一種賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核重組表達與制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核重組表達與制備方法。該制備方法包括：向受體大腸桿菌細胞中導入氨基酸序列為序列2的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因，得到重組大腸桿菌細胞；對其進行誘導表達，收集并破碎重組大腸桿菌細胞，得到包含體；然后依次進行變性、復性、激活、純化，得到重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶。采用本發(fā)明的制備方法制備的重組Lys?C蛋白酶具有高的酶活力和較高的尿素耐受。本發(fā)明的制備方法具有酶、特異性好、無動物來源病毒等有優(yōu)點，生產(chǎn)與制備工藝簡單、成本低，可以應用于生物制藥和蛋白質(zhì)組學研究。
【專利說明】
一種賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核重組表達與制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核重組表達與制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶1^871611(1〇口6口1^(^86化0 3.4.21.50)可以特異性在蛋白底物 C端的賴氨酸進行消化，目前報道的Lysyl endopeptidase主要有三種，分別是來源于 Achromobacter lyticus的Achromobacter protease I (API)，來源于Lysobacter enzymogenes的lysyl endopeptidase和來源于Pseudomonas aeruginosa的preL〇對API(A-LEP)的研究表明，API在表達的時候以酶原的形式表達，其完整序列包括20個氨基酸的信號 肽序列，N端185個氨基酸的pro-peptide和C端的180個氨基酸的extension peptide以及由 268個氨基酸組成的成熟的API API比trypsin有更高的活性、更廣泛的pH耐受和表面活性 劑耐受等特點。這些特點使API成為蛋白序列分析、蛋白組學研究和生物制藥工藝的重要工 具。
[0003]對來源于Lysobacter enzymogenes的賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶lysyl endopeptidase (Le-LEP)進行序列分析表明，Le-LEP具有與A-LEP相同的pro-peptide和extension peptide組成形式，但是其表達水平非常低。至今尚無基因工程重組表達Le-LEP的成功報 道。利用傳統(tǒng)菌種篩選方法可以獲得高表達菌種，但是仍無法滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。
[0004] 來源于Pseudomonas aeruginosa的preL的基因構(gòu)造跟前兩種蛋白有所不同，其完 整序列包括24個氨基酸的信號肽序列，N端187個氨基酸的pro-peptide和251個氨基酸組成 的成熟的preL。雖然三種來源的Lysyl endopeptidase都實現(xiàn)了商品化銷售，但因為preL具 有更為優(yōu)越的表面活性劑以及高達8M尿素的耐受能力，因此在蛋白組學研究中越來越受到 研究者的重視。但與Le-LEP類似，至今尚無基于原核表達體系進行preL重組表達并進行蛋 白復性的成功報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是利用分子生物學技術(shù)，采用大腸桿菌作為宿主細 胞，構(gòu)建Lysyl endopeptidase(Lys-C) (preL)的表達載體，并優(yōu)化蛋白復性和純化方法，獲 得均一、高活性、高特異性的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的方 法。
[0007] 本發(fā)明所提供的制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的方法，具體可包括如下步驟：
[0008] (1)向受體大腸桿菌細胞中導入氨基酸序列如序列表中序列2所示的重組賴氨酰 肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因，得到重組大腸桿菌細胞；
[0009] (2)對所述重組大腸桿菌細胞進行誘導表達后，收集所述重組大腸桿菌細胞;破碎 所述重組大腸桿菌細胞，得到包含體；
[0010] (3)對所述包含體進行變性，得到變性后的樣品；
[0011] (4)將所述變性后的樣品進行復性，得到復性后的樣品；
[0012] (5)將所述復性后的樣品進行激活，得到有活性的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品；
[0013] (6)對所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品進行純化，得到純化后的重組賴氨酰肽鏈 內(nèi)肽酶；
[0014] 在步驟(4)中，所述復性在復性緩沖液中進行，所述復性緩沖液的pH值為9.0-10.0 (如pH值為10)，所述復性緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨 基甲烷、胱氨酸、半胱氨酸和尿素;所述三羥甲基氨基甲烷在所述復性緩沖液中的濃度為5-50mM，所述胱氨酸在所述復性緩沖液中的濃度為0.5-2mM，所述半胱氨酸在所述復性緩沖液 中的濃度為3-5mM，所述尿素在所述復性緩沖液中的濃度為0.4-2M。
[0015] 更加具體的，在本發(fā)明的一個實施例中，所述所述復性緩沖液的pH值為10.0,所述 復性緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基甲烷、胱氨酸、半 胱氨酸和尿素;所述三羥甲基氨基甲烷在所述復性緩沖液中的濃度為20mM，所述胱氨酸在 所述復性緩沖液中的濃度為ImM，所述半胱氨酸在所述復性緩沖液中的濃度為3mM，所述尿 素在所述復性緩沖液中的濃度為2M。
[0016] 在步驟(5)中，所述激活為將所述復性后的樣品調(diào)pH值為5.5-9.5(如7.0-8.0,再 如7.5)，于25°C靜置1-6小時(如3-6小時，再如6小時）。
[0017] 在步驟(6)中，所述純化為將所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品依次進行硫酸銨沉 淀、金屬離子親和層析、超濾濃縮和凝膠過濾層析；
[0018]所述金屬離子親和層析采用的層析介質(zhì)為Chelating FF(金屬螯合高流速瓊脂糖 微球)或者Chelating HP(金屬螯合高分辨瓊脂糖微球）；所述凝膠過濾層析采用的層析介 質(zhì)為Sephacryl S-100(丙稀葡萄糖凝膠S-100)。
[0019] 其中，在進行所述硫酸銨沉淀前還可包括對所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品進 行-20 °C凍融12-16h (過夜，具體如14h)的步驟。
[0020] 在本發(fā)明中，所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因具體可是如下a)或b)或c)的 核酸分子：
[0021] a)其編碼序列如序列表中序列1所示的DNA分子；
[0022] b)其編碼序列是將序列表中序列1中的T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA分 子；
