一種雙功能酸性脲酶基因及其表達(dá)與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙功能酸性脲酶基因及其表達(dá)與應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的雙功能酸性脲酶是來(lái)自于普羅威登斯菌(Providencia sp.LBBE)，基因排列順序?yàn)镈、A、B、C、E、F、G，能夠耐受高濃度乙醇的同時(shí)高效降解氨基甲酸乙酯和尿素。本發(fā)明利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)/pRSFDuet?1，成功實(shí)現(xiàn)了具有雙功能酸性脲酶基因的高效表達(dá)，以EC為底物時(shí)酶活達(dá)到0.39U/ml，以尿素為底物時(shí)酶活達(dá)到4.82U/ml。重組酶在20％的乙醇中37℃保留4h，以EC為底物時(shí)仍可保留其93％以上的活性。本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的雙功能酸性脲酶是一種新的脲酶，所制備的重組酶為實(shí)現(xiàn)黃酒中EC及尿素的消除，實(shí)現(xiàn)EC水解酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。CCTCC NO: M 201554120150915
【專利說(shuō)明】
一種雙功能酸性脲酶基因及其表達(dá)與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種雙功能酸性脲酶基因及其表達(dá)與應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脲酶(Urease，EC 3.5.1.5)，廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等中，其能專一性 的催化尿素水解產(chǎn)生兩分子氨和一分子碳酸。脲酶是世界上首次成功獲得的結(jié)晶態(tài)的酶， 它于1926年由Summer首次從刀豆中提取出。根據(jù)脲酶作用的最適pH值，可將脲酶分為酸性 脲酶、中性脲酶和堿性脲酶。
[0003] 氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate或Urethane，簡(jiǎn)稱EC)，具有遺傳毒性及致癌性， 廣泛存在于多種發(fā)酵食品（如醬油、食醋、泡菜)和酒精飲料(如黃酒、白酒、葡萄酒等）中。研 究證實(shí)發(fā)酵食品（如黃酒、醬油等）中尿素是EC形成的主要前體物質(zhì)，它和乙醇自發(fā)的反應(yīng) 生成EC，從而嚴(yán)重影響人類的健康。雙功能酸性脲酶可以高效消除發(fā)酵食品（如酒精類飲 料）中的尿素的同時(shí)也可以高效降解EC，從而可以實(shí)現(xiàn)從源頭到終端對(duì)發(fā)酵食品(尤其是酒 精類飲料）中EC的消除。
[0004] 本發(fā)明所獲得的雙功能酸性脲酶其在高濃度乙醇(20%v/v)中仍具有高效尿素及 EC降解酶活力，使得其在黃酒中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，其基因序列的解析為脲酶及EC降解 酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明的脲酶基因序列由結(jié)構(gòu)基因及其輔助基因構(gòu)成，結(jié)構(gòu)基因編脲酶蛋白，其 輔助基因起到輔助結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，對(duì)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行修飾（比如向催化活性中心 傳遞金屬離子)從而形成成熟的脲酶。不同來(lái)源的脲酶其單體結(jié)構(gòu)不同。其中來(lái)源于細(xì)菌的 脲酶通常由三個(gè)不同的亞基A、B、C構(gòu)成多聚體，它的催化活性中心位于C亞基。本發(fā)明中所 獲得的脲酶由三個(gè)結(jié)構(gòu)基因 ureA、ureB、ureC(分別編碼亞基A、B、C)及4個(gè)輔助基因 ureD、 ureE、ureF、ureG構(gòu)成，其催化活性中心位于C亞基，最終成熟的蛋白質(zhì)是A、B及C三個(gè)亞基組 成的三聚體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能耐受高濃度乙醇同時(shí)高效降解氨基甲酸乙酯 和尿素的雙功能酸性脲酶及其基因序列。
[0007] 所述雙功能酸性脲酶的結(jié)構(gòu)亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列：（a)分別如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID N0.4所示；（b)是在(a)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)取代、缺 失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由 (a)衍生的蛋白質(zhì)，比如在C端或N端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基、添加融合標(biāo)簽等， 雖然在形式上進(jìn)行修飾但不改變蛋白的酶活。
[0008] 所述雙功能酸性脲酶的結(jié)構(gòu)亞基按照UreA、UreB、UreC依次排列。
[0009] 所述雙功能酸性脲酶來(lái)源于普羅威登斯菌(Providencia sp.LBBE)，Providencia sp.LBBE已于2015年9月15日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCM 2015541。
[0010] 所述雙功能酸性脲酶由三個(gè)結(jié)構(gòu)基因 ureA、ureB、ureC(分別編碼亞基A、B、C)及4 個(gè)輔助基因 ureD、ureE、ureF、ureG構(gòu)成，這些基因在基因組上的排布順序?yàn)閡reD、ureA、 ureB、ureC、ureE、ureF、ureG 〇
