專利名稱：一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法。
背景技術：
高速逆流色譜(high speed counter current chromatography, HSCCC)是由美國國立 衛(wèi)生研究院(NIH)的Yoichiro Ito博士于上世紀80年代發(fā)明的一種色譜分離純化技 術。這種色譜裝置由輕巧的聚四氟乙烯管纏繞成螺旋管，管內沒有固體支撐物，螺旋 管在自轉的同時，圍繞與自轉軸成一定角度(平行、垂直或成一定角度)的公轉軸旋 轉，產生了周期性變化的離心力場，管內的兩相液體在阿基米德螺旋力的作用下，不 斷的混合、澄清，其中一相得以保留，另一相作為流動相被泵系統(tǒng)不斷從管路的末端 推出。目標產物與雜質在液/液兩相間進行分配，根據分配系數的不同實現(xiàn)分離。目前 高速逆流色譜作為一種分離純化技術已經廣泛應用于生物、醫(yī)藥、農林、能源、環(huán)境、 化工、海洋科學等各個領域。
將高速逆流色譜分離純化裝置作為生物催化反應器使用，具有以下優(yōu)勢
1) 結構簡單，便于放大。高速逆流色譜是液/液分配系統(tǒng)，沒有固體支撐物，以 輕巧的軟螺旋空管作為反應柱，固定相和流動相都是流體，只要簡單地延長螺旋管就 可以將反應放大，另外也可以增加管徑，這樣可以提高固定相的保留率，制備型高速 逆流設備通過創(chuàng)新，管徑可達20mm，設備體積一般0.3m3，最大的也小于2m3，有 利于多機生產，擴大生產規(guī)模；
2) 進料方式靈活，傳質速率快。原料物不需要嚴格的預處理，可處理帶固體懸浮 物的物料，反應器是一組螺旋空管，無內部構件，相的混合和澄清是靠軸向流動和徑 向周期變化的強離心力產生雙向多角度的強烈振蕩來實現(xiàn)，傳質速率快并且易于通過 流動相流速和螺旋管轉速調節(jié)，兩相有四個進出口，可方便組成逆流、并流操作，固 定相可選擇輕相或重相，因此操作上可多種組合，靈活性大；
3) 無機械攪拌，無固相載體。無機械攪拌的反應器應用于酶催化反應，有利于延 長酶的壽命，保持酶活，而無固相載體，避免了待分離樣品與固相載體接觸而可能產生的化學變性和不可逆吸附，從而降低成本。
生物柴油是生物質能的一種形式，其主要成分為通過動植物油脂轉化而來的高級 脂肪酸的低碳烷基酯混合物，以其物化性能與石化柴油相近，并可以直接代替石化柴 油或與普通石化柴油以任意比例互溶代替石化柴油使用而得名。與得自于石油的石化 柴油相比，得自于動植物油脂的生物柴油具有環(huán)境友好、在使用過程中降低有害廢棄 物排放等多方面環(huán)保優(yōu)點，加之占世界能源消耗量40%的石油因資源量極為有限，造 成原油和燃料油市場價格巨幅波動，生物柴油作為一種優(yōu)質生物質可再生能源，自二 十世紀九十年代以來在世界范圍內形成了研究開發(fā)熱潮，并已經形成快速發(fā)展的產業(yè)。 隨著生物技術的發(fā)展，近年來采用生物酶催化劑合成生物柴油的技術得到研究和發(fā)展， 而生物酶技術還無法達到工業(yè)化實用水平，需要研究新的酶和不使用化學催化劑或使 用可完全回收催化劑的生物柴油綠色化生產技術。發(fā)展生物柴油不可能像石油工業(yè)那 樣大規(guī)模集中生產，原因是資源多樣與分布面積廣闊，原料收集加工等成本相對高， 因此國外有報導采用國家統(tǒng)一標準(我國也正在做)，分散生產，甚至可以農莊或個人 為生產單元，高速逆流反應器現(xiàn)今已放大到一定規(guī)模，如管徑可達到20mm，這將是 一個很好的推廣單元。目前尚未有利用高速逆流反應器進行生物柴油合成的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于利用高速逆流反應器的液/液兩相分配(或液/液/液、液/液/固、 液/液/氣等多相分配)，為生物柴油的合成反應提供一個場所，同時耦合產物的分離純 化過程，開發(fā)出連續(xù)、高效的生物柴油合成的生產工藝。 一方面通過液/液兩相間高頻 率的混合與澄清，增加酶或微生物與脂肪酸底物的接觸面積，提高底物與產物在兩相 間的傳質效率；另一方面通過操作方式的選擇和萃取、反萃過程的耦合，減少高濃度 底物或產物積累所導致的酶活抑制，加速反應，提高轉化率。
