專利名稱：抑制血管平滑肌細(xì)胞移動的方法
背景技術(shù)：
細(xì)胞移動在傷口愈合、炎癥、成人呼吸窘迫綜合征及惡性腫瘤發(fā)病中起著重要作用(Savani等，J.Clin，Invest.951158-1168，1995；Kullmann等Am J.Respir.Cell.Mol.Biol.883-88，1993；Brooks等，Cell79，1157-1164，1994)。血管平滑肌細(xì)胞由介質(zhì)向內(nèi)膜的移動在新內(nèi)膜形成中起至關(guān)重要的作用，這是導(dǎo)致的血管疾病的致病機理，這些血管疾病如動脈粥樣硬化、PTCA后再狹窄及靜脈旁路動脈粥樣硬化(Jackson等，Arteriosclerosis and Thrombosis131218-1226，1993；Brown等，Cardiovascular Res.281815-1820，1995；Bell和Madri等，Am.J.Pathol.1377-12，1990)。在血管受傷的動物模型中已發(fā)現(xiàn)，使用刺激平滑肌細(xì)胞移動的生長因子的抗體或使用阻斷整聯(lián)因子(integrin)介導(dǎo)細(xì)胞移動的肽可以抑制新內(nèi)膜形成(Ferns等，Science 2531129-1132，1991，Choi等，J.Vasc.Surg.19125-135，1994)。
經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)后血管再狹窄表明為組織反應(yīng)，其特征是分為早期和晚期。血栓形成和/或血管痙攣發(fā)生在早期，在PTCA后幾小時至幾天內(nèi)發(fā)生。晚期似乎由SMC移動、增殖及血管再造所支配。在這種疾病中，由介質(zhì)向內(nèi)膜的移動造成的SMC積累的增加是這種疾病的主要病理機制。血管平滑肌細(xì)胞的過量增殖及移動可能是PTCA、動脈切開術(shù)、激光血管成形術(shù)及動脈旁路移植手術(shù)后冠狀動脈再栓塞的主要機理。見《平滑肌細(xì)胞的內(nèi)膜增殖-經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)后復(fù)發(fā)冠狀動脈狹窄的解釋》，Austin等，Journal of the AmericanCollege of Cardiology 8369-375(1985年8月)。
通過經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)、動脈切開術(shù)、激光血管成形術(shù)及動脈旁路移植手術(shù)對栓塞動脈進(jìn)行外科手術(shù)后，血管再栓塞仍是主要的、長期的并發(fā)癥。進(jìn)行PTCA的病人約有35％在術(shù)后三至六個月內(nèi)發(fā)生再狹窄。目前治療血管再狹窄的辦法包括用器械如斯坦特固定模進(jìn)行器械介入或藥物療法，包括使用肝素、低分子量肝素、香豆素、阿斯匹林、魚油、鈣離子拮抗劑、甾類及前列環(huán)素。這些方法不能控制再栓塞率，不能有效地治療和預(yù)防血管再狹窄。參見《經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動脈成形術(shù)后預(yù)防再狹窄“魔微粒”的研究》，Hermans等，AmericanHeart Journal 122171-187(1991年7月)。
再狹窄的發(fā)病機理由于血液和損傷動脈血管壁中細(xì)胞成份產(chǎn)生的生長因子造成過量的細(xì)胞增殖和移動，這些又介導(dǎo)血管再狹窄中平滑肌細(xì)胞的增殖。
能抑制平滑肌細(xì)胞移動的藥物可用于治療和預(yù)防再狹窄。本發(fā)明提供了應(yīng)用化合物作為平滑肌細(xì)胞移動抑制劑。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了抑制人或其它哺乳動物受試者血管平滑肌細(xì)胞移動的方法，該方法包括給所述受試者使用藥學(xué)上有效劑量的式I化合物及其藥用鹽及溶劑化物，

其中R1和R3獨立地為氫、-CH3、

其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷子基(pyrrolidino)、六亞甲基亞氨基或哌啶子基。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)所選式I化合物可用于抑制血管平滑肌細(xì)胞移動。本發(fā)明提供的治療方法是給需要的人或其它哺乳動物一定劑量能有效抑制血管平滑肌細(xì)胞移動的式I或式II化合物或其藥用鹽或溶劑化物。
