B類單端孢霉烯族毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為B類單端孢霉烯族毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒。其檢測快速、靈敏、準(zhǔn)確、可定量、操作簡單、且對樣品純度要求不高，特異性強(qiáng)，特別適用于大批量樣品的檢測，為此本發(fā)明還提供了專用測試盒的制備及檢測方法。其特征在于：其包括濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、顯色液A、顯色液B和終止液，其還包括包被有B類單端孢霉烯族毒素固相抗原的包被板、B類單端孢霉烯族毒素標(biāo)準(zhǔn)品、B類單端孢霉烯族毒素抗體凍干品。檢測后在450nm處測吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的B類單端孢霉烯族毒素含量。
【專利說明】B類單端孢霉烯族毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物及食品安全檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為B類單端孢霉烯族毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒及制備及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0003]B類單端孢霉烯族毒素是一類由鐮刀菌屬類真菌產(chǎn)生的代謝物，在自然界分布極為廣泛，多分布于小麥、大麥、玉米等谷物籽實(shí)中，是自然發(fā)生的最危險(xiǎn)的食品污染物，對人畜危害十分嚴(yán)重。它不但引起人畜急慢性中毒，還具有致癌、致畸、致突變的潛在危險(xiǎn)。B類單端孢霉烯族毒素主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON) >3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyl-D0N, 3_Ac_D0N)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-acetyl-D0N,15-Ac-DON)、雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol, NIV)和鐮刀菌酮(fusarenon X, FUS-X)等。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖所示(I)及表1所示。
【權(quán)利要求】
1.B類單端孢霉烯族毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒，其特征在于:其包括濃縮洗漆液、濃縮復(fù)溶液、顯色液A、顯色液B和終止液,其還包括包被有B類單端孢霉烯族毒素固相抗原的包被板、B類單端孢霉烯族毒素標(biāo)準(zhǔn)品、B類單端孢霉烯族毒素抗體凍干品以及酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品。
2.B類單端孢霉烯族毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制備，其特征在于:其包括以下步驟:包被板的制備、B類單端孢霉烯族毒素標(biāo)準(zhǔn)品的制備、B類單端孢霉烯族毒素一卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)物的制備，抗B類單端孢霉烯族毒素抗體及其溶液的制備，完全福氏佐劑的制備，不完全福氏佐劑的制備、酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品的制備；顯色液A的制備；顯色液B的制備； 終止液的制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述B類單端孢霉烯族毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制備，其特征在于:所述包被板包被B類單端孢霉烯族毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用10 mmol/L^100 mmol/L pH9~10 Na2CO3-NaHCO3的緩沖液作為包被液，將B類單端孢霉烯族毒素一卵清蛋白(OVA)稀釋至0.1 μ g/mL^l.0 μ g/mL, 96或48或24孔微孔板各加100 yL，2~8°C放置過夜或放37°C烘箱中孵育2 h，棄去包被液，洗滌2~3次，加入含1%~5%牛血清蛋白(溶于pH 7^8的磷酸鹽緩沖液)，2~8°C封閉過夜或37°C烘箱中放置1.5h，棄去封閉液，吹干，板條密封后置-4°C~4°C保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述B類單端孢霉烯族毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制備，其特征在于:所述B類單端孢霉烯族毒素標(biāo)準(zhǔn)品用嘔吐毒素(DON)標(biāo)準(zhǔn)品表示，嘔吐毒素(DON)標(biāo)準(zhǔn)品用嘔吐毒素(DON)純品中稀釋得到,稀釋液為去離子水，DON濃度為:0.001ng/mL~1000 n g/mL
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述B類單端孢霉烯族毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制備，其特征在于:B類單端孢霉烯族毒素一牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物的制備:將B類單端孢霉烯族毒素溶解在吡啶中，在反應(yīng)瓶中加入I一丁基硼酸；混合物在室溫下攪拌過夜；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮?dú)猓幻芊夥磻?yīng)瓶，混合物在沸水浴中攪拌90 mirTl20 min ；將吡啶在室溫吹干后，加入少量的水，然后將殘余物溶解于5 mL乙酸乙酯中，超聲波處理10min~30 min后,6000 rpm一15000 rpm下離心5 min一30 min,取上清液；將沉淀物用乙酸乙酯溶解，重復(fù)上述操作，合并上清液，將上清液減壓濃縮后備用；取濃縮物與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫震蕩10mirT60 min，離心；將上清液緩慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.01 M-0.2 MNaHCO3溶液中)，在2~8°C震蕩2 h~3 h，然后，在0.01 M-0.2 M磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)(pH7~8)中透析，換透析液3~8次；冷凍干燥，偶聯(lián)物于_4°C一4°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述B類單端孢霉烯族毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制備，其特征在于:B類單端孢霉烯族毒素一卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)物的制備:將B類單端孢霉烯族毒素溶解在吡啶中，在反應(yīng)瓶中加入I一丁基硼酸；混合物在室溫下攪拌過夜；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮?dú)?