干燥轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及干燥轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物，所述組合物可通過將包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、鹽和至少一種另外的選自糖、氨基酸和緩沖液的組分的含水組合物凍干或噴霧干燥而獲得，其中含水組合物中鹽的濃度范圍為5?100 mM。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及制備所述干燥轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物的方法、復(fù)溶溶液、藥物組合物以及治療方法。
【專利說明】干燥轉(zhuǎn)谷氨醜胺酶組合物
[0001 ] 本申請是申請日為2009年4月20日、申請?zhí)枮?00980124151.5、發(fā)明名稱為"干燥 轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物"的發(fā)明專利申請的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物，具體地講是凝血因子XIII的穩(wěn)定的凍干或噴霧 干燥組合物，而且還設(shè)及制備所述組合物的方法、復(fù)溶溶液、藥物組合物W及治療方法。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶是化h依賴性酶，該酶催化蛋白質(zhì)中的谷氨酷胺側(cè)鏈丫-甲酯胺基與 賴氨酸側(cè)鏈E-氨基之間形成異膚鍵。轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶存在于細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶 的實(shí)例包括因子XIII、表皮轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶、II型轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(組織型轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶、肝轉(zhuǎn) 谷氨酷胺酶)和I型轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶）。
[0005] 凝血因子Xin(FXIII)是血漿轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶，亦稱為"血纖維連接酶"和"血纖蛋白 穩(wěn)定因子"，其在血漿中的循環(huán)濃度為20微克/ml。該蛋白質(zhì)在血漿中W由兩個(gè)A亞基和兩個(gè) B亞基組成的四聚體(A2B2)存在。每個(gè)亞基的分子量約為SOOOODa,整個(gè)蛋白質(zhì)的分子量約為 330000化。A亞基含有轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶催化部位，而B亞基沒有催化活性，但是卻起著結(jié)構(gòu)蛋白 的作用，保護(hù)A亞基不被清除。
[0006] 因子XIII的活化取決于凝血酶和化2+。凝血酶在A亞基Ar的7的C端側(cè)切割，從而釋 放出活化膚(A亞基的殘基1-37)和B亞基，留下活性形式的A2二聚體?；罨腇XIII A2亞基 (FXIIIa)是FXIII的催化活性形式。
[0007] FXIII酶是凝血級聯(lián)中被激活的最后一個(gè)酶，其作用是使a-血纖蛋白鏈與丫-血纖 蛋白鏈交聯(lián)，形成對血纖蛋白溶解的抗性提高的更牢固的凝塊。此外，多種抗纖維蛋白溶 解、促止血和黏附蛋白交聯(lián)成凝塊，因此提供牢固的血纖蛋白結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對纖維蛋白溶酶 和其它蛋白水解酶溶解的機(jī)械阻力增強(qiáng)。
[000引在許多情況下，市售可得的純或部分純的轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶或因子XIII制品含有添加 的穩(wěn)定劑，例如人血清白蛋白化SA)。蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的使用尚有疑問，因?yàn)楫?dāng)給予患者時(shí)，其 降低蛋白質(zhì)比活，增加蛋白質(zhì)負(fù)荷，并且可能干擾純度評價(jià)。還可能使蛋白質(zhì)制品產(chǎn)生免疫 原性。蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的運(yùn)些缺點(diǎn)使得它們特別不利于穩(wěn)定非常純的蛋白質(zhì)（例如重組蛋 白）。另外，當(dāng)加入例如白蛋白時(shí)，蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的使用可能會(huì)造成被病毒抗原污染。
[0009] 自胎盤或血漿分離FXIII或者新鮮冰凍血漿形式的FXIII多年來一直被用來治療 因子XIII缺陷癥。然而，運(yùn)些制劑受含有外源蛋白質(zhì)的缺點(diǎn)W及與之相連的所有問題(例如 不利的免疫原性)所困。
[0010] 目前可采用重組DNA技術(shù)來制備轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶和因子XIII。本文所使用的rFXIII 是指重組因子XIII。然而迄今為止，市場上尚無市售的rFXin產(chǎn)品。
[0011] 用于治療的蛋白質(zhì)制品中的組合物和活性必須在相對較長的時(shí)間內(nèi)處于穩(wěn)定。在 溶液中幾乎不能達(dá)到運(yùn)種穩(wěn)定性，因此，運(yùn)類產(chǎn)品通常W干燥狀態(tài)銷售。適度的冷凍干燥 (凍干)是將運(yùn)類產(chǎn)品干燥的精選方法之一。然而，即使當(dāng)采用運(yùn)種方法時(shí)，也難W得到滿足 完整性和持久性需要的穩(wěn)定制品。
[0012] 例如，轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶或因子XIII溶液的冷凍干燥可能導(dǎo)致活性明顯下降W及純度 損失。例如，冷凍干燥的因子XIII的另一個(gè)問題是由因子XIII的降解產(chǎn)物造成的，因子XIII 的降解產(chǎn)物即所謂的非蛋白酶水解活化型(FXIIIa°)，亦稱為前激活因子XIII。一般認(rèn)為 尸乂111曰°會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性風(fēng)險(xiǎn)，注射FXIIIa°可能引起潛在的不良副作用。因此，需要使轉(zhuǎn) 谷氨酷胺酶或因子XIII制劑穩(wěn)定W免形成非蛋白酶水解活化產(chǎn)物。
[0013] 本領(lǐng)域已知各種干燥FXIII組合物。下面公開的是凍干FXHI組合物的公開內(nèi)容的 實(shí)例。W02002/36155披露了可W用ImM抓TA、IOmM甘氨酸、2 %薦糖的水溶液，或者用20mM組 氨酸、3% (重量/體積)薦糖、2mM甘氨酸和0.01 % (重量/體積)聚山梨醇醋(pH 8.0)來制備 凍干FXIII組合物。US 6204036(Aventis Behring)設(shè)及穩(wěn)定的凍干轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶制劑，所 述制劑包含至少一種選自D-氨基酸和レ氨基酸及其鹽、衍生物、類似物和二聚體、糖和糖 醇、表面活性成分和還原劑的添加劑，前提條件是添加劑不是甘氨酸，也不是精氨酸，其中 所述制劑不含蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，且其中所述制劑在適用于胃腸外給藥的含水溶劑中是溶解 的，并無任何濁度。