本發(fā)明在放大作工業(yè)單元時，管徑需放大至10-20mm，但目前高速逆流色譜儀均 用均徑直管，增加管長則分離時間過長，增大直徑則使轉鼓轉速降低，分辨率降低。 本發(fā)明中的工業(yè)規(guī)模部分，采用波紋狀異形管繞制，管內增加周期性變化的徑向和軸 向力，增加兩相接觸混合，強化傳質，增加流動相的微觀停留時間，提高單位體積的 柱效率，使放大成為現(xiàn)實。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術方案實現(xiàn)的
在高速逆流反應器中進行生物柴油的合成，若采用游離態(tài)的酶作生物催化劑，則反應體系為兩相，若采用固定化酶、微生物作為生物催化劑或由反膠團包被的非水酶 催化反應，則反應體系為三相，酶在相界面處發(fā)揮催化作用。通過調整四個進出口與 泵系統(tǒng)的連接方式，流動相與固定相可逆流也可并流，通過調整螺旋管的旋轉方向和 轉速，輕相和重相都可以作為固定相或流動相，反應溫度通過水浴夾套調控，操作十 分靈活。
具體步驟如下
(1) 游離酶溶液、固相載體固定化酶懸液、膠團或反膠團包被酶液的制備；
(2) 根據生物柴油合成反應體系的組成成分與分相特點，確定固定相和流動相的組 成，需要考慮的因素包括酶的形式、底物和產物在水相和有機相中的溶解情況、 兩相流體的粘度和分層時間、操作的簡便程度等；
(3) 分別配制未加入酶制劑的固定相和流動相，超聲脫氣15min，靜置30min以上， 若固定相和流動相之間有一定的互溶比例，則事先在分液漏斗中將兩相混勻，靜 置分層2h以上，分出輕相與重相，然后再超聲脫氣備用；
(4) 將酶制劑加入到選定的含酶相中，分散均勻，酶制劑的添加量根據酶活調整；
(5) 通過恒流泵將固定相以8.0 10.0mL/min的流速泵入高速逆流反應器的螺旋管柱 中，直至泵滿，并從出口流出；
(6) 開始高速旋轉螺旋管柱，輕相作固定相時正向旋轉，重相作固定相時反向旋轉， 轉速300 900rpm，根據固定相保留情況進行轉速調整；
(7) 以0.5 2.0mL/min的流速泵入流動相，根據固定相保留情況和完成目標轉化率 所需要的反應時間進行流動相流速調整；
(8) 為解決現(xiàn)有設備理論塔板數有限的問題，流動相采用回流操作；
(9) 反應一定時間后，根據工藝的需要進行萃取或反萃，或者直接收集含有產物的液 體，揮干溶劑或去除水分，獲得產物并進行轉化率分析。
本發(fā)明提供的高速逆流反應器合成生物柴油的方法，適用于利用各種游離或固定 化的酶，從動植物油脂及其轉化的甘油單酯、甘油二酯以及長鏈脂肪酸和低碳醇合成 生物柴油。
本發(fā)明提供的高速逆流反應器合成生物柴油的方法，與常規(guī)機械攪拌、流態(tài)化、 氣升式、液升式等反應裝置相比，具有結構簡單易于規(guī)模放大、進料方式靈活、傳質 速率快、酶活保持較高和底物不可逆吸附低等優(yōu)點。反應過程與分離過程耦合，簡化 了操作，并減少了高濃度底物與產物對酶活的抑制，提高了轉化率。
具體實施例方式
實施例1、在高速逆流反應器中進行脂肪酶催化油酸與甲醇合成生物柴油的反應，上 相為固定相。
設備儀器高速逆流反應器，直管，管內徑5.0mm，柱體積300mL 水浴溫度40°C
反應體系石油醚-磷酸緩沖液(pH7.8，0.02MNa2HPO4/NaH2PO4)體系 NOVO Lipozyme TL IOOL， 30，000U/mL酶液
上相組成將350g油酸和50mL甲醇溶于1L石油醚(60 卯。C)。 下相組成lmL酶液溶于1L磷酸緩沖液(pH 7.8, 0.02M Na2HP04/NaH2P04)。
流動相采用回流操作，提高轉化率。
運行方法
通過恒流泵系統(tǒng)，以8.0mL/min流速用上相固定相充滿反應柱管，然后開始旋轉 主機內的螺旋管柱，正向旋轉850rpm，以1.0mL/min流速泵入下相流動相。收集從螺 旋管柱出口流出的反應混合液，靜置分層，每2h將流出的下相含酶流動相分出，回流 至反應器入口，繼續(xù)循環(huán)使用。
反應24h后停止主機旋轉，停泵，用氮氣將螺旋管柱內所有反應混合液吹出，靜 置分層，用NaOH滴定的方法檢測上相有機相中減少的油酸的量，計算轉化率。橄欖 油水解法檢測反應前后水相脂肪酶酶活的回收率。 運行結果
上相固定相保留55 60%， 24h酯化率76%，酶活回收92%。
實施例2、在高速逆流反應器中進行脂肪酶催化油酸與甲醇合成生物柴油的反應，下 相為固定相。
