)上直接把突出的4-羥基酯化成羧基，將伊維菌素藥物的主體結(jié)構(gòu)暴露，這樣就突出了伊維菌素類藥物的簇特征結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出的抗原制備的抗體是針對(duì)伊維菌素類藥物的簇抗體。
2、包被原將伊維菌素半抗原和兔血清白蛋白(RSA)載體蛋白，采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到。
包被原合成的具體方法如下取伊維菌素藥物半抗原2g溶于30ml，5‰(質(zhì)量濃度)的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無(wú)水二唖烷中，加到半抗原溶液中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，取兔血清白蛋白(RSA)32g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中，再將兔血清白蛋白(RSA)滴加到半抗原中4℃攪拌過夜。將反應(yīng)完的人工抗原對(duì)0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次。最后將抗原凍干保存。
3、酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將伊維菌素半抗原與兔血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋成0.07μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用去離子水稀釋19倍的濃縮洗滌液，洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、伊維菌素鼠單克隆抗體的制備免疫原的制備過程取伊維菌素藥物半抗原2g溶于30ml，5‰(質(zhì)量濃度)的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無(wú)水二唖烷中，加到半抗原溶液中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，取卵清蛋白(OVA)32g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中，再將卵清蛋白(OVA)滴加到半抗原中4℃攪拌過夜。將反應(yīng)完的人工抗原對(duì)0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次。最后將抗原凍干保存。
動(dòng)物免疫程序 采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以伊維菌素半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)物為免疫原，免疫原免疫劑量為100μg/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株—伊維菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-2 CGMCC No.1612。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7～14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×106個(gè)/只，7～10天后采集腹水。用辛酸—飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
三、酶標(biāo)抗體的制備抗抗體的制備以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。
酶標(biāo)記抗抗體的制備步驟如下將羊抗鼠抗抗體與堿性磷酸酯酶進(jìn)行偶聯(lián)，采用的方法優(yōu)選戊二醛法，用堿性磷酸酯酶以2∶1的比例與抗體偶聯(lián)時(shí)，約有60％～70％的酶與8％的抗體偶聯(lián)，酶標(biāo)記物的產(chǎn)量比使用辣根過氧化物酶高。
酶標(biāo)羊抗鼠抗抗體具體步驟如下1)稱取堿性磷酸酯酶25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1min，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以聚己二醇濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
3)取羊抗鼠抗抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
4)用1M pH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3h。
5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2h。
6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1h。
7)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液中。
8)將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
利用該試劑盒檢測(cè)樣品中殘留的伊維菌素的方法如下一、樣品前處理a.動(dòng)物組織用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，稱取5g±0.1g樣本于50ml離心管中，加入10ml無(wú)水甲醇混合，渦動(dòng)1min后于振蕩器上振蕩10min。3000g以上，15℃，離心10min。取上清液20μl，用稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液(濃縮復(fù)溶液用去離子水按1∶1稀釋)稀釋10倍；取20μl樣本與180μl稀釋1倍的濃縮復(fù)溶液混合即可進(jìn)行分析。
二、檢測(cè)方法伊維菌素半抗原與兔血清白蛋白偶聯(lián)物的96孔酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μl，再加入伊維菌素鼠單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，拍干。每孔加入250μl洗滌液0.8％～1.2％吐溫，1‰(質(zhì)量濃度)硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.01M PH7.4，將濃縮洗滌液用去離子水20倍稀釋)，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μl用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟。加入底物顯色液(4-硝基酚磷酸鹽緩沖液)100μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液(1mol/L硫酸)50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)為400nm)測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。
三、結(jié)果分析所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
百分吸光度值＝B/B0×100％公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以伊維菌素濃度的自然對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中伊維菌素的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液中伊維菌素的濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。整個(gè)檢測(cè)過程只需2.0小時(shí)就可以完成，最低檢測(cè)限為0.5μg/L。