[0014] 然而，上述運(yùn)些制劑可能受上述高水平非蛋白酶水解活化的因子XIII的缺點(diǎn)所 困，一般認(rèn)為運(yùn)有礙于運(yùn)些制劑的臨床和商業(yè)可行性。因此顯而易見的是，非常需要具有低 水平非蛋白酶水解活化產(chǎn)物的穩(wěn)定的干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶和因子XIII制劑。而且，運(yùn)類制劑 不需要添加蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，例如HSA。
[001引發(fā)明概述
[0016] 本發(fā)明基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即就純度和前激活轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶的形成而言，鹽(例 如一價(jià)鹽)對干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(例如因子XIII)組合物具有明顯的穩(wěn)定效應(yīng)或作用。運(yùn)種 效應(yīng)是干燥狀態(tài)特有的，并且對于生產(chǎn)穩(wěn)定的商品特別重要。
[0017] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物，所述組合物可通過將含水組 合物凍干或噴霧干燥而獲得，所述含水組合物包含轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶、鹽和至少一種另外的選 自糖、氨基酸和緩沖液的組分，其中含水組合物中鹽的濃度范圍為5-1 OOmM。
[0018] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供制備所述干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物、復(fù)溶溶液、藥物組 合物的方法W及治療方法。
[0019] 本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢從下面的發(fā)明詳述來看是顯而易見的。然而，應(yīng)當(dāng) 了解的是，發(fā)明詳述和具體實(shí)施例雖然提供本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但只是通過實(shí)例給出， 因?yàn)閺陌l(fā)明詳述來看，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變動(dòng)和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯 而易見的。
[0020] 附圖描述
[0021 ] 圖1:薦糖和NaCl水平的評價(jià)。25mMNaCl對保存于40°C的樣品的AIE-HPLC純度的作 用的Modde分析。
[0022] 圖2: NaCl和組氨酸水平的全析因研究。25 °C rFXII Ia°數(shù)據(jù)的Modde分析。
[0023] 圖3:NaQ和組氨酸水平的全析因研究。AIE-HPLC純度數(shù)據(jù)的Modde分析。
[0024] 定義
[002引本發(fā)明的術(shù)語"前激活"或"非蛋白酶水解活化"轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶是指不是蛋白酶水 解激活的轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶，例如當(dāng)因子XIII在凝血酶(凝血酶具有蛋白水解切割FXHI的能 力)不存在時(shí)被激活，便被稱為非蛋白酶水解活化;有關(guān)參考文獻(xiàn)可參見例如化Igar J.等， Biochem J 1990;267:557-600Muszbek L.等，Ilirombosis Research 94(1999)271-305。作 為FXIII的降解產(chǎn)物的非蛋白酶水解活化因子XIII(FXIIr )不利于FXHI藥物組合物的效 力(viability),因?yàn)橐话阏J(rèn)為運(yùn)種降解產(chǎn)物會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性風(fēng)險(xiǎn)。
[0026] 本文使用的術(shù)語"生物活性"是指在生物中具有活性，例如醫(yī)學(xué)活性、農(nóng)業(yè)活性或 美容活性。
[0027] 本發(fā)明的術(shù)語"含水組合物"是指包含液體水分的組合物。運(yùn)類組合物通常是溶液 或懸浮液。用于本
【發(fā)明內(nèi)容】
的術(shù)語"含水組合物"是指包含W重量計(jì)至少50% (重量/重量） 的水的制劑。
[0028] 本發(fā)明的術(shù)語"稀釋劑"是指液體溶液或懸浮液。用于本
【發(fā)明內(nèi)容】
的術(shù)語"稀釋劑" 是指包含W重量計(jì)至少50% (重量/重量)水的溶液或懸浮液。在本發(fā)明的情況下，稀釋劑用 于干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物的復(fù)溶。
[0029] 所有參考文獻(xiàn)，包括本文引用的出版物、專利申請和專利都通過引用其整體特此 結(jié)合，其程度與每個(gè)參考文獻(xiàn)單獨(dú)而具體指明通過引用結(jié)合一樣，并W其整體列舉在本文 中（至法律允許的最大程度）。
[0030] 所有標(biāo)題和副標(biāo)題在本文中僅出于方便而使用，不應(yīng)解釋為W任何方式限制本發(fā) 明。
[0031] 本文提供的任何和全部實(shí)例或示例性語言(諸如"例如"）的使用，僅僅是為了更好 地說明本發(fā)明，并非對本發(fā)明的范圍提出限制，除非另有要求。本說明書中的任何語言都不 應(yīng)解釋為表示任何非要求保護(hù)的要素是實(shí)施本發(fā)明必需的。
[0032] 本文對專利文件的引用和結(jié)合只是出于方便，并不反映對運(yùn)類專利文件的有效 性、專利性和/或可實(shí)施性有任何觀點(diǎn)。
[0033] 本發(fā)明包括適用法律所允許的隨附權(quán)利要求書中所述主題的所有修改和等同內(nèi) 容。
[0034] 發(fā)明詳述
[0035] 本發(fā)明提供轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物，具體地講是穩(wěn)定的凍干或噴霧干燥的轉(zhuǎn)谷氨酷 胺酶(例如凝血因子Xin(FXIII))組合物。本發(fā)明還提供制備所述干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合 物、復(fù)溶溶液、藥物組合物的方法及治療方法。
[0036] 本發(fā)明提供包含轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(例如因子XIII)的產(chǎn)品，其具有在整個(gè)轉(zhuǎn)谷氨酷胺 酶產(chǎn)品的制備過程、膽存和使用期間均可接受的純度水平和前激活水平。
[0037] 就前激活水平和總純度而論，提供穩(wěn)定性改進(jìn)的本發(fā)明的組合物包含干燥轉(zhuǎn)谷氨 酷胺酶組合物，所述組合物可通過將包含轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶、鹽和至少一種另外選自糖、氨基酸 和緩沖液的組分的含水組合物凍干或噴霧干燥而獲得，其中含水組合物中鹽的濃度范圍為 5-lOOmM。