設備儀器高速逆流反應器，直管，管內徑5.0mm，柱體積300mL 水浴溫度40°C
反應體系石油醚-磷酸緩沖液(PH7.8,0.02MNa2HPO4/NaH2PO4)體系 NOVO Lipozyme TL IOOL， 30，000U/mL酶液 上相組成將350g油酸和50mL甲醇溶于IL石油醚(60 90°C)。下相組成lmL酶液溶于1L磷酸緩沖液(pH 7.8, 0.02M Na2HP04/NaH2P04)。
流動相采用回流操作，提高酶的利用率，減少酶的用量。
運行方法
通過恒流泵系統(tǒng)，以8.0mL/min流速用下相固定相充滿反應柱管，然后開始旋轉 主機內的螺旋管柱，反向旋轉750rpm，以0.8 mL/min流速泵入上相流動相。待螺旋管 柱出口有連續(xù)的上相流出，直接將流出液回流至反應器入口，提高反應轉化率，每隔 2h，從反應器出口取少量流動相樣品，用NaOH滴定的方法監(jiān)測減少的油酸的量，計 算轉化率，從而監(jiān)測反應進程。
反應24h后停止主機旋轉，停泵，用氮氣將螺旋管柱內所有反應混合液吹出，靜 置分層，用NaOH滴定的方法檢測上相有機相中減少的油酸的量，計算總轉化率。橄 欖油水解法檢測反應前后水相脂肪酶酶活的回收率。 運行結果-
下相固定相保留34 37%，第一個2h后酯化率liy。， 24h總酯化率85y。，酶活回 收96%。
實施例3、在高速逆流反應器中進行固定化脂肪酶催化棕櫚酸與乙醇合成生物柴油的
反應，上相為固定相。 設備儀器高速逆流反應器，波紋管，管內徑10.0mm，柱體積350mL 水浴溫度40°C
反應體系異辛烷-磷酸緩沖液(PH7.8,0.02MNa2HPO4/NaH2PO4)體系 Novyzym 435 2，500U/g固定化酶顆粒，粒徑0.3mm 上相組成將200g棕櫚酸酸和30mL乙醇溶于IL異辛烷。 下相組成4.0g固定化酶顆粒懸浮于1L磷酸緩沖液(pH 7.8, 0.02M
Na2HP04/NaH2P04)。 流動相采用回流操作，提高轉化率。
運行方法
通過恒流泵系統(tǒng)，以8.0 mL/min流速用上相固定相充滿反應柱管，然后開始旋轉 主機內的螺旋管柱，正向旋轉800rpm，以0.5 mL/min流速泵入下相流動相。收集從螺 旋管柱出口流出的反應混合液，靜置分層，每2h將流出的下相含酶流動相分出，回流至反應器入口，繼續(xù)循環(huán)使用。
反應24h后停止主機旋轉，停泵，用氮氣將螺旋管柱內所有反應混合液吹出，靜 置分層，用NaOH滴定的方法檢測上相有機相中減少的棕櫚酸酸的量，計算轉化率。 橄欖油水解法檢測反應前后水相脂肪酶酶活的回收率。 運行結果
上相固定相保留64 69%， 24h酯化率80%，酶活回收96%。
實施例4、在高速逆流反應器中進行固定化脂肪酶催化棕櫚酸與乙醇合成生物柴油的
反應，下相為固定相。 設備儀器高速逆流反應器，波紋管，管內徑10.0mm，柱體積350mL 水浴溫度40 °C
反應體系異辛垸-磷酸緩沖液(pH7.8,0.02MNa2HPO4/NaH2PO4)體系 Novyzym 435 2，500U/g固定化酶顆粒，粒徑0.3mm 上相組成將200g棕櫚酸酸和30mL乙醇溶于1L異辛垸。 下相組成4.0g固定化酶顆粒懸浮于1L磷酸緩沖液(pH 7.8， 0.02M
Na2HP04/NaH2P04)0 流動相采用回流操作，提高酶的利用率，減少酶的用量。
運行方法
通過恒流泵系統(tǒng)，以8.0mL/min流速用下相固定相充滿反應柱管，然后開始旋轉 主機內的螺旋管柱，反向旋轉700rpm，以0.5 mL/min流速泵入上相流動相。待螺旋管 柱出口有連續(xù)的上相流出，直接將流出液回流至反應器入口，提高反應轉化率，每隔 2h，從反應器出口取少量流動相樣品，用NaOH滴定的方法監(jiān)測減少的棕櫚酸的量， 計算轉化率，從而監(jiān)測反應進程。
反應24h后停止主機旋轉，停泵，用氮氣將螺旋管柱內所有反應混合液吹出，靜 置分層，用NaOH滴定的方法檢測上相有機相中減少的棕櫚酸的量，計算總轉化率。 橄欖油水解法檢測反應前后水相脂肪酶酶活的回收率。
運行結果
下相固定相保留30 33%，第一個211后酯化率8%， 2411總酯化率92%，酶活回 收99%。
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權利要求