術(shù)語“抑制”包括其通?？山邮艿暮x，包括給經(jīng)受平滑肌細(xì)胞移動的病人預(yù)防性治療，及防止和/或治療現(xiàn)存的平滑肌細(xì)胞移動。這樣，本方法包括適當(dāng)?shù)乃幬镏委熀?或預(yù)防給藥。
通常，將本發(fā)明化合物與普通的賦形劑、稀釋劑或載體一起配制，并壓制成片劑，或者配制成方便口服給藥的酏劑或溶液劑；或者通過肌內(nèi)或靜脈途徑給藥的溶液劑。該化合物可以經(jīng)皮給藥，并且可以配制成緩釋劑型等。
本發(fā)明方法所使用的式I化合物可以按已有的方法(例如US4,133,814、4,418,068和4,380,635中所述的方法，這些專利引入本文作為參考)制備。一般，該方法用具有6-羥基和2-(4-羥苯基)基團(tuán)的苯并[b]噻吩開始。將起始化合物保護(hù)、烷基化并脫保護(hù)，得到式I化合物。在上述美國專利中提供了這些化合物的制備實例。
本發(fā)明中包括的是下列化合物的用途

取代的苯基包括由C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羥基、硝基、氯、氟或三(氯或氟)甲基一次或二次取代的苯基。
用于本發(fā)明方法的化合物可以與多種有機和無機酸、堿生成藥學(xué)上適用的酸和堿加成鹽，藥學(xué)上適用的酸和堿加成鹽包括通常用于藥物化學(xué)中的生理上適用的鹽。所述鹽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。用于生成上述鹽的典型的無機酸包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、連二磷酸等?？梢詰?yīng)用由有機酸生成的鹽，有機酸包括脂肪族一或二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸和羥基鏈烷二酸，芳香族酸，脂肪族和芳香族磺酸。因此所述藥學(xué)適用的鹽包括乙酸鹽、苯基乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙烯酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、氯代苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、鄰-乙酰氧基苯甲酸鹽、萘-2-苯甲酸鹽、溴化物、異丁酸鹽、苯基丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽、丁炔-1，4-二酸鹽、己炔-1，4-二酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、氯化物、肉桂酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、羥基乙酸鹽、庚酸鹽、馬尿酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、羥基馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、異煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、對苯二甲酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、丙炔酸鹽、丙酸鹽、苯基丙酸鹽、水楊酸鹽、癸二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、焦硫酸鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磺酸鹽、苯磺酸鹽、對溴苯磺酸鹽、氯代苯磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、甲磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、酒石酸鹽等。優(yōu)選的鹽是鹽酸鹽。
藥學(xué)上適用的酸加成鹽一般可通過式I化合物與等摩爾或過量的酸反應(yīng)制得。反應(yīng)物通常于互溶劑如乙醚或苯中進(jìn)行反應(yīng)。鹽一般在約1小時～10天內(nèi)從溶液中析出，并且可以經(jīng)過濾分離，或者按常規(guī)方法除去溶劑。
