一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶及方法。組合酶由羅氏膠原混合酶和彈性蛋白酶組成，其混合比例為羅氏膠原混合酶0.5～0.7U、彈性蛋白酶 40～70μg。本發(fā)明的組合酶，可以快速地將血管組織分離為較多的單細(xì)胞及疏松的小組織塊，處理得到的細(xì)胞具有很高的活力，常規(guī)條件下培養(yǎng)2～3天幾乎所有細(xì)胞和疏松的小組織塊都牢固貼壁生長，開始呈現(xiàn)放射狀生長和增殖，5天后細(xì)胞呈現(xiàn)典型峰谷樣生長模式，可進(jìn)行傳代操作。
【專利說明】
一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種組合酶，特別涉及一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶，以及使用該組合酶高效分離小鼠動脈血管平滑肌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高血壓、冠心病是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率高、致死致殘率高的心血管疾病。其病理特點(diǎn)主要表現(xiàn)為大動脈及外周小動脈血管中層平滑肌增生，管腔狹窄，或同時(shí)伴隨脂質(zhì)沉積和粥樣斑塊，增加血流阻力，最終可出現(xiàn)不可逆的進(jìn)行性血壓升高、腦卒中、心梗等嚴(yán)重并發(fā)癥。
[0003]血管平滑肌不僅是血管壁中層的主要細(xì)胞結(jié)構(gòu)，維持和形成血管壁張力。此外，血管平滑肌還主動參與動脈粥樣硬化及高血壓進(jìn)程并表現(xiàn)出多種不同功能的表型(如合成型和收縮型)和分泌炎癥性細(xì)胞因子。因此，對于血管平滑肌功能及其相關(guān)分子機(jī)制的研究顯的尤為重要。
[0004]目前有大量文獻(xiàn)報(bào)道多種分離和培養(yǎng)大鼠大/小動脈血管平滑肌的方法如組織塊貼壁法14和膠原酶法及胰消化法酶等6—1(3對大鼠主動脈血管平滑肌的分離效果都較好，細(xì)胞傳代增殖力較高。
[0005]但隨著研究深入的需要，更多相關(guān)分子機(jī)制研究需要在轉(zhuǎn)基因小鼠來源的組織細(xì)胞上進(jìn)行，如何快速分離和培養(yǎng)高活性小鼠的大/小動脈血管平滑肌一直有爭議。文獻(xiàn)報(bào)道的針對小鼠的血管平滑肌分離培養(yǎng)方法主要沿用大鼠血管平滑肌分離方法:I)組織塊貼壁法n，12;無菌條件下取出胸主動脈，用鑷子輕輕刮除血管內(nèi)膜，并分離血管中膜(血管平滑肌層)，用眼科剪將中膜剪成I X Imm3組織塊，小心將組織塊用吸管置于培養(yǎng)瓶底部均勻分布，倒置培養(yǎng)瓶并放入培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中靜置40min左右，待組織塊貼壁牢固后，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)5天，觀察是否有血管平滑肌從組織塊中爬出。該方法缺點(diǎn)在于不是所有組織塊都能貼壁成功和有細(xì)胞爬出，細(xì)胞爬出至貼壁所需時(shí)間長，且操作過程技術(shù)要求較高。細(xì)胞生長緩慢，數(shù)量少，不能很快的進(jìn)入對數(shù)增長階段從而影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程;2)膠原酶消化法:文獻(xiàn)報(bào)道的小鼠分離采用的膠原酶濃度不一，大部分采用膠原酶I13或胰酶12用于去除血管壁內(nèi)皮等其他細(xì)胞，再進(jìn)行組織塊貼壁法操作，但我們實(shí)際操作發(fā)現(xiàn)分離的原代細(xì)胞活性差，貼壁慢。因此，非常迫切需要進(jìn)一步找到能快速分離和穩(wěn)定傳代的小鼠動脈血管平滑肌分禺培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶及方法。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶，組合酶由羅氏膠原混合酶和彈性蛋白酶組成，其混合比例為羅氏膠原混合酶0.5?0.7U、彈性蛋白酶40?70yg。
[0008]羅氏膠原混合酶型號為Liberase TM Research，貨號為05401119001。[0009 ]彈性蛋白酶為S i gma公司的豬彈性蛋白酶。
[0010]組合酶由羅氏膠原混合酶為Liberase TM Research和Sigma豬彈性蛋白酶按
0.6U: 50yg的比例混合而成。
[0011 ] 一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的方法，包括如下步驟:
1)將分離得到的小鼠動脈血管中膜剪成小塊，置于組合酶液中消化；
2)消化結(jié)束后，將酶液離心，棄上清，得到小鼠動脈血管平滑肌細(xì)胞；
其中，組合酶如上所述。
[0012]組合酶液中，羅氏膠原混合酶為Liberase TM Research的濃度為0.6 U/ml，Sigma豬彈性蛋白酶的濃度為50yg/ml。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的組合酶，可以快速地將血管組織分離為較多的單細(xì)胞及疏松的小組織塊，處理得到的細(xì)胞具有很高的活力，常規(guī)條件下培養(yǎng)2?3天幾乎所有細(xì)胞和疏松的小組織塊都牢固貼壁生長，開始呈現(xiàn)放射狀生長和增殖，5天后細(xì)胞呈現(xiàn)典型峰谷樣生長模式，可進(jìn)行傳代操作。