[0023] c)在嚴格條件下與a)限定的DNA分子雜交且編碼序列表中序列2所示的重組賴氨 酰肽鏈內(nèi)肽酶的DNA分子。
[0024] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法， 對所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因序列進行突變，那些經(jīng)過人工修飾的，與所述重 組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因序列具有75%或者更高同一性且具有相同的功能，均是衍 生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0025] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明序列1所示的DNA分子具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一 性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個 序列之間的同一性可以用百分比（％ )表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0026] 所述嚴格條件可為在2 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下雜交并洗膜2次，每次 5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次15min。
[0027] 在本發(fā)明中，序列表中序列1所示的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因是為經(jīng)過 密碼子優(yōu)化的基因；所述優(yōu)化為在不改變野生型賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的氨基酸序列的前提 下，將其密碼子替換為大腸桿菌偏好(高頻使用）的密碼子。所述優(yōu)化還包括對賴氨酰肽鏈 內(nèi)肽酶的基因序列的其他改造，以適合在大腸桿菌中表達。本發(fā)明中使用的術(shù)語"偏好的密 碼子"具有本領(lǐng)域公知的含義，也稱為密碼子的偏好性(Codon Preference)，是指某些生物 體更偏愛使用某些同義三聯(lián)密碼子(即編碼相同氨基酸的密碼子）。
[0028] 在步驟（1)中，所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因是通過重組表達載體的形 式導入所述受體大腸桿菌細胞中的。更加具體的，所述重組表達載體為將序列表中序列1的 第502-1818位所示DNA片段替換pET-32a( + )載體的EcoR I/Xho I的識別序列間的DNA片段 后得到的重組質(zhì)粒。
[0029]在本發(fā)明中，所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0030] 在所述方法中，所述金屬離子親和層析的洗脫程序具體可如下：1)用平衡液與洗 脫緩沖液的混合液進行咪唑線性洗脫，共洗脫5個柱體積，在所述5個柱體積內(nèi)，咪唑在所述 混合液中的濃度由0M線性升至0.01M;2)用所述平衡液與所述洗脫緩沖液的混合液進行咪 唑線性洗脫，共洗脫10個柱體積，在所述10個柱體積內(nèi)，咪唑在所述混合液中的濃度由 0.01M線性升至0.5M。所述平衡液由溶劑和溶質(zhì)組成；溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為：20mM Tris，2M NaCl，pH 7.5。所述洗脫緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成；溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為： 20mMTris，2M NaCl，0.5M咪唑，ρΗ7·5。
[0031] 在本發(fā)明的一個實施例中，進行所述金屬離子親和層析時采用的親和柱的柱體積 為5ml。在進行上柱前還包括采用所述平衡液液對所述層析柱進行平衡的步驟。
[0032] 在所述方法中，所述凝膠過濾層析所用層析柱的柱長度和柱內(nèi)直徑比為165:8(如 33cm: 1.6cm);所述凝膠過濾層析所采用的洗脫液的pH值為3-4,所述洗脫液由溶劑和溶質(zhì) 組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為醋酸和棉籽糖，所述醋酸在所述洗脫液中的濃度為50mM， 所述棉籽糖在所述洗脫液中的濃度為6.7mg/mL。
[0033]在本發(fā)明的一個實施例中，所述凝膠過濾層析所用層析柱具體為GE Healthcare 公司生產(chǎn)的"XK 16X40,柱高：33mm"柱子。在進行上柱前還包括采用所述凝膠過濾層析所 采用的洗脫液對所述層析柱進行平衡的步驟。進行所述凝膠過濾層析時的上樣量為2mL，層 析流速3mL/min。
[0034] 在所述方法中，進行所述金屬離子親和層析和所述凝膠過濾層析時，均是收集采 用SDS電泳檢測在約28KD的位置上出現(xiàn)目的條帶的洗脫峰，進行后續(xù)操作。
[0035] 在所述方法中，所述硫酸銨沉淀的步驟具體可為：1)在所述激活后的樣品中加入 固體硫酸銨至60 %飽和濃度，4 °C攪拌直至硫酸銨完全溶解（1小時），在冰上沉淀蛋白4小 時;2)離心收集沉淀蛋白（如4000rpm離心40分鐘）。
[0036] 在所述方法中，在所述硫酸銨沉淀和所述金屬離子親和層析之間還可包括重懸所 述沉淀蛋白的步驟;進行所述重懸時使用的重懸緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:20mM Tris,150mM NaCl,pH 7.5〇
[0037] 在所述方法中，所述超濾濃縮為采用截留分子量具體為lOkD的超濾濃縮。
[0038] 在所述方法的步驟(2)中，對所述重組大腸桿菌細胞進行誘導表達為向培養(yǎng)有所 述重組大腸桿菌的培養(yǎng)體系中加入IPTG至其終濃度為0.5-1.5mM，32°C誘導9小時。
[0039] 更加具體的，所述步驟(2)為:將所述重組大腸桿菌細胞接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(初始 0D_為0.01)中；先在條件1下進行培養(yǎng)，得到發(fā)酵液1;再向所述發(fā)酵液1中加入補料，在條 件2下培養(yǎng)，然后加入IPTG至其終濃度為0.5-1.5mM，32°C誘導9小時，得到發(fā)酵液2;從所述 發(fā)酵液2中收集所述重組大腸桿菌細胞;破碎所述重組大腸桿菌細胞，得到所述包含體。
[0040] 所述條件1具體可為:培養(yǎng)溫度為37°C;溶氧量(D0)(相對溶氧量)設(shè)定為15% ;pH 值為7.0;培養(yǎng)至發(fā)酵體系的0D6Q()>31。
[0041] 所述條件2具體可為:培養(yǎng)溫度為32°C，溶氧量(D0)(相對溶氧量)設(shè)定為15% ;pH 值為7.0;培養(yǎng)至發(fā)酵體系的0D6(x)為100。
[0042]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可如下：每1L所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有26-27g甘油、39-41g 酵母粉、1.6-2.0g磷酸二氫鉀、1.6-2.0g檸檬酸、4.9-5. lmL鹽溶液、0.9-1. lmL微量金屬鹽 溶液、0.9-1. lmL消泡劑204,余量為水;pH值為7.2-7.4。其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值可通 過30% (體積百分含量)氨水進行控制。
