專利名稱:一種復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜的測定方法,具體地說是用高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜方法來測定復(fù)方丹參滴丸中有效成分的一種方法。
背景技術(shù):
心腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類的常見疾病。近年來,由于社會的發(fā)展,工作、生活、飲食結(jié)構(gòu)及環(huán)境等的變化,心腦血管疾病呈上升趨勢。對于心血管疾病的治療,雖然中藥單一靶點的作用強(qiáng)度低于西藥,但其多途徑、多靶點、動態(tài)整體治療、毒副作用小的特性則遠(yuǎn)非西藥所能企及,療效確切的中成藥的綜合治療效果要超過西藥。復(fù)方丹參制劑多用來治療心腦血管疾病,例如復(fù)方丹參片、復(fù)方丹參滴丸、冠心丹參滴丸等。這些復(fù)方丹參制劑(均含有丹參、三七)因其配方不同,或者配方比例不同,或者提取精制方法不同,或者劑型不同,治療效果也有所差異。另外,由于這些復(fù)方丹參制劑的質(zhì)量控制方法不夠全面,難以全面表征它們的物理化學(xué)特征。因此,對復(fù)方丹參制劑的提取精制方法、質(zhì)量控制方法進(jìn)行改進(jìn)成為人們積極研究的課題。
丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。全國大部分地區(qū)均產(chǎn)。由于丹參因品種、產(chǎn)地、采收期不同而造成質(zhì)量參差不齊,因而其制成品質(zhì)量的穩(wěn)定性也難以保證。目前,對丹參及其復(fù)方制劑的鑒定,往往是選取丹參的一、二個活性成分或指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定,并以其含量多少來判定質(zhì)量。例如,以丹參酮IIA含量(中國藥典2000年版一部58頁)或丹參素含量(張友芹等,中醫(yī)藥學(xué)報,2000,28(3)68)等來鑒別丹參藥材的質(zhì)量;以丹參酮來判定丹參品種和產(chǎn)地情況(裘飛君,中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),1998,15(5)16;胡世林等,中國中藥雜志,1999,24(12)721);用丹參素含量(嚴(yán)常開等,中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2000,20(10)600)、原兒茶醛含量(鄭末晶等,中國藥事,2000,14(4)254)或丹參酮IIA含量(林偉忠等,中成藥,2000,22(11)766)等判別復(fù)方丹參制劑的質(zhì)量,用丹參酮IIA含量鑒別不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片的質(zhì)量(邵水娟,中國藥業(yè),2000,9(7)27)等。已知的丹參的化學(xué)成分有幾十種,其脂溶性成分大多為醌型紅黃色物質(zhì),如丹參酮I、IIA、IIB,丹參醌A、B、C,丹參酸鉀脂,異丹參酮I、II,隱丹參酮等。其水溶性成分大多為酚性醛、酚性酸、二萜酸,如丁二酸、丹酚酸A、B、C,3,4-二羥基苯甲酸等。此外,還分離出β-谷甾醇、維生素E等(王伯祥主編,中醫(yī)肝膽病學(xué),第一版,中國醫(yī)藥科技出版社,1993年,96頁)。三七為五加科(Araliaceae)植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen,的干燥根,主產(chǎn)于云南、廣西及四川等地,是我國珍貴的特產(chǎn)藥材,常用中藥。其味甘,微苦,性溫,歸肝、腎經(jīng),具有散瘀止血、消腫止痛的功效,傳統(tǒng)用于治療跌打損傷和各種出血性疾病。研究表明,三七主要含有皂甙、多糖、氨基酸等化學(xué)成分,其中皂甙部分是三七活血化瘀功效應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ),是三七主要的有效成分。三七總皂甙含有人參皂甙Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Bh1,三七皂甙R1、R2、R3、R4、R6等20余種皂甙成分。這些成分均屬于達(dá)馬烷型[Dammarane type]四環(huán)三萜皂甙,其中人參皂甙Rb1、Rg1,三七皂甙R1是含量最高的3個成分,三七皂甙R1是三七最具代表性特征的化合物。
中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下,中藥指紋圖譜對于有效控制中藥材或中成藥的質(zhì)量具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)在企業(yè)內(nèi)部采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。德國、法國在對銀杏葉提取物聯(lián)合開發(fā)的過程中,發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物的醫(yī)療作用是提取物所得物質(zhì)群的整體作用結(jié)果,而對這樣一個整體的質(zhì)量控制,亦采用高效液相指紋圖譜方法。美國FDA最近幾年制定的植物草藥指南中已經(jīng)明確把指紋圖譜作為混合物質(zhì)群的質(zhì)量控制方法(FDA.Guidance of IndustryBotanical Drug(Draft).2000 August)。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn),作為中醫(yī)理論的實踐產(chǎn)物,中藥,尤其是復(fù)方中藥,其中所含的任一成分都不能代表其整體療效。人們逐漸認(rèn)識到,現(xiàn)行的參照西藥(合成藥)質(zhì)量控制模式的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能恰當(dāng)?shù)胤从持兴巸?nèi)在的質(zhì)量。從發(fā)展趨勢看,從現(xiàn)行的質(zhì)量控制模式向一種綜合的、宏觀的、可量化的鑒別與主要有效成分含量測定結(jié)合已是發(fā)展的趨勢。