[003引在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的干燥組合物包含干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物，所述組 合物可通過將包含轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶、鹽和至少一種另外選自糖、氨基酸和緩沖液的組分的含 水組合物凍干或噴霧干燥而獲得，其中含水組合物中鹽的濃度范圍為5-lOOmM，前提條件是 組合物不是通過將含有0.5%化Cl和2.25%甘氨酸的因子XIII溶液凍干而獲得的干燥因子 XIII組合物。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的干燥組合物不含任何蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，例如白蛋白。
[0040] 下述實(shí)施方案和實(shí)施例主要描述和公開了重組FXIII (rFXII I)的組合物，但是本 發(fā)明并不限于運(yùn)些實(shí)施方案和實(shí)施例，而是可適用于目前已知的或未來開發(fā)的任何轉(zhuǎn)谷氨 酷胺酶的組合物。
[0041 ] 組合物的組分
[0042]本發(fā)明的組合物包含轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶。可通過本發(fā)明的制劑穩(wěn)定的轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶的 實(shí)例包括但不限于因子XIII、表皮轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶、II型轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(組織型轉(zhuǎn)谷氨酷胺 酶、肝轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶)和I型轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶）。
[00創(chuàng) 因子XIII
[0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物包含因子XIII化合物。因子 XIII化合物可W是例如天然野生型因子XIII和因子XIII的天然等位變異體。運(yùn)些FXIII化 合物可W來源于例如人或其它動(dòng)物源，例如人FXIII、豬FXIH和牛FXIII。人因子XIII的野 生型序列可參見例如EP 268772和EP 236978。本發(fā)明的因子XIII化合物，包括完整的因子 XIII酶原四聚體(A2B2)和因子XII Ia及其亞基，包括A亞基和A2二聚體。
[0045] 本發(fā)明的因子XIII化合物可W是例如保持至少部分野生型因子XIII特有的交聯(lián) 活性的因子XIII的生物活性片段、衍生物或變體。運(yùn)種交聯(lián)活性可通過本領(lǐng)域已知方法測 定。
[0046] 在一些實(shí)施方案中，因子XIII的生物活性片段、衍生物或變體保持10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的野生型因子XIII的交聯(lián)活性。
[0047] 因子XIII的片段、衍生物和變體包括取代、插入和缺失變體。插入變體包含氨基端 和/或簇基端融合W及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。例如，可將插入殘基引入野生 型因子XIII蛋白的成熟編碼序列內(nèi)。缺失變體的特征在于從野生型因子XIII蛋白除去一個(gè) 或多個(gè)氨基酸殘基。一般在編碼蛋白質(zhì)的DNA的核巧酸中通過位點(diǎn)專一誘變來制備運(yùn)些變 體，從而產(chǎn)生編碼變體的DNA，之后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)所述DNA。然而，還可W通過體 外合成制備變體蛋白質(zhì)片段。雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)通常是預(yù)先確定的，但是突 變本身不是預(yù)先確定的。例如，為了使在指定位點(diǎn)的突變性能最優(yōu)化，可W在目標(biāo)密碼子或 目標(biāo)區(qū)進(jìn)行隨機(jī)誘變，并篩選表達(dá)蛋白質(zhì)變體所需活性的最優(yōu)組合。在具有已知序列的DNA 的預(yù)定位點(diǎn)上進(jìn)行取代突變的技術(shù)是眾所周知的，例如M13引物誘變。取代變體是其中除去 至少一個(gè)殘基序列并在其位置上插入不同殘基的變體。氨基酸取代通常為單一殘基的取 代;插入一般約為1-10個(gè)氨基酸殘基;缺失的范圍可約為1-30個(gè)殘基。例如，缺失或插入可 W相鄰的一對進(jìn)行，即2個(gè)殘基的缺失或2個(gè)殘基的插入?？蒞結(jié)合取代、缺失、插入或其任 何組合W得到最終的構(gòu)建體。顯然，將在編碼變體蛋白質(zhì)的DNA中產(chǎn)生的突變不必把該序列 置于讀框外，且優(yōu)選將不會(huì)產(chǎn)生可形成二級HiRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。經(jīng)遺傳工程改造的因子 XIII的變體的一個(gè)實(shí)例是野生型人因子XIII的化13化eu變體（即其中野生型人因子XIII氨 基酸序列第34位的化1殘基被亮氨酸殘基置換的變體）。
[004引本發(fā)明的因子XIII可從多種生物材料中提純，包括天然產(chǎn)生因子XIII的細(xì)胞的裂 解物、勻漿物或提取物，而且還包括通過遺傳工程修飾W產(chǎn)生因子XIII的細(xì)胞，例如用因子 XIII編碼DNA轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。提純因子XIII的方法的實(shí)例可參見W0/2006/021584。
[0049] 本發(fā)明的因子XIII可W通過例如重組DNA技術(shù)來制備。制備重組因子XIII的方法 是本領(lǐng)域已知的。參見例如Davi e等，EP 268,772; Grun血ann等，AU-A-69896/87; Bi shop等， Biochemistry 1990,29:1861-1869;Board等，Thromb.Haemost.1990，63:235-240; Jagadeeswaran等，Gene 1990，86: 279-283; W及Bt湖ter 等，F(xiàn)EBS Lett. 1989，248:105- 110。在一個(gè)實(shí)施方案中，因子XIII A2二聚體在酵母釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的細(xì)胞質(zhì)中制備，參見美國專利申請順序號07/741263。收獲細(xì)胞后裂解，制備 澄清的裂解液。在中性到略微堿性的pH下，使用衍生化瓊脂糖柱，例如DEAE化St-Flow Sepharose?(Pharmacia)等，通過陰離子交換層析法對裂解液進(jìn)行分級分離。然后將洗脫液 濃縮，并通過例如用班巧酸錠緩沖液滲濾調(diào)節(jié)pH至5.2-5.5,從而使因子XIII從柱洗脫液中 沉淀出。然后將沉淀物溶解，并采用常用層析技術(shù)(例如凝膠過濾和疏水相互作用層析法） 進(jìn)一步純化。
[0050] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，因子XIII是重組因子XIII。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方 案中，因子XIII是人因子XIII。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，因子XIII是重組人因子XIII。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，因子XIII是A亞基的二聚體。