；密封反?yīng)瓶，混合物在沸水浴中攪拌90 mirTl20 min;將吡啶在室溫吹干后，加入少量的水，然后將殘余物溶解于5 mL乙酸乙酯中，超聲波處理10min~30 min后,6000 rpm一15000 rpm下離心5 min一30 min,取上清液；將沉淀物用乙酸乙酯溶解，重復(fù)上述操作，合并上清液，將上清液減壓濃縮后備用；取濃縮物與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫震蕩10mirT60 min，離心；將上清液緩慢滴加到卵清蛋白(溶于0.01 M-0.2 MNaHCO3溶液中)，在2~8°C震蕩2 h^3 h，然后，在0.01 M-0.2 M磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)(pH7~8)中透析，換透析液31次；冷凍干燥，偶聯(lián)物于-4 0C-4 °C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的B類單端孢霉烯族毒素酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制備，其特征在于:B類單端孢霉烯族毒素抗體及其溶液的制備:取B類單端孢霉烯族毒素一牛血清白蛋白偶聯(lián)物用生理鹽水配成0.1 μ g/μ L^lO μ g/μ L抗原溶液與等體積完全福氏佐劑混勻，充分乳化，供首次免疫用，加強(qiáng)免疫時(shí)用同量的不完全福氏佐劑代替完全福氏佐劑，首次免疫采用小鼠腹腔內(nèi)直接注射，免疫劑量為10 yg/只~100 yg/只小鼠，以后每隔2周到4周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫采用尾靜脈注射，免疫劑量為10 μ g/只~100μ g/只，最后一次免疫采用脾內(nèi)注射，4天后取脾融合，將分離的免疫小鼠脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞SP-2/o以10:1比列混合，離心，去除上清，在50 s^90 s內(nèi)將0.1mL~10 mL50%聚乙二醇(分子量為1500)加至細(xì)胞中，充分混勻，使其溶解，f 3 min后加入10 mL飛O mLDMEM培養(yǎng)液，終止融合，水浴靜置10 mirT30 min后離心，去除上清；將融合細(xì)胞用含5%~30%小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，以最后濃度為I X IO4^l X IO6飼養(yǎng)細(xì)胞/0.1 mL接種于以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于59Tl0%C02，35°C —45°C條件下培養(yǎng)，5天一 10天后，每培養(yǎng)孔更換2/3 HT培養(yǎng)液，10天~20天后，開始對對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養(yǎng)孔，取上清液進(jìn)行篩選，對檢測結(jié)果呈陽性的細(xì)胞立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆，雜交瘤篩選采用固相抗原間接競爭ELISA法進(jìn)行，以B類單端孢霉烯族毒素一卵清蛋白為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽性對照；以SP-2/o骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為陰性對照；陽性細(xì)胞孔的判斷標(biāo)準(zhǔn)為(Aa^-Ase)/ (Aw-Ase) >2.1 ;對分泌陽性抗體的細(xì)胞進(jìn)行克??；采用有限稀釋法，將陽性克隆細(xì)胞吹勻，取一微滴至培養(yǎng)瓶內(nèi)，倒置顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，稀釋為70個(gè)/mL，再取I mL稀釋至20倍，接種于96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行亞克隆，直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清均呈陽性為止；對10周齡~13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3 mL/只5 mL/只；8天~10天后，腹腔注射培養(yǎng)至對數(shù)期的雜交瘤細(xì)胞，5X IO5細(xì)胞/只，5天后注意觀察，收集腹水，離心去除沉淀，加甘油于_4°C °C保存；上述反應(yīng)成分的比列為:B類單端孢霉烯族毒素一卵清蛋白:生理鹽水=(10—1000)μ g: (0.1~10) mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的B類單端孢霉烯族毒素酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制備，其特征在于:所述完全福氏佐劑是由下列材料配比而成，液體石蠟:羊毛脂:卡介苗=(6^24) g:(10^40) mL:(0.05^0.5) g ;所述不完全福氏佐劑是由下列材料配比而成，液體石蠟:羊毛脂=(6~24)g:(10~40) mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的B類單端孢霉烯族毒素酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制備，其特征在于:所述的酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品為辣根或氧化物酶-羊抗鼠抗體凍干品；所述濃縮洗滌液為含有吐溫和NaN3磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為0.8 mol/LpH7.2-7.5的磷酸鹽緩沖液；所述顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述顯色液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為硫酸溶液。
10.B類單端孢霉烯族毒素酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的檢測方法，其特征在于: O將待測樣本進(jìn)行前處理，得到待測樣本溶液:a)所述待測樣品為谷物或飼料；取待測樣品溶于10%(體積百分含量)甲醇水溶液中，超聲波振蕩，過濾并收集濾液，即為待測樣本溶液；b)所述待測樣品為啤酒；將待測樣本攪拌，除去過量氣體，靜置得到上清液，即為待測樣本溶液；c)所述待測樣品為麥芽汁；直接作為待測樣本溶液； 2)用所述試劑盒對所述樣本進(jìn)行檢測:取包被有B類單端孢霉烯族毒素-卵清蛋白的微孔包被板，加入50 μ L^lOO μ L的DON標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品到各自的微孔中，加入50μ L^lOO μ L抗B類單端孢霉烯族毒素抗體，25°C左右孵育0.5 h~l h，洗滌液洗3~5次，加.50 μ L^lOO μ L辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗鼠抗體，25°C左右孵育0.5~1 h，用洗滌液洗3~5次，加50 μ L~100 μ L顯色液A和50 μ L~100 μ L顯色液B，避光靜置10~20 min后加終止液，在450 nm處測其吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中B類單端孢霉烯族毒素含量。
11.B類單端孢霉烯族毒素各主要毒素交叉反應(yīng)率的檢測方法，其特征在于用生物化學(xué)技術(shù)和B類單端孢霉烯族毒素適應(yīng)方法，將D0N、3-Ac-D0N、15-Ac-D0N、NIV, FUS-X設(shè)為被測物，通過生物化學(xué)反應(yīng)測定D0N、3-Ac-D0N、15-Ac_D0N、NIV、FUS-X的交叉反應(yīng)系數(shù)，經(jīng)測定，部分谷物D0N、3-Ac-D0N、15-Ac-DON、NIV、FUS-X的交叉反應(yīng)系數(shù)是:

【文檔編號】G01N33/543GK103792347SQ201210435376
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月5日
【發(fā)明者】杜道林, 吳灣灣 申請人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司