通常用于生成鹽的堿包括氫氧化銨、堿金屬和堿土金屬氫氧化物、碳酸鹽和碳酸氫鹽、以及脂族和芳族胺、脂族二胺及羥基烷胺。用于制備加成鹽的堿尤其包括氫氧化銨、碳酸鉀、碳酸氫鈉、氫氧化鈣、甲胺、二乙胺、乙二胺、環(huán)己胺及乙醇胺。
與化合物(由該化合物衍生得到鹽)相比較，藥學(xué)上適用的鹽通常有提高的溶解度性質(zhì)，因此通常更適用于配制成液劑或乳劑。
藥物制劑可按本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法制備。例如，將化合物與常用的賦形劑、稀釋劑或載體一起配制，并可配制成片劑、膠囊劑、混懸液劑、粉劑等。適用于上述制劑的賦形劑、稀釋劑和載體包括填充劑和增容劑如淀粉、糖、甘露糖醇以及硅衍生物；粘合劑如羧甲基纖維素和其他的纖維素衍生物，藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；阻滯溶解劑如石蠟；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如鯨蠟醇、單硬脂酸甘油酯；吸附載體如高嶺土和膨潤土；以及潤滑劑如滑石、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂以及固體聚乙二醇。
本發(fā)明的化合物也可以配制成方便口服給藥的酏劑或溶液劑，或者配制成適于非經(jīng)胃腸道(如經(jīng)肌內(nèi)、皮下或靜脈途徑)給藥的溶液劑。另外，本發(fā)明化合物還非常適用于配制成緩釋劑型等。緩釋制劑可以這樣構(gòu)成，以使它們僅僅或最好在腸道的特定部位，可能在一定時間內(nèi)釋放活性成分。包衣、包膜和保護(hù)基質(zhì)可以由例如聚合物質(zhì)或蠟制成。
根據(jù)本發(fā)明，抑制平滑肌細(xì)胞遷移而需使用的式I化合物的具體劑量取決于由主治醫(yī)師確定的病癥嚴(yán)重程度、給藥途徑及相關(guān)因素。通?？山邮懿⒂行У娜談┝繛榧s0.1至約1000毫克/天，更典型的是約50至200毫克/天?？擅刻煲淮位蛉谓o需要所述治療的患者施用此劑量，或者根據(jù)需要增加給藥次數(shù)，以有效抑制平滑肌細(xì)胞遷移。
為了治療血管平滑肌細(xì)胞移動或再狹窄，可以通過多種技術(shù)在發(fā)病部位或接近發(fā)病部位局部施用有效抑制劑量的活性化合物。局部給藥技術(shù)的實例不是要限制而旨在說明現(xiàn)有技術(shù)。實例包括導(dǎo)管局部給藥、位點特異載體、移植物、直接注射或直接施用。
通過導(dǎo)管局部給藥是將藥物制劑直接施用于損傷部位。使用氣囊導(dǎo)管進(jìn)行局部給藥的實例見EP 383 492 A2及US 4636(Wolinsky，1987年1月13日)。
通過移植物局部給藥是指通過手術(shù)將含藥物制劑的骨架植入損傷部位，被植入的骨架通過擴(kuò)散、化學(xué)反應(yīng)或溶劑活化劑釋放藥物制劑。見Lange，Science 2491527-1533(1990年9月)。
通過移植物局部給藥的一個實例是使用斯坦特固定模。該模通過機械作用防止冠狀動脈萎陷或再梗塞。將藥物制劑加入該?？芍苯訉⑺幬镛D(zhuǎn)運到發(fā)病部位。通過此項技術(shù)的局部給藥見Kohn，PharmaceuticalTechnology(1990年10月)。
給藥系統(tǒng)的另一實例是將含藥劑的聚合物以液體形式注射到損傷部位。聚合物隨即就地形成移植物而起治療作用。此技術(shù)描述于PCTWO 90/03768(Donn，1990年4月19日)。
另一實例是通過聚合物內(nèi)腔包封輸送藥物。此技術(shù)使用插管將聚合物移植物涂在腔的內(nèi)表面。于是摻入生物可降解聚合物移植物中的藥物在手術(shù)部位釋放。參見PCT WO 90/01969(Schindler，1989年8月23日)。
通過移植物局部給藥的最后一個實例是將囊泡或微粒直接注射入發(fā)病部位。這些微?？梢杂傻鞍踪|(zhì)、脂、碳水化合物或合成聚合物組成。這些微粒中或在其外做為包衣中摻有藥物。含微粒給藥系統(tǒng)的描述見Lange，Science 2491527-1533(1990年9月)及Mathiowitz等，J.App.Poly.Sci.，26809(1981)。
通過位點特異載體的局部給藥是指將藥物附著在載體上，然后將其直接引導(dǎo)至損傷部位。該給藥技術(shù)的實例包括使用載體如蛋白質(zhì)配位體或單克隆抗體。見Lange，Science 2491527-1533(9月)。