[0051] 在待凍干或噴霧干燥的含水組合物中，因子XIII的濃度可在例如一個(gè)大的范圍內(nèi) 變化，在一個(gè)實(shí)施方案中范圍為0.003-100mg/ml，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中范圍為l-30mg/ ml,在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中范圍為2-15mg/ml。
[00對莖
[0053] 本發(fā)明的含水組合物包含鹽或鹽的混合物。鹽用來改進(jìn)干燥組合物在前激活W及 總純度方面的穩(wěn)定性。本發(fā)明的稀釋劑可包含例如鹽或鹽的混合物。在一些實(shí)施方案中，鹽 為一價(jià)鹽。例如，可W使用的一價(jià)鹽的實(shí)例包括但不限于氯化鋼、氯化鐘、乙酸鋼、硫酸鋼、 葡糖酸鋼及其混合物。在一些實(shí)施方案中，鹽為二價(jià)鹽。在一些實(shí)施方案中，鹽為二價(jià)鹽，前 提條件是二價(jià)鹽不是化(II)鹽。
[0054] 例如，所采用的鹽(例如化Cl)的濃度可在一定范圍內(nèi)變化，在一個(gè)實(shí)施方案中，范 圍為 5-lOOmM，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，范圍為 5-99mM、7-95mM、8-90mM、10-80mM、15-70mM、 25-75mM和20-60mM，在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，范圍為25-50mM。
[00巧]糖和糖醇
[0056] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物包含一種或多種糖 或糖醇。例如，用于干燥組合物復(fù)溶的稀釋劑可包含一種或多種糖或糖醇。在本發(fā)明的干燥 組合物中，糖或糖醇可用于在冷凍干燥期間通過防止物理/化學(xué)失穩(wěn)效應(yīng)(例如解折疊)而 使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。例如，可W使用的糖或糖醇的實(shí)例包括但不限于薦糖、甘露糖、海藻糖、乳 糖、麥牙糖、山梨醇、棉子糖、糊精、環(huán)糊精及其衍生物、類似物和混合物。
[0057] 所使用的糖和糖醇的濃度范圍可在例如大的范圍變化，在一個(gè)實(shí)施方案中的范圍 為0.1-15% (重量/重量），在進(jìn)一步的實(shí)施方案中的范圍為0.1-8.5% (重量/重量），在更進(jìn) 一步的實(shí)施方案中的范圍為0.5-5.0% (重量/重量）。
[005引 氨基酸
[0059]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物包含一種或多種氨 基酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用于干燥組合物復(fù)溶的稀釋劑可包含一種或多種氨基 酸。例如，可W使用氨基酸W改進(jìn)凍干或噴霧干燥組合物的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，使 用一種或多種氨基酸來降低組合物膽存期間轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(例如FXIII)聚集體的形成。可 W使用的氨基酸的實(shí)例包括但不限于甘氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、 賴氨酸、丙氨酸、異亮氨酸和半脫氨酸(617、化3、4'肖、6111、16*、1'虹、1^73、41日、116和切3)及 其鹽、衍生物、類似物、二聚體、寡聚體和混合物。
[0060] 合適的衍生物和類似物是眾所周知的。合適的衍生物包括但不限于:簇基的醋、硫 醋和酷胺;氨基的酷化衍生物，包括氨基甲酸醋衍生物;及側(cè)鏈官能團(tuán)的醋、酷胺和醋。合適 的類似物包括例如鳥氨酸(賴氨酸的類似物）、高絲氨酸和Q-氨基下酸。生理上可接受的鹽 也是本領(lǐng)域眾所周知的，可參見例如Remington's化armaceutical Science:D;rug Receptors and Receptor Theory，（第十八片反.），Mack Publishing Co . ,Easton Pa. (1990)。
[0061] 使用的氨基酸的濃度可在例如0.01-10% (重量/重量)的范圍或在0.1-3% (重量/ 重量)的范圍變化。
[006。緩沖液
[0063] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于干燥組 合物復(fù)溶的稀釋劑包含緩沖液。緩沖液是包含某一物質(zhì)的溶液，當(dāng)向該溶液中加入少量酸 或堿時(shí)，所述物質(zhì)能夠防止溶液的pH發(fā)生明顯變化，從而在很大程度上保持溶液的原酸度 或堿度。緩沖液通常包含弱酸或弱堿及其鹽。
[0064] 含水組合物的pH的范圍可為2-10,特別介于7和8之間。上述氨基酸或pH范圍為2- 10的緩沖液可用來促進(jìn)緩沖效果。例如可W使用的緩沖液的實(shí)例包括但不限于乙酸鹽緩沖 液、碳酸鹽緩沖液、巧樣酸鹽緩沖液、甘氨酷甘氨酸緩沖液、組氨酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、 賴氨酸緩沖液、精氨酸緩沖液、憐酸鹽緩沖液(含有例如憐酸二氨鋼、憐酸氨二鋼或憐酸= 鋼）、TRIS[S(^甲基)氨基甲燒]緩沖液、N-二巧圣乙基)甘氨酸緩沖液、N-S(^甲基）甲基 甘氨酸緩沖液、蘋果酸鹽緩沖液、班巧酸鹽緩沖液、馬來酸鹽緩沖液、富馬酸鹽緩沖液、酒石 酸鹽緩沖液、天冬氨酸鹽緩沖液及其混合物。在一些實(shí)施方案中，使用巧樣酸鹽緩沖液、組 氨酸緩沖液、憐酸鋼緩沖液、班巧酸鹽緩沖液和TRIS緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用組氨 酸。
[0065] 所使用的緩沖液的濃度可為例如O-SOmM的范圍，或0-25mM的范圍。
[0066] 其它組分
[0067] 還可將一種或多種其它組分滲入待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復(fù)溶 干燥組合物的稀釋劑中。運(yùn)類另外的成分包括但不限于非離子型表面活性劑、還原劑、馨合 劑、抗氧化劑、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、填充劑、張力調(diào)節(jié)劑（t O n i C i t y m O d i f i e r / tonicity-adjusting agents)、油性溶媒、蛋白質(zhì)（例如人血清白蛋白、明膠或其它蛋白質(zhì)） 和兩性離子物質(zhì)（例如甜菜堿、牛橫酸或氨基酸例如精氨酸、甘氨酸、賴氨酸或組氨酸）。當(dāng) 然，運(yùn)類另外的成分不應(yīng)對本發(fā)明的含水組合物或干燥組合物的總體穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影 響。在運(yùn)方面，可參照Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版，1995。 [00側(cè)非離子型表面活性劑
[0069]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復(fù)溶干 燥組合物的稀釋劑包含非離子型表面活性劑。離子型表面活性劑是通過屏蔽蛋白質(zhì)的臨界 面(例如包裹、固體(solids))而起作用的表面活性劑，可W使用離子型表面活性劑例如改 進(jìn)凍干或噴霧干燥組合物的穩(wěn)定性。例如，可W使用的非離子型表面活性劑的實(shí)例包括但 不限于吐溫80、吐溫20、PEG、嫁蠟醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、失水山梨醇單油酸醋、泊洛沙姆和 聚氧乙締烷基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用吐溫20。