[0043]更加具體的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如下：每1L所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有26.7g甘 油、40g酵母粉、1.8g磷酸二氫鉀、1.8g檸檬酸、5mL鹽溶液、lmL微量金屬鹽溶液、lmL消泡劑 204,余量為水;pH值為7.2。
[0044] 其中，所述鹽溶液由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為：250g/L MgCl2 · 6H20、 100g/L CaCl2.2H20、100g/L KC1、2M梓檬酸(Citric acid)。所述微量金屬鹽溶液的組成如 下：每1L所述微量金屬鹽溶液中含有6.80g ZnCl2、54.00g FeCl3 · 6H20、16.20gMnCl2 · 4H20、2.20g CuS〇4 · 5H20、4.80g CoCh · 6H2〇、0.024g(NH4)6M〇7〇24 · 4H20、0.20g KI和 119mL 3 7 % (體積百分比濃度)的濃鹽酸，余量為水。
[0045]所述補料由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度可為:270-280g/L甘油和220-230g/ L酵母粉，具體可為275g/L甘油和225g/L酵母粉。
[0046] 收集所述重組大腸桿菌細胞的方法可為離心或過濾中至少一種，具體可為離心收 集;破碎所述重組大腸桿菌細胞方法可為高壓勻漿、凍融或超聲破碎中至少一種，具體可為 高壓勻漿破碎。
[0047] 在步驟(3)中，對所述包含體進行變性是在變性緩沖液中進行。所述變性緩沖液的 pH值為10.0;所述變性緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基 甲烷、尿素和二硫蘇糖醇;所述三羥甲基氨基甲烷在所述變性緩沖液中的濃度為5-100mM; 所述尿素在所述變性緩沖液中的濃度為6-8M;所述二硫蘇糖醇在所述變性緩沖液中的濃度 為10-100mM 〇
[0048] 更加具體的，在本發(fā)明的一個實施例中，所述變性緩沖液的pH值為10.0;所述變性 緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基甲烷、尿素和二硫蘇糖 醇;所述三羥甲基氨基甲烷在所述變性緩沖液中的濃度為20mM;所述尿素在所述變性緩沖 液中的濃度為8M;所述二硫蘇糖醇在所述變性緩沖液中的濃度為20mM。
[0049] 所述變性的溫度為20-30Γ (室溫），時間為3_4h。變性后離心收集上清液，得到所 述變性后的樣品。
[0050] 進行所述變性時，所述包含體與所述變性緩沖液的比例具體可為lg: 40mL
[0051]在步驟(4)中，將所述變性后的樣品進行復性時，所述變性后的樣品與所述復性緩 沖液的比例具體可為1:20 (體積比）。
[0052] 所述復性的溫度為25°C，時間為12-16h(過夜），如14h。
[0053]利用所述方法制備得到的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0054]本發(fā)明還提供了一種用于制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的成套試劑和試劑盒。
[0055] 本發(fā)明所提供的用于制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的成套試劑，由所述復性緩沖 液、進行所述金屬離子親和層析時采用的所述平衡液和所述洗脫緩沖液、進行所述凝膠過 濾層析時采用的所述洗脫液組成。
[0056] 本發(fā)明所提供的用于制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的試劑盒，含所述成套試劑，以 及如下中全部或部分:大腸桿菌感受態(tài)細胞、能夠表達氨基酸序列如序列表中序列2所示的 重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核表達載體、IPTG、Chelating FF或者Chelating HP、 Sephacryl S-100〇
[0057] 所述試劑盒中還含有記載有前文所述的制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的方法的可 讀性載體。
[0058]下述生物材料中的任一種也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0059] (al)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0060] (a2)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0061 ] (a3)將序列表中序列1中的T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA分子；
[0062] (a4)含有序列表中序列1所示的DNA分子的表達盒、重組載體、重組微生物、重組病 毒、轉(zhuǎn)基因植物細胞系或轉(zhuǎn)基因動物細胞系。
[0063] 其中，所述轉(zhuǎn)基因植物細胞系和所述轉(zhuǎn)基因動物細胞系均為非繁殖材料。
[0064] 下述應用中的任一種也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0065] I)所述方法在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應用；
[0066] II)所述成套試劑在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應用；
[0067] III)所述試劑盒在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應用；
[0068] IV)所述生物材料在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應用。
[0069] 在本發(fā)明中，所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0070] 實驗證明，采用本發(fā)明的制備方法制備的重組Lys-c蛋白酶具有高的酶活力和較 高的尿素耐受。本發(fā)明的制備方法具有酶切特異性好、無動物來源病毒等有優(yōu)點，生產(chǎn)與制 備工藝簡單、成本低，可以應用于生物制藥和蛋白質(zhì)組學研究。
【附圖說明】
[0071] 圖1為大腸桿菌發(fā)酵與表達鑒定。其中，A為大腸桿菌發(fā)酵的生長曲線，標注31的檢 測點對應的OD600為加入IPTG誘導時發(fā)酵液的0D600值，標注100的代表菌體收集時發(fā)酵液的 OD6Q0值。B為對BL21-Lys-C菌株的誘導后的全菌蛋白、上清和包含體進行15%SDS-PAGE電泳 檢測結(jié)果。C為包含體經(jīng)8M尿素溶解后的質(zhì)譜分析結(jié)果。
[0072] 圖2為復性蛋白的激活條件優(yōu)化。其中，A為不同pH對復性蛋白的激活結(jié)果比較，箭 頭所示條帶為激活蛋白條帶。B為pH 7.5條件下，不同激活時間對蛋白激活的影響，箭頭所 示條帶為激活蛋白條帶。
[0073] 圖3為蛋白純化以及相應蛋白分析結(jié)果。其中，A為親和層析的色譜圖，親和洗脫收 集的色譜峰為虛線包括范圍。B為凝膠層析的色譜圖，凝膠層析收集的洗脫峰為虛線包括范 圍。C為純化各步驟的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分析結(jié)果(分子篩峰1為圖3中B的凝膠層 析色譜峰的30-45mL組分，分子篩主峰為圖3中B的凝膠層析色譜峰的45-55mL對應組分，即 虛線部分為分子篩主峰的液質(zhì)連用(LC/MS)分析的結(jié)果。