實(shí)施例2、以抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法以伊維菌素抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有抗抗體的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記的伊維菌素半抗原工作液將堿性磷酸酯酶標(biāo)記的伊維菌素半抗原稀釋為0.1～1μg/L的酶標(biāo)記抗抗體工作液，12ml/瓶，1瓶。所用的稀釋液為含有0.1‰(質(zhì)量濃度)甘油(可防止放入-20℃環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長(zhǎng)時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1％的硫柳汞防腐劑(便于保存)溶液。
3)伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液用稀釋液將伊維菌素稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L，1～3ml/瓶。所用的伊維菌素藥物稀釋液為pH值為8.3，0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液。
(4)顯色劑4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。均為8ml/瓶。
(5)伊維菌素兔多克隆抗體工作液用抗體工作液將兔多克隆抗體稀釋成蛋白濃度為0.01～0.1μg/L抗體工作液，12ml/瓶，1瓶?？贵w工作液所用的抗體稀釋液為pH值7.9的0.2mol/L，含有3％的N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸鹽緩沖液。
(6)濃縮洗滌液pH 7.4，0.01～0.05mol/L，含有0.8～1.2％吐溫80，3‰(質(zhì)量濃度)疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。40ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液1mol/L氫氧化鈉，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液pH8.3，0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液，為正常使用濃度的2倍，30ml/瓶，1瓶。
制備酶標(biāo)板時(shí)所需試劑(1)包被緩沖液pH8.2，0.5mol/L硼砂—硼酸緩沖液。
(2)封閉液含有3-10％的馬血清，1％酪蛋白的磷酸鹽緩沖溶液。
其中，抗抗體包被原、伊維菌素特異性抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的伊維菌素半抗原的制備方法如下一、酶標(biāo)板的制備1、羊抗兔抗抗體包被原的制備以兔源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。
2、包被有羊抗兔抗抗體的酶標(biāo)板制備方法酶標(biāo)板的材料為聚氯乙稀，用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成0.07μg/ml，酶標(biāo)板每孔加入100μl，37℃溫育2h，傾去包被液，用洗滌液(濃縮洗滌液用去離子水稀釋19倍)洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，拍干后用鋁膜真空密封保存。
二、伊維菌素兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以實(shí)施例1制備的伊維菌素半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)物為免疫原，免疫原免疫劑量為1mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，用硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。
三、酶標(biāo)半抗原的制備酶標(biāo)記伊維菌素抗原的制備將二溴丁二酸法和戊二酸酐法合成伊維菌素半抗原，將伊維菌素半抗原與堿性磷酸酯酶采用活性酯法進(jìn)行偶聯(lián)得到酶標(biāo)記伊維菌素抗原。
具體制備方法如下取伊維菌素半抗原2g溶于30ml，5‰(質(zhì)量濃度)的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無(wú)水二唖烷中，加到半抗原溶液中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)，取堿性磷酸酯酶32g溶于70ml pH9.6碳酸鹽緩沖液中，再將堿性磷酸酯酶滴加到半抗原中4℃攪拌過夜。將反應(yīng)完的酶標(biāo)記半抗原對(duì)0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次。最后將酶標(biāo)記半抗原凍干保存。
利用該試劑盒檢測(cè)樣品中殘留的伊維菌素的方法如下樣品前處理的具體步驟同實(shí)施例1中的樣品前處理步驟。
檢測(cè)方法向包被有羊抗兔抗抗體的96孔酶標(biāo)板微孔中加伊維菌素兔多克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液(0.8％～1.2％吐溫，1‰(質(zhì)量濃度)硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.01MPH7.4，濃縮洗滌液用去離子水稀釋19倍)，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μl，再加入酶標(biāo)記半抗原100μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟。加入底物顯色液(4-硝基酚磷酸鹽緩沖液)100μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液(1mol/L硫酸)50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)為400nm)測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。
結(jié)果分析的方法同實(shí)施例1中的結(jié)果分析方法，該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖2所示結(jié)果分析表明，制備的試劑盒整個(gè)檢測(cè)過程只需2.0小時(shí)就可以完成，最低檢測(cè)限為0.5μg/L。
實(shí)施例3、試劑盒精密度、準(zhǔn)確度和保存期試驗(yàn)1、試劑盒精密度試驗(yàn)(1)標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備的試劑盒分別取三批進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，每批試劑盒抽取10個(gè)試劑盒，再?gòu)拿總€(gè)試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定4.5μg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值(OD值)，計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)施例1中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在4.3％-10.4％之間。
表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)施例2中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在4.3％～9.8％之間。
表2標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)

