專利名稱：嘔吐毒素雜交瘤、單克隆抗體及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雜交瘤、單克隆抗體及其制備與用途，具體涉及嘔吐毒素雜交瘤、嘔吐毒素單克隆抗體及其制備方法與用途。
背景技術(shù)：
嘔吐毒素(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖I)，化學(xué)上稱作脫氧腐鐮刀菌烯醇，屬于霉菌的單端孢菌素族，具有很高的細(xì)胞毒性及免疫抑制性質(zhì)，禾谷鐮刀菌、擬枝鐮刀菌，梨孢鐮刀菌等鐮刀菌株及頭孢均屬、漆班菌屬、木霉菌等菌株都可產(chǎn)生該毒素，嘔吐毒素對(duì)糧谷類的污染非常普遍。嘔吐毒素可引起雛鴨、豬、貓、狗等動(dòng)物嚴(yán)重的嘔吐反應(yīng)，嚴(yán)重者可造成死亡。急性中毒的動(dòng)物主要表現(xiàn)為站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍、豎毛、食欲下降、嘔吐等，還可引起動(dòng)物的拒食反應(yīng)，其中豬對(duì)嘔吐毒素最為敏感，嘔吐毒素能引起豬食欲減退或廢絕、嘔吐、體重下降，流產(chǎn)、死胎和弱仔，抑制免疫機(jī)能和降低機(jī)體抵抗力。·目前，嘔吐毒素的檢測(cè)方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法等，儀器設(shè)備昂貴，技術(shù)水平要求較高，樣品還需要進(jìn)行純化處理，不利于現(xiàn)場(chǎng)篩查。薄層色譜，樣品前處理繁瑣，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，所需時(shí)間長(zhǎng)，準(zhǔn)確性差，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員危害較大，亦不利于現(xiàn)場(chǎng)篩查。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于快速、微量檢測(cè)藥物殘留，酶聯(lián)免疫分析技術(shù)可定性定量檢測(cè)微量殘留有害物質(zhì)，且對(duì)儀器要求低，成本低，操作快速簡(jiǎn)便，對(duì)樣本前處理過程簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)人員專業(yè)要求低，靈敏度較高，可適用于現(xiàn)場(chǎng)大量樣本快速檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵是合成抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一種嘔吐毒素雜交瘤、單克隆抗體及其制備方法與用途。一種嘔吐毒素雜交瘤細(xì)胞株D-2-1CGMCC No. 5161。一種嘔吐毒素單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞D-2-1CGMCC No. 5161分泌的。一種嘔吐毒素單克隆抗體的制備方法，其特征在于以嘔吐毒素半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫抗原，免疫Balb/C小鼠，將小鼠的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0制備雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法獲得單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞株注射于小鼠腹腔生產(chǎn)單克隆抗體。免疫抗原是由嘔吐毒素與馬來酸酐縮合反應(yīng)，再與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到的。本發(fā)明的提供一種基于上述方法制備的抗原及其單克隆抗體用于檢測(cè)嘔吐毒素及其含量的ELISA測(cè)定方法。本發(fā)明所述的一種檢測(cè)嘔吐毒素及其含量的ELISA測(cè)定方法，樣本中的嘔吐毒素可以與包被抗原對(duì)抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，根據(jù)其吸光度的數(shù)值可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品中嘔吐毒素的含量，該方法的靈敏度可達(dá)到O. 5μ g/L。
有益效果本發(fā)明提供的單克隆抗體可特異性檢測(cè)嘔吐毒素，靈敏度較高，本發(fā)明單克隆抗體制備的ELISA試劑盒可以對(duì)食品中嘔吐毒素進(jìn)行快速檢測(cè)，具有特異性高，靈敏度高，無需大型儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，便于推廣應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。


圖I嘔吐毒素結(jié)構(gòu)式。圖2嘔吐毒素半抗原合成路線圖。圖3嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)ELISA曲線。
具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I嘔吐毒素完全抗原合成(I)嘔吐毒素半抗原合成(合成技術(shù)路線見圖2)20-100mg嘔吐毒素(購(gòu)自上海安普科學(xué)儀器有限公司，貨號(hào)CDFV-ALX-630-115-M001)，與l_3mol馬來酸酐，催化量的DMAP，在2_5ml甲苯中，于室溫80°C攪拌反應(yīng)，8-20h后，蒸干溶劑，酸化，萃取，重結(jié)晶后得到嘔吐毒素半抗原。(2)嘔吐毒素免疫抗原合成將嘔吐毒素半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原。取60mg牛血清白蛋白溶于9.5ml PBS (O. 01mol/L，ρΗ5· O)溶液中，加入12. 5mgEDCjflA ImlDMF溶解的IOmg嘔吐毒素半抗原，室溫?cái)嚢鐸h,再加6mg EDC,暗處攪拌反應(yīng)并過夜，用O. Olmol/LPBS透析3天，每天換3次透析液，得到嘔吐毒素與牛血清白蛋白的免疫抗原。(3)嘔吐毒素包被抗原合成將嘔吐毒素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到免疫原。取45mg 卵清蛋白溶于 5. 5ml PBS (O. 01mol/L，pH5. O)溶液中，加入 12. 5mgEDC，力口入ImlDMF溶解的IOmg嘔吐毒素半抗原,室溫?cái)嚢鐸h,再加6mg EDC,暗處攪拌反應(yīng)并過夜，用O. Olmol/LPBS透析3天，每天換3次透析液，得到嘔吐毒素與牛血清白蛋白的免疫抗原。實(shí)施例2嘔吐毒素單克隆抗體的制備將上述所得免疫抗原與弗氏佐劑(購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)F5881)按I : 3的比例混合，對(duì)8-10周齡Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，頸背部皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為150 μ g/只，兩周后二免，采用弗氏不完全佐劑(購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)F5506)，免疫劑量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量同上，31天后加強(qiáng)免，直接采用免疫原免疫。加強(qiáng)免疫后3天，取免疫Balb/c小鼠一只，眼眶采血后脫臼處死，在75%酒精中消毒后取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加RPMI1640至30ml，1500 2000rpm離心5min,棄上清,加RPMI1640至30ml,計(jì)數(shù)待用。