酶抑制劑環(huán)氧酮化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開的新化合物和藥物組合物可作為蛋白酶體的抑制劑，這些化合物具有改進(jìn)的蛋白酶體抑制活性和選擇性以及增強(qiáng)的水溶性，可以用于治療多種與蛋白酶體相關(guān)的疾病或病癥。
【專利說(shuō)明】
酶抑制劑環(huán)氧酮化合物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2014年7月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)62/024,024的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi) 容在此參考并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及多肽環(huán)氧酮結(jié)構(gòu)的化合物。這些化合物可以用于抑制蛋白酶體的活 性?！?br>[0004] 發(fā)明背景
[0005] 蛋白酶體是一個(gè)具有多催化功能的蛋白酶復(fù)合體，在細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解過(guò)程中起 關(guān)鍵作用。通常認(rèn)為蛋白酶體在體內(nèi)以26S蛋白酶體存在，其分子量約為2000kDa，包含有一 個(gè)20S核心顆粒(20S蛋白酶體)和兩個(gè)19S調(diào)節(jié)顆粒。20S核心顆粒為中空結(jié)構(gòu)，將降解蛋白 質(zhì)的活性位點(diǎn)圍在空腔中。核心顆粒的每一端都連接著一個(gè)19S調(diào)節(jié)顆粒，每個(gè)調(diào)節(jié)顆粒都 含有多個(gè)ATP酶活性位點(diǎn)和泛素結(jié)合位點(diǎn)；調(diào)節(jié)顆粒可以識(shí)別多泛素化的蛋白質(zhì)，并將它們 傳送到核心顆粒中。除了 19S調(diào)節(jié)顆粒外，還存在另一種調(diào)節(jié)顆粒，即11S顆粒；11S調(diào)節(jié)顆粒 可以以類似于19S顆粒的方式與核心顆粒結(jié)合；11S顆?？赡茉诮到馔庠措纳习l(fā)揮作用。核 心顆粒20S蛋白酶體分子量約為700kDa，有28個(gè)亞基構(gòu)成4個(gè)環(huán)。在酵母和其它真核生物中， 兩個(gè)外環(huán)各由7個(gè)α亞基構(gòu)成，兩個(gè)內(nèi)環(huán)各由七個(gè)β亞基組成。α環(huán)是19S或11S調(diào)節(jié)復(fù)合體的 結(jié)合位點(diǎn)，也是兩個(gè)β內(nèi)環(huán)的物理屏障。兩個(gè)β內(nèi)環(huán)含有蛋白酶的催化活性位點(diǎn)，蛋白質(zhì)的降 解由20S核心顆粒中的β亞基進(jìn)行。在體內(nèi)，抑制20S蛋白酶體很容易與抑制26S蛋白酶體直 接關(guān)聯(lián)。有兩種形式的蛋白酶體:一種是組成型蛋白酶體，存在于絕大多數(shù)真核生物的細(xì)胞 內(nèi)；另一種是免疫蛋白酶體，主要存在于造血細(xì)胞及暴露于炎性細(xì)胞因子的細(xì)胞中。蛋白酶 體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解是一個(gè)高度有規(guī)律可循的過(guò)程，是細(xì)胞內(nèi)各種生化過(guò)程所必需的的程 序。通過(guò)使用不同的肽底物，已定義了真核生物蛋白酶體的三個(gè)主要蛋白酶活性:糜蛋白酶 樣活性(〇171]1〇1：^口8；[11-1^1?5，簡(jiǎn)寫為(：1'-]^)，其功能為水解大的疏水氨基酸殘基;胰蛋白酶 樣活性(Trypsin-Like,簡(jiǎn)寫為T-L)，其功能為水解堿性氨基酸殘基;肽基谷氨酰肽水解活 性(Peptidyl Glutamyl Peptide Hydrolyzing,簡(jiǎn)寫為PGPH)，其功能為水解酸性氨基酸殘 基。很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)蛋白酶體一直被認(rèn)為是藥物開發(fā)有吸引力的分子靶標(biāo)，并且在抗腫瘤藥 物領(lǐng)域獲得了臨床驗(yàn)證(Orlowski and Kuhn,Clin.Cancer Res. (2008) ,14,1649-1657)。
[0006] 已有幾類小分子化合物被用來(lái)抑制蛋白酶體活性，這些化合物包括肽硼酸，β內(nèi)酯 和多月太環(huán)氧酉同(Bennett and Kirk,Current Opinion in Drug Discovery&Development (2008)，11,616-625;Borissenko and Groll，Chem.Rev. (2007) 107,687-717)。然而，這些 化合物通常缺乏適當(dāng)?shù)奶禺愋耘c生物活性，難以用來(lái)在分子水平，細(xì)胞水平及體內(nèi)充分開 發(fā)和利用蛋白酶體。例如，多肽硼酸和內(nèi)酯都是非特異性的20S蛋白酶體抑制劑，因?yàn)樗?們也可以抑制其他蛋白酶（Borissenko and Groll，Chem. Rev · (2007) 107,687-717 ;Myung et al.，Medicinal Research Reviews(2001 ),21,245-273;)。這就可能導(dǎo)致這些抑制劑在 體內(nèi)除了抑制蛋白酶體以外也抑制其它蛋白酶，從而產(chǎn)生非靶向毒性。另一方面，在專利 US8088741B2,US6831099Bl,ff02005/105827,CN101044157A,US7687452B2 and US2007/ 0105786A1中描述的多肽環(huán)氧酮作為20S蛋白酶體的抑制劑具有較高的選擇性。然而，這些 多肽環(huán)氧酮有較差的水溶性和/或欠優(yōu)化的蛋白酶體抑制活性。因此，有必要開發(fā)新的有改 良藥學(xué)性能和/或生物特性的蛋白酶體抑制劑。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明涉及的是具有三肽環(huán)氧酮結(jié)構(gòu)的化合物，這些化合物具有改進(jìn)的水溶性和 對(duì)蛋白酶體的抑制特性。
[0009] 在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物具有下式（I)所示的結(jié)構(gòu)，及其對(duì)映異構(gòu)體，非 對(duì)映異構(gòu)體，互變異構(gòu)體，其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物或前藥：
[0011] 其中Ri是_(CH2)m-R4,其中m = 0或1，R4選自以下基團(tuán)：
[0013] 其中
[0014] 任一 Μ蟲立的選自Η，羥基，Cko烷基，Cko烷氧基，Cho羥烷基，Cko烷氧烷基，NH2， NHR6，-R7-0 (C = 0) -R8，-R7- (C = 0) X-Rs，-R7-OPO3M1M2，
[0016] 其中
[0017] R6 是1Q 烷基，苯基，-(0 = 0)&-6 烷基，或 _(C = 0)苯基；
[0018] 任一 R7和R9獨(dú)立的為不存在或亞烴基；
[0019] 任一Rs獨(dú)立的選自Η，羥基，金屬離子，Ci-1Q烷基，-Ci-1Q亞烴基，-NRioRn，和- OPO3M1M2,
[0020] 任一R1Q和Rn獨(dú)立的選自Η，&-1Q烷基(如6烷基)和取代的&― 1Q烷基(如6烷基）；
[0021]任一 Μ!，M2是獨(dú)立的為H，或金屬離子；
[0022] X為不存在或0;
[0023] γ為不存在或-(c = 〇)-;
[0024] Z為不存在或0。
[0025] 任一R2和R3獨(dú)立的選自下組:Cm烷基，Cm烯烴，Cm羥烷基，Cm烷氧烷基，芳 基，Cko芳烷基，雜芳基，Cko雜芳烷基，雜環(huán)基，Cho雜環(huán)烷基，碳環(huán)基和Cho碳環(huán)醇烷基，
[0026]
和R2是異丁基時(shí)，R3不是4-R比陡甲基。
[0027] 在某些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)式(I)化合物具有下述結(jié)構(gòu)（II)
[0029] 其中任一辦，1?2和R3基團(tuán)如上所述。
[0030] 在某些實(shí)施例中，R4選自以下基團(tuán)：
[0032]在某些實(shí)施例中，R!選自以下基團(tuán)：
[0034] 在某實(shí)些施例中，R2是1Q烷基，1Q烷氧烷基，芳基，雜芳基， 1Q芳烷基或10雜 芳烷基。
[0035] 在某些實(shí)施例中，R2是甲氧基甲基，4-吡啶甲基，異丁基，芐基，4-噻唑基甲基。
[0036] 在某些實(shí)施例中，R3是C^o烷基，芳基，雜芳基，Cho芳烷基或Cko雜芳烷基。
[0037] 在某些實(shí)施例中，R3是異丁基，4-吡啶甲基或芐基。
[0038] 一方面，本發(fā)明提供的三肽環(huán)氧酮可以抑制20S蛋白酶體的催化活性。在某些實(shí)施 例中，本發(fā)明涉及的三肽環(huán)氧酮對(duì)20S蛋白酶體的CT-L催化活性的半抑制濃度IC50是約 500nM，250nM，1OOnM，50nM，1OnM，或5nM。
[0039]另一方面，本發(fā)明提供的化合物有改進(jìn)的水溶性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及的 三肽環(huán)氧酮的水溶性至少是約ο. 02，0.05，0.1，0.5or lmg/mL。
[0040] 另一方面，本發(fā)明也提供了可用于治療人類各種疾病的藥物組合物。這些藥物組 合物包括有效劑量的本發(fā)明提供的蛋白酶體抑制劑和藥用載體;人類疾病包括但不限于癌 癥、炎癥、神經(jīng)退行性疾病(例如老年性癡呆）、肌肉萎縮癥、慢性傳染病、發(fā)燒、肌肉廢用，去 神經(jīng)支配，神經(jīng)損傷，和免疫相關(guān)的疾病等。
[0041] 在某些實(shí)施方式中，藥物組合物包括約10-9克至約10克本發(fā)明提供的化合物。合適 的劑量范圍為每人每天約〇.〇1毫克至約5克。
[0042] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的化合物和藥物組合物可以配方成適當(dāng)?shù)闹苿┮?便通過(guò)注射途徑給藥(如皮下，靜脈，肌肉，動(dòng)脈，鞘膜，囊內(nèi)，眼框內(nèi)，心臟內(nèi)，皮層內(nèi)，腹膜 內(nèi)，經(jīng)氣管，表皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，囊下，蛛網(wǎng)膜下，脊柱內(nèi)，胸骨內(nèi)，和/或輸液)和非注射途徑給 藥(如□服，腸道，□腔，鼻，鼻內(nèi)，經(jīng)粘膜，表皮，貼膏，皮膚，眼藥，肺部，舌下，直腸，陰道或 局部給藥）。
[0043] 另一方面，本發(fā)明提供了治療與蛋白酶體相關(guān)的疾病的方法，這些方法包括施用 有效劑量的本發(fā)明提供的蛋白酶體抑制劑。
[0044] 另一方面，本發(fā)明提供了制備多肽環(huán)氧酮的方法。
[0045] 本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)可見下面的詳細(xì)敘述和權(quán)利要求書。
[0046]附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0047] 圖1說(shuō)明的是BALB/c小鼠經(jīng)本發(fā)明的化合物給藥處理后血液蛋白酶體的百分殘留 活性。小鼠經(jīng)溶媒給藥處理后血液蛋白酶體的活性為百分之百（對(duì)照組）；本發(fā)明的化合物 以靜脈注射（IV)或灌胃（P0)對(duì)小鼠給藥處理后血液蛋白酶體的活性與對(duì)照組比較得到百 分殘留活性。靜脈注射劑量為l〇mg/kg;灌胃給藥劑量為30mg/kg。
[0048] 圖2A說(shuō)明的是CX13-103對(duì)經(jīng)皮下注射移植于小鼠的人源大腸腺癌HT-29的抗腫瘤 療效。使用雙向方差檢驗(yàn)(2iay ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0049]圖2B說(shuō)明的是CX13-103對(duì)經(jīng)皮下注射移植于小鼠的人源淋巴癌RL的抗腫瘤療效。 使用雙方向方差檢驗(yàn)(2iay ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0050] 發(fā)明詳述 [00511 化合物及其鹽
[0052] 一方面，本發(fā)明的化合物含有式（I)的結(jié)構(gòu)，和其對(duì)映異構(gòu)體，非對(duì)映異構(gòu)體，互變 異構(gòu)體，其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物或前藥：
[0054] 其中R^-(CH2)m-R4,其中m = 0或1，R4選自下述基團(tuán)：&―1Q烷基，
[0056] 其中
[0057] 任一R5獨(dú)立的選自Η，羥基，Ci-1Q烷基，Ci- 1Q烷氧基，Ci-1Q羥烷基，Ci-1Q烷氧基烷基， NH2, NHRe, -R7-0 (C = 0) -Rs, -Ry- (C = 0) X-Rs, -R7-OPO3M1M2,
[0059] 其中
[0060] R6 是1Q 烷基，苯基，-(C = 0) &-6 烷基，或-(C = 0)苯基；
[0061 ] 任一 R?和R9獨(dú)立的為不存在，或亞烴基；
[0062] 任一R8獨(dú)立的為Η，羥基，金屬尚子，Ci-?ο烷基，_Ci-?ο亞經(jīng)基，-NRiqRii，或-ΟΡΟ3Μ1Μ2， [0063] 任一R1Q和Rn獨(dú)立的為Η，Cho烷基(如&-6烷基)或取代的Cho烷基(如&- 6烷基）； [0064] 任一Ml, M2獨(dú)立的為H,或金屬離子；
[0065] X為不存在，或是0;
[0066] Y為不存在，或是-(C = 0)_;