[0074] 圖4為純化蛋白的活性分析結(jié)果。其中，A為純化Lys-C對大腸桿菌全蛋白在不同尿 素濃度下對底物蛋白的酶切比較結(jié)果。B為純化Lys-C對大腸桿菌全蛋白在2M尿素濃度下對 底物蛋白在不同酶切比例條件下的酶切比較結(jié)果。C為純化Ly s -C對大腸桿菌全蛋白在2M尿 素濃度下，按照1:50比例進行酶切樣品的質(zhì)譜分析的離子峰。
【具體實施方式】
[0075] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0076] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0077] pET_32a( + )載體:Novagen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為69030-3。
[0078]高密度基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:每1L所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有26.7g甘油、40g酵母粉、1.8g 磷酸二氫鉀、1.8g檸檬酸、5mL鹽溶液、lmL微量金屬鹽溶液、lmL消泡劑204，余量為水;pH值 為 7.2。
[0079] 其中，所述鹽溶液由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為：250g/L MgCl2 · 6H20、 100g/L CaCl2.2H20、100g/L KC1、2M梓檬酸(Citric acid)。所述微量金屬鹽溶液的組成如 下：每1L所述微量金屬鹽溶液中含有6.80g ZnCl2、54.00g FeCl3 · 6H20、16.20gMnCl2 · 4H20、2.20g CuS〇4 · 5H20、4.80g CoCh · 6H2〇、0.024g(NH4)6M〇7〇24 · 4H20、0.20g KI和 119mL 3 7 % (體積百分比濃度)的濃鹽酸，余量為水。
[0080]補料：由水和溶質(zhì)組成，所述溶質(zhì)及其濃度為:275g/L甘油和225g/L酵母粉。
[0081 ]包含體洗滌緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為pH值為7.2-7.5的10mM的roS緩沖 液，溶質(zhì)及其濃度為:2M尿素。
[0082]變性緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成。溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為:20mM三羥甲基氨基 甲烷(Tr i s)、8M尿素(urea)和20mM二硫蘇糖醇(DTT); pH值為10.0。
[0083]復性緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：20mM三羥甲基氨 基甲燒(Tris)、2M尿素(Urea)、ImM胱氨酸（Cystine)和3mM半胱氨酸（Cysteine);pH值為 10.0〇
[0084] 硫酸銨沉淀所采用的復溶緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成。溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度 為：20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5。
[0085] 親和層析所采用的平衡液：由溶劑和溶質(zhì)組成。溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為：20mM Tris，2M NaCl，pH 7.5。
[0086] 親和層析所采用的洗脫緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成。溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為： 20mM Tris，2M NaCl，0.5M咪唑，pH 7.5。
[0087] 超濾稀釋緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成。溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度為:20mM Tris，8M 尿素 ，pH 8.5。
[0088] 凝膠過濾層析所采用的洗脫液：由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如 下：50mM醋酸(HAC)、6· 7mg/mL棉籽糖(Raff inose) ;pH值為3-4。
[0089]實施例1、重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)的制備與鑒定
[0090]本實施例將采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)，并 對其進行鑒定。
[0091 ] -、表達重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)重組大腸桿菌的制備
[0092] 1、賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)編碼基因的優(yōu)化
[0093]將綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa)來源的Lys-C的編碼基因（GenBank號： AY062882.1的第73-1389位，GI :17978564)，在不改變野生型賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的氨基酸序 列（序列2的第169-606位）的前提下，將其密碼子替換為大腸桿菌偏好(高頻使用）的密碼 子。所述優(yōu)化還包括對賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的基因序列的其他改造，以適合在大腸桿菌中表 達，并在優(yōu)化好的序列前加入起始密碼子ATG，最終獲得優(yōu)化后的Lys-C的編碼基因序列如 序列表中序列1的第502-1818位所示。
[0094] 2、重組表達載體的構(gòu)建
[0095] 將pET-32a( + )載體的EcoR I和Xho I識別位點（識別序列）間的DNA序列替換為序 列表中序列1的第502-1818位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不變，得到重組表達載體 pET-32a( + )-Lys-C。并進一步經(jīng)DNA測序驗證表明載體構(gòu)建正確。
[0096] 重組表達載體pET-32a( + )-Lys-C，其編碼的蛋白序列（序列2)除Lys-C酶原的完整 序列以外，還包括了N端的載體TRX標簽序列，C端的6xHis序列等。表達蛋白的完整分子量 (理論）為64888.53Da。如果第一個甲硫氨酸在表達后去除，其完整分子量（理論）為 64757.33Da〇 [0097] 3、化學轉(zhuǎn)化
[0098]通過化學轉(zhuǎn)化法，將步驟2構(gòu)建的pET-32a( + )-Lys-C導入大腸桿菌BL21(DE3)感受 態(tài)細胞中，得到含有重組Lys-C基因的重組菌株，將該菌株命名為重組大腸桿菌BL21-Lys-C (下文中簡稱BL21_Lys_C菌株）。