[0070] 例如，所使用的非離子型表面活性劑的濃度可為0.00001-5% (重量/重量）的范 圍，或0.0002%和0.1 % (重量/重量)的范圍。
[0071] 還原劑
[0072] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復(fù)溶干 燥組合物的稀釋劑包含還原劑。使用還原劑(例如抗氧化劑）W除去可破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)定的自 由基?？蒞使用的還原劑的實(shí)例包括但不限于半脫氨酸、N-乙酷基-半脫氨酸、硫代甘油、硫 化鋼、生育酪和谷脫甘膚。
[007引馨合劑
[0074]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復(fù)溶干 燥組合物的稀釋劑包含馨合劑。馨合劑用于除去制劑中的金屬(鐵、銅），并且通常有助于保 護(hù)蛋白質(zhì)免受金屬催化的反應(yīng)。例如，可W使用的馨合劑的實(shí)例包括但不限于邸TA的鹽、巧 樣酸和天冬氨酸及其混合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，馨合劑的濃度為O.lmg/ml到 5mg/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，馨合劑的濃度為0.1 mg/ml到2mg/ml。在本發(fā)明進(jìn)一步 的實(shí)施方案中，馨合劑的濃度為2mg/na到5mg/ml。
[00對抗氧化劑
[0076] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復(fù)溶干 燥組合物的稀釋劑包含抗氧化劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，含水組合物包含甲硫氨酸(或另一種 含硫氨基酸或氨基酸類似物），當(dāng)轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(例如FXIII)是包含至少一個(gè)易于氧化成其 亞諷形式的甲硫氨酸殘基的多膚時(shí)，抑制甲硫氨酸殘基的運(yùn)類氧化。術(shù)語"抑制氧化"是指 氧化類物質(zhì)（甲硫氨酸)隨時(shí)間的積累最小化。甲硫氨酸氧化的抑制導(dǎo)致多膚更多地保持其 適當(dāng)?shù)姆肿有问?。例如，可W使用甲硫氨酸的任何立體異構(gòu)體化、D或DL異構(gòu)體)或其組合。 待添加的量應(yīng)為足W抑制甲硫氨酸殘基氧化的量，使得甲硫氨酸的亞諷形式的量是管理機(jī) 構(gòu)可接受的。運(yùn)通常意味著組合物含有約10%-約30% W內(nèi)的甲硫氨酸亞諷形式。運(yùn)一般可 通過例如按致使加入的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基的摩爾比為約1:1 -約1000:1、例如1〇:1- 約100:1的范圍的量加入甲硫氨酸來實(shí)現(xiàn)。
[0077] 防腐劑
[0078] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復(fù)溶干 燥組合物的稀釋劑包含防腐劑。可按管理機(jī)構(gòu)對多劑量容器內(nèi)容物的要求加入防腐劑。防 腐劑被用作抗微生物劑，W免在從小瓶中抽取多劑量時(shí)受微生物污染。例如，可使用的防腐 劑的實(shí)例包括但不限于苯酪、鄰甲酪、間甲酪、對甲酪、氯甲酪、對徑基苯甲酸甲醋、對徑基 苯甲酸乙醋、對徑基苯甲酸丙醋、對徑基苯甲酸下醋、2-苯氧乙醇、2-苯基乙醇、苯甲醇、= 氯叔下醇、硫柳隸、漠硝丙二醇、苯甲酸、咪挫燒脈、氯己定(Chlorohexidine)、脫氨醋酸鋼、 節(jié)索氯錠、氯苯甘酸（3-對氯苯氧基丙烷-1,2-二醇）及其混合物。例如，防腐劑的濃度為 0.1 mg/ml到20mg/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，防腐劑的濃度為0.1 mg/m巧Ij5mg/ml。在 本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，防腐劑的濃度為5mg/ml到lOmg/ml。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案 中，防腐劑的濃度為lOmg/na到20mg/ml。
[0079] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠使用下述方法，僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法便能分析本發(fā)明的干燥 組合物或含水組合物中一種或多種添加組分對穩(wěn)定性、前激活和純度的作用。
[0080] 干燥組合物一粉末
[0081 ]在凍干或噴霧干燥后，本發(fā)明的組合物為干燥形式。例如，本發(fā)明的干燥組合物可 W為固體、粉末或粒狀物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的干燥組合物為粉末。在膽存期間，該 干燥組合物中殘留水分的水平對干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(例如FXIII)的穩(wěn)定性十分重要。在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，干燥組合物含有3% W下的殘留水分。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，干 燥組合物含有1 % W下的殘留水分。
[0082] 干燥技術(shù)和復(fù)溶
[0083] 本發(fā)明的含水組合物的凍干和噴霧干燥可W采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的凍干和 噴霧干燥方法進(jìn)行：有關(guān)凍干法參見例如Wi 11 iams和Pol 1 i (1984)，J .化renteral Sci .Technol. 38:48-59。有關(guān)噴霧干燥法參見例如Masters，載于Spra}f-Drying 化n化ook (第5版；Lon邑 man Scientific and Technical , Essex , U. K . , 1991)，第491-676頁； Broa化ead等（1992)D;rug Devel.Ind.Pharm.18:1169-1206;W及Mumenthaler等（1994) Pharm.Res. 11:12-20。還可采用其它干燥技術(shù)，例如風(fēng)干，參見(^!rpenter和Crowe(1988)， Cryobiology 25:459-470; W及Rose;r( 1991 )Bio地arm.4:47-53。
[0084] 至于本發(fā)明，當(dāng)提及凍干和噴霧干燥時(shí)，還包括可W采用的其它干燥技術(shù)。例如， 本發(fā)明的表述"待凍干或噴霧干燥的含水組合物"也包括"待用其它干燥技術(shù)干燥的含水組 合物'。
[0085] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的干燥組合物通過凍干獲得。凍干方法通常包括下列 步驟:冷凍步驟、初步干燥步驟和再次干燥步驟。在冷凍步驟中，使含水組合物冷卻。選擇運(yùn) 類冷凍步驟的溫度和持續(xù)時(shí)間，使得組合物中的所有組分完全凍結(jié)。例如，合適的冷凍溫度 約為-40°C。在初步干燥步驟中，在低溫下真空升華除去冷凍期間結(jié)的冰。例如，用于升華的 內(nèi)腔壓力可為例如約40mTorr-400mTorr，溫度可為例如-30°C至-5°C之間。在初步干燥后， 未能通過升華除去的任何殘留量的液體都通過再次干燥（即解吸）除去。在再次干燥期間， 溫度接近或大于環(huán)境溫度。