[0067] Z為不存在，或是0。
[0068] 任一R2和R3獨(dú)立的選自下組：Cm烷基，Cm烯烴，Cm羥烷基，Cm烷氧烷基，芳 基，Cko芳烷基，雜芳基，Cko雜芳烷基，雜環(huán)基，Cho雜環(huán)烷基，碳環(huán)基和Cho碳環(huán)醇烷基，
[0069]
并且R2是異丁基時(shí)，R3不是4-吡啶基甲基。
[0070] 在某些實(shí)施例中，1?5是-1?7-0(0 = 0)-1?8，1?7和Rs定義如上所述。在某些實(shí)施例中，R7 為不存在，Rs選自Η，Ci-1Q烷基(如4烷基，Ci-6烷基），-Ci-1Q亞烴基，-NR 1QRn，其中R1Q和Rn定 義如上所述。在某實(shí)施例中，辦是1Q亞烴基（如-CH2-，-C2H4-，-C 3H7-等），Rs選自Η，&-10烷 基(如6烷基），-&-1Q亞烴基，-NRkjRh，其中R1Q和Rn定義如上所述。
[0071] 在某些實(shí)施例中，1?5是-1?7-(0 = 0)乂-1?8，1?7和Rs定義如上所述。在某些實(shí)施例中，R7 不存在，X是〇，R8選自H，金屬尚子（比如Na，K)，NH4,Ci-?ο烷基（如Ci-6烷基），-Ci-?ο亞經(jīng)基，- NRkjRu，其中R1Q和Rn定義如上所述。在某些實(shí)施例中，R7不存在，X不存在，Rs選自-NR1QRn，其 中Rio和Rn定義如上所述。
[0072] 在某些實(shí)施例中，R5 是 NH2，NHC0Me，NHC0Et，NHC0C3H7，SNHBoc。
[0073] 在某些實(shí)施例中，

R7，R9，X，Y，and Z定義如上所述。在某些實(shí)施例中，R7，R9， 5? X，Y，and Z中至少其中之一是存在的。在某些實(shí)施例中，X，Y，Z and R7都不存在，R9是-Cho 亞烴基（比如-CH2-，-C2H4-，-C3H7-等）。在某些實(shí)施例中，R?，R 9和X不存在，Y是-(C = 0) -，Z是 0。在某些實(shí)施例中，R7和X都不存在，1?9是&-1Q亞烴基（比如-CH2-，-C 2H4-，-C3H7-等），Y是-(C =0) -，Z是0。在某些實(shí)施例中，R9和X都不存在，1?7是(：1-1Q亞烴基（比如-CH 2-，-C2H4-，-C3H7- 等），y是 _(c=o)-，z 是0。
[0074] 在某些實(shí)施例中，X不存在，R7和R9獨(dú)立的為&―1Q亞烴基（比如-CH 2-，-C2H4-，-C3H7- 等），Y是-(C = 0)-，Z是0。在某些實(shí)施例中，R7，R9，X和Z都不存在，y是-(c = o)-。
[0075] 在某些實(shí)施例中，任一R5獨(dú)立的是H，-CH3，-C2H 5，C3H7
[0076] 在某些實(shí)施例中，任一 1?5獨(dú)立的為-OH,-〇CH3，-〇C2H5，-0C 3H7，-〇P〇3Na2，-0C( = 0) CH3, -oc ( = 0) C2H5, -oc ( = 0) C3H7, -oc ( = 0) C4H9, -oc ( = 0) CH2NH2, -oc ( = 0) CH2N (CH3) 2, -oc (=0)CH2N(C2H5)2,-0C(=0)NH2,-0C(=0)N(CH3)2,-0C(=0)N(C2H5)2,
[0077] 在某實(shí)施例中，任一他獨(dú)立的為-CH20H，-C2H50H，-C 3H70H，-CH20C(=0)CH3，-CH20C (=0) C2H5，-CH2OC ( = 0) C3H7，-CH2OC ( = 0) C4H9，-CH2〇P〇3Na2，-CH2OC ( = 0) CH2NH2，-CH2OC (=
0 ) CH2N ( CH3 ) 2，-CH2OC ( = 0 ) CH2N ( C2H5 ) 2 CH2〇C(=0)NH2，-CH2〇C(=0)N(CH3)2，-CH2〇C(=0)N(C2H5)2，
[0078] 在某些實(shí)施例中，任一抱獨(dú)立的為-(C = 0)0H，-(C = 0)0Na，-(C = 0)0NH4，-(C = 0) 0CH3，-(C = 0)0C2H5，-(C = 0)0C3H7,or-(C = 0)0C4H9〇
[0079] 在某些實(shí)施例中，任一1?5獨(dú)立的為-C0NH2，-CON(CH3) 2，-CON(C2H5)2，
[0080] 在某些實(shí)施例中1選自下述基團(tuán)：甲基：

[0081 ] 在某些實(shí)施例中，R2和R3獨(dú)立的為Cho烷基，&- 1()烷氧基烷基，芳香基，雜芳基，&一10 芳烷基或Cho雜芳烷基。
[0082] 在某些實(shí)施例中，R2和R3獨(dú)立的為-(CH2)nR12，R 12is Ch烷基，苯基，吡啶基，-Ο- Ο 一 6 烷基，噻唑基，其中 n=0，l，2,3,4,5。
[0083] 在某些實(shí)施例中，1?2是甲氧基甲基(11161:1171-(^-11161:1171)，4-吡啶甲基，異丁基，節(jié) 基或4-噻唑基-甲基。
[0084] 在某些實(shí)施例中，R3是異丁基，4-吡啶甲基或芐基。
[0085] 含有結(jié)構(gòu)式(I)的化合物包括但不局限如下所示的化合物：



[0090]其中，結(jié)構(gòu)式(I)中的任一手性碳原子均可為獨(dú)立的R構(gòu)型或S構(gòu)型。
[0091 ]在某些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)式（I)的化合物有結(jié)構(gòu)式（II)所示的構(gòu)型，其中h，R2，R3定 義如上所述。
[0093]在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的化合物有以下所列的結(jié)構(gòu)以及其對(duì)映異構(gòu)體，非 對(duì)映異構(gòu)體，互變異構(gòu)體，其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物或前體藥物：


[0097]藥學(xué)上可接受的鹽可以是生理上可接受的和適合給藥的任何鹽或酯。例如，藥學(xué) 上可接受的鹽包括酸加成鹽(如鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，硝酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，磷 酸鹽，酸性磷酸鹽，異煙酸鹽，醋酸鹽，乳酸鹽，水楊酸鹽，檸檬酸鹽，酒石酸鹽，泛酸鹽、膽堿 鹽，抗壞血酸鹽，琥珀酸鹽，順丁烯二酸鹽，富馬酸鹽，葡萄糖酸鹽，葡萄糖醛酸酯，蔗糖酸 鹽，甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽，甲磺酸鹽、乙磺酸鹽，苯磺酸鹽，對(duì)甲苯磺酸鹽和撲酸鹽） 和堿鹽(如鋁鹽，鈣鹽，鋰鹽，鎂鹽，鉀鹽，鈉鹽，鋅鹽，和二乙醇胺鹽）。
[0098]
[0099] i5"Cx-y烷基"是指取代或未取代的飽和碳?xì)浠鶊F(tuán)，包括含有X-Y個(gè)碳原子的直鏈 烷基和支鏈烷基。
[0100] 術(shù)語(yǔ)"C2.y烯基"和"c2-y炔基"是指取代或未取代的不飽和脂肪基團(tuán)，分別含有至少 一個(gè)雙鍵或者三鍵，長(zhǎng)度與上述的烷基相似，且可以被烷基取代。
[0101] 術(shù)語(yǔ)"烷氧基"是指烷基上連接有一個(gè)氧原子。具有代表性的烷氧基基團(tuán)有甲氧 基，乙氧基，丙氧基，叔丁氧基等等。釀是2個(gè)經(jīng)基共價(jià)連接1個(gè)氧原子。因此，烷基的取代是 烷基化生成醚或者烷氧基。
[0102] 術(shù)語(yǔ)烷氧烷基"是指Cho烷基上有一個(gè)烷氧基取代，從而形成醚。
[0103] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"Cwo芳烷基"是指Cuo烷基上有芳香基取代。
[0104] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"Cho雜芳烷基"是指Cho烷基上有雜芳基取代。
[0105] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"芳香基"是指5_，6_，和7-元取代或未取代的單環(huán)芳香基，其中環(huán) 上的每個(gè)原子都是碳原子。
[01 06]術(shù)語(yǔ)"雜芳基"是指取代或未取代的5-7元芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，最優(yōu)選的是5-6元環(huán)，其環(huán) 結(jié)構(gòu)上包括1-4個(gè)雜環(huán)原子。
[0107]本文使用的術(shù)語(yǔ)"碳環(huán)"和"碳環(huán)基"是指取代或未取代的非芳香環(huán)，其中環(huán)上的每 個(gè)原子都是碳原子。
[0108]術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)基"或"雜環(huán)基團(tuán)"是指取代或未取代的非芳香3-10元環(huán)結(jié)構(gòu)，最優(yōu)選的 是3-7元環(huán)，其環(huán)結(jié)構(gòu)上含有1-4個(gè)雜原子。
[0109] 術(shù)語(yǔ)羥烷基"是指一個(gè)Cho烷基上有一個(gè)羥基取代。
[0110] 術(shù)語(yǔ)"前藥"指在生理?xiàng)l件下可以轉(zhuǎn)化為治療活性成分的化合物。制備前藥的一個(gè) 通常方法是在活性分子上選擇性的加上某種成分，可以在生理?xiàng)l件下通過(guò)水解釋放所需的 活性分子。在其他實(shí)施例中，前藥也可以由宿主動(dòng)物中的酶活性進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0111] 生物活性，選擇性和可溶性
[0112] 本發(fā)明提供的化合物具有抑制蛋白酶體催化活性的生物性能。蛋白酶體的活性可 以通過(guò)本領(lǐng)域已知的實(shí)驗(yàn)方法確定，這些方法在Stein et al ·，Biochemistry(1996) ,35， 3899_3908、Lightcap et al.，Clinical Chemistry，2000,46,673_683、Kisselev et al·， Journal of Biological Chemistry，（2006) ,281,8582-8590以及美國(guó)專利申請(qǐng)09/569748 中均有描述。20S蛋白酶體的CT-L，PGPH和T-L活性通過(guò)使用熒光底物檢測(cè)方法來(lái)確定。該方 作為CT-L，PGPH和T-L的底物，反應(yīng)在緩沖液中完成，分解出的自由熒光團(tuán)7-胺基-4-甲基香 豆素(AMC)用熒光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，可以測(cè)得20S蛋白酶體的CT-L，PGPH和T-L活性。
[0113] 本發(fā)明提供的化合物有用，部分原因在于它們能抑制蛋白酶體的催化活性。
[0114] 在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的化合物當(dāng)濃度低于約500nM，250nM，100nM(比如， CX13-130)，50nMUI^nCX13-104，CX13-137，CX13-601，CX13-603)，10nMUI^nCX13-135， CX13-605，CX13-606，CX13-705)或 5nM(比如 CX13-103，CX13-105，CX13-107，CX13-133， CX13-600，CX13-608)時(shí)，對(duì)20S蛋白酶體的CT-L活性有抑制作用（比如至少50%的抑制作 用）。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的化合物當(dāng)濃度低于約500nM(比如CX13-133，CX13-606， CX13-608)時(shí)，對(duì)20S蛋白酶體的T-L活性也有抑制作用。
[0115] 另一方面，本發(fā)明提供的化合物有增強(qiáng)的水溶性。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的 三肽環(huán)氧酮的水溶性至少為約〇. 02，0.05，0.1，0.5或lmg/mL。
[0116] 另一方面，本發(fā)明提供的三肽環(huán)氧酮化合物同時(shí)具有增強(qiáng)的水溶性和改進(jìn)的蛋白 酶體抑制作用。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的化合物的水溶性至少約為0.1，〇. 5或lmg/ mL;當(dāng)其濃度低于約100nM，50nM，10nM或5nM時(shí)對(duì)20S蛋白酶體的CT-L活性有抑制作用。
[0117] 化合物的用途
[0118] 本發(fā)明提供了抑制蛋白酶體活性的方法，包括通過(guò)給予有效劑量的本發(fā)明化合物 進(jìn)行治療。"治療有效劑量"是指足以使接受化合物的的個(gè)體產(chǎn)生預(yù)計(jì)治療效果或活性的化 合物劑量。有效劑量可能會(huì)根據(jù)不同的因素而變化，比如接受治療者的年齡，性別，健康狀 況，化合物的劑型，病情的嚴(yán)重性等。治療有效劑量由醫(yī)生根據(jù)包括上面提到的因素在內(nèi)的 各種因素來(lái)確定。
[0119] 另一方面，本發(fā)明提供了治療與蛋白酶體相關(guān)的疾病的方法。該方法包括給予有 效劑量的本發(fā)明提供的化合物。這些化合物可以用來(lái)治療與蛋白酶體有關(guān)的各種癥狀或疾 病，包括但不限于下面列舉的這些。