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述雙功能酸性脲酶具有SEQ ID NO: 1所示的核苷 酸序列。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述雙功能酸性脲酶基因序列，是通過(guò)對(duì)不同來(lái)源 的脲酶結(jié)構(gòu)基因保守性分析，通過(guò)保守性位點(diǎn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以普羅威登斯菌 (Providencia sp.LBBE)基因組為模板進(jìn)行PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，而后根據(jù)所測(cè)序列利 用染色體步移方法最終得到完整的脲酶序列。
[0013] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)所述雙功能酸性脲酶的重組質(zhì)粒或重組菌。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的重組質(zhì)粒，可以是市售的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體 等經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)手段將所述雙功能酸性脲酶的基因序列連接入而構(gòu)建而成，其中優(yōu)選 pRSFDuet-1。
[0015]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組菌，是將SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列連 接到表達(dá)質(zhì)粒載體上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，然后將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后得到的。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主菌，可以是大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大 芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸乳球菌或酵母菌中的任意一種，其中優(yōu)選大腸桿菌BL21DE3。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述宿主菌的構(gòu)建具體是：（1)獲取核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的脲酶基因 urePS; (2)將目的基因 urePS連接到載體pRSFDuet-Ι得到重組質(zhì)粒 pRSFDuet-urePS;(3)將步驟2獲得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21DE3中獲得重組大腸桿菌 BL21DE3(pRSFDuet-urePS)，雙功能酸性脲酶基因在重組菌中表達(dá)受T7啟動(dòng)子調(diào)控；（4)利 用重組菌BL21DE3(pRSFDuet-urePS)發(fā)酵生產(chǎn)雙功能酸性脲酶。
[0018] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)所述雙功能酸性脲酶的方法，是將重組菌 E. coli BL21 (DE3)/pRSFDuet-urePS培養(yǎng)到一定菌體濃度(如0D6(X) = 0 · 6-0 · 8)，添加誘導(dǎo)劑 (如IPTG最終濃度為ImM)，培養(yǎng)一定時(shí)間（如10-30h)，高效表達(dá)雙功能酸性脲酶。
[0019] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種降解尿素和氨基甲酸乙酯的方法，是利用本發(fā)明 所述的雙功能酸性脲酶來(lái)降解尿素和氨基甲酸乙酯。
[0020] 所述雙功能酸性脲酶含有以下特征之一 ：（a)結(jié)構(gòu)亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸 序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID勵(lì).4所示；（13)結(jié)構(gòu)亞基的氨基酸序列是在 (1)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的，且編碼具有 氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由（a)衍生的蛋白質(zhì)；（c)具有SEQ ID N0:1所示的核苷 酸序列。
[0021] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述雙功能酸性脲酶，是通過(guò)從普羅威登斯菌 (Providencia sp.LBBE)基因組上克隆獲得雙功能酸性脲酶基因，然后將雙功能酸性脲酶 基因在宿主菌中進(jìn)行表達(dá)而得到的。
[0022] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種所述雙功能酸性脲酶的純化方法。
[0023] 所述純化方法，是利用重組菌BL21DE3(pRSFDuet-urePS)發(fā)酵產(chǎn)酶，然后超聲破碎 菌體得到粗酶液;粗酶液依次經(jīng)乙醇分級(jí)沉淀、第一次離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾 層析、第二次離子交換層析處理。
[0024] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述乙醇分級(jí)沉淀，是30-60%乙醇沉淀;所述第一 次離子交換層析為DEAE離子交換層析，第二次離子交換層析為MonoQ離子交換層析;疏水層 析為phenyl疏水作用層析。
[0025] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述雙功能酸性脲酶在消除黃酒等發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙 酯和尿素方面的應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明的有益效果：