(2)樣本可重復(fù)性試驗(yàn)每個(gè)樣本按15μg/kg濃度的伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加，分別取實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備的三個(gè)不同批次的試劑盒各三個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)施例1中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表3、表4所示，結(jié)果表明牛肉、牛肝樣本變異系數(shù)均低于20％。
表3牛肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


表4牛肝樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)施例2中的三批試劑盒的結(jié)果如表5、表6所示，結(jié)果表明牛肉樣本變異系數(shù)均低于20％，牛肝樣本的變異系數(shù)均低于20％。
表5牛肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


表6牛肝樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

2、試劑盒的準(zhǔn)確度測(cè)定每個(gè)牛肉樣本和牛肝樣本分別按20μg/kg(L)和50μg/kg(L)濃度添加伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，分別利用實(shí)施例1或?qū)嵤├?的試劑盒按照實(shí)施例1或?qū)嵤├?的方法檢測(cè)伊維菌素，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度。實(shí)施例1的試劑盒測(cè)定結(jié)果如表7所示，結(jié)果表明牛肉添加回收率在72.5％~120.3％之間，牛肝添加回收率在72.5％～90.5％之間。
表7準(zhǔn)確度測(cè)定試驗(yàn)μg/kg

實(shí)施例2的試劑盒測(cè)定結(jié)果如表8所示，結(jié)果表明牛肉添加回收率在64.5％～101.5％之間，牛肝添加回收率在68.5％～110.5％之間。
表8準(zhǔn)確度測(cè)定試驗(yàn) μg/kg

3、試劑盒保存期試驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒分別保存在2-8℃，6個(gè)月后，測(cè)定試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、伊維菌素添加實(shí)際測(cè)定值，結(jié)果表明所測(cè)得的結(jié)果均在正常檢測(cè)范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將上述試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)伊維菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括伊維菌素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)伊維菌素半抗原；當(dāng)所述包被原為伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)伊維菌素抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)伊維菌素半抗原；所述伊維菌素半抗原是將伊維菌素經(jīng)二溴丁二酸法和戊二酸酐法合成得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液、包被緩沖液和封閉液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述伊維菌素特異性抗體為伊維菌素單克隆抗體或伊維菌素多克隆抗體；它們均是用伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述伊維菌素半抗原是將伊維菌素經(jīng)二溴丁二酸法和戊二酸酐法合成得到的；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍(lán)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體；所述伊維菌素單克隆抗體為伊維菌素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-2CGMCC No.1612。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為pH 7.4，0.01～0.05mol/L含有0.8～1.2％吐溫80，0.3％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于當(dāng)酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶時(shí)，所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；當(dāng)酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶是堿性磷酸酯酶時(shí)，所述顯色劑為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮復(fù)溶液為pH8.3、0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述包被緩沖液為pH8.2，0.5mol/L硼砂-硼酸緩沖液；所述封閉液含有3-10％的馬血清，1％酪蛋白的溶液；所述終止液為1～2mol/L的硫酸、氫氧化鈉或鹽酸緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
10.一種檢測(cè)伊維菌素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當(dāng)樣品為動(dòng)物組織時(shí)，稱取5g動(dòng)物組織勻漿物，加入10ml無(wú)水甲醇混合，混勻，3000g以上，15℃，離心10-15分鐘，取上清液，用稀釋1倍的權(quán)利要求8所述的濃縮復(fù)溶液稀釋10倍；2)利用權(quán)利要求1-9中任一所述的檢測(cè)伊維菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)伊維菌素的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。該檢測(cè)伊維菌素的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括伊維菌素特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)伊維菌素半抗原；當(dāng)所述包被原為伊維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)伊維菌素半抗原。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本篩查的檢測(cè)動(dòng)物組織等中伊維菌素藥物殘留量。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1811440SQ20061000728
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月17日
發(fā)明者沈建忠, 史為民, 何繼紅, 何方洋, 丁雙陽(yáng), 萬(wàn)宇平 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)