[0120]已知有多種疾病或狀況與蛋白酶體的催化功能有關(guān)。蛋白酶體抑制劑已被建議用 來(lái)預(yù)防或治療多種疾病，包括癌癥，神經(jīng)中毒/退行性疾病，阿爾茲海默癥，缺血性疾病，炎 癥，免疫相關(guān)的疾病，HI V感染，器官移植排斥，感染性休克，抗原遞呈抑制，寄生蟲感染，酸 血癥有關(guān)的疾病，黃斑變性，肺部疾病，肌肉萎縮癥，纖維化疾病，骨骼和毛發(fā)生長(zhǎng)疾病。因 此，諸如本發(fā)明描述的多肽環(huán)氧酮的蛋白酶體抑制劑為上述疾病提供了一種治療的途徑。 [0121]蛋白酶體抑制劑已被臨床證明具有治療惡性腫瘤功能。因此，本文所描述的化合 物可用于治療癌癥。示例的可被治療的癌癥包括白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，實(shí)體腫瘤肝細(xì)胞 癌等。本發(fā)明所述的化合物還可以用來(lái)治療以下癌癥：腎上腺皮質(zhì)癌，艾滋病相關(guān)的癌癥， 星形細(xì)胞瘤，骨癌，骨肉瘤，多形性神經(jīng)母細(xì)胞瘤，惡性纖維組織細(xì)胞瘤，黑素瘤，惡性間皮 細(xì)胞瘤，嗜鉻細(xì)胞瘤，成松果體細(xì)胞瘤和原始神經(jīng)外胚層腫瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，子宮肉瘤，膽 管癌，膀胱癌，乳房癌，腸胃癌，宮頸癌，結(jié)腸癌，直腸癌，食道癌，眼癌，卵巢癌，頭頸部癌，腎 癌，嘴唇和口腔癌，肺癌，鼻腔及副鼻竇癌，鼻竇癌，陰莖癌，前列腺癌，移行細(xì)胞癌，唾腺癌， 軟組織癌，皮膚癌，甲狀腺和副甲狀腺癌，陰道癌等。
[0122] 蛋白酶體抑制劑與NF-κΒ活性抑制相關(guān)。NF-κΒ是一種高效的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié) 諸如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素1、環(huán)氧化酶和細(xì)胞間粘附分子等可以引發(fā)炎癥的分子的基 因的轉(zhuǎn)錄。因此，本發(fā)明中化合物作為一種免疫抑制劑能用于治療炎癥性疾病，如過(guò)敏，哮 喘，器官/組織移植排斥反應(yīng)，自身免疫性紅斑狼瘡，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，多發(fā)性硬化和 炎性腸病?？梢詫?duì)患有上述疾病的患者給予有效劑量的本發(fā)明中提供的化合物，該化合物 可以包括在藥物組合物中，以治療這些疾病。
[0123] 已發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑可以減少肌肉蛋白質(zhì)的降解，因而在抑制肌肉萎縮和肌纖 維萎縮中很有用。因此本發(fā)明中涉及的化合物可用于治療瘦弱癥和肌肉萎縮癥，例如慢性 感染性疾病，發(fā)燒，肌肉廢用和去神經(jīng)，神經(jīng)損傷，因酸毒癥引起的腎功能衰竭，肝功能衰 竭?？梢詫?duì)患有上述疾病的患者給予有效劑量的本發(fā)明中提供的化合物，該化合物可以包 括在藥物組合物中，從而減慢或降低肌肉蛋白、細(xì)胞內(nèi)蛋白或P53蛋白的降解。
[0124] 本發(fā)明中提供的化合物也可用于治療神經(jīng)退行性疾病和癥狀，包括中風(fēng)，神經(jīng)系 統(tǒng)缺血性損傷，神經(jīng)創(chuàng)傷(例如敲擊后腦損傷，脊髓損傷，神經(jīng)系統(tǒng)外損傷），多發(fā)性硬化和 其它免疫介導(dǎo)性神經(jīng)病（如急性感染性多發(fā)性神經(jīng)炎和它的變異體，急性運(yùn)動(dòng)軸索型神經(jīng) 病，急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病，菲希爾綜合征），艾滋病病毒/艾滋病癡呆綜合癥， 糖尿病神經(jīng)病變，帕金森綜合癥，亨丁頓舞蹈癥，多發(fā)性硬化，細(xì)菌性斑點(diǎn)病，寄生蟲、真菌 和病毒性腦膜炎，腦炎，血管性癡呆癥，多發(fā)性腦梗死性癡呆，路易體癡呆，額葉癡呆如皮克 氏病，皮質(zhì)下癡呆(如亨丁頓或進(jìn)行性核上性麻痹），焦皮質(zhì)萎縮綜合征(如原發(fā)性進(jìn)行性失 語(yǔ)），代謝有毒癡呆，因感染引起的癡呆(如梅毒或慢性腦膜炎）。
[0125] 本發(fā)明中提供的化合物還可以用于調(diào)節(jié)與細(xì)胞外β淀粉樣蛋白沉積相關(guān)的蛋白的 處理過(guò)程，β淀粉樣蛋白是阿茲海默癥的主要原因。因此，本發(fā)明中提供的化合物對(duì)治療阿 茲海默癥很有用，例如通過(guò)降低β淀粉樣蛋白調(diào)控過(guò)程的速度，降低β淀粉樣蛋白的空斑形 成的速度，降低β淀粉樣蛋白的生成速度和減少阿茲海默癥的臨床癥狀。
[0126] 蛋白酶體抑制對(duì)降低纖維化癥狀也有幫助。因此，本發(fā)明中提供的化合物可用于 治療纖維化相關(guān)的疾病，例如糖尿病腎病，腎小球硬化癥，IgA腎病，肝硬化，膽道閉鎖，充血 性心力衰竭，硬皮病，放射性纖維化，肺纖維化，心肌纖維化。
[0127] 藥物組合物成分和給藥方式
[0128] 另一方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明提供的化合物及藥學(xué)上可接受的載體組成的藥物 組合物。
[0129] 在此提到的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"是指一種藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、成分或溶 媒，比如液體或固體填充劑、稀釋劑、輔料、溶劑或灌封材料，其參與將本發(fā)明提供的化合物 從身體的某一位置、某種體液、某一組織、某一器官（內(nèi)部或外部），或身體的某一部分傳遞 到另一位置、另一體液，另一器官（內(nèi)部或外部），或另一部分。藥學(xué)上可接受的載體可以是 溶媒、稀釋劑、輔料或其它沒(méi)有過(guò)度毒副作用并能與動(dòng)物組織相接觸的材料。典型的藥學(xué)上 可接受的載體包括糖類，淀粉，纖維素類，麥芽糖，黃蓍膠，明膠，林格氏溶液，海藻酸，生理 鹽水，緩沖劑等。
[0130] 每種藥學(xué)上可接受的載體應(yīng)該與其它組成成分相容，例如與本發(fā)明中提供的化合 物形成制劑，對(duì)生物活體組織或者器官?zèng)]有過(guò)度毒性、刺激、過(guò)敏性反應(yīng)、免疫原性或其它 問(wèn)題或并發(fā)癥，且有較合理的效益風(fēng)險(xiǎn)比。
[0131 ] -些藥學(xué)上可接受的載體的物質(zhì)包括：（1)糖類，比如乳糖，葡萄糖和蔗糖；（2)淀 粉，比如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；（3)纖維素和其衍生物，比如羧甲基纖維素鈉，乙基纖維 素，醋酸纖維素；（4)西黃蓍膠粉；（5)麥芽糖；（6)明膠；（7)滑石粉；（8)賦形劑，比如可可脂 和栓劑蠟；（9)油類，比如花生油，棉籽油，紅花油，芝麻油，橄欖油，玉米油和大豆油；（10)二 醇類，比如丙二醇；（11)多元醇類，比如甘油，山梨醇，甘露醇和聚乙二醇；（12)脂類，比如油 酸乙酯，月桂酸乙酯；（13)瓊脂膠；（14)緩沖劑，比如氫氧化鎂和氫氧化鋁；（15)海藻酸； (16)滅菌無(wú)熱原水；（17)生理鹽水；（18)林格氏溶液；（19)醇類，比如乙醇和丙醇；（20)磷酸 緩沖液;（21)其它在藥物劑型中可相容無(wú)毒性的物質(zhì)，比如丙酮。
[0132]藥物組合物可能包括藥學(xué)上可接受的用于模擬生理?xiàng)l件的輔料，比如pH調(diào)節(jié)劑和 緩沖劑，毒性調(diào)節(jié)劑等，如乙酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，乳酸鈉等。
[0133] 藥物組合物可制成任何合適的劑型，如固體劑型（例如片劑，膠囊，粉末，顆粒等） 和液體劑型(例如水溶液，乳濁液，酏劑，糖漿等）。藥物組合物的制備方法已眾所周知，可根 據(jù)如在由Remington所著的"The Science and Practice of Pharmacy"（Gennaro ed.20th edition，Williams&Wilkins PA,USA，2000)書中所描述的常規(guī)方法進(jìn)行制備。
[0134] 在某些實(shí)施例中，藥物組合物包括約l(T9g至約10g的本發(fā)明提供的化合物(比如約 0 · Olmg至約10g,約0 · lmg至約10g，約lmg至約10g，約5mg至約10g，約10mg至約10g,約20mg至 約10g,約30mg至約10g,約40mg至約10g,約50mg至約10g,約80mg至約10g,約100mg至約10g, 約150mg至約10g，約200mg至約10g，約300mg至約10g，約400mg至約10g，約500mg至約10g，約 600mg至約 10g,約700mg至約 10g,約 800mg至約 10g,約 900mg至約 10g,約 lg至約 10g,約 10mg 至約5g，約10mg至約3g，約10mg至約lg，約10mg至約900mg，約10mg至約700mg，約10mg至約 500mg,或約10mg至約300mg)。合理的劑量為每人每天約0.01111〖至約5區(qū)。
[0135] 在某些實(shí)施例中，本發(fā)明中提供的化合物或藥物組合物可以被制成適當(dāng)?shù)膭┬鸵?便通過(guò)非腸道途徑給藥(如皮下，靜脈，肌肉，動(dòng)脈，鞘膜，囊內(nèi)，框內(nèi)，心臟內(nèi)，真皮內(nèi)，腹膜 內(nèi)，經(jīng)氣管，表皮，關(guān)節(jié)內(nèi)，囊下，蛛網(wǎng)膜下，脊柱內(nèi)，胸骨內(nèi)，和/或輸液)和通過(guò)腸道途徑給 藥(如□服，腸道，□腔，鼻，鼻內(nèi)，粘膜，表皮，貼膏劑，真皮，眼藥，肺部，舌下，直腸，陰道或 表皮局部給藥）。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明中提供的化合物或藥物組合物可以被制成適當(dāng)?shù)?劑型以便通過(guò)口服給藥。
[0136] 合適的劑型包括但不局限于可以通過(guò)非腸道途徑給藥的制劑(如適用于注射的乳 狀液，溶液和混懸液）、可以通過(guò)口服給藥的制劑（如片劑，膠囊，丸劑，糖衣丸，粉末和顆 粒）、可以通過(guò)局部用藥或經(jīng)皮膚吸收的制劑(如噴劑，軟膏，糊劑，乳霜，乳液，凝膠，溶液， 藥物貼片和吸入劑），以及可以通過(guò)陰道或直腸給藥的制劑(如栓劑）。這些劑型可在適當(dāng)條 件下通過(guò)把化合物與輔料混合制備，制備方法及工藝眾所周知，如在由Remington所著的 "The Science and Practice of Pharmacy"（Gennaro ed.20th edition，Wi11iams& Wilkins PA,USA，2000)書中描述。
[0137] 藥物組合物可通過(guò)任何合適的途徑給藥，比如通過(guò)口服，靜脈，鼻內(nèi)，外用，肌注， 真皮內(nèi)注射，經(jīng)皮給藥或皮下途徑。
[0138] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的化合物或藥物組合物可以與第二種活性物質(zhì)同 時(shí)施用，這樣能在生物體內(nèi)達(dá)到疊加甚至協(xié)同的作用。例如，本發(fā)明提供的化合物可以和第 二種活性物質(zhì)制成一個(gè)藥物組合物，或以單獨(dú)的組合物同時(shí)給藥，或以單獨(dú)的組合物依次 給藥。能與本發(fā)明化合物同時(shí)使用、用于治療癌癥的第二種活性物質(zhì)包括但不局限于:氟尿 嘧啶，阿霉素，柔紅霉素，它莫西芬，亮丙瑞林，戈舍瑞林，氟他米特，尼魯米特，非那雄胺，地 塞米松，氨魯米特，安吖啶、阿那曲唑，天冬酰胺酶，卡介苗，比卡魯胺、博來(lái)霉素、臨床、白消 安，喜樹堿，卡培他濱，卡鉑，卡莫司汀，苯丁酸氮芥，順鉑，克拉屈濱，秋水仙堿，環(huán)磷酰胺、 藥物、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪，放線菌素 d，正定霉素，雙烯雌酚、己烯雌酚、多西紫杉 醇、阿霉素，亞德里亞霉素、表柔比星、雌二醇，雌氮芥、依托泊苷、依西美坦，非格司亭，氟達(dá) 拉濱，氟氫可的松、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、氟他米特，吉西他濱，染料木黃酮，戈舍瑞林，三苯 氧胺、替尼泊苷、睪酮、二氯化二茂鈦，拓普泰康，曲妥單抗、維甲酸、長(zhǎng)春花堿、羥基脲，伊達(dá) 比星，異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、干擾素、伊立替康，伊立替康、來(lái)曲唑、甲酰四氫葉酸，噴司他 丁，光神霉素、甲基芐肼、雷替曲塞卟菲爾，利妥昔鏈脲菌素，蘇拉明，亮丙瑞林、左旋咪唑， 環(huán)己亞硝脲、氮芥、甲羥孕酮、甲地孕酮，美法侖、巰嘌呤、巰乙磺酸鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、 米托坦、米托蒽醌，尼魯米特，諾考達(dá)唑、奧曲肽、鉑、紫杉醇、帕米磷酸，硫鳥嘌呤，三胺硫 磷、氯甲烷、拓?fù)涮婵刀?，曲妥單抗，維甲酸、長(zhǎng)春花堿，長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛，長(zhǎng)春瑞斌。
[0139] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的化合物可與非化學(xué)方法同時(shí)使用進(jìn)行癌癥治 療。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的化合物可與放射療法同時(shí)進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供的化合物可與外科手術(shù)，腫瘤熱治療，超音波聚焦療法，冷凍療法或以上幾種療 法結(jié)合使用。
[0140] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的化合物可與類固醇同時(shí)使用。合適的類固醇包 括但不局限于:安西縮松、倍氯米松，倍他米松，布地奈德，氯潑尼松，氯倍他索，皮質(zhì)甾酮， 可的松，羥潑尼縮松，去羥米松，地塞米松，雙氟拉松，雙氟米松，二氟孕留丁酯，甘草次酸， 氟扎可松，氟米松，氟尼縮松，氟氯奈德，膚輕松醋酸酯，氟輕松醋酸酯，氟可丁丁酯，氟可 龍，丙酮縮氟氫羥龍，醋酸氟培龍，醋酸氟潑尼定，氟潑尼龍，氟氫縮松，丙酸氟、醛基縮松， 丙酸氯倍他索，哈西縮松，鹵米松，氫化可的松，氯替潑諾碳酸乙酯，甲哌地強(qiáng)龍，甲羥松，甲 潑尼松，6-甲氫化潑尼松，在任糠酸鹽，帕拉米松，潑尼松龍，地塞米松，和25-二乙胺醋強(qiáng)的 松龍。