[0027] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的雙功能酸性脲酶基因，該酶在高濃度乙醇（20 % v/v)中仍 具有高效尿素及EC降解酶活力，可以應(yīng)用于降解酒精飲料的尿素及氨基甲酸乙酯。本發(fā)明 的雙功能酸性脲酶的基因簇排列順序?yàn)椹?、六』?：4、？、6。本發(fā)明利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) BL21(DE3)/pRSrouet-l，成功實(shí)現(xiàn)了具有雙功能酸性脲酶基因的高效表達(dá)，以EC為底物時(shí) 酶活達(dá)到0.39U/ml，以尿素為底物時(shí)酶活達(dá)到4.82U/ml。重組酶在20%的乙醇中37°C保留 4h，以EC為底物時(shí)仍可保留其93%以上的活性。本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的雙功能酸性脲酶是一種新 的脲酶，所制備的重組酶為實(shí)現(xiàn)黃酒中EC及尿素的消除，實(shí)現(xiàn)EC水解酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定了 基礎(chǔ)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。
[0028]生物材料保藏
[0029] 一株普羅威登斯菌，分類學(xué)命名為Providencia sp.LBBE，已于2015年9月15日保 藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC N0: M2015541。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1:普羅威登斯菌(Providencia sp · LBBE)雙功能脲酶urePS基因簇排列順序；
[0031] 圖2:重組表達(dá)質(zhì)粒pRSFDuet-urePS的構(gòu)建示意圖；
[0032] 圖3:重組菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS表達(dá)的雙功能酸性脲酶蛋白純化 過(guò)程SDS-PAGE蛋白電泳圖；其中1為重組菌誘導(dǎo)后細(xì)胞破壁上清液，2為30-60 %乙醇沉淀后 酶液，3為DEAE離子交換層析酶液，4為phenyl疏水作用層析酶液，5為凝膠過(guò)濾層析酶液，6 為MonoQ離子交換層析酶液；
[0033]圖4:基因工程菌株表達(dá)的雙功能脲酶以EC為底物時(shí)的乙醇耐受性圖譜。
【具體實(shí)施方式】 [0034]材料與方法
[0035] LB培養(yǎng)基:酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L(固定培養(yǎng)基另加1.5 %的瓊脂 粉）
[0036] TB培養(yǎng)基：將下列組分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml。各 組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60°C，再加100ml滅菌的0 · 17mmol/L KH2P〇4,0 · 72mmol/L K2HP〇4的溶液。
[0037] 所使用的限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司，膠回收試劑盒購(gòu)自TAKARA公司，具體 的反應(yīng)條件和使用方法參考其說(shuō)明書?；蚪M抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司，使用參考其說(shuō)明 書。
[0038] 下面的商品化質(zhì)粒和大腸桿菌用于基因克隆和表達(dá)：
[0039] pRSFDuet_l(Novagen，美國(guó)）
[0040] E.coli BL21(DE3)(Novagen，美國(guó)）
[0041] 氯化銨標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
[0042] 用超線水配制0 · lmmol/L、0 · 2mmol/L、0 · 3mmol/L、0 · 4mmol/L、0 · 5mmol/L的NH4+標(biāo) 準(zhǔn)溶液。用移液管準(zhǔn)確移取lmL NH4+標(biāo)準(zhǔn)梯度液分別置于順序編號(hào)的lOmL比色管中。37°C下 恒溫保溫30min，立即用吸lmL終止劑于比色管中，振蕩混勻。再依次加入lmL顯色劑I和顯色 劑II，強(qiáng)烈振蕩，使之充分混勻，反應(yīng)20min。超純水定容至10mL，在625nm下比色測(cè)定0D值， 以0D值為縱坐標(biāo)，NH4+梯度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0043]脲酶或氨基甲酸乙酯水解酶酶活測(cè)定方法：
[0044] 取兩支10mL比色管，分別加入lmL酶液和lmL滅活的酶液。然后在兩管中分別加入 lmL 3%尿素或EC(用20mM pH 4.5的檸檬酸緩沖液配制），在37°(：恒溫水浴箱中反應(yīng)3〇1^11 后，在兩管各加入lmL終止劑（10%三氯乙酸），混勻后加入lmL的顯色劑I(15g苯酚和0.625g 亞硝基鐵氰化鈉用超純水定容至25〇1^)和11^顯色劑11(13.1258似0!1和7.5111〇^(：10用超 純水定容至250mL)，強(qiáng)烈震蕩，繼續(xù)在37°C恒溫水浴箱中保溫20min后取出，用超純水稀釋 到10mL，625nm處比色，測(cè)定0D值，計(jì)算酶活(采用氯化銨繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）。
[0045] 脲酶酶活單位定義:在常壓，20mM pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液及37°C條件下， 每分鐘降解尿素生成2μπι〇1 NH4+所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。
[0046]氨基甲酸乙酯水解酶酶活單位定義:在常壓，20mM ρΗ4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 及37°C條件下，每分鐘降解EC生成Ιμπιο? ΝΗ4+所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。
[0047]實(shí)施例1:雙功能酸性脲酶urePS基因的鑒定及克隆
[0048] 按照細(xì)菌基因組提取試劑盒（OMEGA)使用說(shuō)明提取普羅威登斯菌（Providencia sp.LBBE)基因組DNA。根據(jù)正向引物F及反向引物R，正向引物加上BamM酶切位點(diǎn)及其保護(hù) 堿基，反向引物加上Xho頂每切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基，如下：