[0086] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在凍干期間的冷凍步驟中引入退火處理 (annealing)(加熱步驟）。運(yùn)種加熱使得溫度在制劑的冷凍點(diǎn)W下。運(yùn)種退火(加熱步驟)可 進(jìn)一步使本發(fā)明的干燥組合物穩(wěn)定。
[0087]
[0088] 在需要時(shí)，例如當(dāng)給予患者轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(例如FXIII)時(shí)，本發(fā)明的干燥組合物可 用稀釋劑復(fù)溶。復(fù)溶一般在25°C左右的溫度下進(jìn)行，W確保完全水合，但是需要時(shí)可采用其 它溫度。復(fù)溶所需時(shí)間將取決于例如稀釋劑的類型W及轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶和其它組分的量。
[0089] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，稀釋劑是蒸饋水。例如，使用蒸饋水可具有優(yōu)勢，因 為不需要制備單獨(dú)定制的稀釋劑。
[0090] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，稀釋劑是乙醇。
[0091] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，稀釋劑例如可包含一種或多種組分，例如鹽、糖、氨 基酸、緩沖液、非離子型表面活性劑、還原劑、馨合劑、抗氧化劑、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、填 充劑、張力調(diào)節(jié)劑、油性溶媒、蛋白質(zhì)（例如人血清白蛋白、明膠或其它蛋白質(zhì)）和兩性離子 物質(zhì)。稀釋劑包括的組分和運(yùn)些組分的量取決于通過運(yùn)些組分要達(dá)到的理想效果。稀釋劑 的實(shí)例包括但不限于注射用抑菌水(BWFI)、pH緩沖溶液(例如憐酸緩沖鹽溶液）、無菌鹽溶 液和葡萄糖溶液。
[0092] 復(fù)溶溶液中蛋白質(zhì)濃度為至少5mg/ml，例如約lOmg/ml-約400mg/ml、約20mg/ml- 約200mg/ml或約30mg/ml-約150mg/ml。如果從皮下遞送復(fù)溶溶液，則復(fù)溶溶液中的高蛋白 質(zhì)濃度被視為是特別有益的。然而，對于其它給藥途徑，例如靜脈內(nèi)給藥，在復(fù)溶溶液中可 能需要較低的蛋白質(zhì)濃度(例如復(fù)溶溶液中的蛋白質(zhì)約5-50mg/ml或約10-40mg/ml)。在某 些實(shí)施方案中，復(fù)溶溶液中的蛋白質(zhì)濃度比預(yù)干燥制劑中的顯著較高。例如，復(fù)溶溶液中的 蛋白質(zhì)濃度可W是預(yù)干燥含水組合物的約2-40倍、3-10倍和/或3-6倍(例如至少3倍或至少 4倍)。
[0093] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，例如包含因子XIII的干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物膽存 3年W上是穩(wěn)定的，且復(fù)溶溶液使用6周W上是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，例如包 含因子XIII的干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物膽存2年W上是穩(wěn)定的，且復(fù)溶溶液使用4周W上是 穩(wěn)定的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，例如包含因子XIII的干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物膽存1 年W上是穩(wěn)定的，且復(fù)溶溶液使用2周W上是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，不超過 1%的復(fù)溶因子XIII組合物是非蛋白酶水解活化因子XIII。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，不 超過0.5%的復(fù)溶因子XIII組合物是非蛋白酶水解活化因子XIII。
[0094] 示例性變化方案
[0095] 表1和表2是本發(fā)明的示例性變化的非限制性表。
[0096] 表1:示例性變化的非限制性列表
[0100]
[0101] 藥物組合物
[0102] 本發(fā)明提供包含轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(例如因子XIII)的藥物組合物。該藥物組合物包含 本發(fā)明的復(fù)溶溶液或干燥組合物。
[0103] 在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是由醫(yī)生或患者在臨用前加入稀釋劑復(fù)溶的干燥 組合物(例如冷凍干燥或噴霧干燥組合物）。
[0104] 含有轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(例如因子XIII)的本發(fā)明的藥物組合物可W通過若干不同的 途徑給予需要運(yùn)類治療的患者，例如局部(例如用于皮膚或黏膜）、通過避開吸收的途徑(例 如在動(dòng)脈中、靜脈中或屯、臟內(nèi)給藥)及通過設(shè)及吸收的途徑(例如在皮膚中、皮膚下、肌肉內(nèi) 或腹部給藥）。
[0105] 可W通過各種給藥途徑給予有需要的患者本發(fā)明的藥物組合物，例如舌、舌下、口 腔、口服、胃或腸內(nèi)、鼻、肺(例如通過細(xì)支氣管和肺泡或兩者）、表皮、真皮、經(jīng)皮、陰道、直 腸、眼（例如通過結(jié)膜）、尿道或胃腸外。
[0106] 可W各種劑型給予本發(fā)明的藥物組合物，例如溶液劑、混懸劑、乳劑、微乳劑、復(fù)合 型乳劑、泡沫制劑、油膏劑、糊劑、硬膏劑、軟膏劑、片劑、包衣片、漱洗劑(rinse)、膠囊劑(例 如硬明膠膠囊劑或軟明膠膠囊劑）、栓劑、直腸膠囊劑、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、散劑、氣霧劑、 吸入劑、滴眼劑、眼用軟膏劑、眼用沖洗劑(0地thalmic rinse)、陰道栓劑、陰道環(huán)、陰道軟 膏劑、注射溶液劑、原位轉(zhuǎn)化溶液劑（in situ trans化rming solution)(例如原位膠凝、原 位沉積（in situ setting)、原位沉淀或原位結(jié)晶）、輸注溶液劑或植入物。
[0107] 本發(fā)明的藥物組合物還可W(例如通過共價(jià)、疏水或靜電相互作用）與藥物載體、 藥物遞送系統(tǒng)或高級藥物遞送系統(tǒng)混合、結(jié)合或綴合，W進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶(例如因 子XIII)的穩(wěn)定性、提高生物利用度、提高溶解度、降低不良反應(yīng)、實(shí)現(xiàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的擇時(shí)治療和/或提高患者依從性。載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)的實(shí)例包括但 不限于聚合物，例如纖維素及其衍生物、其它多糖(例如葡聚糖及其衍生物、淀粉及其衍生 物）、聚乙締醇、丙締酸醋和甲基丙締酸醋聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙 二醇、載體蛋白（例如白蛋白）、凝膠(例如熱凝膠系統(tǒng)，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的嵌段共 聚物系統(tǒng)）、微團(tuán)、脂質(zhì)體、微球、納米顆粒、液晶及其分散體、脂質(zhì)-水系統(tǒng)的相特征領(lǐng)域技 術(shù)人員熟知的L2相及其分散體、聚合物微團(tuán)、復(fù)乳（自乳化和自微乳化）、環(huán)糊精及其衍生物 和樹狀聚體。