[0141] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的化合物可與免疫治療劑同時(shí)使用。合適的免疫 治療劑包括:腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)劑(比如維拉帕米），雷帕霉素，霉酚酸酯，沙利度胺， 環(huán)磷酰胺，環(huán)孢霉素，和單克隆抗體類。 實(shí)施例
[0142] 下面列舉了本發(fā)明的一些三肽環(huán)氧酮化合物及其合成、蛋白酶體活性抑制特性、 抗腫瘤活性和水溶性。
[0143] 本發(fā)明提供的化合物的合成在以下列舉的例子中作了圖解說(shuō)明。這些方案方案僅 是說(shuō)明性的，并不意味著僅限于這些方案來(lái)合成本發(fā)明提供的化合物。此外，方案方案中的 步驟是為更好地說(shuō)明，可以視情況進(jìn)行改變。以下列舉的化合物的合成都在海外完成，是為 了研究用途和潛在的向管理機(jī)構(gòu)遞交材料的需要。
[0144] 在一般的實(shí)驗(yàn)方法中，使用匪R譜圖得到化合物的結(jié)構(gòu)信息，采用四極桿質(zhì)譜 系統(tǒng)在正電噴霧離子化(ESI)模式下進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)檢測(cè)，純度用帶有UV檢測(cè) 器的高效液相儀(HPLC)測(cè)定，在有需要時(shí)用高效液相制備色譜進(jìn)行分離純化。
[0145] 實(shí)施例1
[0146] 化合物CX13-103的合成
[0147] 方案 1.CX13-103 的合成
[0149] C103-2 的合成
[0150] 在0°C下將5ml S0C12滴加到150ml甲醇中，然后加入C103-l(10g，42mmol)，加熱回 流過(guò)夜。冷至室溫后，在真空中濃縮干燥得到純產(chǎn)品C103-2(llg)，MS(ESI)m/z:181[M+H] +。
[0151] C103-6 的合成
[0152] 在C103-5(7.05g，50mmol)和四氯化碳(250mL)溶液中，加入NBS(11.5g，65mmol)和 AIBN(820mg，5mmol)。加熱回流過(guò)夜。冷至室溫后，將反應(yīng)液倒至水中，水相用二氯甲烷提取 兩次，合并有機(jī)相，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，用硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾并真空濃縮，得到的 油狀物用快速硅膠色譜純化得到C103-6(5.56g，收率51 % ) JSUSI)m/z: 221 [M+H] +。
[0153] Cl 03-7 的合成
[0154] 在預(yù)冷至0 °C的嗎啡(4.8g，55mmo 1)和四氫呋喃（20mL)溶液中滴加溶解于20mL四 氫咲喃的(^103-6(5.568,25.51111]1〇1)溶液，然后于0<€攪拌3〇111；[11，倒至水中，水相用乙酸乙酯 提取兩次，合并有機(jī)相，用鹵水洗滌，用硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾并真空濃縮。得到的油狀物用 快速硅膠色譜純化得到 C103-7(4.03g，收率 70%)。]\^化31)111/2:227[]\1+!1] +。
[0155] C103-8 的合成
[0156] C103-7(4g，17.7mmol)溶解于四氫呋喃（30mL)和甲醇(30mL)中并預(yù)冷至0°C，加入 2N LiOH( 13mL，26mmol)，室溫?cái)嚢鑜h，加鹽酸溶液調(diào)pH至5，真空濃縮，得到的殘留物用色譜 法純化得到 C103-8(2.65g,收率 Tl^hMSUSDm/zJlStM+H]'
[0157] C103-10 的合成
[0158] C103-9(5 · 81g, 20 · 8mmol)+溶解于DMF(80mL)中并預(yù)冷至0°C，加入HATU(8 · 3g, 21.8謹(jǐn)〇1)和0此八（14.311^，85111111〇1)，0。(：攪拌3011^11，加入(：103-2(5.228,20.8111111〇1)。反應(yīng)液 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢鑜h，倒至水中，用乙酸乙酯提取兩次，合并有機(jī)相，用硫酸鈉干燥，然 后過(guò)濾并真空濃縮。得到的殘留物經(jīng)制備高效液相色譜純化得到C103-10(7.9g，收率 86%)〇MS(ESI)m/z:442[M+H] + 〇
[0159] C103-11 的合成
[0160] C103-10(7· 9g，17 ·9mmol)溶解于DCM(40mL)中，于0°C緩慢加入TFA( 10mL)，室溫?cái)?拌lh，真空濃縮得到粗品，不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。MS(ESI)m/z:342[M+H] +。
[0161] C103-12 的合成
[0162] C103-8(2.65g, 12.5mmol)溶解于DMF(50mL)溶液中并預(yù)冷至0°C，加入HATU (6.188，16.25_〇1)和0此4(101^，60臟〇1)，0°(：攪拌3011^11，加入(：103-11，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室 溫?cái)嚢鑜h，反應(yīng)液倒至水中，用乙酸乙酯提取兩次，合并有機(jī)相，用硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾并 真空濃縮。得到的殘留物用色譜法純化得到C103-12(5.3g，收率79%)。1^化51)111/2:536[1+ H] +。
[0163] C103-13 的合成
[0164] C103-12(5.3g，9.88mmol)溶解于THF(30mL)和Me0H(30mL)并預(yù)冷至0°C，加入2N 1^0!1(7.51^，16臟〇1)，室溫?cái)嚢?11，加鹽酸溶液調(diào)?!1至5，真空濃縮，得到的殘留物經(jīng)色譜法 純化得到 C103-13(3.4g,收率 66%)。]\^化51)111/2:522[]\1+!1] +。
[0165] CX13-103 的合成
[0166] C103-13(3.4g,6.53mmol)溶解于DMF(20mL)并預(yù)冷至0°C，加入HATU(3.23g, 8 · 5mmol)和DIEA(5mL, 30mmol)，于0°C攪拌30min，再加入C103-4(C103-4的合成請(qǐng)見專利 PCT/US2013/052143)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢鑜h，倒至水中，用乙酸乙酯提取兩次，合并有機(jī) 相，用硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾并真空濃縮。得到的油狀殘留物經(jīng)制備高效液相純化得到 CX13-103(1.12g,收率 25%)。
[0167] iH-NMRHOOMHz，甲醇-ck)δ8 · 37(d，2H)，7 · 32(d，2H)，7 · 29-7 · 25(m，2H)，7 · 20-7 · 18 (m，3H)，6·71(s，1H)，4.77(dd，lH),4.56-4.51(m，2H)，3.82(s，2H)，3.74-3.72(m，4H),3.25 (d，lH)，3.23(dd，lH)，3.01(dd，lH)，2.95(d，lH),2.70-2.50(m，6H),2.20-1.95(m，2H)， 1.80-1·60(m，1H)，1.52-1.20(m，5H),0.91(d，3H)，0.89(d，3H);MS(ESI)m/z:675[M+H] +;純 度 >95%。
[0168] 實(shí)施例2
[0169] 化合物CX13-104的合成
[0170] 中間體C104-7的合成
[0171] 方案2:中間體C104-7的制備
[0173] C104-1 的合成
[0174] 將9.6g(40mmol)L-3-(4-吡啶基)-丙氨酸鹽酸鹽加入到200ml 1N氫氧化鈉水溶液 和200ml THF中，攪拌下，滴加20ml二碳酸二叔丁酯，加完后攪拌2h，反應(yīng)液中加入300ml水， 用乙酸乙酯洗滌（200ml X 2次）。水相中加入5 %硫酸氫鉀水溶液調(diào)pH約為4，然后用正丁醇 提取(4次X 200ml)，有機(jī)相減壓濃縮，過(guò)濾，干燥后得到8.0g白色固體C104-1，MS(ESI)m/z: 267.2[M+H]+〇
[0175] C104-02 的合成
[0176] 室溫下將8.0g(30mmol)C104-l溶于100ml DMF，冷至4°C，加入N，0-二甲基羥胺鹽 酸鹽（4 · 4g，45mmol)，再加入HBTU( 17g，45mmol)，HOBt (6 · lg，45mmol)和DIEA( 12ml， 90mmol)。反應(yīng)液緩慢升至室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，次日，用300ml乙酸乙酯稀釋，連續(xù)用飽和氯化鈉 溶液洗滌兩次(2X 100ml)。有機(jī)相用硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾并減壓濃縮。用柱層析純化(DCM (1 %TEA))得到黃色油狀化合物C104-2(6 · 2g，66% ) JS ESI)m/z: 310 · 3[M+H] +。
[0177] C104-3 的合成
[0178] 將(：104-2(6.28,20111111〇1)溶于2001111 1'冊(cè)中，冷至0°(：(冰鹽水冷卻），緩慢加異丙烯 溴化鎂(0.5M in 1'冊(cè);2001111;100臟〇1)，201^11加完。于0°(：攪拌411，緩慢倒至0°(：飽和氯化銨 水溶液中。減壓除去THF，用乙酸乙酯提取三次(3X 100ml)。合并有機(jī)相，分別用飽和碳酸氫 鈉溶液，水，飽和氯化鈉溶液洗滌。有機(jī)相用硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾并減壓濃縮，柱層析純化 (DCM( 1 %TEA))得到黃色油狀物化合物3(5 · 0g，86% ) .MS(ESI)m/z: 291。4[]\1+扣 +。
[0179] Cl 04-4 的合成
[0180] 將化合物C104-3(5.0g，17mmol)溶于100ml甲醇中，冷至0°C，加入三氯化鈰(8.2g， 22mmol)，再加入硼氫化鈉(0.85g，22mmol)。0°(：攪拌3h，緩慢倒至0°C的200ml飽和氯化銨水 溶液中，用乙酸乙酯提取(4 X 100ml )，合并有機(jī)相，分別用飽和碳酸氫鈉，水和鹽水。有機(jī)相 用硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾并減壓濃縮，柱層析純化(DCM(1 % TEA))得到黃色固體C104-4 (4.5g,90%)〇MS(ESI)m/z:293.4[M+H] + 〇
[0181] C104-5 的合成
[0182] 化合物(：104-4(4.58，15臟〇1)溶于1001111001中，冷至0°(：，加入氧化二乙酰丙酮合 釩(0.12g，0.45mmol)和叔丁基過(guò)氧化氫(5.0-6.0M癸烷溶液；12ml，60mmol)，緩慢升至室溫 過(guò)夜。分別用飽和碳酸氫鈉，水和鹽水洗滌，有機(jī)相用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮，得到 C104-5，不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。MS(ESI )m/z: 309.4[M+H] +。
[0183] C104-6 的合成
[0184] 化合物C104-5(4.5g，15mmol)溶于100ml DCM中，冷至0°C，加入戴斯馬丁氧化劑 (13g，30mmol)，緩慢升至室溫，24h后反應(yīng)液冷至4°C，再加入戴斯馬丁氧化劑（6.4g， 15_〇1)，然后再緩慢升至室溫。3h后反應(yīng)液用硅藻土過(guò)濾，濾液分別用飽和硫代硫酸鈉，飽 和碳酸氫鈉，水和鹽水洗滌，有機(jī)相硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮，柱層析純化(DCM( 2 % MeOH))得到棕色油狀物C104-6(0 · 35g，7 · 5% ):々-Μ?(氯仿_(1)δ(ppm): 8 · 37-8 · 61 (m，2H)， 7.13(d,J=5.2Hz,2H),5.13(br.s.,lH),4.61(d,lH),3.19(d,lH),2.68-2.90(m,3H),1.54 (s,3H),1.39(s,9H)；MS(ESI)m/z:307.4[M+H]+〇
[0185] Cl 04-7 的合成
[0186] 化合物(：104-6(1.38,4.2111111〇1)溶于501111001中，冷至0°(：，加入501111了?六，緩慢升 至室溫，減壓濃縮得到 C104-7TFA 鹽，MS(ESI )m/z: 207.4[M+H] +。
[0187] 方案 3:CX13_104 的制備
[0189] C104-8 的合成
[0190] 將(3)-2-氨基-4-苯基丁酸(5.(^，281]11]1〇1)，苯甲醇(6.(^，551]11]1〇1)，對(duì)甲苯磺酸一 水合物(9.5g，55mmol)和200ml甲苯混合，加熱回流16h(裝載有迪安-斯塔克裝置）。該苯溶 液然后用5%碳酸氫鈉水溶液和鹵水洗滌，用硫酸鎂粉干燥，過(guò)濾，減壓蒸干，殘留物在正己 烷中結(jié)晶得到無(wú)色針狀晶體C104-8(9.0g,80%) JSUSDm/z :270.5(M+H) +。
[0191] C104-9 的合成