[0049] 正向引物F:5'-CGCGGATCCGATGTCTGATTTTTCAGGATCAGGCTG-3'（核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示）
[0050] 反向引物R:5'-CCGCTCGAG TTAACGTCTTAACATGCCTTTATC-3'（核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 6所示）
[0051 ]以地衣芽孢桿菌基因組DNA為模板，上述特異性引物為引物，對(duì)urePS基因（核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：按照PrimerSTAR HS DNA Polymerase (TAKARA)試劑盒說(shuō)明書配制50μ1反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件為:98°C30s 1個(gè)循環(huán)，98°C10s，54°C 10s，72°C5min 48s，30個(gè)循環(huán)，72°C 10min-個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn) 行切膠回收，回收約5. lkb的DNA片段(如圖1所示），回收方法參照膠回收試劑盒(TAKARA)說(shuō) 明書進(jìn)行。回收產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)定核苷酸序列。
[0052]實(shí)施例2:表達(dá)載體和表達(dá)體系的構(gòu)建
[0053] 實(shí)施例1方法所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和Xho I雙酶切，切膠回收后，與經(jīng)BamHI和 Xho I雙酶切的pRSFDuet-Ι質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)入E.coli BL21DE3感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有50yg/ ml卡那霉素的LB固體平板上，37°C培養(yǎng)12h，用正向引物F及反向引物R，PCR鑒定陽(yáng)性克隆。 將菌落PCR鑒定正確的陽(yáng)性克隆接入含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì) 粒，進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證。經(jīng)BamHI和Xho I雙酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒(如圖2所示)送往上海生 工生物公司測(cè)序。由此得到重組脲酶的外源表達(dá)體系BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS。
[0054] 實(shí)施例3:雙功能脲酶的重組表達(dá)
[0055] 挑取基因工程菌BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS單菌落，接種于25mL、含有50yg/mL卡 那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。第二天按1%接種量轉(zhuǎn)接至含有50yg/mL卡 那霉素的TB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌濃0D 6Q() = 0 · 6時(shí)，加入IPTG至終濃度為lmmol/L誘導(dǎo)，同時(shí)添 加終濃度為2mM的NiCl2，30°C培養(yǎng)10h，離心收集菌體，用20mM pH4.5檸檬酸-檸檬酸緩沖液 重懸細(xì)胞，通過(guò)超聲破壁、離心取上清，測(cè)定酶活，酶活力為：以EC為底物時(shí)酶活達(dá)到0.39U/ ml，以尿素為底物時(shí)酶活達(dá)到4.82U/ml。
[0056] 實(shí)施例4:重組雙功能脲酶的純化
[0057] (1)基因工程菌BL21 (DE3)/pRSFDuet-urePS粗酶液的制備
[0058] 挑取基因工程菌BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS單菌落，接種于25mL、含有50yg/mL卡 那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。第二天按1%接種量轉(zhuǎn)接至含有50yg/mL卡 那霉素的TB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌濃0D 6Q() = 0 · 6時(shí)，加入IPTG至終濃度為lmmol/L誘導(dǎo)，同時(shí)添 加終濃度為2mM的NiCl230°C培養(yǎng)10h，離心收集菌體，并重懸于50mM pH4.5的檸檬酸緩沖液 中，菌體終濃度為0. lg/ml。將菌體置于冰水浴中進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎的條件為：功率 70W，工作2s間隔4s，重復(fù)工作30min，至菌體溶液變清澈為止。將破碎液于4°C12000rpm離心 10min，轉(zhuǎn)移上清液于干凈的離心管中低溫保存。
[0059] (2)乙醇分級(jí)沉淀
[0060]將冷乙醇緩慢加入到粗酶液中，并不斷攪拌至飽和度為30%，4°C靜置4h， lOOOOrpm離心20min棄沉淀取上清，并向上清中繼續(xù)加入冷乙醇至飽和度為60 %，如上述條 件進(jìn)行沉淀離心棄上清取沉淀。然后將蛋白沉淀溶解于適量20mmol · Ι^ρΗ 7.0的磷酸鹽緩 沖溶液中，用透析袋在相同的緩沖溶液中對(duì)蛋白樣品透析。
[0061 ] (3)離子交換層析
[0062] 起始緩沖液A:20mmol · I/bH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液Β:含lmol · 1/ SaCl的20mmol.L-bH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。采用HiTrap DEAE HL 5mL陰離子交換柱，先 用起始緩沖液平衡柱子，流速為5mL · mirT1，上樣后用洗脫緩沖液梯度洗脫蛋白，采用梯度 20%，40 %，60 %，80 %，100 % B液。合并活性管并透析除鹽。
[0063] (4)疏水層析