中藥質(zhì)量評價的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是利用光譜或色譜手段鑒別和測定某一種或幾種有效成分、活性成分或指標(biāo)成分,以及藥典規(guī)定的常規(guī)檢查項目。如中國藥典2000年版[一部]共收載602種藥材及成藥品種。其中有992個薄層色譜鑒別,308個品種有含量測定〔容量法、光譜法、液相色譜法、氣相色譜法及薄層色譜掃描法〕,大多數(shù)品種有一般的檢查項目。顯然,這些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置是模仿了化學(xué)藥品的模式。其它國家如英國、印度、美國草藥典、日本藥局方中的漢藥及德國Commission E編輯的德國草藥專論等也采用了基本相同的內(nèi)容。對于化學(xué)藥品而言,其藥效成分為結(jié)構(gòu)清晰的單一化合物,構(gòu)效關(guān)系明確,其含量和純度直接表達(dá)其有效及安全性。然而,中醫(yī)用藥的特點是復(fù)方配伍,任何單一的有效或活性成分的含量高低均不能表達(dá)其整體的療效。例如,黃芪所含的黃芪甲苷(aastraga losideIV)是當(dāng)前被選擇為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的鑒別和含量測定的最為常見的目標(biāo),但并沒有依據(jù)證明黃芪甲苷與黃芪的功能主治的明確聯(lián)系。同樣,黃連、黃柏、三棵針均含小梁堿,一般都以它作為檢測的目標(biāo),但是三者的功能主治卻截然不同。復(fù)方制劑的情況就更加復(fù)雜。中醫(yī)這種不是一對一的非線性的理論和實踐說明中藥質(zhì)量應(yīng)該采用某種宏觀的綜合的質(zhì)量評價手段。
復(fù)方丹參滴丸是由丹參、三七為主要原料制成的滴丸制劑,臨床上用于治療心腦血管疾病、冠心病、心絞痛、心肌缺血、微循環(huán)障礙所導(dǎo)致的各類疾病等,其治療效果已經(jīng)得到臨床的驗證,而是否能夠保證藥物的質(zhì)量以及復(fù)方丹參滴丸中有效成分的含量,是決定復(fù)方丹參滴丸療效的基礎(chǔ)。如果用一、二種丹參的活性成分來說明復(fù)方丹參滴丸的內(nèi)在質(zhì)量,具有一定的片面性,更不用說無藥效的指標(biāo)成分了。要控制復(fù)方丹參滴丸的功效,只針對其一、二個化學(xué)成分進(jìn)行表征和控制是不夠的,必須對它的物質(zhì)群整體予以控制。所以,除了“微觀分析”外,還應(yīng)該用某種“宏觀分析”方法,從整體上有效地表征中藥質(zhì)量。指紋圖譜作為中草藥及其提取物質(zhì)量控制方法,目前已經(jīng)成為國際共識?,F(xiàn)在,對丹參中活性成分如丹參酮、丹參素等的測定方法較多,對三七中活性成分如三七皂甙Rg1,人參皂甙Rg1等測定方法較多,但如何能夠從更宏觀的角度對復(fù)方丹參滴丸中丹參化學(xué)組分為指標(biāo)的宏觀指紋圖譜的建立方法卻未見報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)方丹參滴丸宏觀指紋圖譜的測定方法,通過此測定方法,可控制復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量。
本發(fā)明可通過下列步驟實施(a)復(fù)方丹參滴丸供試品的制備取復(fù)方丹參滴丸,置容量瓶中,加蒸餾水超聲溶解,定容,過濾,即為供試品;(b)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料;采用梯度洗脫,流動相A為磷酸水溶液;流動相B為乙腈磷酸水溶液,檢測波長274~286nm;(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,得到復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜。
優(yōu)選的本發(fā)明可通過下列步驟實施所述(a)步驟中檢測波長277~283nm。
進(jìn)一步優(yōu)選的復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜獲取方法,方法如下(a)復(fù)方丹參滴丸供試品溶液的制備取復(fù)方丹參滴丸,精密稱定,置1~25ml容量瓶中,加蒸餾水超聲5~30min,溶解,定容,過濾,即為供試品;(b)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料;采用梯度洗脫,流動相A為0.01%磷酸水溶液;流動相B為80%乙腈磷酸水溶液;梯度洗脫程序如下0min時,流動相A為90%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為10%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;8min時,流動相A為78%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為22%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;15min時,流動相A為74%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為26%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;55min時,流動相A為48%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為52%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;流速1.000ml/min,檢測波長280nm,柱溫30℃,進(jìn)樣體積10μl;(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,得到復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜。