取3瓶生長(zhǎng)狀態(tài)良好的(活細(xì)胞數(shù)>95%)骨髓瘤細(xì)胞，將之完全吹下，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加RPMI1640至30ml, 1500 2000rpm離心5min分鐘，棄上清，加RPMI1640至30ml，計(jì)數(shù)待用。將脾細(xì)胞與骨髓瘤按照8 : I的比例混合，1500 2000rpm離心5min,將混合好的細(xì)胞離心，將沉淀細(xì)胞置于37°C水浴，加入Iml聚乙二醇(PEG) 4000，攪拌2min，隨后加入20ml無血清的PEG營(yíng)養(yǎng)液，IOOOrpm離心lOmin，棄上清，用20 50ml完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，鋪種于含飼養(yǎng)細(xì)胞96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱中。上清檢測(cè)待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底的1/2 1/3時(shí)，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔，將陽性細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，10 14天后，再取細(xì)胞上清檢測(cè)，最終得到嘔吐毒素的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，此細(xì)胞株命名為D-2-1,分類命名為嘔吐毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株已于2011年08月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5161。單克隆抗體的腹水制備和純化液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6 8周，注射體積500μ I/只。10天后可制備腹水，取100到150萬細(xì)胞注射于老鼠腹腔，一周后采集腹水。采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入-20°C環(huán)境保存。 實(shí)施例3間接ELISA法建立(I)抗原抗體效價(jià)測(cè)定取嘔吐毒素-卵清蛋白包被抗原以PBS(pH7. 4，0. Olmol/L)作I 1000，I 2000，I 3000,1 4000,1 5000稀釋，按照每孔100 μ I進(jìn)行包被，37°C溫育2h，傾去包被液，用PBST洗滌2次，每孔中加入200 μ I封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，備用。向板孔中加入嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μ I/孔，隨即加入以PBS(pH7. 4,0. Olmol/L)1 4000稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)二抗(購(gòu)自北京吉比埃生物技術(shù)有限公司)50μ I/孔，再加入以 PBS (ρΗ7· 4，O. 01mol/L)進(jìn)行 I 3000，I 6000，I 12000，I 24000，I 48000，
I 96000稀釋的嘔吐毒素單克隆抗體50 μ I/孔，25°C反應(yīng)30min，用PBST洗板3次，拍干。加入顯色底物反應(yīng)25°C反應(yīng)15min后，加入I 2mol/L的硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀以450/630nm雙波長(zhǎng)讀取數(shù)據(jù)，以零標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值約為I. 5-2. O左右，0. 5 μ g/L標(biāo)準(zhǔn)品抑制率約為15% -30%為參照，綜合考慮抗原抗體稀釋倍數(shù)等因素，最終測(cè)定抗原稀釋倍數(shù)為I : 2000-3000，抗體稀釋倍數(shù)為I : 12000-48000，具體測(cè)定結(jié)果見表I。表I最佳抗原包被濃度和最佳抗體稀釋濃度的測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種嘔吐毒素雜交瘤細(xì)胞株D-2-1CGMCC No. 5161。
2.—種嘔吐毒素單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞D-2-1CGMCC No. 5161分泌的。
3.—種嘔吐毒素單克隆抗體的制備方法，其特征在于以嘔吐毒素半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫抗原，免疫Balb/C小鼠，將小鼠的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0制備雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法獲得單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞株注射于小鼠腹腔生產(chǎn)單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的嘔吐毒素單克隆抗體的制備方法，其特征在于免疫抗原是由嘔吐毒素與馬來酸酐縮合反應(yīng)，再與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到的。
5.如權(quán)利要求2所述的嘔吐毒素單克隆抗體用于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)嘔吐毒素含量的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了嘔吐毒素雜交瘤、單克隆抗體及其制備方法及用途。以嘔吐毒素與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，將小鼠的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0制備雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法獲得單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-2-1CGMCC No.5161，將雜交瘤細(xì)胞株注射于小鼠腹腔內(nèi)生產(chǎn)單克隆抗體，將該抗體應(yīng)用于嘔吐霉素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定。本發(fā)明單克隆抗體可特異性檢測(cè)嘔吐毒素，靈敏度高，以此單克隆抗體制備的ELISA試劑盒檢測(cè)嘔吐毒素，成本低，無需大型儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，便于推廣利用。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102952782SQ20111025450
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者何方洋, 韓黎, 吳鵬, 馮才偉, 羅貴昆, 韓雪琳, 孫震, 趙正苗, 李勇, 陳勇, 馮才茂, 羅曉琴 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司