[0099]二、重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)的制備 [0100] 1、BL21-Lys-C菌株的發(fā)酵與包含體收集及初步鑒定
[0101] 將步驟一制備的BL21-Lys-C菌株在固體LB/Amp平板上活化，獲得BL21-Lys-C菌株 的單克隆。將單克隆接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中（卡那霉素的濃度為100yg/mL)，37°C搖床 震蕩培養(yǎng)。當LB液體培養(yǎng)體系的OD600為1.5-2.0時（以LB液體培養(yǎng)基為空白對照），得到一級 種子。將一級種子單獨接種到經(jīng)121°C濕熱法高壓滅菌的裝有2.5L高密度發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 5L發(fā)酵罐(Applikon Biotechnology公司）中，接種后的培養(yǎng)體系的0D6QQ為0 · 01 (以高密度 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照）。初始發(fā)酵參數(shù):培養(yǎng)溫度為37 °C，攪拌速度為400rpm，空氣流 量為6L/min，pH值為7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值通過30 %氨水(體積百分比濃度)控制。當溶氧 (D0)(相對溶氧量)〈15%時與轉(zhuǎn)速聯(lián)動，最高轉(zhuǎn)速1200rpm。當初始發(fā)酵體系的0D 6Q()>31(以 高密度發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照）時，獲得菌株發(fā)酵液1。向菌株發(fā)酵液1中補料，補料速 度控制在16-18mL/h，降低溫度至32°C，并加 IPTG至終濃度為ImM，誘導培養(yǎng)9h。誘導培養(yǎng)參 數(shù)為:培養(yǎng)溫度為32°C，攪拌速度為400rpm，空氣流量為6L/min，pH值為7.0，發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH值通過30%氨水（體積百分比濃度）控制。溶氧量和轉(zhuǎn)速控制同上，培養(yǎng)至發(fā)酵體系的 OD6〇Q為100,得到發(fā)酵液2。
[0102] 采用水平轉(zhuǎn)子對BL21-LyS-C菌株的發(fā)酵液2在4000rpm條件下離心30min收集菌 體，得到BL21 -Ly s-C菌株。在菌體中按照1 g: 1 OmL (w/v)的比例加入濃度為1 OmM的PBS緩沖 液，用高速組織剪切機混合均勻，并采用高壓勻漿法破碎。高壓勻漿壓力設(shè)定800bar，連續(xù) 破碎3次后采用水平轉(zhuǎn)子在4000rpm條件下離心30min，獲得BL21-Lys-C菌株的包含體(記為 包含體1)，共70g。用roS+2M尿素對包含體1進行洗滌并離心收集包含體(記為包含體2)，共 48g〇
[0103] 大腸桿菌發(fā)酵的生長曲線如圖1中A所示。對BL21-Lys-C菌株的誘導后的全菌蛋 白、上清和包含體進行15%SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖1中B所示。BL21-Lys-C菌株在誘導 后的全菌蛋白和洗滌后的包含體中含有大小約為65kD的目的蛋白。電泳結(jié)果顯示誘導的目 的蛋白主要以包含體形式表達(圖1中B)。
[0104]本發(fā)明的發(fā)明人進一步對包含體用8M尿素溶解后進行質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示分子量 為64758.44Da(圖1中C)，該分子量與步驟一2中分析的Lys-C蛋白的理論分子量大小相符。 [0105] 2、包含體蛋白變性
[0106] 將包含體按照1:40 (質(zhì)量體積比，g/ml)的比例溶解到變性緩沖液中并室溫(25 °C) 變性3-4小時，13000rpm離心收集上清液，即為變性后的樣品。
[0107] 3、蛋白復性
[0108] 將上述步驟2獲得的變性后的樣品按照1:20(體積比）的比例加入到復性緩沖液 中，25 °C復性過夜（14小時）中，即得復性后的樣品。
[0109] 4、蛋白激活
[0110] 按照如下進行蛋白激活條件的優(yōu)化：
[0111] 將步驟3獲得的復性后的樣品分別調(diào)pH值為:9.5、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、5.5,并 將不同pH值樣品分別置于25°C激活6小時，并對激活樣品進行SDS電泳分析（圖2中A)。將步 驟3獲得的復性后的樣品調(diào)pH值為7.5并將樣品分別置于25°C激活6小時，每隔1小時取樣并 對激活樣品進行SDS電泳分析(圖2中B)。
[0112] 由圖2可見，在pH 7.0-8.0之間時，在分子量約28KD位置，有一個明顯的條帶產(chǎn)生， 證明蛋白已經(jīng)被成功激活。
[0113] 5、激活蛋白的純化
[0114] (1)硫酸銨沉淀及重懸
[0115] 硫酸銨沉淀，具體操作如下：①向在pH 7.0條件下激活的蛋白樣品中加入固體硫 酸銨至60 %飽和濃度并4 °C攪拌直至硫酸銨完全溶解，冰上沉淀蛋白4小時。②4000rpm離心 30min并收集沉淀蛋白。
[0116] 重懸:將沉淀蛋白樣品用重懸緩沖液(配方:溶劑為水，溶質(zhì)及濃度為20mM Tris， 150mM NaCl，pH 7.5)溶解后并12000印111離心3〇111；[11，收集上清蛋白。
[0117] (2)金屬離子親和層析純化
[0118] 將步驟（1)重懸后所得上清蛋白進行金屬離子親和層析純化，層析介質(zhì)為 Chelating FF(也可以以Chelating HP(GE)替代），層析柱體積為5mL。親和層析的具體操作 如下：
[0119] 平衡:先用平衡液平衡親和層析柱5個柱體積，使得流出液的基線平穩(wěn)。
[0120] 上洋:將步驟(1)所得上清蛋白直接上樣。
[0121] 洗脫:上樣結(jié)束后用平衡液平衡5個柱體積，再按照如下洗脫程序進行洗脫:①用 平衡液與洗脫緩沖液的混合液進行咪唑線性洗脫，共洗脫5個柱體積，在這5個柱體積內(nèi)，洗 脫緩沖液在混合液中的體積含量由〇 %線性變化至2 %，即咪唑在洗脫液中的濃度由0M線性 升至0.01M。②用平衡液與洗脫緩沖液的混合液進行咪唑線性洗脫，共洗脫10個柱體積，在 這10個柱體積內(nèi)，洗脫緩沖液在混合液中的體積含量由2%線性變化至100%，即咪唑在洗 脫液中的濃度由0.01M線性升至0.5M。收集洗脫峰，并進行SDS電泳檢測。
[0122] 親和層析的色譜圖如圖3中A所示。SDS電泳結(jié)果如圖3中C所示，在約28KD的位置上 出現(xiàn)目的條帶。
[0123] (3)親和洗脫樣品的超濾濃縮
[0124] 將步驟(2)收集的經(jīng)SDS-PAGE鑒定產(chǎn)生約28KD目的條帶的洗脫峰用超濾稀釋緩沖 液稀釋一倍并進行超濾濃縮，超濾管為Merck-Millipore公司的10kDa Centrifugal Filter Unit〇
[0125] 超濾后的樣品進行SDS-PAGE，結(jié)果如圖3中C所示，在約28KD的位置上出現(xiàn)目的條 帶，且雜帶明顯減少。
[0126] (4)凝膠層析純化
[0127] 將步驟(3)所得超濾濃縮后樣品通過凝膠過濾層析進行最終純化，所用層析柱為 XK 16X40column柱高：33mm，GE Healthcare,USA"，層析介質(zhì)為Sephacryl? S-100。具體操 作如下：
[0128] 平衡：用平衡緩沖液（溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：50mM HAC，6.7mg/mL Raffinose)，平衡2個柱體積。