最佳的復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜獲取方法,方法如下(a)復(fù)方丹參滴丸供試品溶液的制備取復(fù)方丹參滴丸5~15粒,精密稱定,置10ml容量瓶中,加蒸餾水超聲15min,溶解,定容,過濾,即為供試品;(b)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料;采用梯度洗脫,流動相A為0.02%磷酸水溶液;流動相B為80%乙腈磷0.02%酸水溶液;梯度洗脫程序如下0min時,流動相A為90%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為10%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;8min時,流動相A為78%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為22%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;15min時,流動相A為74%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為26%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;55min時,流動相A為48%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為52%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;流速1.000ml/min,檢測波長280nm,柱溫30℃,進(jìn)樣體積10μl;(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,得到的復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積2%的吸收峰有8個,分別為1號峰,平均保留時間RT為6.04min,RSD為0.31%,峰面積為1627.92,RSD為5.91%;2號峰,平均保留時間RT為9.90min,RSD為0.25%,峰面積為2575.54,RSD為13.53%;
3號峰,平均保留時間RT為16.89min,RSD為0.61%,峰面積為366.89,RSD為10.92%;4號峰,平均保留時間RT為17.84min,RSD為0.07%,峰面積為381.40,RSD為13.81%;5號峰,平均保留時間RT為20.31min,RSD為0.96%,峰面積為186.08,RSD為12.04%;6號峰,平均保留時間RT為23.74min,RSD為0.76%,峰面積為555.35,RSD為10.48%;7號峰,平均保留時間RT為27.73min,RSD為0.50%,峰面積為281.91,RSD為18.08%;8號峰,平均保留時間RT為31.02min,RSD為1.18%,峰面積為1852.33,RSD為14.84%。
所述指紋圖譜中,復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜中吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積5%的吸收峰有4個,分別為1號峰,平均保留時間RT為6.04min,RSD為0.31%,峰面積為1627.92,RSD為5.91%;2號峰,平均保留時間RT為9.90min,RSD為0.25%,峰面積為2575.54,RSD為13.53%;6號峰,平均保留時間RT為23.74min,RSD為0.76%,峰面積為555.35,RSD為10.48%;8號峰,平均保留時間RT為31.02min,RSD為1.18%,峰面積為1852.33,RSD為14.84%。
所述指紋圖譜中,復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜中吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積10%的吸收峰有3個,分別為1號峰,平均保留時間RT為6.04min,RSD為0.31%,峰面積為1627.92,RSD為5.91%;2號峰,平均保留時間RT為9.90min,RSD為0.25%,峰面積為2575.54,RSD為13.53%;8號峰,平均保留時間RT為31.02min,RSD為1.18%,峰面積為1852.33,RSD為14.84%。
上述復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜的測定方法中,其用于梯度洗脫的流動相A溶液的配制比例是按體積比配制,流動相B溶液的配制比例是按體積比配制。
本發(fā)明對丹參藥材、復(fù)方丹參滴丸中間體中的化學(xué)成分進(jìn)行了測定,方法如下丹參藥材中化學(xué)組分高效液相指紋圖譜獲取方法,方法如下丹參藥材供試品的制備取丹參藥材粉碎,置燒瓶中,加水,加熱回流,放冷,收集回流液,將殘渣中再加水,加熱回流,放冷,收集回流液,合并兩次回流液,定容,過濾,作為供試品;色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料;采用梯度洗脫,流動相A為磷酸~水溶液;流動相B為乙腈磷酸水溶液,流速1.000ml/min,檢測波長280nm,柱溫30℃;測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,得到丹參組分化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