[0108] 本發(fā)明的藥物組合物適用于使用例如定量吸入器、干粉吸入器或霧化器(所有運(yùn) 些是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的裝置)經(jīng)肺給藥的固體、半固體、粉末和溶液制劑。
[0109] 本發(fā)明的藥物組合物適用于W控釋、緩釋、延遲釋放、遲滯釋放或慢速釋放藥物遞 送系統(tǒng)的制劑使用。本發(fā)明的藥物組合物可用于例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知類型的胃腸外控 釋和緩釋系統(tǒng)(兩種系統(tǒng)導(dǎo)致給藥次數(shù)成倍減少)的制劑，例如用于皮下給藥的控釋和緩釋 系統(tǒng)。在不限制本發(fā)明范圍的情況下，有益的控釋系統(tǒng)和組合物的實(shí)例為水凝膠、油質(zhì)凝 膠、液晶、聚合物微團(tuán)、微球和納米微粒。生產(chǎn)用于本發(fā)明藥物組合物的控釋系統(tǒng)的方法包 括但不限于結(jié)晶、縮合、共結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓均化、膠囊化、噴霧干燥、微 囊化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)產(chǎn)生微球、擠出和超臨界流體方法。一般參考文獻(xiàn)參見 Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise，D丄.主編，Marcel Dekker,New York,2000WDrugs and the Pharmaceutical Sciences，第99卷：Protein Formulation and Delivery(MacNally，E.J.主編，Marcel Dekker，化W York,2000)。
[0110] 胃腸外給藥可用注射器(例如筆型裝置的注射器)通過皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈 內(nèi)注射進(jìn)行?；蛘撸改c外給藥可W通過例如輸注累進(jìn)行。W溶液劑或混懸劑形式給予本發(fā) 明的藥物組合物的又一選擇是作為鼻或肺噴霧劑給予。作為另一種選擇，本發(fā)明的藥物組 合物可適于經(jīng)皮給藥，例如通過無針注射、通過貼劑(例如離子導(dǎo)入貼劑)或經(jīng)黏膜(例如口 腔)給藥。
[0111] 對本發(fā)明來說，W其各種語法形式的術(shù)語"治療"是指治愈、逆轉(zhuǎn)、減輕、緩解、改 善、抑制、減至最小、阻止或中止(1)疾病的有害作用，（2)疾病進(jìn)程，或(3)致病因子。
[0112] 在本發(fā)明的情況下，"有效量"的藥物組合物的定義是藥物組合物(例如因子XIII) 的量足W單獨(dú)或與其它所給予的治療劑組合預(yù)防、治愈、逆轉(zhuǎn)、減輕、緩解、改善、抑制、減至 最小、阻止、或中止(1)疾病的有害作用，（2)疾病進(jìn)程，或(3)致病因子。
[0113] 研究表明，因子XIII可用于治療或預(yù)防患有先天性因子XIII缺陷癥的患者W及未 患先天性因子XIII缺陷癥的患者的出血事件，參見例如US 5.1 14.916、US 5.607.917、W0 2002038167、W0 2002036155、W0 200267981和WO 200267980。
[0114] 本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防出血事件的方法，所述方法包括給予有需要的受治療 者有效量的包含F(xiàn)XHI的本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及用于縮 短受治療者的凝血時(shí)間的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者本發(fā)明的藥物組合 物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及用于延長哺乳動(dòng)物血漿中血塊溶解時(shí)間的方法，所 述方法包括給予有需要的受治療者本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明 設(shè)及用于增加哺乳動(dòng)物血漿中血塊強(qiáng)度的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者有效 量的本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及增強(qiáng)哺乳動(dòng)物血漿中血纖 蛋白凝塊形成的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者有效量的本發(fā)明的藥物組合 物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及用于預(yù)防早產(chǎn)嬰兒的腦室出血的方法，所述方法包 括給予有需要的受治療者有效量的本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明 設(shè)及用于在手術(shù)期間或手術(shù)后減少受治療者的手術(shù)相關(guān)失血的方法，所述方法包括給予有 需要的受治療者有效量的本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及用于 治療血友病A的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者有效量的本發(fā)明的藥物組合物。 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及用于治療血友病B的方法，所述方法包括給予有需要的 受治療者有效量的本發(fā)明的藥物組合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及用于治療血 小板疾病的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者有效量的本發(fā)明的藥物組合物。在 進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及用于治療馮威勒布蘭特氏病（von Wi Ilebrand ' S disease)的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者有效量的本發(fā)明的藥物組合物。
[0115] 本發(fā)明的藥物組合物當(dāng)包含F(xiàn)XHI時(shí)，還可用于全身或局部使用W治療疾病，包括 骨愈合或傷口愈合、潰瘍性結(jié)腸炎、硬皮?。⊿Chleroderma)、舍恩萊因-亨諾赫紫齋 (Scholein Henoch PU巧ura)、蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarchnoidal hemorrhage)、腦室出血和 不明原因出血。
[0116] 在運(yùn)些方法進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物(例如包含因子XIII)按WO 200185198中所述方法與有效量的因子Vila組合給予。
[0117] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是給予受治療者的唯一活性劑用于規(guī)定 療法。
[0118] 在一個(gè)實(shí)施方案中，待治療的受治療者是人;在一個(gè)實(shí)施方案中，受治療者患有凝 血酶產(chǎn)生減少;在一個(gè)實(shí)施方案中，受治療者的血纖蛋白酶原的血漿濃度下降（例如多次輸 血的雙治療者的情況）。
