本發(fā)明涉及一種活性多肽在制備離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-iii（簡寫為spnp-iii）在制備電壓門控鈉通道工具試劑-nav1.5型鈉通道抑制劑中的用途。

背景技術(shù)：

電壓門控鈉通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程,同時也是治療藥物作用的重要靶標之一。鈉通道在動作電位的產(chǎn)生和傳播過程中的關(guān)鍵性作用，電壓門控鈉通道成為很多動植物毒素的作用靶標。鈉離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國際上的研究熱點。電壓門控鈉通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點。自然界的動物毒素是一類具有很高實用價值和應用前景的工具試劑或藥物導向物質(zhì)，不僅是有毒動物抵御天敵的有力武器，也是從事神經(jīng)生物學和生理學研究、天然創(chuàng)新藥物開發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料,同時也是研究離子通道的獨特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動物等）的毒液中鑒定到了很多作用于鈉通道的活性成分。它們通過與鈉通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動力學特征發(fā)生相應的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鈉通道的分子機制，除了在理論上可深入推測鈉通道亞型之間的功能活動區(qū)別和門控活動機制外，還可以為將它們開發(fā)成治療人類相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-iii在制備電壓門控鈉通道工具試劑-nav1.5型鈉通道抑制劑中的應用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-iii（簡寫為spnp-iii），其氨基酸序列為：

nh2-aspglyglucysglyglyphetrptrplyscysglyargglylysproprocyscyslysglytyralacysserlysthrtrpglytrpcysalavalglualapro-oh,

其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-iii作為單一有效活性組份用于制備nav1.5型鈉通道抑制劑。

所述的一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-iii在制備電壓門控鈉通道工具試劑-nav1.5型鈉通道抑制劑中的應用，其特征在于，所述的蜘蛛抑鈉肽-iii的n端第4位半胱氨酸和第19位半胱氨酸之間，n端第11位半胱氨酸和第24位半胱氨酸之間，n端第18位半胱氨酸和第31位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

該蜘蛛抑鈉肽-iii作為單一有效活性組分用于制備nav1.5型鈉通道抑制劑，以細胞外給藥的方式制備成nav1.5型鈉通道工具試劑。

蜘蛛抑鈉肽-iii在制備nav1.5型鈉通道工具試劑或抑制劑時，配制細胞外給藥的劑量為1μmol/l。

蜘蛛抑鈉肽-iii對nav1.5型鈉通道的抑制呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依從性，是一種較好的nav1.5型鈉通道工具試劑。

附圖說明

圖1是spnp-iii對nav1.5型鈉通道的影響。

圖2是spnp-iii抑制nav1.5型鈉通道的時間-效應關(guān)系曲線。

具體實施方式

為了更好的理解和更充分公開本發(fā)明，下面將通過細胞外給藥途徑，采用轉(zhuǎn)染hek293t細胞模型來說明蜘蛛抑鈉肽-iii的nav1.5型鈉通道抑制作用。

、實驗材料和方法

1.1人胚腎細胞（hek293t）的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

hek293t細胞適應酸性環(huán)境,ph值在6.9～7.1時,可順利貼壁生長,換液時動作要輕。一般用高糖的dmem培養(yǎng)基。

1.1.1細胞的傳代培養(yǎng)

(1)hek293細胞傳代時機為達80-90%匯合，待細胞在60mm培養(yǎng)皿中長滿后，吸掉培養(yǎng)液。

(2)加適量pbs漂洗兩次，吸掉。

(3)加0.5ml0.25%胰酶，搖勻。37℃培養(yǎng)箱中胰酶處理2-3min。于顯微鏡下觀察細胞是否全部脫壁。加入適量10%新生牛血清dmem培養(yǎng)液終止胰酶反應。

(4)用移液管將細胞團輕輕吸打成單個細胞。將細胞按1∶3平均分入裝有預熱培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%co2、15%相對濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2陽離子性的脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染方法:

（1）在轉(zhuǎn)染前一天，對于35mm培養(yǎng)皿，每皿用2ml不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