優(yōu)選的丹參藥材中化學(xué)組分高效液相指紋圖譜獲取方法,方法如下丹參藥材供試品的制備取粉碎的丹參藥材2.5g,置燒瓶中,加50ml水,加熱回流1.5小時,放冷,收集回流液,將殘渣中再加50ml水,加熱回流1小時,放冷,收集回流液,合并兩煎回流液與100ml容量瓶中,定容,過濾,作為供試品;色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料;采用梯度洗脫,流動相A相為0.02%的磷酸水溶液;流動相B相為80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;色譜流動相洗脫梯度如下0min時,流動相A為90%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為10%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;8min時,流動相A為78%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為22%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;15min時,流動相A為74%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為26%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;55min時,流動相A為48%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為52%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;流速1.000ml/min,檢測波長280nm,柱溫30℃,進(jìn)樣體積10μl;測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,得到丹參組分化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜;丹參藥材中丹參組分化學(xué)成分吸收峰有9個,其中單峰面積超過總峰面積2%的吸收峰有9個,分別為1號峰,平均保留時間RT為5.99min,RSD為0.45%,峰面積為784.93,RSD為7.34%;2號峰,平均保留時間RT為9.85min,RSD為0.47%,峰面積為916.57,RSD為6.06%;3號峰,平均保留時間RT為20.13min,RSD為0.46%,峰面積為778.87,RSD為8.78%;4號峰,平均保留時間RT為22.37min,RSD為0.77%,峰面積為1165.13,RSD為7.60%;5號峰,平均保留時間RT為23.49min,RSD為0.45%,峰面積為1076.7,RSD為3.70%;6號峰,平均保留時間RT為24.51min,RSD為0.46%,峰面積為802.43,RSD為8.21%;7號峰,平均保留時間RT為27.26min,RSD為0.44%,峰面積為9017.8,RSD為10.82%;8號峰,平均保留時間RT為29.71min,RSD為0.32%,峰面積為539.37,RSD為13.30%;9號峰,平均保留時間RT為30.68min,RSD為0.29%,峰面積為496.67,RSD為15.23%。
丹參藥材中丹參組分化學(xué)成分吸收峰有9個,其中單峰面積超過總峰面積5%的吸收峰有7個,分別為1號峰,平均保留時間RT為5.99min,RSD為0.45%,峰面積為784.93,RSD為7.34%;2號峰,平均保留時間RT為9.85min,RSD為0.47%,峰面積為916.57,RSD為6.06%;
3號峰,平均保留時間RT為20.13min,RSD為0.46%,峰面積為778.87,RSD為8.78%;4號峰,平均保留時間RT為22.37min,RSD為0.77%,峰面積為1165.13,RSD為7.60%;5號峰,平均保留時間RT為23.49min,RSD為0.45%,峰面積為1076.7,RSD為3.70%;6號峰,平均保留時間RT為24.51min,RSD為0.46%,峰面積為802.43,RSD為8.21%;7號峰,平均保留時間RT為27.26min,RSD為0.44%,峰面積為9017.8,RSD為10.82%。
丹參藥材中丹參組分化學(xué)成分吸收峰有9個,其中單峰面積超過總峰面積10%的吸收峰有1個,為7號峰平均保留時間RT為27.26min,RSD為0.44%,峰面積為9017.8,RSD為10.82%。
復(fù)方丹參滴丸中間體中丹參化學(xué)組分高效液相指紋圖譜獲取方法,方法如下復(fù)方丹參滴丸中間體供試品的制備取丹參浸膏,置于容量瓶中,加蒸餾水超聲溶解,定容,過濾,即為供試品;色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料;采用梯度洗脫,流動相A為磷酸水溶液;流動相B為乙腈磷酸水溶液,流速1.000ml/min,檢測波長280nm,柱溫30℃;測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,得到復(fù)方丹參滴丸中丹參組分化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜;優(yōu)選的復(fù)方丹參滴丸中間體中丹參化學(xué)組分高效液相指紋圖譜獲取方法,方法如下復(fù)方丹參滴丸中間體供試品的制備取丹參浸膏0.1g,精密稱定,置10ml容量瓶中,加蒸餾水超聲15min,溶解,定容,過濾,即為供試品;色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料;采用梯度洗脫,流動相A相為0.02%的磷酸水溶液;流動相B相為80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;色譜流動相洗脫梯度如下0min時,流動相A為90%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為10%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;8min時,流動相A為78%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為22%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;15min時,流動相A為74%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為26%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;55min時,流動相A為48%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為52%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;流速1.000ml/min,檢測波長280nm,柱溫30℃,進(jìn)樣體積10μl;測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,得到復(fù)方丹參滴丸中丹參組分化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜;