[0129] 上洋:將步驟(3)所得超濾濃縮后樣品直接上樣，上樣量為2mL。
[0130] 洗脫：用洗脫液進行洗脫，基于體積進行連續(xù)收集，每個收集組分為2mL，流速為 3mL/min，并對收集組分進行電泳分析，對電泳純度較好的組分進行合并并進行后續(xù)活性分 析。
[0131] 樣品的凝膠過濾層析圖譜如圖3中B所示，將所收集的洗脫峰進行SDS-PAGE，結(jié)果 如圖3中C所示(其中，分子篩峰1為圖3中B的凝膠層析色譜峰的30-45mL組分，分子篩主峰為 圖3中B的凝膠層析色譜峰的45-55mL對應組分，即虛線部分），在約28KD的位置上出現(xiàn)目的 條帶，已經(jīng)基本沒有任何雜帶產(chǎn)生。
[0132] 基于圖3中色譜圖和電泳結(jié)果表明，在虛線標注的色譜峰之前的蛋白峰，除了含有 目的蛋白外，在低分子量部分含有大量的降解條帶，這個結(jié)果表明，蛋白降解產(chǎn)物可能有非 常強的相互作用。
[0133] 另外，有圖3中C所示的將復性激活但未經(jīng)硫酸銨沉淀的蛋白樣品、經(jīng)硫酸銨沉淀 復溶后的蛋白樣品、以及經(jīng)不同純化方法獲得的蛋白樣品一同進行SDS凝膠電泳檢測的結(jié) 果，可見:經(jīng)過激活后(未經(jīng)硫酸銨沉淀）的蛋白是一個混合物，在分子量約28kD處有一個明 顯條帶;經(jīng)過硫酸銨沉淀和親和純化后，蛋白純度沒有明顯提高，但蛋白得到有效濃縮;經(jīng) 過進一步的超濾濃縮和凝膠過濾層析，蛋白純度有明顯提高，在分子量約28kD處有一條主 要條帶產(chǎn)生而且有一條約18kD的蛋白產(chǎn)生。該結(jié)果與Lee S.Engel，1998(Protease IV，a Unique Extracellular Protease and Virulence Factor from Pseudomonas aeruginosa,the journal of biological chemistry，1998)的報道--致。這進--步說明 18kD的蛋白不是雜蛋白，而可能是Lys-C蛋白的降解產(chǎn)物。
[0134] 三、重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)的質(zhì)譜鑒定
[0135] 對凝膠過濾層析后獲得的蛋白純品進行LC-MS/MS分析。結(jié)果如圖3中D所示，經(jīng)凝 膠過濾層析獲得的蛋白純品的實際測量分子量為27431.28kD，與理論分子量27431.1 lkD相 符。該結(jié)果進一步證明，Lys-C蛋白表達完全正確。
[0136] 四、重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)回收率計算
[0137] 根據(jù)純化各步驟以及對圖3中C的電泳結(jié)果進行灰度值掃描定量，計算Lys-C蛋白 整體回收率，如表1所示?？梢姡谠摳呙芏却竽c桿菌發(fā)酵體系，Lys-C蛋白的最終蛋白回 收率約為36.61mg/L，即每1L發(fā)酵體系中可獲得36.61mg的Lys-C蛋白純品。
[0138] 表1 Lys-C蛋白整體回收率
[0139]
[0140] 實施例2、重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-c)的活性測定
[0141] -、制備大腸桿菌全蛋白
[0142] 將大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen，Germany)PBS重懸后進行超聲破碎并離心獲得菌 體總蛋白，并按照1:9的比例用預冷丙酮進行蛋白沉淀，然后用重懸緩沖液(配方：溶劑為 水;溶質(zhì)及濃度為50mM NH4HC03和8M的尿素)進行重懸，蛋白濃度為4mg/ml。加入DTT至終濃 度20mM，并37°C變性45min，將樣品冷卻至常溫后加入碘化乙酰胺至終濃度40mM并黑暗中進 行烷基化，烷基化時間為30min。烷基化結(jié)束后，用10kD超濾管換液以去除DTT和碘化乙酰 胺。采用緩沖液(配方:溶劑為水;溶質(zhì)及濃度為50mM NH4HC03和不同濃度的尿素)對其進行 稀釋，得到4份大腸桿菌全蛋白樣品，使4份大腸桿菌全蛋白樣品中蛋白濃度均為lmg/ml， NH4HC03濃度均為50mM，尿素濃度分別為2M、4M、6M、8M，備用。
[0143] 二、利用重組Lys-C蛋白酶切大腸桿菌全蛋白樣品
[0144] 利用實施例1制備的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)純品酶切步驟一制得的大腸 桿菌全蛋白樣品。具體進行了如下實驗：
[0145] 1.將實施例1制備的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)純品按照1:20(質(zhì)量比）的比 例加入到步驟一制得的酵母全蛋白樣品（尿素濃度分別為21、41、611、81〇中，37°(：酶切4小 時，酶切結(jié)束后進行SDS電泳檢測。
[0146] 結(jié)果如圖4中A所示?；陔娪窘Y(jié)果，該蛋白酶在2-8M尿素條件下均實現(xiàn)對大腸桿 菌全蛋白的完全酶切。
[0147] 2.將實施例1制備的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-c)純品按照1: (50-1000)(質(zhì)量 比）的比例加入到步驟一制得的大腸桿菌全蛋白樣品(尿素濃度為2M)中，37°C酶切過夜（14 小時），酶切結(jié)束后進行SDS電泳檢測。
[0148] 結(jié)果如圖4中B所示?；陔娪窘Y(jié)果，在進行分析的酶切條件中，大腸桿菌的全蛋白 均被完全酶切，只有在1:1000條件下，有少量蛋白蛋白殘留。
[0149] 3.將實施例1制備的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶(Lys-C)純品按照1:50(質(zhì)量比）的比 例加入到步驟一制得的大腸桿菌全蛋白樣品（尿素濃度為2M)中，37°C酶切過夜（14小時）， 體系中酵母全蛋白的總量為2yg。酶切結(jié)束后，將溶液酶切樣品進行真空干燥后進行 C18z ip-tip脫鹽用于質(zhì)譜分析。
[0150] C18zip-tip脫鹽柱的預處理與脫鹽
[0151] 1)脫鹽柱處理：向脫鹽柱中加入20yL甲醇，靜置2-3mins，用注射器將甲醇壓出，注 意不要壓太干;繼續(xù)加入20yL buffer B(配方:溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:80%ACN，0.5% 乙酸，19.5 % ddH20，％表示體積百分含量），靜置2-3mins，用注射器將甲醇壓出，注意不要 壓太干；
[0152] 2)加入20yL buffer A(配方溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：98%ddH20，l%CAN，l% TFA，％表示體積百分含量），靜置2-3mins用注射器將甲醇壓出，注意不要壓太干;重復上述 平衡步驟1_2次；
[0153] 3)向3中已干燥樣品中加入10yL buffer A，輕彈渦旋已充分溶解樣品，離心 (6000rpm，5mins);將樣品加到已平衡好的Ziptip柱子中，輕彈，將液體輕甩至柱底部，保留 裝過樣品的PCR管；用注射器分別將樣品壓至相應的樣品PCR管中，瞬離樣品至管底部；
[0154] 4)重復上述3步驟，最后將樣品分別壓入新的PCR管中（記為Ft);
[0155] 5)平衡：向脫鹽柱中加入20yL buffer A，輕彈，將液體輕甩至柱底部，輕彈，將液 體輕甩至柱底部，將樣品分別壓入新的PCR管中（記為Wash);
[0156] 6)洗脫：用裝有ddH20的洗瓶沖洗脫鹽柱的外壁；向脫鹽柱中加入20yL buffer B， 用注射器將樣品分別壓入新的PCR管中；重復該步驟1次，分別將脫鹽柱的液體壓入相對應 的PCR管中，（記為Et);