（2）轉(zhuǎn)染的當天，細胞密度最好達到80-90%，吸掉舊培養(yǎng)液，pbs漂洗一次，換成2ml無血清opti-mem培養(yǎng)液。

（3）每皿dna用量為4μg，用無血清無血清opti-mem培養(yǎng)液分別稀釋到250μl，輕輕混勻,室溫靜置5min。

（4）同時將10μl脂質(zhì)體加入250μl無血清opti-mem培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫靜置5min。

（5）將稀釋的脂質(zhì)體加入等體積dna混勻，室溫靜置20min。

（6）將0.5mldna/脂質(zhì)體復合物輕輕混勻，滴加入細胞中，輕輕混勻，常規(guī)條件培養(yǎng)。

（7）讓dna/脂質(zhì)體復合物與細胞接觸4-6h后，換成10%新生牛血清dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)。24-72h內(nèi)可以進行膜片鉗實驗。

1.2膜片鉗電生理活性實驗

膜片鉗實驗均在室溫（25±1℃）進行，采用全細胞膜片鉗技術(shù)。挑選質(zhì)膜光滑可見、胞質(zhì)均勻的有綠色熒光的hek293t細胞作為實驗細胞。電流記錄通過全細胞膜片鉗技術(shù)利用epc9放大器(heka公司,german)在電腦上進行。計算機記錄和分析系統(tǒng)采用pulse+pulsefit8.0軟件。玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細管（南京泉水教學實驗器材廠）。玻璃電極兩步拉制而成，經(jīng)拋光儀(narishige,japan)拋光后電極尖端直徑約為3μm，充灌電極液后電極電阻為1-3mω。膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，整個實驗過程中溫度的變動最多上下不超過2℃。采用sigmaplot9.0軟件分析實驗結(jié)果。

2、實驗結(jié)果與分析

2.1spnp-iii對nav1.5型電壓門控鈉通道的影響

運用全細胞膜片鉗技術(shù)，我們進一步研究了spnp-iii對瞬時表達于hek293t細胞的鈉通道亞型nav1.5的抑制作用。鈉通道亞型電流以同一種去極化方式誘導：將細胞膜電位鉗制在-100mv，以20ms的時程給予一測試電壓-10mv，每隔5s重復一次。

如圖1所示，1mmspnp-iii對nav1.5通道有一定的抑制作用，其抑制程度為71%。spnp-iii對nav1.5通道的抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度依從性，spnp-iii的半數(shù)有效作用劑量ic50為350nmol/l。spnp-iii對nav1.5鈉通道的抑制具有時間依從性，當濃度增加為1μm時，可在約3min的時間內(nèi)達到最大抑制程度。

2.2spnp-iii對nav1.5型電壓門控鈉通道激活狀態(tài)的影響

在全細胞電壓鉗模式下，將細胞鉗制在-100mv時，分別給予一系列測試電壓，其變化范圍為-80～+60mv，持續(xù)時間為50ms，步幅為+10mv，我們進一步檢測了spnp-iii對nav1.5通道i-v曲線的影響，探究其對鈉通道亞型激活過程的影響，結(jié)果如圖2所示?？瞻讓φ諚l件下，當細胞膜電位鉗制在-100mv時，nav1.5通道的起始激活電壓為-60mv，最大電流峰值激活電壓為-30mv。在細胞周圍加入spnp-iii，毒素與細胞作用3min后，再以相同的去極化脈沖誘導i-v曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)spnp-iii能使nav1.5鈉通道的起始激活電位和峰值電流激活電壓向去極化方向漂移約+10mv，但反轉(zhuǎn)電位變化不明顯，說明毒素與通道的相互作用沒有改變通道對離子通透的選擇性。

sequencelisting

<110>長沙沁才生物科技有限公司

<120>蜘蛛抑鈉肽-iii

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>33

<212>prt

<213>廣西纓毛蛛

<400>1

alacysglyglnphetrptrplyscysglygluglylyspropro

151015

cyscysalaasnphealacyslysileglyleutyrleucysile

16202530

trpserpro

31