所述指紋圖譜中,復(fù)方丹參滴丸中間體中丹參組分化學(xué)成分吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積2%的吸收峰有8個,分別為1號峰,平均保留時間RT為6.12min,RSD為0.83%,峰面積為2554.6,RSD為10.68%;2號峰,平均保留時間RT為10.00min,RSD為0.77%,峰面積為4438.6,RSD為14.63%;3號峰,平均保留時間RT為15.96min,RSD為0.58%,峰面積為740.16,RSD為13.18%;4號峰,平均保留時間RT為17.89min,RSD為1.17%,峰面積為667.68,RSD為13.47%;5號峰,平均保留時間RT為20.27min,RSD為2.94%,峰面積為654.73,RSD為15.01%;6號峰,平均保留時間RT為23.83min,RSD為0.88%,峰面積為1140.51,RSD為16.45%;7號峰,平均保留時間RT為27.67min,RSD為0.61%,峰面積為880.14,RSD為11.49%;8號峰,平均保留時間RT為30.93min,RSD為0.47%,峰面積為2965.29,RSD為10.21%。
所述指紋圖譜中,復(fù)方丹參滴丸中間體中丹參組分化學(xué)成分吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積5%的吸收峰有6個,分別為1號峰,平均保留時間RT為6.12min,RSD為0.83%,峰面積為2554.6,RSD為10.68%;2號峰,平均保留時間RT為10.00min,RSD為0.77%,峰面積為4438.6,RSD為14.63%;3號峰,平均保留時間RT為15.96min,RSD為0.58%,峰面積為740.16,RSD為13.18%;6號峰,平均保留時間RT為23.83min,RSD為0.88%,峰面積為1140.51,RSD為16.45%;7號峰,平均保留時間RT為27.67min,RSD為0.61%,峰面積為880.14,RSD為11.49%;8號峰,平均保留時間RT為30.93min,RSD為0.47%,峰面積為2965.29,RSD為10.21%。
所述指紋圖譜中,復(fù)方丹參滴丸中間體中丹參組分化學(xué)成分吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積10%的吸收峰有3個,分別為1號峰,平均保留時間RT為6.12min,RSD為0.83%,峰面積為2554.6,RSD為10.68%;2號峰,平均保留時間RT為10.00min,RSD為0.77%,峰面積為4438.6,RSD為14.63%;8號峰,平均保留時間RT為30.93min,RSD為0.47%,峰面積為2965.29,RSD為10.21%。
本發(fā)明通過測定復(fù)方丹參滴丸、復(fù)方丹參滴丸中間體、丹參藥材的指紋圖譜發(fā)現(xiàn),三者中吸收峰數(shù)量幾乎完全相同,說明丹參藥材中的化學(xué)組分幾乎完全被提取到復(fù)方丹參滴丸中,測定復(fù)方丹參滴丸產(chǎn)品的指紋圖譜可作為復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),能夠客觀的反映產(chǎn)品內(nèi)在成分的有無與與含量,可以全面控制產(chǎn)品的質(zhì)量。
本發(fā)明的優(yōu)點如下
(1).以復(fù)方丹參滴丸中主要有效成分丹參化學(xué)組分為指標(biāo)建立起來的HPLC指紋圖譜,代表著復(fù)方丹參滴丸大部分藥理活性,能有效地表征復(fù)方丹參滴丸的質(zhì)量。從而實現(xiàn)對復(fù)方丹參滴丸最大可能的化學(xué)成分進(jìn)行檢測,有利于對中藥質(zhì)量的全方面監(jiān)控。
(2).以復(fù)方丹參滴丸中丹參各有效成分指紋圖形作為一個整體看待,注重各個構(gòu)成指紋特征峰的前后順序和相互關(guān)系,注重整體面貌特征,既避免了因只測定一、二個化學(xué)成分而判定復(fù)方丹參滴丸整體質(zhì)量的片面性,又減少了為質(zhì)量達(dá)標(biāo)而人為處理的可能性。本發(fā)明為完整、準(zhǔn)確評價復(fù)方丹參滴丸的質(zhì)量提供了新的對照標(biāo)準(zhǔn),將為提高復(fù)方丹參滴丸及其他以丹參、三七為主要成分成方制劑的質(zhì)量及療效做出貢獻(xiàn)。
(3).本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點。
本發(fā)明提供了一種復(fù)方丹參滴丸的檢測方法,本發(fā)明是通過大量實驗所得到的切實可行的方法,具有重復(fù)性。在本發(fā)明中通過高效液相、在相同測試條件下所獲取的復(fù)方丹參滴丸中丹參化學(xué)組分高效液相指紋圖譜、復(fù)方丹參滴丸中間體的丹參化學(xué)組分高效液相指紋圖譜以及丹參藥材指紋圖譜的重合性好,測定重復(fù)性好,因此可通過將上述測定方法建立的復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜作為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,其測定方法可作為含有丹參、三七制劑有效成分測定的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,以鑒別其有效成分。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容,本領(lǐng)域技術(shù)人員將很清楚本發(fā)明的其它實施方案,本發(fā)明實施例僅作為示例。在不違反本發(fā)明主旨及范圍的情況下,可對本發(fā)明進(jìn)行各種改變和改進(jìn)。例如,使用不同的檢測儀器所獲得的測定結(jié)果可能有所不同,但只要使用本發(fā)明所述的質(zhì)量控制方法,均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。