直接施用的局部給藥包括局部給藥方法的使用。通過直接施用的局部給藥的實例為在手術(shù)過程中將藥物直接施于動脈旁路移植物上。
如應(yīng)用帶有堿性基團(tuán)(如哌啶子基環(huán))的藥物時慣用其酸加成鹽一樣，通常優(yōu)選應(yīng)用式I化合物的酸加成鹽形式。通過口服途徑給老年人(如絕經(jīng)婦女)施用該化合物也是有利的。為此目的，以下口服劑型是適用的。
制劑在以下制劑中，“活性成分”是指式1化合物。
制劑1明膠膠囊劑硬明膠膠囊劑按下面方法制備成分 量(mg/膠囊)活性成分 0.1-1000淀粉，NF 0-650可流動的淀粉粉末 0-650聚硅氧烷流體(350厘沲) 0-15將上述成分混合，通過美國45號篩并將其裝入硬明膠膠囊。
其中所述化合物為雷洛昔芬的具體膠囊劑實例包括下列制劑
制劑2雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)雷洛昔芬 1淀粉，NF 112可流動的淀粉粉末 225.3聚硅氧烷流體(350厘沲) 1.7制劑3雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)雷洛昔芬 5淀粉，NF 108可流動的淀粉粉末 225.3聚硅氧烷流體(350厘沲) 1.7制劑4雷洛昔芬膠囊劑成分量(mg/膠囊)雷洛昔芬 10淀粉，NF 103可流動的淀粉粉末 225.3聚硅氧烷流體(350厘沲) 1.7
制劑5雷洛昔芬膠囊劑成分 量(mg/膠囊)雷洛昔芬 50淀粉，NF 150可流動的淀粉粉末 397聚硅氧烷流體(350厘沲) 3.0按照提供的合理的改變，可以將上述具體的配方進(jìn)行變化。
用下述成分制備片劑制劑6片劑成分 量(mg/片)活性成分 0.1-1000微晶纖維素 0-650煅制的二氧化硅 0-650硬脂酸 0-15將上述成分混合并壓制成片劑。
另外，每片含0.1～1000mg活性成分的片劑可以按下法制備制劑7片劑成分量(mg/片)活性成分0.1-1000淀粉 45微晶纖維素35聚乙烯吡咯烷酮(為10％的水溶液)4羧甲基纖維素鈉4.5硬脂酸鎂 0.5滑石 1
將活性成分、淀粉和纖維素通過美國45號篩，并充分地混合。使聚乙烯吡咯烷酮溶液與得到的粉末混合。然后再通過美國14號篩。得到的顆粒于50～60℃干燥并通過美國18號篩。將預(yù)先通過美國60號篩的羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂和滑石加到顆粒中，在混合以后將其在壓片機上壓制成片劑。
每5ml劑量含0.1-1000mg藥物的混懸液劑可按下示制備制劑8混懸液劑成分 量(mg/5ml)活性成分 0.1-1000mg羧甲基纖維素鈉 50mg糖漿 1.25mg苯甲酸溶液 0.10ml調(diào)味劑 適量著色劑 適量純水 加至5ml將活性成分通過美國45號篩并與羧甲基纖維素鈉和糖漿混合得到調(diào)勻的膏狀物。將苯甲酸溶液、調(diào)味劑和著色劑用一定量的水稀釋并邊攪拌邊加入其中，然后加入足夠的水至所需的體積。
測試方法本發(fā)明化合物具有抑制血管平滑肌移動的能力，證明如下豬主動脈平滑肌細(xì)胞在當(dāng)?shù)赝涝讏鰪膭偼涝椎男坌员婚幐钬i中獲取豬主動脈。用類似于上述方法(Bonin等，1989年)制備平滑肌細(xì)胞。簡言之，縱向切割主動脈，用切片刀輕輕刮腔表面以除去內(nèi)皮。然后，在滅菌的、由達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、10％牛胎血清、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/ml)及鏈霉素(100μg/ml)組成的生長培養(yǎng)基中，將該主動脈清洗幾次。再從外膜將中間平滑肌細(xì)胞條剝離并切成1-2mm的小片。將此移植物置于裝有上述生長培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)皿中。在5-7天內(nèi)，觀察移植物上細(xì)胞的生長情況。10-14天后，取出移植物，使細(xì)胞受胰蛋白酶作用，并在裝有15ml此生長培養(yǎng)基的T75燒杯中傳代培養(yǎng)。
人平滑肌細(xì)胞從Clonetics Corporation(San Diego，CA)購買人冠狀動脈及主動脈平滑肌細(xì)胞。按豬平滑肌細(xì)胞所述，將所述兩種細(xì)胞培養(yǎng)于生長培養(yǎng)基中。