[0014]本發(fā)明的組合酶無論對于小鼠胸主動脈還是腸系膜等不同部位血管平滑肌分離效果都非常好。操作方法簡單，不需要再翻轉(zhuǎn)瓶，組織塊貼壁，對操作人員技術(shù)要求不高，且細(xì)胞貼壁快，增殖力強(qiáng)。
【附圖說明】
[0015]圖1是分離得到的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)5d后的顯微照片；
圖2和圖3分別是平滑肌細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第二代和第4代的顯微照片；
圖4和圖5:傳統(tǒng)膠原酶和胰酶組合后接種培養(yǎng)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0016]—種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶，組合酶由羅氏膠原混合酶和彈性蛋白酶組成，其混合比例為羅氏膠原混合酶0.5?0.7U、彈性蛋白酶40?70yg。
[0017]羅氏膠原混合酶型號為Liberase TM Research，貨號為05401119001。
[0018]彈性蛋白酶為Sigma公司的豬彈性蛋白酶。
[0019]組合酶由羅氏膠原混合酶為Liberase TM Research和Sigma豬彈性蛋白酶按
0.6U: 50yg的比例混合而成。
[0020]—種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的方法，包括如下步驟:
1)將分離得到的小鼠動脈血管中膜剪成小塊，置于組合酶液中消化；
2)消化結(jié)束后，將酶液離心，棄上清，得到小鼠動脈血管平滑肌細(xì)胞；
其中，組合酶如上所述。
[0021 ] 組合酶液中，羅氏膠原混合酶為Liberase TM Research的濃度為0.6 U/ml，Sigma豬彈性蛋白酶的濃度為50yg/ml。
[0022]下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0023]以下實(shí)施例使用的羅氏膠原混合酶的貨號為05401119001。
[0024]實(shí)施例1: 1)配制混合酶:取羅氏的膠原混合酶(LiberaseTM Research，0.6unit)+豬彈性蛋白酶(Sigma，50ug)加入到Iml的PBS中，混勾后置于冰上備用；
2)取6-8周齡小鼠2只，脫臼法處死后，快速浸沒入70%乙醇溶液約2min中；
3)取出小鼠后，置于超凈臺的手術(shù)操作臺上，用滅菌眼科剪小心打開胸腔，分離胸主動脈，置于冰預(yù)冷的PBS中；
4)在體式顯微鏡下，用顯微鑷去除動脈周圍脂肪組織，體式顯微鏡下快速分離血管中膜，PBS沖洗兩次后，轉(zhuǎn)入EP管內(nèi)，加入配制好的混合消化酶500ul，用顯微剪剪碎動脈中層成約I X Imm3組織塊，放入37°C孵箱中消化45min，期間每隔10-15分鐘取出振搖10s_20s ；
5)消化結(jié)束后，4°C1400rpm離心10分鐘。棄上清，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基輕輕吹打混勻成細(xì)胞懸液及疏松的組織小塊。
[0025]6)將消化得到的細(xì)胞懸液及疏松的組織小塊接種于35mm培養(yǎng)皿中，約2天后可見細(xì)胞貼壁生長，疏松組織塊周圍大量血管平滑肌呈放射狀生長;4天后可出現(xiàn)典型的峰谷樣生長表現(xiàn)，5-6天后即可以傳代，2-8代細(xì)胞可滿足隨后的大量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)需求。
[0026]接種培養(yǎng)5d后的細(xì)胞如圖1所示，第二代和第四代細(xì)胞分別如圖2和3所示。
[0027]從圖中可以看出，圖1(接種第五天)即可見到消化的單細(xì)胞及微小組織塊貼壁，且組織塊周圍有大量平滑肌爬出呈放射狀生長，說明此混合酶作用溫和，對細(xì)胞/組織塊的生長沒有影響，細(xì)胞已經(jīng)開始增殖；圖2(傳代后第二天)代表接種第6天即傳代后第二天原代細(xì)胞經(jīng)常規(guī)胰酶消化后24小時(shí)內(nèi)即可貼壁生長，增殖力良好；圖3代表第四次傳代后原代細(xì)胞仍然保持長梭形的細(xì)胞形態(tài)，且呈現(xiàn)峰谷樣生長方式，提示本發(fā)明的混合酶消化后，原代細(xì)胞增殖及傳代不受影響且生長旺盛。
[0028]對比例:
為了進(jìn)一步比較傳統(tǒng)的膠原酶混合胰酶消化法與本申請所采用的新型膠原酶和豬彈力蛋白酶消化法分離腸系膜血管平滑肌及原代培養(yǎng)的效果，我們采用既往文獻(xiàn)報(bào)道的方法:利用膠原酶/分散劑(2g/L)組合胰酶(25ug/ml)，采用上述同樣的操作方法進(jìn)行同基因型小鼠腸系膜平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)。
[0029]結(jié)果如圖3和圖4顯示，消化接種5d后，顯微鏡下可見散在零星分布的貼壁血管平滑肌細(xì)胞，鏡下同樣可見散在多數(shù)未貼壁的細(xì)胞呈圓形具有較高折光性。