下面給出丹參藥材指紋圖譜、復(fù)方丹參滴丸中間體中丹參指紋圖譜、復(fù)方丹參滴丸中丹參的指紋圖譜、不同來源的丹參化學(xué)組分HPLC指紋圖譜的對照,旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明,但對本發(fā)明并不構(gòu)成限制。
圖1 丹參藥材中丹參的指紋圖譜圖2 復(fù)方丹參滴丸中間體中丹參的指紋圖譜圖3 復(fù)方丹參滴丸中丹參的指紋圖譜圖4 不同來源的丹參化學(xué)組分HPLC指紋圖譜的對照其中1為復(fù)方丹參滴丸2為復(fù)方丹參滴丸中間體3為丹參藥材
具體實施例方式
下面列舉制備方面的實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明,該實施例僅用于說明本發(fā)明,對本發(fā)明并不構(gòu)成限制。
實施例一(制備例)稱取丹參41.06g、三七8.03g,加水煎煮二次,第一次4倍量水2小時,第二次3倍量水1小時,過濾,濾液合并,濃縮至比重為1.19-1.20(75±1℃)時,加濃度為90%左右乙醇至乙醇含量為65%(20℃),靜置12小時,分離上清液,回收乙醇,濃縮至藥液相對密度為1.37(55-60℃),得丹參三七浸膏。取上述丹參三七浸膏和冰片0.46g,與聚乙二醇-6000 18g混和均勻,加熱至溫度85℃,化料80分鐘后,移至罐溫保持在86℃的滴丸機(jī)滴罐中。藥液滴至8℃液體石蠟中,取出滴丸,除油,篩網(wǎng)選丸,即得。
實施例二(制備例)稱取丹參59.36g、三七6.38g,加水煎煮二次,第一次4倍量水2.5小時,第二次3倍量水1.5小時,過濾,濾液合并,濃縮至比重為1.19-1.20(75±1℃)時,加濃度為85%左右乙醇至乙醇含量為70%(20℃),靜置10小時,分離上清液,回收乙醇,濃縮至藥液相對密度為1.35(55-60℃),得丹參三七浸膏。取上述丹參三七浸膏和冰片0.34g,與聚乙二醇-6000 23g混和均勻,加熱至溫度89℃,化料100分鐘后,移至罐溫保持在85℃的滴丸機(jī)滴罐中。藥液滴至8℃甲基硅油中,取出滴丸,除油,篩網(wǎng)選丸,即得。
實施例三(制備例)稱取丹參31.12g、三七9.21g,加藥材總量0.5%的氫氧化鈉,煎煮二次,第一次4倍量水1.5小時,第二次3倍量水1.5小時,過濾,濾液合并,濃縮至比重為1.19-1.20(75±1℃)時,加濃度為88%左右乙醇至乙醇含量為66%(20℃),靜置10小時,分離上清液,回收乙醇,濃縮至藥液相對密度為1.40(55-60℃),得丹參三七浸膏。取上述丹參三七浸膏和冰片0.50g,甘露醇90g、依地酸鈣鈉15g和蒸餾水15ml,上述組分混勻后,冷凍干燥,制成粉針劑。
實施例四(制備例)稱取丹參116.35g、三七58.21g,加藥材總量2.0%的碳酸氫鈉,煎煮二次,第一次4倍量水2小時,第二次3倍量水1.5小時,過濾,濾液合并,濃縮至比重為1.19-1.20(75±1℃)時,加濃度為88%左右乙醇至乙醇含量為66%(20℃),靜置10小時,分離上清液,回收乙醇,濃縮至藥液相對密度為1.40(55-60℃),得丹參三七浸膏。取上述丹參三七浸膏和降香油1.8g,與40g微晶纖維素混合均勻,加3%聚維酮乙醇溶液制軟材,過18目篩制顆粒,60℃干燥35分鐘,整粒,加入4g滑石粉,混勻,充于膠囊中,即得。
實施例五(制備例)稱取丹參116.35g、三七58.21g,加水煎煮二次,第一次4倍量水2小時,第二次3倍量水1.5小時,過濾,濾液合并,濃縮至比重為1.19-1.20(75±1℃)時,加濃度為88%左右乙醇至乙醇含量為66%(20℃),靜置10小時,分離上清液,回收乙醇,濃縮至藥液相對密度為1.40(55-60℃),得丹參三七浸膏。取上述丹參三七浸膏和冰片0.9g,與微晶纖維素120g、羥丙甲基纖維素40g、木糖醇5g、硬脂酸鎂2g混合均勻,壓片,即得。
實施例六(制備例)稱取丹參140.35g、三七36.42g,加藥材總量2.5%的碳酸氫鈉,煎煮二次,第一次4倍量水2小時,第二次3倍量水1.5小時,過濾,濾液合并,濃縮至比重為1.19-1.20(75±1℃)時,加濃度為90%左右乙醇至乙醇含量為65%(20℃),靜置8小時,分離上清液,回收乙醇,濃縮至藥液相對密度為1.35(55-60℃),得丹參三七浸膏。取上述丹參三七浸膏和冰片1.0g,與46g微晶纖維素混合均勻,加3%聚維酮乙醇溶液制軟材,過18目篩制顆粒,60℃干燥30分鐘,整粒,加入4g滑石粉,混勻,壓片,即得。
實施例七(復(fù)方丹參滴丸丹參組分指紋圖譜檢測例)1、儀器與試劑儀器采用Agilent 1100液相色譜,包括四元泵,在線脫氣裝置,自動進(jìn)樣器,DAD檢測器,柱溫箱,Chemstation工作站;BS210S電子天平(1/10-4g)(北京塞多利斯公司)、METTLERAE240電子天平(1/10-4g或1/10-5g)(梅特勒-托利多(上海)有限公司)、LD4-2離心機(jī)(4000r/min)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(天津長風(fēng)有限公司)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、SHE-(III)循環(huán)水式真空泵(鞏義英峪予華儀器廠)、KQ-250B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、HENGAO T&D過濾器(HENGGAO T&D)、合成纖維過濾膜(孔徑0.45μm)(上海興亞凈化材料廠);試劑乙腈(色譜純,美國墨克公司),磷酸(優(yōu)級純),娃哈哈純凈水。
2、供試品制備復(fù)方丹參滴丸供試晶的制備取實施例一各批次復(fù)方丹參滴丸10粒,精密稱定,置10ml容量瓶中,加蒸餾水超聲15min,溶解,定容,過濾,即為供試品。
復(fù)方丹參滴丸中間體供試品的制備取實施例一各批次丹參三七浸膏0.1g,精密稱定,置10ml容量瓶中,加蒸餾水超聲15min,溶解,定容,過濾,即為供試品。
丹參藥材供試品的制備取丹參藥材(粉碎)2.5g,置燒瓶中,加50ml水,加熱回流1.5小時,放冷,收集回流液。將殘渣中再加50ml水,加熱回流1小時,放冷,收集回流液。合并兩煎回流液與100ml容量瓶中,定容,過濾,作為供試品。