[0157] (注意:所有試驗中PCR樣品管樣品全部保留，將所有Ft，Wash，Et樣品全部離心，真 空冷凍干燥;將蒸干的Ft，Wash及脫鹽柱于冰箱冷凍保存。）
[0158] 7)向標記有Et的樣品中加入4yL質(zhì)譜上樣Loading buffer，輕彈充分溶解樣品，離 心，取3yL用于質(zhì)譜檢測。
[0159] 4.酶切樣品的質(zhì)譜分析
[0160] 質(zhì)譜型號與參數(shù)：液相系統(tǒng)UPLC system(nanoAcquity Ultra Performance LC, Waters);色譜柱（5μηι i.d.X15cm fused-silica capillary column,Cisresins, 100 ?。?μ m);流速0 · 3yL/min;質(zhì)譜系統(tǒng)Orbitrap mass spectrometer(Thermo Scientific , San 了〇86^，1^4)。質(zhì)量范圍：300-1600,01^1廿&?質(zhì)量分析其的分辨率為30000，選擇離子豐度 在前20的離子在LTQ(線性離子肼）中進行CID(碰撞誘導碎裂)碎裂。每一次掃描，在25ms時 間內(nèi)積累的最大離子數(shù)為5000。母離子離子的動態(tài)排除時間為30s。
[0161] 對獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用MaxQuant (v 1.5.3.8)進行數(shù)據(jù)分析。
[0162] 質(zhì)譜結(jié)果見圖4中C和表2。結(jié)果表明，在鑒定的肽段中，以賴氨酸為C端肽段所占比 例為全部肽段的96%以上。說明本發(fā)明實施例1制備的重組Lys-C蛋白的酶切特異性非常 高?？梢杂脕磉M行蛋白組學的樣品制備。
[0163] 表2基于大腸桿菌全蛋白檢測重組蛋白酶的特異性
[0164]
[0165] 對比例1 .Lys-C優(yōu)化基因的構(gòu)建與表達方式對照試驗1
[0166] 將實施例1中優(yōu)化后的Lys-C基因序列(序列1的第502-1818位)替換為優(yōu)化前序列 (GenBank號:AY062882.1的第73-1389位），其余操作均同實施例1和2。結(jié)果證實本對比例蛋 白的復性收效率非常低，幾乎無法拿到有活性的Lys-C蛋白酶。
[0167] 對比例2. Lys-C優(yōu)化基因的構(gòu)建與表達方式對照試驗2
[0168] 將實施例1中優(yōu)化后的Lys-C基因序列（序列1的第502-1818位)采用實施例1相同 的酶切位點連接到pET-30a( + )中，其余操作均同實施例1和2。結(jié)果證實本對比例蛋白表達 量很低，經(jīng)SDS-PAGE檢測無法看到明顯的蛋白表達，表達蛋白可以復性，但回收效率特別 低。分析其原因可能在于：pET-32a( + )載體的N端存在TRX標簽序列，其與序列1的第502-1818位融合后表達的重組蛋白才能取得實施例中令人滿意的效果，本對比例中目的蛋白的 回收效果不甚理想正是由于pET-30a( + )載體缺少TRX標簽序列所致。
[0169] 對比例3. Lys-C優(yōu)化基因的構(gòu)建與表達方式對照試驗3
[0170] 將實施例1中優(yōu)化后的Lys-C基因序列(序列1的第502-1818位）中編碼成熟蛋白的 序列（序列1的第1068-1818位)采用實施例1相同的酶切位點連接到pET-32a( + )中，其余操 作均同實施例1和2。結(jié)果證實本對比例蛋白表達量與實施例相當，但是表達蛋白無法復性。 [0171 ]對比例4. Lys-C優(yōu)化基因的構(gòu)建與表達方式對照試驗4
[0172] 將實施例1中優(yōu)化后的Lys-C基因序列（序列1)采用實施例1相同的酶切位點連接 到Pgex-4T-l載體中，其余操作均同實施例1和2。結(jié)果證實本對比例蛋白表達量適中，表達 蛋白可以復性，但激活過程中蛋白降解速度快于實施例，同等條件下無法獲得激活蛋白。
[0173] 對比例5.不同復性方法的對照試驗
[0174] 變性樣品的制備及之前的所有步驟同實施例1。將變性樣品平均分成兩份，按照1: 40(體積比）的比例分別加入到本發(fā)明實施例1中的復性緩沖液(記為①)和對照復性緩沖液 (記為②）中，4°C復性過夜（14小時），即得復性樣品。將復性樣品調(diào)pH值為7.5,置于25°C激 活5小時，取樣并進行電泳分析(具體方法參見實施例1)。
[0175] 復性緩沖液①:20mM Tris，lmM胱氨酸，3mM半胱氨酸，2M尿素 ，pH 9.5;
[0176] 對照復性緩沖液②:20mM Tris，10mM CaCl2,2M尿素，0.05%SDS，pH 7.5。
[0177] 結(jié)果顯示:4°C條件下復性后激活條件①激活，但效果不及實施例中25°C條件下的 復性效果;而條件②未激活。
[0178] 對比例6.不同純化方法的對照試驗1
[0179] 復性后的樣品的制備及之前的所有步驟同實施例1。將復性后的樣品平均分為兩 份A、B。其中A樣品直接調(diào)pH值為7.5，B份稀釋4倍后調(diào)pH值為7.5。將兩份樣品分別置于25°C 激活5小時。
[0180] 分別取激活樣品置于_20°C凍存過夜（14h)，然后參照實施例1進行硫酸銨沉淀和 重懸，獲得上清蛋白。將所得上清蛋白脫鹽至緩沖液（溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：50mM HAC，6.7mg/ml Raffinose)或緩沖液2(溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：lmM HC1)中然后進行電 泳分析，然后對大腸桿菌全蛋白的切割活性驗證(具體方法參見實施例2)。
[0181] 結(jié)果顯示:A/B兩份樣品在激活后的蛋白是混合物，在分子量約28kD處有一個明顯 條帶;但經(jīng)-20°C凍融后純度均明顯提高，在銨鹽沉淀復溶以及脫鹽后樣品A的純度再次提 高且酶切大腸桿菌全蛋白有活性，但B樣品卻純度下降且混合雜質(zhì)特別多。該對比例說明， 凍融和銨鹽沉淀能夠起到蛋白濃縮和提高純度的作用，但是復性樣品稀釋后凍融對蛋白的 激活和純度提高幫助不大。
[0182] 對比例7.不同純化方法的對照試驗2
[0183] 蛋白復性、硫酸銨沉淀和重懸，以及之前的所有步驟同實施例1，經(jīng)硫酸銨沉淀和 重懸后獲得上清蛋白。
[0184] 將所得上清蛋白進行親和層析純化(層析柱體積5ml)。親和層析的具體操作:先用 平衡液(bufTerA:20mMhepes，0.3MNaCl，pH7.5)平衡親和層析柱5個柱體積，使基線平 穩(wěn);將以上所得上清蛋白直接上樣，體積為20ml;上樣結(jié)束后用平衡液平衡5個柱體積后，再 按照如下洗脫程序進行洗脫:①用平衡液與洗脫緩沖液的混合液進行咪唑線性洗脫，共洗 脫5個柱體積，在這5個柱體積內(nèi)，洗脫緩沖液在混合液中的體積含量由0 %線性變化至2 %， 即咪唑在洗脫液中的濃度由〇M線性升至〇. 01M。②用平衡液與洗脫緩沖液的混合液進行咪 唑線性洗脫，共洗脫10個柱體積，在這10個柱體積內(nèi)，洗脫緩沖液在混合液中的體積含量由 2%線性變化至100%，即咪唑在洗脫液中的濃度由0.01M線性升至0.5M。③用洗脫緩沖液洗 脫3個柱體積。收集洗脫峰取樣并進行電泳檢測(具體操作參見實施例1)。其中，洗脫緩沖液 的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下:20mM h印es，0.3M NaCl，0.5M咪唑;pH 7.5。
[0185] 結(jié)果顯示:在經(jīng)親和層析后得到相對純度較高的激活蛋白。但蛋白回收率很低，說 明激活Lys-C蛋白的穩(wěn)定性較差，在蛋白純化過程中降解明顯。
【主權(quán)項】