[0030]本申請采用的新型組合酶消化靜置貼壁3天后，視野內(nèi)即可見大量貼壁及增殖的平滑肌細(xì)胞圍繞在組織塊周圍，且開始呈現(xiàn)峰谷樣生長趨勢。與對比例的組合酶消化和培養(yǎng)的結(jié)果對比，本發(fā)明新型的組合酶消化效果好，細(xì)胞活力強(qiáng)，易貼壁，且接種5天后即可傳代消化生長。而傳統(tǒng)組合酶消化雖然可以得到單個(gè)分離的原代平滑肌細(xì)胞，但接種5天后才有散在少量細(xì)胞貼壁，其余消化的細(xì)胞不貼壁。說明傳統(tǒng)組合酶對血管平滑肌消化時(shí)有較大的損傷效果，分離的細(xì)胞活力差，貼壁慢，且大量細(xì)胞尚未貼壁。因此，對比結(jié)果顯示新型組合酶對小鼠腸系膜血管平滑肌具有很好的分離及保護(hù)細(xì)胞活力的作用，非常適合小鼠原代血管平滑肌培養(yǎng)及傳代。
[0031]參考文獻(xiàn):
1.黃鶯，雷艷，劉榕君，鄭智華胡.三種血管平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng).現(xiàn)代醫(yī)院.2015
2.李萍，鄭蓮星，王伶，程曉曙.反復(fù)貼塊法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞.中國組織工程研究與臨床康復(fù).2007
3.孟立平，蔣承建，趙飛，郭艷，池菊芳，郭航遠(yuǎn).大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改進(jìn).溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2015
4.王關(guān)嵩，楊曉靜，錢桂生，胡義德，蘭陽君.大鼠血管平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)的探討.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào).1998
5.魏峰濤李.紫杉醇抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究.嶺南心血管病雜志.2009
6.彭公永，周玉民，胡國平，蔣永亮，胡錦興.原代培養(yǎng)的大鼠遠(yuǎn)端肺動脈平滑肌細(xì)胞的功能研究.中國藥理學(xué)通報(bào).2012
7.涂永生.氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及周期素dl的表達(dá).中國組織工程研究與臨床康復(fù).2009
8.涂永生，黃紅林，朱炳陽，廖端芳.Π型膠原酶/彈性蛋白酶消化法培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞.中國動脈硬化雜志.2001
9.王春華，霍榮，杜智敏郭楊.糖尿病大鼠冠狀動脈平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的探討.中國藥理學(xué)通報(bào).2007
10.王明勇，陳楓，陳莊.酶消化法培養(yǎng)老齡sd大鼠血管平滑肌細(xì)胞.中國當(dāng)代醫(yī)藥.2011
11.辛毅，張耀中，林箏，張穎，秦彥文.小鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2012:5-10
12.何藺，劉濤，王浩宇，任麗蓉.改良組織塊貼壁法培養(yǎng)小鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞及生物學(xué)鑒定.重慶醫(yī)學(xué).2015
13.芳，田瑞敏，陳建業(yè)張王易.小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞改良分離方法的建立.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2014。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶，其特征在于:組合酶由羅氏膠原混合酶和彈性蛋白酶組成，其混合比例為羅氏膠原混合酶0.5?0.7U、彈性蛋白酶40?70yg。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效分離小鼠動脈血管平滑肌的組合酶，其特征在于:羅氏膠原混合酶型號為Liberase TM Research，貨號為05401119001。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合酶，其特征在于:彈性蛋白酶為Sigma公司的豬彈性蛋白酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合酶，其特征在于:組合酶由羅氏膠原混合酶為LiberaseTM Research和Sigma豬彈性蛋白酶按0.6U: 50yg的比例混合而成。5.—種高效分離小鼠動脈血管平滑肌的方法，包括如下步驟: I)將分離得到的小鼠動脈血管中膜剪成小塊，置于組合酶液中消化； 2 )消化結(jié)束后，將酶液離心，棄上清，得到小鼠動脈血管平滑肌細(xì)胞； 3)其中，組合酶如權(quán)利要求1?4任意一項(xiàng)所述。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:組合酶液中，羅氏膠原混合酶為LiberaseTM Research的濃度為0.6 U/ml，Sigma豬彈性蛋白酶的濃度為50yg/ml。
【文檔編號】C12N9/64GK105950594SQ201610404507
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】鄭凌云, 王麗京, 李香莉
【申請人】廣東藥學(xué)院