3、HPLC分析條件Agilent ZoRBAx SB-C18(4.6×250mm,5μm)色譜柱,流動相A相為0.02%的磷酸水溶液;B相為80%乙腈0.02%的磷酸水溶液。流速1.000ml/min,檢測波長280nm,柱溫30℃,進(jìn)樣體積10μl。
色譜流動相洗脫梯度如下表保留時間 流動相A(v/v)流動相B(v/v)0min 90%10%8min 78%22%15min74%26%55min48%52%成分名稱
數(shù)據(jù)分析共計對200余批復(fù)方丹參浸膏分別進(jìn)行丹參指紋圖譜分析,其相似度均在90%以上?,F(xiàn)將圖譜的保留時間、峰面積的平均值以及RSD值匯總?cè)缦碌⒅讣y圖譜部分
所述指紋圖譜中,復(fù)方丹參滴丸中間體中丹參組分化學(xué)成分吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積2%的吸收峰有8個,它們是1號峰平均保留時間RT為6.12min,RSD為0.83%,峰面積為2554.6,RSD為10.68%;2號峰平均保留時間RT為10.00min,RSD為0.77%,峰面積為4438.6,RSD為14.63%;3號峰平均保留時間RT為15.96min,RSD為0.58%,峰面積為740.16,RSD為13.18%;4號峰平均保留時間RT為17.89min,RSD為1.17%,峰面積為667.68,RSD為13.47%;5號峰平均保留時間RT為20.27min,RSD為2.94%,峰面積為654.73,RSD為15.01%;6號峰平均保留時間RT為23.83min,RSD為0.88%,峰面積為1140.51,RSD為16.45%;7號峰平均保留時間RT為27.67min,RSD為0.61%,峰面積為880.14,RSD為11.49%;8號峰平均保留時間RT為30.93min,RSD為0.47%,峰面積為2965.29,RSD為10.21%。
所述指紋圖譜中,復(fù)方丹參滴丸中間體中丹參組分化學(xué)成分吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積5%的吸收峰有6個,它們是1號峰平均保留時間RT為6.12min,RSD為0.83%,峰面積為2554.6,RSD為10.68%;2號峰平均保留時間RT為10.00min,RSD為0.77%,峰面積為4438.6,RSD為14.63%;3號峰平均保留時間RT為15.96min,RSD為0.58%,峰面積為740.16,RSD為13.18%;6號峰平均保留時間RT為23.83min,RSD為0.88%,峰面積為1140.51,RSD為16.45%;7號峰平均保留時間RT為27.67min,RSD為0.61%,峰面積為880.14,RSD為11.49%;8號峰平均保留時間RT為30.93min,RSD為0.47%,峰面積為2965.29,RSD為10.21%。
所述指紋圖譜中,復(fù)方丹參滴丸中間體中丹參組分化學(xué)成分吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積10%的吸收峰有3個,它們是1號峰平均保留時間RT為6.12min,RSD為0.83%,峰面積為2554.6,RSD為10.68%;2號峰平均保留時間RT為10.00min,RSD為0.77%,峰面積為4438.6,RSD為14.63%;8號峰平均保留時間RT為30.93min,RSD為0.47%,峰面積為2965.29,RSD為10.21%。
共計對200余批復(fù)方丹參滴丸分別進(jìn)行丹參指紋圖譜分析,其相似度均在90%以上?,F(xiàn)將圖譜的保留時間、峰面積的平均值以及RSD值匯總?cè)缦聫?fù)方丹參滴丸指紋圖譜部分
在對照指紋圖譜的建立中,照高效液相色譜法測定所獲得的對照復(fù)方丹參滴丸的指紋圖譜中吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積10%的吸收峰有3個,它們是1號峰平均保留時間RT為6.04min,RSD為0.31%,峰面積為1627.92,RSD為5.91%;2號峰平均保留時間RT為9.90min,RSD為0.25%,峰面積為2575.54,RSD為13.53%;8號峰平均保留時間RT為31.02min,RSD為1.18%,峰面積為1852.33,RSD為14.84%;在對照指紋圖譜的建立中,照高效液相色譜法測定所獲得的對照復(fù)方丹參滴丸的指紋圖譜中吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積5%的吸收峰有4個,分別為1號峰,平均保留時間RT為6.04min,RSD為0.31%,峰面積為1627.92,RSD為5.91%;2號峰,平均保留時間RT為9.90min,RSD為0.25%,峰面積為2575.54,RSD為13.53%;6號峰,平均保留時間RT為23.74min,RSD為0.76%,峰面積為555.35,RSD為10.48%;8號峰,平均保留時間RT為31.02min,RSD為1.18%,峰面積為1852.33,RSD為14.84%;在對照指紋圖譜的建立中,照高效液相色譜法測定所獲得的對照復(fù)方丹參滴丸的指紋圖譜中吸收峰有8個,其中單峰面積超過總峰面積2%的吸收峰有8個,分別為1號峰,平均保留時間RT為6.04min,RSD為0.31%,峰面積為1627.92,RSD為5.91%;2號峰,平均保留時間RT為9.90min,RSD為0.25%,峰面積為2575.54,RSD為13.53%;3號峰,平均保留時間RT為16.89min,RSD為0.61%,峰面積為366.89,RSD為10.92%;4號峰,平均保留時間RT為17.84min,RSD為0.07%,峰面積為381.40,RSD為13.81%;5號峰,平均保留時間RT為20.31min,RSD為0.96%,峰面積為186.08,RSD為12.04%;6號峰,平均保留時間RT為23.74min,RSD為0.76%,峰面積為555.35,RSD為10.48%;7號峰,平均保留時間RT為27.73min,RSD為0.50%,峰面積為281.91,RSD為18.08%;8號峰,平均保留時間RT為31.02min,RSD為1.18%,峰面積為1852.33,RSD為14.84%。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜的測定方法,其特征包括如下步驟(a)復(fù)方丹參滴丸供試品的制備取復(fù)方丹參滴丸,置容量瓶中,加蒸餾水超聲溶解,定容,過濾,即為供試品;(b)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料;采用梯度洗脫,流動相A為磷酸水溶液;流動相B為乙腈磷酸水溶液,檢測波長274~286nm;(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,得到復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜的測定方法,其特征在于所述(a)步驟中檢測波長277~283nm。