[0192] C103-8(1·8g,8·5mmol),C104-8(3·7g,8·5mmol)和HBTU(4·8g,13mmol)的DMF (20mL)溶液中通過(guò)滴加漏斗緩慢加3ml DIEA，反應(yīng)16h用20ml乙酸乙酯和20ml鹵水稀釋。分 層后，水相用乙酸乙酯提取(2X30ml)，合并有機(jī)相，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓蒸 餾除去易揮發(fā)物，硅膠層析純化(PE: EA = 5 :1)得到白色固體C104-9 (2.4g，61 %收率）JS (ESI)m/z:463.5(M+H)+〇
[0193] C104-10 的合成
[0194] C104-9(2.4g)的THF溶液中加入Pd/C(0.24g)，H2氣氛下攪拌2h，過(guò)濾，濃縮得到產(chǎn) 品104-5,不經(jīng)純化直接用于下一步。MS(ESI)m/z :374.5(M+H) +。
[0195] C104-11 的合成
[0196] C104-10(1.8g，8.5mmol)，（S)_芐基2-氨基-4-戊酸甲酯（1.9g，8.5mmol)，HBTU (4 · 8g，13mmo 1)的DMF (20mL)混合溶液中通過(guò)滴加漏斗緩慢加入3ml DIEA。室溫反應(yīng)16h，用 20ml乙酸乙酯和20ml鹵水稀釋。水相用乙酸乙酯提取(2X30ml)，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥， 過(guò)濾除去固體，減壓蒸餾除去易揮發(fā)物，硅膠層析純化(PE:EA = 5:1)得到白色固體104-11 (2.48,61%收率）。]\^化51)111/2:577.5(]\1+!〇 +。
[0197] C104-12 的合成
[0198] C104-11 (2.4g)的THF溶液中加入Pd/C(0.24g)，H2氣氛下攪拌2h，過(guò)濾，濃縮得到 產(chǎn)品C104-12,不經(jīng)純化直接用于下一步。MS(ESI)m/z :487.5(M+H) +。
[0199] CX13-104 的合成
[0200] C104-12(0.40g，0.82mmol)，C104-7(0.17g，0.82mmol)，H0Bt(0.20g 1.5mmol)和 HBTU(0 · 56g，1 · 5mmol)的THF(5mL)溶液保持-5 °C，滴加 lml DIEA，于-5°C反應(yīng)0 · 5h，用 10ml 乙酸乙酯和l〇ml鹵水稀釋。分層后水相用乙酸乙酯提?。? + 5ml)，合并有機(jī)相，硫酸鈉干 燥，過(guò)濾除去固體，減壓蒸餾除去易揮發(fā)物，粗品經(jīng)硅膠層析(DCM:Me0H=50:l)和制備高效 液相純化得到化合物CX13-104(50mg6.2% )。
[0201 ] ^-NMRHOOMHz，甲醇-d4) δ (ppm): 〇 · 88-0 · 99 (m，7H) 1 · 26-1 · 35 (m，2H) 1 · 40-1 · 47 (m,1H)1.49-1.55(m,4H)1.64(d,J=6.45Hz,lH)1.98-2.18(m,2H)2.53-2.67(m,6H)2.79 (dd ,J= 13.97,9.94Hz, lH)2.99(d,J = 4.84Hz,lH)3.18(dd ,J= 14.10,3.63Hz, lH)3.30(s, 1H)3.67-3.77(m, 4H)3.79-3.87(m, 2H)4.42(dd,J = 8.73,6.31Hz, lH)4.53(dd,J = 8.33, 5.64Hz,lH)4.79(dd,J=9.81,3.63Hz,1H)6.73(s,1H)7.16-7.22(m,3H)7.22-7.32(m,3H) 7.37(d ,J = 5.91Hz,2H)8.40(d ,J = 5.37Hz,2H)；MS(ESI)m/z:675.5(M+H) + 〇
[0202] 實(shí)施例3
[0203] CX13-105 的合成
[0204] 方案 4:CX13-105 的制備
[0206] C105-2 的合成
[0207] 預(yù)冷至0°(：的(：105-1(1(^，33.2111111〇1)30(：1(8.38,43.2111111〇1)和!108七（7 8， 51 · lmmo 1)的DMF(40mL)溶液中加入DIEA(14 · 3mL，85 · 2mmo 1)。于0 °C 攪拌30min，加入N，0-二 甲基羥胺鹽酸鹽(3.28,33.2111111〇1)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?1 1，倒至水中，用乙酸乙酯提取兩 次，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾，真空濃縮，得到的油狀殘留物經(jīng)硅膠柱純化，得到所需 化合物C105-2(8 · 0g，收率72 · 7% ) JSUSI)m/z: 343[M+H] +。
[0208] C105-3 的合成
[0209] 預(yù)冷至0°C的(：105-2(88,23.2!11111〇1)1'冊(cè)（5011^)溶液中于0°(：加入異丙烯溴化鎂 (0.5MTHF溶液，200mL，lOOmmol)，0°C攪拌3h，將反應(yīng)液緩慢倒至飽和NH4C1溶液中，用濃鹽 酸調(diào)pH至1.5,用乙酸乙酯提取，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾，真空濃縮，得到的油狀殘留 物經(jīng)硅膠柱純化得到所需化合物Cl05-3(5.8g，收率77% ).
[0210] C105-4 的合成
[0211] C105-3 (5 · 8g，18mmo 1)溶于甲醇和THF( 20mL)中，預(yù)冷至0 °C，于0 °C 加入Naffl4 (1.21 g，31.8mmo 1)和CeCl3.7H2〇(11.8g，31.8mmo 1)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于0 °C攪拌3h，加入5ml水終 止反應(yīng)，真空下除去所有的易揮發(fā)物，殘留物用乙酸乙酯提取，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò) 濾，真空濃縮，得到的油狀殘留物經(jīng)硅膠柱純化得到所需化合物C105-4(4.37g，收率72%)。 MS(ESI)m/z:326[M+H]+〇
[0212] C105-5 的合成
[0213] 預(yù)冷至0°C的(：105-4(4.378，13.4!11111〇1)的001(201^)溶液中，加入乙酰丙酮氧釩 (344mg，1.3mmol)和t-Bu02H(5.5M癸烷溶液，2.6mL，14.3mmol)。加完后室溫?cái)嚢?h，加入 5mL水終止反應(yīng)。反應(yīng)液用硅藻土過(guò)濾，水相用DCM提取，合并有機(jī)相，用亞硫酸氫鈉溶液和 鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，真空濃縮，得到的油狀殘留物不經(jīng)純化直接用于下一步，MS(ESI)m/ z:342[M+H]+〇 [0214] C105-6 的合成
[0215] 預(yù)冷至〇°C的C105-5的DCM(20mL)溶液中，加入戴斯-馬丁氧化劑（13g，32 · 5mmol)， 室溫?cái)嚢鑜h，通過(guò)硅藻土過(guò)濾，濾餅用DCM洗滌兩次，合并有機(jī)相，分別用亞硫酸氫鈉溶液， 飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌，硫酸鈉干燥，真空濃縮，得到的油狀殘留物經(jīng)硅膠柱純化得到所 需化合物 C105-6(2g,收率 29%)。]\^化51)111/2:340[]\1+!1] +。
[0216] C105-7 的合成
[0217] C105-6(2g,5 · 88mmo 1)溶解于MeOH( 10mL)和TFA(lmL)中，預(yù)冷至0°C，加入鈀碳 (400mg，40%wt)，在氫氣氣氛下（3.5atm)于0°C攪拌6h，然后娃藻土過(guò)濾，濾液真空濃縮得 到粗品，不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。MS(ESI)m/z:206[M+H] +。
[0218] CX13-105 的合成
[0219] 預(yù)冷至 〇°C的 C104-7(311mg，0.74mmol)，HATU(422mg，l.llmmol)和 DMF(5mL)的溶 液中，加入0此4(0.6211^，3.7111111〇1)，于0°(：攪拌301^11，加入(：105-7的001(21^)溶液，氮?dú)獗?護(hù)下室溫?cái)嚢鑜h，然后倒至水中，用乙酸乙酯提取兩次，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾，真 空濃縮，得到的殘留物經(jīng)制備高效液相純化得到CX13-105(70mg，收率16% )。
[0220] 1!1-匪1?(4001泡，甲醇-(14)37.32-7.09(111，10!1)，6.72(8，1!1)，4.76((1(1，1!1)，4.55 (dd，lH)，4.46(dd，lH)，3.83(s，2H)，3.73-3.71(m，4H)，3.28(d，lH)，3.11(dd，lH)，2.94(d， 1H),2.76-2.60(m,3H),2.59-2.55(m,4H),2.11-2.02(m,2H),1.65-1.61(m,lH),1.54-1.51 (m，2H)，1.45(s，3H)，0.94(d，3H)，0.90(d，3H);MS(ESI)m/z:674[M+H] + ;純度 >95%。
[0221 ] 實(shí)施例4
[0222] CX13-107 的合成
[0223] 方案 5:CX13_107 的制備
[0225] C107-3 的合成
[0226] 預(yù)冷至0 °C 的C107-1 (10g，35 · 8mmol)的DMF(40mL)溶液中，加入EDCI (8 · 5g， 44.3mmol)，H0Bt(7g，51. lmmol)和0此八（14.311^，85.2111111〇1)。于0°(：攪拌30分鐘，再加入 C107-2(6.2g，34. lmmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢鑜h，倒至水中，用乙酸乙酯提取兩次，合并有 機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾，真空濃縮，得到的油狀殘留物用快速硅膠柱色譜純化得到C107-3 (13.58，收率97.8%)。]\^化51)111/2:351[]\1+!1-55] +。
[0227] C107-4 的合成
[0228] 預(yù)冷至0 °C 的C107-3 (13 · 5g，33 · 3mmo 1)的DCM( 50mL)溶液中，加入20ml TFA，室溫 攪拌lh，真空濃縮得到粗品，不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。MS(ESI)m/z:307[M+H] +。
[0229] C107-6 的合成
[0230] 預(yù)冷至 〇°C 的 C107-5(l .8g, 12.4mmol)的 DMF(20mL)溶液中，加入 HATU(5.8g, 15.3mmol)和DIEA( 10mL，60mmol)，于0°C攪拌30分鐘，加入C107-4，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?lh，將反應(yīng)液倒至水中，用乙酸乙酯提取兩次，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾，真空濃縮，得 到的油狀殘留物經(jīng)快速硅膠柱色譜純化得到C107-6(4.5g，收率88% ) JSUSI )m/z : 434[M+ H] +。
[0231] Cl 07-7 的合成
[0232] <：107-6(4.58，10.1111111〇1)溶解于1'冊(cè)（1011^)和]\^0!1(1011^)中，預(yù)冷至0°(：，加入2~ Li0H(10mL，20mmol)，室溫?cái)嚢鑜h，加入鹽酸溶液調(diào)pH至5，得到的固體用水洗，真空干燥得 到所需化合物(3.8g，收率90 % )。
[0233] CX13-107 的合成
[0234] C107-7(311mg，0.74mmol)，HATU(445mg，1.17mmol)和 DIEA(0.5mL，2.2mmol)溶于 DMF(5mL)，于0°C攪拌30分鐘，加入C105-7,氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢鑜h，將反應(yīng)液倒至水中，用 乙酸乙酯提取兩次，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾，真空濃縮，得到的油狀殘留物經(jīng)制備高 效液相純化得到產(chǎn)品（70mg，收率16 % )。
[0235] 1!1-匪1?(4001!^，甲醇-(14)，37.20-6.98(111，10!〇,4.67((1(1，1!〇,4.36-4.31(111，2!〇， 3.68-3.62(m，4H)，3.21(d，lH)，3.02(dd，lH)，2.96(dd，2H)，2.85(d，lH)，2.63(dd，lH)， 2.50-2.40(m,6H),1.96-1.78(m,2H),1.55-1.43(m,lH),1.43-1.36(m,2H),1.22(s,3H), 0.85((1,3H),0.81((1,3H);MS(ESI)m/z:607[M+H] + ;純度 >95%。
[0236] 實(shí)施例5
[0237] 化合物CX13-130的合成
[0238] 方案 6:CX13_130 的制備
[0240] C130-2 的合成
[0241] 室溫下往(：130-1(1.58,5.4臟〇1)的01^(301^)溶液中加入(3)-芐基2-氨基-3-(吡 啶基-4-基）丙酸酯（1.388,5.4!11111〇1)，冊(cè)1'1](3.18,8.1111111〇1)和0此4(411^)，在室溫下反應(yīng) 16h，用80ml乙酸乙酯和40ml鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次(2 X 40ml )，合并有 機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，經(jīng)硅膠層析(PE:EA=10:1)純化得到 白色固體化合物 130-2(2.0g, 72%收率），MS(ESI)m/z :518.3(M+H) +。