1.一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法，包括如下步驟(1)游離酶溶液、固相載體固定化酶懸液、膠團或反膠團包被酶液的制備；(2)根據生物柴油合成反應體系的組成成分與分相特點，確定固定相和流動相的組成，包括酶的形式、底物和產物在水相和有機相中的溶解情況、兩相流體的粘度和分層時間、操作的簡便程度等；(3)分別配制未加入酶制劑的固定相和流動相，超聲脫氣15min，靜置30min以上，對于固定相和流動相之間有一定的互溶比例的溶劑，在分液漏斗中將兩相混勻，靜置分層2h以上，分出輕相與重相，然后再超聲脫氣備用；(4)將酶制劑加入到選定的含酶相中，分散均勻，根據酶活調整酶制劑添加量；(5)通過恒流泵將固定相以8.0～10.0mL/min的流速泵入高速逆流反應器的螺旋管柱中，直至泵滿，并從出口流出；(6)啟動高速旋轉螺旋管柱，輕相作固定相時正向旋轉，重相作固定相時反向旋轉，轉速300～900rpm，根據固定相保留情況進行轉速調整；(7)以0.5～2.0mL/min的流速泵入流動相，根據固定相保留情況和完成目標轉化率所需要的反應時間調整流動相流速；(8)為解決現(xiàn)有設備理論塔板數有限的問題，流動相采用回流操作；(9)反應一定時間后，萃取或反萃或直接收集含有產物的液體，揮干溶劑或去除水分，獲得產物并進行轉化率分析。
2. 如權利要求l所述一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法，其特征是高速逆 流反應器的柱管類型包括直管、波形管、螺旋管及截面異形管等。
3. 如權利要求l所述一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法，其特征是高速逆 流反應器的柱管內徑2.6~20.0mm。
4. 如權利要求1所述一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法，其特征是步驟2) 所述生物柴油合成反應的類型包括酯化、酯交換反應。
5. 如權利要求1所述一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法，其特征是步驟2) 所述反應底物的組成成分包括各種動植物油脂、由動植物油脂轉化來的甘油二酯、 甘油單酯、長鏈脂肪酸以及各種低碳醇(甲醇、乙醇、丙醇等)。
6. 如權利要求1所述一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法，其特征是步驟2) 所述組成固定相和流動相的其它溶劑包括各種水性緩沖液、石油醚、正己垸、正庚垸、異辛垸、環(huán)己烷等常用有機溶劑。
7. 如權利要求1所述一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法，其特征是步驟2) 所述催化用酶包括各種游離態(tài)或固定化(固體載體、膠團、反膠團)的脂肪酶、酯 酶。
8. 如權利要求1所述一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法，其特征是步驟9) 所述轉化率檢測方法包括酸堿滴定、氣相色譜分析、液相色譜分析等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用高速逆流反應器合成生物柴油的方法。反應體系為液/液兩相或液/液/固三相，兩相時游離酶溶液(水相)構成固定相或流動相，三相時由固定化酶與水(流態(tài)化型的液相)構成固定相或流動相。一方面兩液相在螺旋纏繞的管柱的行星式離心運動所產生的強度和方向周期變化的作用力和在波紋管內徑向和軸向周期變化力的共同作用下，進行高頻率的混合與澄清，強化酶或微生物與脂肪酸底物的接觸及傳遞速率，提高底物的轉化率；另一方面通過操作方式的選擇和萃取、反萃過程的耦合，減少高濃度底物或產物積累所導致的酶活抑制，加速反應，提高底物的轉化率。同時提出實現(xiàn)放大生產時對儀器所進行的改造。
文檔編號C10G3/00GK101575531SQ20081010600
公開日2009年11月11日 申請日期2008年5月7日 優(yōu)先權日2008年5月7日
發(fā)明者張曉鷗, 歐陽藩, 蘇志國, 銘 顧 申請人:中國科學院過程工程研究所