3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜的測定方法,其特征包括如下步驟(a)復(fù)方丹參滴丸供試品溶液的制備取復(fù)方丹參滴丸,精密稱定,置1~25ml容量瓶中,加蒸餾水超聲5~30min,溶解,定容,過濾,即為供試品;(b)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料;采用梯度洗脫,流動相A為0.01%磷酸水溶液;流動相B為80%乙腈磷酸水溶液;梯度洗脫程序如下0min時,流動相A為90%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為10%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;8min時,流動相A為78%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為22%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;15min時,流動相A為74%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為26%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;55min時,流動相A為48%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為52%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;流速1.000ml/min,檢測波長280nm,柱溫30℃,進(jìn)樣體積10μl;(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,得到復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜。
4.如權(quán)利要求1所述的復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜的測定方法,其特征包括如下步驟(a)復(fù)方丹參滴丸供試品溶液的制備取復(fù)方丹參滴丸5~15粒,精密稱定,置10ml容量瓶中,加蒸餾水超聲15min,溶解,定容,過濾,即為供試品;(b)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料;采用梯度洗脫,流動相A為0.02%磷酸水溶液;流動相B為80%乙腈磷0.02%酸水溶液;梯度洗脫程序如下0min時,流動相A為90%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為10%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;8min時,流動相A為78%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為22%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;15min時,流動相A為74%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為26%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;55min時,流動相A為48%的0.02%的磷酸水溶液,流動相B為52%的80%乙腈0.02%的磷酸水溶液;流速1.000ml/min,檢測波長280nm,柱溫30℃,進(jìn)樣體積10μl;(c)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀,照高效液相色譜法測定,得到復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜。
5.如權(quán)利要求1、2、3或4所述的復(fù)方丹參滴丸指紋圖譜的測定方法,其特征在于流動相A溶液的配制比例是按體積比配制,流動相B溶液的配制比例是按體積比配制。
全文摘要
本發(fā)明涉及復(fù)方丹參滴丸HPLC指紋圖譜的測定方法,并通過大量實驗建立復(fù)方丹參滴丸HPLC指紋圖譜的方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。首先制備復(fù)方丹參滴丸供試品溶液的制備取復(fù)方丹參滴丸5~20粒,精密稱定,置10ml容量瓶中,加蒸餾水超聲15min,溶解,定容,過濾,即為供試品;采用梯度洗脫,流動相A為0.02%磷酸水溶液;流動相B為80%乙腈磷酸水溶液;流速1.000ml/min,檢測波長280nm,柱溫30℃,進(jìn)樣體積10μl;照高效液相色譜法測定,得到復(fù)方丹參滴丸的指紋圖譜。此種方法測定的指紋圖譜重復(fù)性高,可作為測定丹參滴丸的方法,也可作為鑒定復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量控制方法。
文檔編號G01N30/02GK1670524SQ20051005526
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月17日
發(fā)明者程翼宇, 葉正良, 吳永江, 范驍暉, 王毅, 孫玉俠, 李淑菊 申請人:天津天士力制藥股份有限公司