1. 一種制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的方法，包括如下步驟： (1) 向受體大腸桿菌細胞中導入氨基酸序列如序列表中序列2所示的重組賴氨酰肽鏈 內(nèi)肽酶的編碼基因，得到重組大腸桿菌細胞； (2) 對所述重組大腸桿菌細胞進行誘導表達后，收集所述重組大腸桿菌細胞;破碎所述 重組大腸桿菌細胞，得到包含體； (3) 對所述包含體進行變性，得到變性后的樣品； (4) 將所述變性后的樣品進行復性，得到復性后的樣品； (5) 將所述復性后的樣品進行激活，得到有活性的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品； (6) 對所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品進行純化，得到純化后的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽 酶； 在步驟(4)中，所述復性在復性緩沖液中進行，所述復性緩沖液的pH值為9.0-10.0,所 述復性緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基甲烷、胱氨酸、 半胱氨酸和尿素;所述三羥甲基氨基甲烷在所述復性緩沖液中的濃度為5-50mM，所述胱氨 酸在所述復性緩沖液中的濃度為〇.5-2mM，所述半胱氨酸在所述復性緩沖液中的濃度為3-5mM，所述尿素在所述復性緩沖液中的濃度為0.4-2M; 在步驟(5)中，所述激活為將所述復性后的樣品調(diào)pH值為5.5-9.5,于25°C靜置1-6小 時； 在步驟(6)中，所述純化為將所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶粗品依次進行硫酸銨沉淀、金 屬離子親和層析、超濾濃縮和凝膠過濾層析； 所述金屬離子親和層析采用的層析介質(zhì)為金屬螯合高流速瓊脂糖微球或者金屬螯合 高分辨瓊脂糖微球;所述凝膠過濾層析采用的層析介質(zhì)為丙烯葡萄糖凝膠S-100。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的編碼基因是 如下a)或b)或c)的核酸分子： a) 其編碼序列如序列表中序列1所示的DNA分子； b) 其編碼序列是將序列表中序列1中的T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA分子； c) 在嚴格條件下與a)限定的DNA分子雜交且編碼序列表中序列2所示的重組賴氨酰肽 鏈內(nèi)肽酶的DNA分子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述金屬離子親和層析的洗脫程序如 下：1)用平衡液與洗脫緩沖液的混合液進行咪唑線性洗脫，共洗脫5個柱體積，在所述5個柱 體積內(nèi)，咪唑在所述混合液中的濃度由OM線性升至0.0IM; 2)用所述平衡液與所述洗脫緩沖 液的混合液進行咪唑線性洗脫，共洗脫10個柱體積，在所述10個柱體積內(nèi)，咪唑在所述混合 液中的濃度由0.0IM線性升至0.5M; 所述平衡液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基甲烷和NaCl， 所述三羥甲基氨基甲烷在所述平衡液中的濃度為20mM Tris，所述NaCl在所述平衡液中的 濃度為2M，所述平衡液的pH值為7.5; 所述洗脫緩沖液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為三羥甲基氨基甲烷、 NaCl和咪唑，所述三羥甲基氨基甲烷在所述洗脫緩沖液中的濃度為20mM Tri s，所述NaCl在 所述洗脫緩沖液中的濃度為2M，所述咪唑在所述洗脫緩沖液中的濃度為0.5M咪唑，所述洗 脫緩沖液的pH值為7.5。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述凝膠過濾層析所用層析柱的 柱長度和柱內(nèi)直徑比為165:8;所述凝膠過濾層析所采用的洗脫液的pH值為3-4,所述洗脫 液由溶劑和溶質(zhì)組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)為醋酸和棉籽糖，所述醋酸在所述洗脫液中 的濃度為50mM，所述棉籽糖在所述洗脫液中的濃度為6.7mg/mL。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述硫酸銨沉淀的步驟為：1)在 所述激活后的樣品中加入固體硫酸銨至60%飽和濃度，4°C攪拌直至硫酸銨完全溶解，沉淀 蛋白4小時;2)離心收集沉淀蛋白；和/或 所述超濾濃縮為采用截留分子量為IOkD的超濾濃縮;和/或 在步驟(2)中，對所述重組大腸桿菌細胞進行誘導表達為向培養(yǎng)有所述重組大腸桿菌 的培養(yǎng)體系中加入IPTG至其終濃度為0.5-1.5mM，32 °C誘導9小時。6. 利用權(quán)利要求1-5中任一所述的方法制備得到的重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶。7. 成套試劑或試劑盒，其特征在于： 所述成套試劑為用于制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的成套試劑，由權(quán)利要求1-5任一中 所述的復性緩沖液、權(quán)利要求1-5任一中進行所述金屬離子親和層析時采用的所述平衡液 和所述洗脫緩沖液、權(quán)利要求1-5任一中進行所述凝膠過濾層析時采用的所述洗脫液組成； 所述試劑盒為用于制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的試劑盒，含有所述成套試劑，以及如 下中全部或部分:大腸桿菌感受態(tài)細胞、能夠表達氨基酸序列如序列表中序列2所示的重組 賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶的原核表達載體、IPTG、金屬螯合高流速瓊脂糖微球或者金屬螯合高分 辨瓊脂糖微球、丙烯葡萄糖凝膠S-100。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有記載有權(quán)利要求1-5中任一所述方法的可讀性載體。9. 下述生物材料中的任一種： (al)序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)； (a2)序列表中序列1所示的DNA分子； (a3)將序列表中序列1中的T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA分子； (a4)含有序列表中序列1所示的DNA分子的表達盒、重組載體、重組微生物、重組病毒、 轉(zhuǎn)基因植物細胞系或轉(zhuǎn)基因動物細胞系。10. 下述應用中的任一種： I) 權(quán)利要求1-5中任一所述的方法在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應用； II) 權(quán)利要求7所述的成套試劑在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應用； III) 權(quán)利要求7或8所述的試劑盒在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應用； IV) 權(quán)利要求9所述生物材料在制備重組賴氨酰肽鏈內(nèi)肽酶中的應用。
【文檔編號】C12N15/57GK105950593SQ201610319892
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】趙明治, 徐平, 吳飛林, 常蕾
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所