平滑肌細(xì)胞移動試驗用改進(jìn)的Boyden氏趨化試驗裝置進(jìn)行豬及人主動脈平滑肌細(xì)胞對于血小板生長因子梯度的直接移動試驗，該Boyden氏趨化試驗裝置使用96轉(zhuǎn)移孔(transwell)系統(tǒng)和帶有8μm孔的聚碳酸酯過濾器(NeuroProbe，Inc.，Cabin John，NJ)。將生長于T75燒瓶中的平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無酚紅的含有2％牛胎血清、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/ml)及鏈霉素(100μg/ml)的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基/F12培養(yǎng)基(DMEM/F-12)中。24小時后，用無酚紅胰蛋白酶/EDTA(Gibco，BRL)使細(xì)胞受胰蛋白酶作用。將此細(xì)胞(2.5×106個/ml)懸浮于含1％貧血小板血漿的、不同濃度的式I化合物的、無酚紅的DMEM/F12中。將100μl細(xì)胞懸液加到改進(jìn)的Boyden氏趨化試驗裝置上面的孔中。Boyden氏趨化試驗裝置下面的孔中裝有含1％貧血小板血漿、5ng/ml PDGF及不同濃度化合物的43μl DMEM/F-12。Boyden氏趨化試驗裝置在37℃、5％CO2氣氛下孵育5小時。由Boyden氏趨化試驗裝置中取下移動膜并用棉簽移除膜上部的細(xì)胞。在甲醇中固定移動至膜下部的細(xì)胞并用Diff-Quick染色液(Baxter)染色。用微量滴定板計數(shù)器(ThermoMax，Molecular Dynamics，Inc.)以分光光度法或通過倒置顯微鏡(Nikon，Inc.)在40倍高倍視野(HPF)下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)來定量測定細(xì)胞移動。
試驗中細(xì)胞與化合物預(yù)孵育時，藥物以確定的濃度加入預(yù)處理培養(yǎng)基中，并分別在燒瓶中孵育18小時。在這些預(yù)處理試驗中，細(xì)胞的試驗條件應(yīng)與所述急性藥物作用試驗中所用條件完全相同。
表I血小板衍生生長因子(PDGF)刺激豬主動脈平滑肌細(xì)胞(SMC)移動PDGF(ng/ml) SMC移動(O.D.650nm)0.04 0.016±0.0080.80 0.009±0.0031.50 0.013±0.0073.00 0.028±0.0086.00 0.058±0.01012.0 0.052±0.00725.0 0.047±0.009表II化合物A*及β-雌二醇對PDGF引起的豬主動脈SMC移動的抑制SMC移動(O.D.650nm)濃度(nM)化合物A β-雌二醇0.00.053±0.015 0.053±0.0150.10.035±0.005 0.032±0.0031.00.030±0.005 0.023±0.00310 0.032±0.007 0.034±0.006*化合物A為R1及R3為氫而R2為哌啶子基的式I化合物。
上述活性試驗表明，本發(fā)明化合物抑制血管平滑肌細(xì)胞移動及其作用是有效的。
權(quán)利要求
1.一種抑制血管平滑肌細(xì)胞移動的方法，該方法包括給需要治療的人或其它哺乳動物使用有效劑量的下式化合物及其藥用鹽和溶劑化物
其中R1和R3獨立地為氫、-CH3、
其中Ar是任意取代的苯基；R2選自吡咯烷子基、六亞甲基亞氨基或哌啶子基。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物是其鹽酸鹽。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物是下式化合物或其鹽酸鹽，
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述給藥是為了抑制動脈粥樣硬化、再狹窄、炎癥或惡性腫瘤侵入。
全文摘要
抑制血管平滑肌細(xì)胞移動的方法,該方法包括給需要治療的人或其它哺乳動物使用有效劑量的式(Ⅰ)化合物或其藥學(xué)上適用的鹽或溶劑化物,其中R
文檔編號A61K31/4453GK1191487SQ96195651
公開日1998年8月26日 申請日期1996年5月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月1日
發(fā)明者J·P·辛格, T·R·維爾尼基 申請人:伊萊利利公司