[0064]起始緩沖液C:20mmol · PpH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液D:含lmol · I/1 (NH4)2S〇4的20mmol · I^pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。向蛋白樣品中緩慢加入固體硫酸銨至終 濃度為lmol .L-S經(jīng)0.22μπι濾膜過(guò)濾，上樣于提前經(jīng)D液平衡的Phenyl HP 5mL疏水柱，采用 梯度洗脫1〇〇%〇,80%0,60%0,40%0,20%0，流速為51111^1^11-1。分別測(cè)定收集各管酶活 性，合并活性管并透析除鹽。
[0065] (5)凝膠過(guò)濾層析
[0066] Superdex-200 prep grade凝膠柱，進(jìn)樣量為0.5mL，柱體積120mL，緩沖液為 20mmol · L-bH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，流速lmL · min-、收集出峰處，測(cè)定不同出峰處酶 活，合并有酶活各管，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0067] (6)離子交換層析
[0068] 起始緩沖液E:20mmol · I/bH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液F:含lmol · 1/ SaCl的20臟〇1·!/bH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。經(jīng)上步純化的蛋白上樣于Mono Q 5/50GL離 子柱，采用線性洗脫方式，流速為lmL · mirT1。測(cè)定各管收集液酶活，合并有活性各管。
[0069]最終純化效果如圖3所示。
[0070]實(shí)施例5:雙功能脲酶以EC為底物時(shí)的乙醇耐受性
[0071] 將BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS發(fā)酵獲得的純化的脲酶，置于20%乙醇中，37°C保 溫若干小時(shí)，每隔一小時(shí)取一次樣測(cè)定酶活，按照材料與方法中所述氨基甲酸乙酯水解酶 的酶活測(cè)定方法，以未經(jīng)20%乙醇處理的酶液活性作為100%，測(cè)定結(jié)果如圖4所示。
[0072]圖4顯示，酶液在20 %的乙醇中37 °C保溫2h后依然可以保持其93 %及以上的活性。 由此說(shuō)明，此脲酶以EC為底物時(shí)具有高的乙醇耐受性，對(duì)于黃酒中氨基甲酸乙酯的消除具 有巨大的應(yīng)用價(jià)值。
[0073]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雙功能酸性脲酶，其特征在于，所述雙功能酸性脲酶至少含有以下特征之一： (1)結(jié)構(gòu)亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID NO.4所示；（2)結(jié)構(gòu)亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)取代、缺失或者 添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由（1)衍生 的蛋白質(zhì)；（3)具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；（4)在SEQ ID NO. 1基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)缺失、 突變修飾、同源率高于90%且具有脲酶及氨基甲酸乙酯降解酶功能的核苷酸序列。2. 權(quán)利要求1所述的雙功能酸性脲酶，其特征在于，編碼所述雙功能酸性脲酶的整個(gè)基 因簇的基因在基因組上的排布順序?yàn)閡reD、ureA、ureB、ureC、ureE、ureF、ureG。3. 含有權(quán)利要求1-2任一所述的雙功能酸性脲酶編碼基因的重組菌。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌是通過(guò)從Providencia sp.LBBE基因組上克隆獲得雙功能酸性脲酶的編碼基因，然后將雙功能酸性脲酶的編碼基 因在宿主菌中進(jìn)行表達(dá)而得到的。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于，所述宿主菌是大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、 巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸乳球菌或酵母菌中的任意一種。6. -種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述雙功能酸性脲酶的方法，其特征在于，所述方法是將表達(dá)權(quán) 利要求1所述雙功能酸性脲酶的重組菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS培養(yǎng)到一定菌 體濃度，添加誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)一定時(shí)間。7. -種權(quán)利要求1所述雙功能酸性脲酶的純化方法，其特征在于，所述方法利用重組菌 BL21DE3(pRSFDuet-urePS)發(fā)酵產(chǎn)酶，然后超聲破碎菌體得到粗酶液;粗酶液依次經(jīng)乙醇分 級(jí)沉淀、第一次離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾層析、第二次離子交換層析處理。8. 權(quán)利要求1所述雙功能酸性脲酶在降解氨基甲酸乙酯和/或尿素方面的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求1所述雙功能酸性脲酶在發(fā)酵食品方面的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵食品為酒精飲料。
【文檔編號(hào)】C12N9/80GK105950596SQ201610439700
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月20日
【發(fā)明人】康振, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 劉慶濤
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)