[0242] C130-3 的合成
[0243] C130-2(1.5g，2.9mmol)的 THF(25mL)的溶液中加入 10%Pd/C(0.15g)，在氫氣氣氛 下于50°C攪拌16h，過(guò)濾，濃縮得到化合物C130-3(l 100mg，90%收率），不經(jīng)純化，直接用于 下一步反應(yīng)，MS(ESI)m/z :428.3(M+H) +。
[0244] C130-4 的合成
[0245] 往C130-3( 1 · lg，2·6mmol)的DMF( 15mL)溶液中加入C103-4(0 ·69g，2·6mmol)，HBTU (1.5g, 3.9mmol)，H0Bt(0 · 53g，3 · 9mmol)和DIEA(2mL)，室溫下攬摔16h，用60ml乙酸乙酯和 20ml鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次（2 X30ml)，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾 除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，經(jīng)硅膠層析(PE:EA=1:1)純化得到白色固體化合物C130-4 (510mg，34% 收率），MS(ESI)m/z:581.4(M+H) +。
[0246] C130-5 的合成
[0247] 向C130-4(510mg，0.88mmol)的DCM(lOmL)溶液中于0°C加入4ml TFA，0°C下反應(yīng) 2h，減壓除去易揮發(fā)物得到白色固體化合物130-5(500mg，100%收率），MS(ESI)m/z:481.4 (M+H) + 〇
[0248] CX13-130 的合成
[0249] 室溫下往C130-5 (11 Omg，0 · 19mmo 1)的 DMF ( 2mL)溶液中加入乙酸（14mg， 0 · 23mmo 1)，HBTU(108mg，0 · 29mmo 1)，HOBt (39mg，0 · 29mmo 1)和DIEA(0 · 2mL)，室溫下反應(yīng) 16h，用40ml乙酸乙酯和10ml鹽水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次(2 X 20ml)，合并有 機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，經(jīng)硅膠柱層析(DCM:Me0H = 40:l)和 制備高效液相純化得到白色固體CX13-130 (25mg，21 % )。
[0250] ^-ΝΜΚΗΟΟΜΗζ,αΧ^Μβ.δΟΟ^Η) ,7.38-7.25(m，4H)，7· 21 (t，J = 7.3Ηζ，1Η)， 7.17(t ,J= 10.3Hz, 3H), 6.83(d,J = 7.6Hz,lH) ,6.19(d ,J = 7.3Hz , 1H) ,4.81 (dd ,J= 13.9, 7.7Hz,lH) ,4.57(t,J = 7.6Hz,lH) ,4.38(dd,J=14.0,7.3Hz,lH) ,3.25(dd,J = 16.9, 5. lHz,2H) ,3.05(dd, J=14.2,8.2Hz,lH) ,2.92(d,J = 4.9Hz,lH) ,2.65(dd,J = 14.7, 6.3Hz,2H),2.13(dd ,J=14.1,7.5Hz,2H),1.93(s,4H),1.67-1.47(m,5H),1.30(dd ,J = 16.6,6.8Hz,2H),0.92(dd,J=8.9,6.5Hz,6H)；MS(ESI)m/z:523.7(M+H)+〇
[0251] 實(shí)施例6
[0252] 化合物CX13-133的合成
[0253] 方案 7:CX13_133 的制備
[0255] C133-2 的合成
[0256] 將嗎啉（456mg , 5 · 6mmol)溶解于乙腈（20mL)中，室溫下加入碳酸鉀（841mg , 6 · lmmo 1)和Cl33-1 (1 g，4 · 7mmo 1)，50°C攪拌4h，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，經(jīng)硅膠 柱層析(PE:EA=4:l)純化得到無(wú)色油狀物C133-2(1.0g，81%收率），MS(ESI)m/z :264.2(M+ H) +。
[0257] C133-3 的合成
[0258] 將C133-2(1000mg，3.8mmol)溶解于THF(16mL)和水（8mL)中，室溫下加入LiOH.H2〇 (477mg，11.4mmol)，室溫?cái)嚢?6h，反應(yīng)液酸化至pH=5，濃縮，層析純化得到白色固體C133- 3(750mg，84%收率 hMSCESDm/z :236.2(M+H) +。
[0259] CX13-133 的合成
[0260] 室溫下往C130-5( 110mg，0. 19mmol)的 DMF(2mL)溶液中加入 133-3(54mg, 0 · 23mmol),HBTU( 108mg, 0 · 29mmo 1),HOBt (39mg, 0 · 29mmo 1)和DIEA(0 · 2mL)，室溫保溫反應(yīng) 16h，用40ml乙酸乙酯和10ml鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次(2 X 20ml)，合并有 機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，經(jīng)硅膠柱層析(DCM:Me0H = 40:l)和 制備高效液相純化得到白色固體CX13-133(55mg，41 % )。
[0261 ] 匪R(400MHz，甲醇-d4) δρρπι 〇 · 86-1 · 01 (dd，6H) 1 · 43(t，J = 6 · 98Hz，4H) 1 ·47- l·64(m，lH)l·88-l·96(m，2H)2·56(m，6H)2·96(m，9·94Hz，2H)3·18(dd，J=9·94Hz，lH)3·22 (d ,J = 5.2Hz,lH)3.4-3.6(m,4H)3.6-3.66(m,4H)4.26-4.28(m,lH)4.46(d ,J = 4.84 1H) 4.71-4.75(m,lH)7.06(d,J=5.2Hz 1H)7.16-7.20(m,1H)7.20-7.24(m,2H)7.26-7.32(m, 2H)7·34(s，4H)8·36-8·38(m,2H);MS(ESI)m/z:698·4(M+H) +。
[0262] 實(shí)施例7
[0263] 化合物CX13-135的合成
[0264] 方案 8:CX13_135 的制備
[0266] 化合物Cl 30-5 (110mg，0.19mmol)的DMF( 2mL)溶液中室溫下加入5-甲基異惡唑-3- 羧酸（40mg，0 · 23mmo 1)，HBTU(108mg，0 · 29mmo 1)，HOBt (39mg，0 · 29mmo 1)和DIEA(0 · 2mL)，室 溫?cái)嚢?6h，用40ml乙酸乙酯和10ml鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取(2 X 20ml)，合并 有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，經(jīng)硅膠柱層析(DCM:Me0H = 40:l) 和制備高效液相純化得到白色固體CX13-135 (18mg，16 % )。
[0267] 匪R(400MHz，CDC13)S8.38(s，2H)，7.35((1, J = 7.9Hz，lH) ,7.33-7.23(m，3H)， 7.20(t ,J = 7.3Hz,lH),7.16-7.08(m,4H) ,6.96(d ,J = 8.0Hz , 1H), 6.68(d ,J = 7.7Hz , 1H), 6.43(d,J = 0.7Hz, 1H) ,4.75(dd,J=14.2,7.5Hz,lH) ,4.62-4.43(m,2H) ,3.26(d,J = 4.9Hz,lH) ,3.12(dd,J=14. l,6.2Hz,lH) ,2.98(dd,J=14.1,7.5Hz,lH) ,2.91(d,J = 5.0Hz,lH) ,2.67(t,J = 7.8Hz,2H),2.58-2.45(m,3H) ,2.21(dt,J=14.0,7.7Hz,2H),2.04 (td ,J= 15.6,7.9Hz,lH), 1.64-1.42(m,5H), 1.37-1.16(m,2H) ,0.89(dd ,J= 13.1,6.3Hz , 6H)；MS(ESI)m/z:590.4(M+H)+〇
[0268] 實(shí)施例8
[0269] 化合物CX13-137的合成
[0270] 方案 9:CX13_137 的制備
[0272] C130-5(110mg，0.19mmol)的DMF(2mL)溶液中室溫下加入5-甲基異惡唑-2-羧酸 (4111^，0.23_〇1)，冊(cè)1'1](10811^，0.29_〇1)，!108七（3911^，0.29111111〇1)和0比厶（0.211^)，室溫?cái)?拌16h，用40ml乙酸乙酯和10ml鹽水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取(2 X 20ml)，合并有機(jī) 相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，經(jīng)層析法純化得到白色固體CX13-137 (36mg,31 %)〇
[0273] 4-^1^(40010^,0)(:13)38.32((1,1 = 5.61^,211),8.05(8,110,7.41(dd，J = 29.1， 17.6Hz,3H) ,7.20(dt ,J = 24.4,7.1Hz,3H),7.13-7.02(m,3H) ,4.79(dd ,J= 13.9,8.0Hz , 1H) ,4.71-4.49(m,2H) ,3.25(d,J = 4.9Hz,lH) ,3.11(dd,J=13.7,5.3Hz,lH),2.98-2.81 (m,2H),2.76(s,3H),2.63(t,J=7.7Hz,2H),2.23-1.93(m,2H),1.76-1.41(m,5H),1.30 (ddd ,J = 14.3,8.6,4.5Hz,2H),0.87(dd ,J = 17.5,6.4Hz,6H)；MS(ESI)m/z:606.3(M+H) + 〇
[0274] 實(shí)施例9
[0275] 化合物CXI 3-600的合成
[0276] 方案 10:CX13-600 的制備
[0278] C600-2 的合成
[0279] C104-10 ( 2 · Og , 5 · 4mmol)的DMF(30mL)溶液中室溫下加入C600-1 (1 · 38g , 5.4mmol)，HBTU(3.1g，8.1mmol)和 DIEA(4mL)，室溫反應(yīng) 16h，用 80ml 乙酸乙酯和 40ml 鹵水稀 釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次(2X40ml)，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減 壓除去易揮發(fā)物，經(jīng)硅膠柱層析(PE:EA=10:l)純化得到白色固體化合物C600-2(1.8g， 69% 收率 h.MSCESDm/zzeil.TCM+Hr。
[0280] C600-3 的合成
[0281] C600-2(1.77g，2.9mmol)的 THF(20mL)的溶液中加入 10%Pd/C(0.15g)，氫氣氣氛 下于50°C攪拌16h，過(guò)濾，濃縮得到C600-3(1.35g，90 %收率），不經(jīng)純化直接用于下一步反 應(yīng)。MS(ESI)m/z :521.3(M+H) +。
[0282] CXI 3-600 的合成
[0283 ] C600-3(150mg，0·29mmo1)、C103-4(78mg，0·29mmo1)、HOBt(60g，0·5lmmo1)、HBTU (165g，0.51mmol)和DMF(4mL)的混合溶液預(yù)冷至0°C，加入DIEA(0.2mL)，于-5°C保溫反應(yīng) lh，用10ml乙酸乙酯和lOmL鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次(2 X 10ml)，合并有機(jī) 相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，得到粗品經(jīng)層析法純化，得到化合物 CX13-600(98mg,51.0%)〇
[0284] 匪R(400MHz，CDC13)S7 · 30(br · s，1H)，7 · 13-7 · 28(m, 10H) ,6 · 57-6 · 73(m,2H)， 6.16(br.s.,lH),4.66(d,J=7.25Hz,lH),4.47-4.59(m,2H),3.59-3.89(br,6H),3.25(d,J = 5.10Hz,lH),3.05(dd ,J = 6.72,3.49Hz,2H),2.90(d ,J = 4.84Hz,lH),2.48-2.74(m,6H), 2.18-2.29(m,lH),1.96-2.11(m,lH),1.55(s,3H),l.41-1.54(m,2H),1.20(t,J=9.94Hz, lH),0.88(dd,J=13.30,5.78Hz,6H)；MS(ESI)m/z:674.3(M+H)+〇
[0285] 實(shí)施例10
[0286] CX13-601 的合成
[0287] 方案 11:CX13_601 的制備
[0289] C601-1 的合成
[0290] 室溫下通過(guò)滴加漏斗往C104-10(500mg，1.3mmol)、（S)-芐基2-氨基-4-甲基戊酸 ((335mg，1 · 6mmo 1)、TBTU(516m g，13mmo 1)的DMF(50mL)溶液中加入DIEA(0 · 3mL)，室溫反應(yīng) 16h，用10ml乙酸乙酯和10ml鹽水稀釋，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去 易揮發(fā)物，經(jīng)硅膠柱層析純化(PE:EA = 5:1)得到白色固體601-l(660g，87%收率），MS(ESI) m/z:565.2(M+H)+〇 [0291] C601-2 的合成
[0292]向C601-1 (660mg)的THF溶液中加入66mg鈀碳，氫氣氣氛下攪拌12h，過(guò)濾，濃縮得 到產(chǎn)品C601-2,不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。MS(ESI)m/z :475.2(M+H) +。
[0293] CXI 3-601 的合成
[0294] C6(n-2(150mg，0.32mmol)、C103-4(102mg，0.38mmol)、H0Bt(51g，0.51mmol)、HBTU (144g，0.5 lmmo 1)和DMF(5mL)的混合溶液預(yù)冷至-5 °C，加入DIEA(0.2mL)，-5 °C 下反應(yīng)lh，用 15ml乙酸乙酯和15ml鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次(2 X 10ml)，合并有機(jī)相，硫 酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，得到粗品經(jīng)層析柱純化，得到化合物〇乂13_ 601(70mg,35.3%)〇
[0295] 4-^^(40010^,0)(:13)37.33((1,1 = 9.94^,211),7.17-7.26(111,311),6.89((1,1 = 8.33Hz,1H),6.74(d,J=6.72Hz,lH),6.66(s,lH),4.58-4.67(m,2H),4.50(m,lH),3.69- 3.83(m,7H),3.35-3.47(m,4H),3.30(d ,J = 4.84Hz,lH),2.92(d ,J = 4.84Hz,lH),2.76(t ,J =7.92Hz,2H),2.49-2.60(m,4H),2.24-2.37(m,lH),2.12(m,lH),1.53-1.67(m,,2H), 1.49-1.58(m,4H)0.89-0.98(m,6H)；MS(ESI)m/z:628.3(M+H)+〇
[0296] 實(shí)施例11
[0297] 化合物CX13-603的合成
[0298] 方案 12:CX13_603 的制備
[0300] C601-2(200mg，0.42mmol)、C105-7(0.17g，0.82mmol)、H0Bt(69m g，0.51mmol)、 HBTU(19 lmg，0 · 5 lmmo 1)和DMF(5mL)的混合溶液預(yù)冷至-5 °C，加入DIEA(0 · 5mL)，-5 °C 下反應(yīng) lh，用10ml乙酸乙酯和10ml鹽水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次(2 X 10ml)，合并有機(jī) 相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，得到粗品經(jīng)層析柱純化，得到化合物 CX13-603(60mg,21.6%)〇
[0301] iH-NMRHOOMHz，CDC13)S7.35-7.23(m，7H) ,7.22-7.13(m，4H) ,7.02((1, J = 7.6Hz, 1H) ,6.81(b,lH),6.64(d ,J = 6.5Hz,lH), 4.81 (td,J = 7.6,4.9Hz,lH) ,4.58(dd ,J= 13.6, 7.9Hz,lH) ,4.42(td,J = 7.3,3.9Hz,lH) ,3.85(b,5H) ,3.74(dd,J = 9.1,3.8Hz,lH) ,3.35 (s,3H),3.32(d,J = 5.1Hz,lH),3.17(dd,J=14.0,4.9Hz,lH),2.95(d,J = 4.9Hz,lH) ,2.86 (dd,J=14.0,7.7Hz,lH),2.71(t,J = 7.8Hz,2H) ,2.63(b,4H) ,2.23(m,lH) ,2.07(m,lH), 1.54(s,3H)；MS(ESI)m/z:662.3(M+H)+〇
[0302] 實(shí)施例12
[0303] 化合物CX13-605的合成
[0304] 方案 13:CX13-605 的制備
[0306] C605-2合成
[0307] 通過(guò)滴加漏斗向 C104-10(240mg，0.64mmol)、C605-l(143mg，0.77mmol)、HBTU (245m g，0·77mmol)和DMF(lOmL)的混合液緩慢加入DIEA(0· 5mL)，室溫下反應(yīng)16h，用10ml 乙酸乙酯和l〇ml鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次(2X 10ml)，合并有機(jī)相，硫酸鈉 干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，經(jīng)層析柱純化得到白色固體C605-2(310g，89%收 率）。.]\^化51)111/2:542.0(]\1+!〇 +。
[0308] C605-3 的合成
[0309] C605-2(270mg，2 · 3mmol)的THF溶液中加入Li0H(97 · 4mg，3 · 5mmol)，室溫?cái)嚢?h， 蒸餾，調(diào)pH至5，蒸餾，層析法純化得到白色固體C605-3 (150mg，61 % )。LC-MS: m/z 528 · 1 (M+ H) +。
[0310] CXI 3-605 的制備
[0311] C605-3(150mg，0.28mmol)、C105-7(87mg，0.28mmol)+H0Bt(58g，0.42mmol)、HBTU (160g，0.42mmo 1)和DMF(5mL)的混合溶液預(yù)冷至-5 °C，加入DIEA(0.3mL)，-5 °C 下反應(yīng)lh，用 10ml乙酸乙酯和lOmL鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次(2 X 10ml)，合并有機(jī)相，硫 酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，得到粗品經(jīng)層析柱純化，得到化合物CX13- 605(50mg,25.1%)〇
[0312] $-匪1?(4001!^，0)(：13)38.82(8，1!〇,7.15-7.41(111，10!〇,7.11((1，了 = 4.30抱，1!〇， 6.75(s,lH),4.67-4.78(m,2H),4.49(d,J=3.49Hz,lH),3.91(s,2H),3.67-3.79(m,4H), 3.21-3.29(d,J = 5.10Hz,2H) ,3.03-3.16(m,2H) ,2.94(d,J = 5.10Hz,lH) ,2.51-2.80(m, 7H).l.91-2.09(m,2H),1.44(s,3H)；MS(ESI)m/z:715.3(M+H)+〇
[0313] 實(shí)施例13
[0314] 化合物CX13-606的合成
[0315] 方案 14:CX13_606 的制備
[0317] C606-2 的合成
[0318] 2.0g(17mmol)of C606-1 中加入35ml IN氫氧化鈉水溶液和35ml THF，0°C攪拌下 加入二碳酸二叔丁酯(4.03g，18.5mmol)的THF( 15mL)溶液，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，反應(yīng)液減壓蒸發(fā) 濃縮，水相用10%檸檬酸溶液調(diào)pH至4-5后用乙酸乙酯提取，鹵水洗滌，硫酸鎂干燥，蒸餾得 到3 · 6g化合物606-2(98%收率）JSUSI)m/z: 220 · 1 (M+H) +。
[0319] C606-3 的合成
[0320] C606-2(3.6g，16mmol)的DCM(40mL)溶液中室溫下加入Me0H(2mL)，DIEA(8mL)和 EDCI (4.8g，25mmol)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，然后用200ml二氯甲烷和50ml鹵水稀釋，有機(jī)相用硫酸 鈉干燥，過(guò)濾除去固體，層析柱純化得到白色固體C606-3 (0.8g，20 % )。. MS (ESI )m/z : 234.1 (M+H) + 〇
[0321] C606-4 的合成
[0322] C606-3(800mg，3 · 4mmo 1)的DCM(8mL)溶液中于0°C加入2ml TFA，0°C下反應(yīng)2h，減 壓除去易揮發(fā)物，得到白色固體化合物C606-4(790mg，100%收率 H) +。
[0323] C606-5 的合成
[0324] 〇606-4(7901^，3.4臟〇1)的01^(10111〇溶液中室溫下加入(3)-2-([叔丁氧羰基]氨 基）_4_苯基丁酸（950mg，3 · 4mmol),HBTU(1950mg,5.15mmol),HOBt(695mg, 5.15mmol)和 DIEA(2mL)，室溫下反應(yīng)16h，用40ml乙酸乙酯和10ml鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取， 合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓餾除去易揮發(fā)物，層析柱純化得到白色固體 C606-5( 1.2g,89% ) 〇MS(ESI)m/z: 395.2(M+H) + 〇
[0325] C606-6 的合成
[0326] 化合物〇606-5(60011^，1.5111111〇1)的0〇1(611^)溶液中于0°(：加入了卩厶（211^)，0°(：保溫 反應(yīng)2h，減壓除去易揮發(fā)物，得到白色固體606-6(595mg，100%收率hMSUSDm/zjgSiM +H) + 〇
[0327] C606-7 的合成
[0328] 化合物C606-6(595mg，l .5mmol)的DMF(5mL)溶液中室溫下加入C133-3(360mg, 1 · 5mmo 1), HBTU(870mg, 2 · 3mmo 1), HOBt (31 lmg, 2 · 3mmo 1)和DIEA(lmL)，室溫下反應(yīng) 16h，用 30ml乙酸乙酯和lOmL鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取兩次(2 X20ml)，合并有機(jī)相，硫 酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，層析柱純化得到白色固體608-7(490mg， 63%)〇MS(ESI)m/z:512.3(M+H) + 〇
[0329] C606-8 的合成
[0330] 化合物 0606-7(49011^，0.96111111〇1) + 的1'冊(cè)（611^)和水（211^)溶液中室溫下加入 1^0!1.!120(10111^，2.4臟〇1)，室溫?cái)嚢?611，調(diào)?!1=5，用1001111乙酸乙酯提取，硫酸鈉干燥，過(guò) 濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物得到白色固體606-8(440mg，92%收率）。.MS(ESI )m/z : 498.3(M+H) + 〇
[0331] CXI 3-606 的合成
[0332] 化合物 0606-8(20011^，0.4111111〇1)的01^(311^)溶液中室溫下加入(：103-4(10711^， 0 · 4mmo 1)，HBTU (227mg，0 · 6mmo 1)，HOBt (82mg，0 · 6mmo 1)和DIEA(0 · 2mL)，室溫下反應(yīng) 16h，用 30ml乙酸乙酯和lOmL鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取(2X20ml)，合并有機(jī)相，硫酸鈉 干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，經(jīng)層析柱純化，得到白色固體CX13-606(100mg， 38%)〇
[0333] 4-^^(40010^,1^00)37.33(8,411),7.24(^ = 7.3^,211),7.15((1(1,1 = 20.9, 7.1Hz,3H) ,4.63-4.48(m,2H) ,4.37(dd ,J = 8.3,4.9Hz , 1H), 3.65(dd ,J = 8.8,4.1Hz ,4H), 3.60(dd,J = 6.1,3.7Hz,3H) ,3.54(d,J = 6.0Hz,2H),3.24(d,J = 5.1Hz,lH) ,2.93(d,J = 5.1Hz,lH),2.69-2.52(m,2H),2.46(s,4H),2.18-2.04(m,lH),2.01-1.85(m,lH),1.76- 1.63(m,lH),1.54-1.42(m,4H) ,1.35(ddd,J=13.9,9.0,3.7Hz,lH) ,0.91(dd,J = 9.7, 6.6Hz,6H)；MS(ESI)m/z:652.0(M+H)+〇
[0334] 實(shí)施例14
[0335] 化合物CXI 3-608的合成
[0336] 方案 15:CX13_608 的制備
[0338] C606-8(200mg,0 ·4mmol)的DMF(3mL)溶液中室溫下加入C105-7(107mg,0 · 4mmol), HBTU(227mg,0.6mmol) ,!108以8211^，0.6111111〇1)和0比厶(0.211^)，室溫下反應(yīng)1611，用301111乙酸 乙酯和10ml齒水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提?。? X 20ml)，合并有機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò) 濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，層析柱純化得到白色固體CX13-608(100mg，36%)。
[0339] 匪R(400MHz，Me0D)S7.32(s，4H)，7.27-7.12(m，8H)，7.n-7.08(m，2H) ,4.79 (dd,J = 8.6,4.6Hz,lH),4.47(t,J = 5.3Hz,lH),4.33(dd,J = 9.2,5.0Hz,lH) ,3.64(t,J = 4.8Hz,4H),3.51-3.59(m,4H),3.50(s,2H),3.30(s,3H),3.25(d,J=5.0Hz,lH),3.07(dd,J = 13.9，4·6Ηζ，1H)，2.93(d，J = 5.OHz，1H)，2.76(dd，J= 13.9,8·7Ηζ，1Η) ,2.64-2.49(m, 2H),2.43(t,J=4.8Hz,4H),2.05(m,lH),1.91(m,lH),1.43(s,3H)；MS(ESI)m/z:685.3(M+ H) +。
[0340] 實(shí)施例15
[0341] 化合物CX13-705的合成
[0342] 方案 16:CX13_705 的制備
[0344] C705-2 的合成
[0345] 0705-1(23911^，0.81111111〇1)的01^(511^)溶液中室溫下加入5-甲基噻唑-2-羧酸 (11611^，0.81_〇1)，邢1'1](37011^，0.97_〇1)，!108七（13111^，0.97_〇1)和0比厶（0.7311^)，室溫 反應(yīng)12h，用20ml乙酸乙酯和10ml鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取(2 X 150ml)，合并有 機(jī)相，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，層析柱純化得到白色固體705-2 (300mg,88%)〇.LC-MS:m/z 420.1(M+H)+ 〇
[0346] C705-3 的合成
[0347] C705-2 (340mg, 0 · 8lmmo 1)的THF(6mL)和水（2mL)溶液中室溫下加入LiOH· H20 (68mg, 1.62mmo 1)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，調(diào)pH至5，用20ml乙酸乙酯提取，硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去 固體，減壓除去易揮發(fā)物，得到白色固體705-3(265mg，78%收率）。.1^化31)111/2:406.1(1+ H) +。
[0348] CX13-705 的制備
[0349] C705-3(265mg，0.65mmol)的DMF(3mL)溶液中室溫下加入C105-7( 130mg, 0 · 72mmo 1), HBTU(300mg, 0 · 79mmo 1), HOBt (106mg, 0 · 79mmo 1)和DIEA(0 · 6mL)，室溫下反應(yīng) 4h，用20ml乙酸乙酯和10ml鹵水稀釋，分層，水相用乙酸乙酯提取(2 X20ml)，合并有機(jī)相， 硫酸鈉干燥，過(guò)濾除去固體，減壓除去易揮發(fā)物，層析柱純化得到白色固體CX13-705(90mg， 23%)〇
[0350] 4-^^(40011^,1^00)38.22(8,110,7.3^7.13(111,1010,4.80((1(1,1 = 8.8,4.8^, 1H)，4.57-4.48(m，2H) ,3.66-3.52(m，2H)，3.25(d，J = 4.84Hz，lH)，3.10(dd，J= 13.97， 4·57Ηζ，1Η)，2.94(d，J=5.10Hz，lH),2.66-2.82(m，6H)，2.02-2.16(m，2H);MS(ESI)m/z: 593.0(M+H)+〇
[0351] 實(shí)施例16
[0352] 化合物對(duì)蛋白酶體活性的抑制作用
[0353] 用純化的人源20S蛋白酶體進(jìn)行糜蛋白酶樣活性(CT-L)，肽基谷氨酰肽水解活性 (PGPH)和胰蛋白酶樣活性(T-L)活性的體外測(cè)定，20S蛋白酶體的濃度分別為2,4和8nmol/ 1^，分別用811(^;[1171-1^11-1^11-\%1-171-厶]\^(1〇41]1〇1/]^)，2-1611-1^11-6111-厶]\^(1〇41]1〇1/]^)和 Boc-Leu-Arg-Arg-AMC(50ymol/L)作為底物，反應(yīng)在包含0 · 5mM乙二胺四乙酸、0 · 001 %十二 烷基硫酸鈉(SDS)和0.05 % NP-40的25mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖溶液(pH7.5)中 進(jìn)行。蛋白酶體抑制劑的儲(chǔ)備液在二甲基亞砜(DMS0)中制備，在測(cè)試混合物中DMS0的最終 濃度是1%。室溫下反應(yīng)1小時(shí)。用熒光光度計(jì)檢測(cè)裂解出來(lái)的7-氨基-4-甲基香豆素?zé)晒?團(tuán)，從而測(cè)定蛋白酶體活性。IC5〇值是抑制劑對(duì)20S蛋白酶體活性的抑制達(dá)到50%時(shí)的濃度， 是抑制劑抑制活性的定量描述。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的化合物對(duì)蛋白酶體的抑制 活性見表1。
[0354] 實(shí)施例17
[0355] 化合物的水溶性
[0356] 化合物水溶性的測(cè)定方法如下：稱取l_5mg化合物至小瓶中，加入lmL緩沖溶液 (50mM檸檬酸鹽溶液，pH=4.0)，于25°C震搖24h，于lOOOrpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘。用0.45μπι過(guò) 濾膜過(guò)濾上清液，測(cè)定化合物的濃度。在某些實(shí)施例中，化合物的水溶性見表1。



[0361] 實(shí)施例18
[0362] 以本發(fā)明中所述的化合物為受試品以可耐受的劑量對(duì)小鼠給藥處理后血液中蛋 白酶體活性的抑制作用
[0363] 以溶媒(20 % (w/v)羥丙基-β-環(huán)糊精的1 OmM檸檬酸鈉溶液，pH= 3.5)或以本發(fā)明 中所述的化合物為受試品以可耐受的劑量對(duì)Balb/c小鼠給藥，溶媒通過(guò)靜脈注射給藥，化 合物通過(guò)靜脈注射（l〇mg/kg)或灌胃（30mg/kg)給藥。給藥后一小時(shí)，通過(guò)心臟穿刺采集全 血標(biāo)本注入含有肝素鈉的試管中，在4°C下于150xg離心5分鐘。離心出來(lái)的沉淀物用冰冷的 磷酸鹽緩沖生理鹽水清洗三次。每次將沉淀物回溶于lmL冷的磷酸鹽緩沖生理鹽水中，在4 °C下于6000xg離心10分鐘。最后一次清洗后，加入100yL裂解液(含有5mM EDTA的磷酸鹽緩 沖生理鹽水，pH 7.4)裂解1小時(shí)，然后在4°C下于6000xg離心10分鐘。上清液轉(zhuǎn)移至另一新 的試管內(nèi)，沉淀物棄之。用BCA方法測(cè)定細(xì)胞裂解物的濃度。10yg蛋白質(zhì)用來(lái)檢測(cè)CT-L的活 性，30yg蛋白質(zhì)用來(lái)檢測(cè)PGPH和T-L活性，分別加入succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC( 25μ mol/LhZ-leu-Leu-Glu-AMCXlOymol/I^SBoc-Leu-Arg-Arg-AMCXlOymol/LMtSCT-L、 PGPH或T-L活性測(cè)定的底物，混合液在37°C培養(yǎng)60分鐘，用熒光光度計(jì)在360/460nm波長(zhǎng)檢 測(cè)裂解出來(lái)的自由7-氨基-4-甲基香豆素?zé)晒鈭F(tuán)從而定量測(cè)定20S蛋白酶體中CT-L，PGPH或 T-活性。小鼠經(jīng)溶媒給藥處理后血液蛋白酶體的活性為百分之百;經(jīng)本發(fā)明的化合物給藥 處理后血液蛋白酶體的活性與溶媒組比較得到百分抑制率。蛋白酶體活性的抑制率見圖1。 如圖1所示，所測(cè)試的化合物對(duì)血液樣品中CT-L的活性有抑制作用。特別是，通過(guò)灌胃給藥 的CX13-603對(duì)血液樣品中CT-L的活性也有抑制作用;CX13-608能同時(shí)抑制血液樣品中蛋白 酶體的CT-L和T-L活性。
[0364] 實(shí)施例19
[0365] 本發(fā)明所述化合物對(duì)移植于裸鼠的人源腫瘤的抗腫瘤療效
[0366] 雌性小鼠 （NIH III H0裸鼠，購(gòu)自Charles River實(shí)驗(yàn)室，體重約20g，5_6周大)實(shí) 驗(yàn)期間養(yǎng)殖在籠子中。將含有3X 106人源結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)或1 X 107人源B淋巴細(xì)胞(RL) 的100yL磷酸鹽緩沖生理鹽水經(jīng)皮下注射到小鼠的右脅。人源結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)和人源B 淋巴細(xì)胞(RL)購(gòu)自ATCC?(HTB-38?和CRL38?)。當(dāng)HT-29腫瘤的平均尺寸達(dá)到約20-30mm3或RL腫瘤的平均尺寸達(dá)到約60-90mm3時(shí)，將患腫瘤的小鼠隨機(jī)分成不同的組別（每組7-10 個(gè)小鼠），所有的組別都有相同的腫瘤尺寸分布。對(duì)小鼠靜脈注射溶媒（10% (w/v)羥丙基- 環(huán)糊精的10mM梓檬酸溶液，pH=4.0)或配制在溶媒中的CX13-103溶液，每周第1天，第2天 和第5天給藥三次，共4-5周。每周用卡尺測(cè)量腫瘤尺寸2-3次，腫瘤體積=長(zhǎng)X寬2/2。使用 雙方向方差檢驗(yàn)(2-way AN0VA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如圖2A和2B所示，CX13-103可以顯著 抑制腫瘤生長(zhǎng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.具有式（I)所示結(jié)構(gòu)的化合物，及其對(duì)映體，非對(duì)映體，互變異構(gòu)體，和藥物可接受的 鹽或溶劑化物或前藥：其中Ri是-(CH2)m-R4,其中m=0 or 1，R4選自下述基團(tuán)：Ci-1Q烷基，其中 任一Rs獨(dú)立的為Η，羥基，Cko烷基，Cko烷氧基，Cko羥烷基，Cko烷氧基烷基，NH2， NHR6，-R7-O (C = 0) -Rs，-R7- (C = 0) X-Rs，-R7-OPO3M1M2， 其中R6是1()烷基，苯基，-(C=0)&-6烷基，或_(C=0)苯基； 任一 R?和R9獨(dú)立的為不存在，或是亞烴基； 任一Rs獨(dú)立的為Η,羥基，金屬離子，Ci-?ο烷基，_Ci-?ο亞經(jīng)基，-NRiqRii，或-ΟΡΟ3Μ1Μ2， 任一 Rio和Rn獨(dú)立的為烷基或取代的烷基； 任一 Μι, M2獨(dú)立的為Η，或金屬離子； X為不存在，或是Ο; Υ為不存在，或是-(C = 0)_; Z為不存在，或是0。 任一R2和R3獨(dú)立的選自下述基團(tuán)：Cno烷基，Cko烯烴，Cko羥烷基，Cm烷氧烷基，芳 基，Cko芳烷基，雜芳基，Cko雜芳烷基，雜環(huán)基，Cho雜環(huán)烷基，碳環(huán)基和Cho碳環(huán)醇烷基， 其中當(dāng)Ri是牛且R2是異丁基時(shí)，R3不是4_吡啶基甲基。2. 權(quán)利要求1中的化合物，有式(II)所示的的結(jié)構(gòu)：3. 權(quán)利要求書1或2中的化合物，其中R4選自含以下基團(tuán)： 甲基4. 權(quán)利要求書1或2中的化合物，其中烷基，Cm燒氧烷基，芳香基，雜環(huán)芳基， Cko芳烷基或&-1()雜環(huán)芳烷基。5. 權(quán)利要求4中的化合物，其中R2是甲基-氧基-甲基，4-吡啶甲基，異丁基，芐基或4-噻 唑基-甲基。6. 權(quán)利要求1或2中的化合物，其中R^Cho烷基，芳香基，雜環(huán)芳基，Cho芳烷基或Cho 雜環(huán)芳烷基。7. 權(quán)利要求6中的化合物，其中R3是異丁基，4-吡啶甲基或芐基。8. 下面所示結(jié)構(gòu)式的化合物和其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥：9. 由權(quán)利要求1-8中的任一化合物和藥學(xué)上可接受的載體組成的藥物組合物。10. 特異性地抑制20S蛋白酶體催化活性的方法，包括給予醫(yī)療上有效劑量的權(quán)利要求 1-8中的化合物。11. 權(quán)利要求10中的方法，其中20S蛋白酶體的CT-L活性和T-L活性可以同時(shí)被抑制。12. 蛋白酶體相關(guān)的疾病或病癥的治療方法，包括給予醫(yī)療上有效劑量的權(quán)利要求1-8 中的化合物。13. 權(quán)利要求12中的方法，其中化合物通過(guò)注射給藥。14. 權(quán)利要求13中的方法，其中化合物通過(guò)以下途徑給藥:皮下給藥，靜脈給藥，肌肉給 藥，動(dòng)脈給藥，鞘膜給藥，囊內(nèi)給藥，眶內(nèi)給藥，心臟內(nèi)給藥，真皮內(nèi)給藥，腹膜內(nèi)給藥，經(jīng)氣 管給藥，表皮給藥，關(guān)節(jié)內(nèi)給藥，囊下給藥，蛛網(wǎng)膜下給藥，脊柱內(nèi)給藥，胸骨內(nèi)給藥，或通過(guò) 滴注給藥。15. 權(quán)利要求12中的方法，其中化合物通過(guò)非注射途徑給藥。16. 權(quán)利要求15中的方法，其中化合物通過(guò)以下途徑給藥：□服，腸道，口腔，鼻，鼻內(nèi)， 經(jīng)粘膜，表皮，貼膏劑，真皮，眼藥，肺部，舌下，直腸，陰道或局部給藥。17. 權(quán)利要求1 -8中任一化合物在制備用于治療與20S蛋白酶體相關(guān)的疾病的藥物中的 用途。18. 權(quán)利要求12中的方法或者權(quán)利要求17中的應(yīng)用，其中20S蛋白酶體相關(guān)的疾病或者 病癥包括癌癥，神經(jīng)中毒/退化疾病，阿茲海默癥，缺血性疾病，炎癥，免疫相關(guān)的疾病，HIV 感染，器官移植排斥，感染性休克，抗原遞呈抑制，病毒基因表達(dá)減少，寄生蟲感染，酸中毒 相關(guān)的疾病，黃斑變性，肺部疾病，肌肉萎縮癥，纖維化疾病，骨骼和毛發(fā)生長(zhǎng)疾病。
【文檔編號(hào)】A61P25/28GK105960399SQ201580002532
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月14日
【發(fā)明人】楊金夫, 岑堅(jiān), 范曉青
【申請(qǐng)人】寧波圣健生物醫(yī)藥科技有限公司