[0119] 參照下列實(shí)施例可W更容易地理解W此概述的本發(fā)明，實(shí)施例W實(shí)例方式提供， 并不意味著是對本發(fā)明的限制。 實(shí)施例
[0120] 為了開發(fā)本發(fā)明的組合物，研究了多種組合物及其在膽存期間對組合物后續(xù)穩(wěn)定 性的作用。
[0121 ]實(shí)施例1:因子XIII的凍干和復(fù)溶
[0122] 冷凍干燥實(shí)驗(yàn)在市售可得的凍干機(jī)中進(jìn)行。根據(jù)合適的冷凍干燥程序，將在酵母 細(xì)胞中表達(dá)而制備的重組因子XIII溶液與其它組分一起干燥。然后用蒸饋水將凍干物復(fù) 溶。
[0123] 實(shí)施例2:干燥因子XIII組合物的穩(wěn)定性
[0124] 按照實(shí)施例1，通過凍干制備一系列的干燥rFXIII組合物，并進(jìn)行了穩(wěn)定性研究， 其中通過AIE-HPLC測定了純度，通過SEC-HPLC測定了聚集體。該項(xiàng)研究分析了灌裝水溶液 中所包括的S種NaCl水平:OmM、12.5mM和25mM NaCl，W及四種薦糖水平，參見表3和表4。
[0125] 表3:在NaCl存在和不存在時(shí)對組合物進(jìn)行的研究
[0126]
[0127]表4:薦糖和NaCl的含量
[01
[01
[01
[0131] 表5和圖I中所給出的結(jié)果表明，于40°C膽存的樣品在NaCl與AIE-HPLC純度之間有 統(tǒng)計(jì)顯著性關(guān)系。對樣品的初始純度沒有影響。因此，可W得出結(jié)論，化Cl特異性對干燥狀 態(tài)（即干燥組合物)起作用，從而顯著改進(jìn)干燥rFXin組合物的膽存穩(wěn)定性。
[0132] 實(shí)施例3:全析因研究
[0133] 本研究的目的在于對rFXin的凍干制劑進(jìn)行初步篩選實(shí)驗(yàn)，W研究在凍干時(shí)組氨 酸和氯化鋼對rFXIIIa°形成的作用。利用實(shí)驗(yàn)的全析因設(shè)計(jì)來評價(jià)干燥rFXIII組合物中 20-60mM范圍內(nèi)的組氨酸濃度和O-SOmM范圍內(nèi)的NaCl濃度。
[0134] 表6:實(shí)驗(yàn)因素
[0135：
[0136] 表7:結(jié)果表
[0137]
[0138] 表7及圖2和圖3所給出的結(jié)果表明，加入化Cl對分別于40°C和25°C膽存達(dá)I個(gè)月和 2個(gè)月的樣品的純度及對rFXIIIa°形成具有顯著的穩(wěn)定效應(yīng)。在起始時(shí)間點(diǎn)上加入化Cl對 樣品沒有顯著作用。于25°C2個(gè)月后，本文研究的化Cl和組氨酸水平對通過SE-HPLC得到的 聚集體水平?jīng)]有顯著影響。本研究表明，就％純度和％rFXIIIa°而言，在干燥rFXnI組合物 中包括NaCl顯著改進(jìn)組合物的膽存穩(wěn)定性。
[0139] 實(shí)施例4:復(fù)溶研究
[0140] 進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)W證實(shí)化Cl的穩(wěn)定效應(yīng)是干燥狀態(tài)（即干燥組合物)特有的。在本項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)中，將一小瓶凍干rFXIII組合物用水復(fù)溶，然后分成等體積的兩份，向其中加入一份 化Cl。將該溶液室溫膽存24小時(shí)，然后分析rFXIIIa°。對S種濃度的化Cl進(jìn)行了評價(jià)。實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)見下表8。
[0141] 表8:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一溶液中NaCl對rFXII Ia°形成的作用
[0142]
[01
[01
[0145] 表9給出的結(jié)果表明，與相應(yīng)的不含NaCl的對照溶液相比，在24小時(shí)后含有化Cl的 樣品具有略高的巧乂111曰°值。運(yùn)些結(jié)果表明，就重。乂111曰°形成而言，在濃度范圍25-75mM內(nèi)， 含水組合物中的NaCl不具有穩(wěn)定效應(yīng)?？蒞得出結(jié)論，如上述實(shí)施例的數(shù)據(jù)所證實(shí)的，化Cl 在凍干rFXn I組合物中的穩(wěn)定效應(yīng)是干燥狀態(tài)(干燥組合物)特異性的。運(yùn)種效應(yīng)是出人意 料的，而且在此之前無人知曉。
[0146] 測定法
[0147] 測定法（I):測定FXIIIa°的方法
[014引為了研究凍干對FXIIIa。的量的作用，可W通過酶促FXIII活性測定法(enzymatic FXIII activity assay)對純的重組因子XIII進(jìn)行分析，其中將沒有起始凝血酶活化的等 分樣品與另一等分量的加入凝血酶的相同樣品進(jìn)行比較，來測定FXIIIa°活性。％FXIIIa° 用100*[無凝血酶的樣品活性]/[具有凝血酶的樣品的活性]計(jì)算。
[0149] 測定法（II):測定FXHI純度的方法
[0150] 為了研究凍干對FXIII的純度的作用，可通過陰離子交換高效液相層析法(AIE- HPLC)對純的重組FXHI進(jìn)行分析。
[0151] 測定法（III):測定FXHI活性的方法
[0152] 測定FXIII交聯(lián)活性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。FXHI活性可W使用市售可得的 試劑盒例如Beric虹om FXIIIR試劑盒來測定。
[0153] 測定法(IV):測定水分含量的方法
[0154] 為了研究干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶（例如FXI11)組合物的水分含量，可W采用Kar 1 Fischer滴定法。
[01W]本發(fā)明的優(yōu)選特征：
[0156] 14.干燥轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物，所述組合物可通過將含水組合物凍干或噴霧干燥 獲得，所述含水組合物包含轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶、鹽和至少一種另外的選自糖、氨基酸和緩沖液的 組分，其中含水組合物中鹽的濃度范圍為5-lOOmM。
[0157] 15.第1項(xiàng)的組合物，其中所述轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶是因子XIII化合物。
[015引16.第2項(xiàng)的組合物，其中因子XIII化合物是人因子XIII。
[0159] 17.第2-3項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中所述因子XIII化合物是重組因子XIII。
[0160] 18.第2-4項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中所述因子XIII化合物是A亞基的二聚體。
[0161] 19.第2項(xiàng)的組合物，其中所述因子XIII化合物選自因子XIII及其保持至少部分野 生型因子XIII的特有交聯(lián)活性的生物活性片段、衍生物和變體。
[0162] 20 .第1 -6項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中所述因子XIII化合物的濃度范圍為1 -約 lOOmg/ml。
[0163] 21.第1-7項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中所述鹽是一價(jià)鹽。
[0164] 22.第8項(xiàng)的組合物，其中所述一價(jià)鹽是氯化鋼鹽。
[01化]23.第1 -9項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中含水組合物中所述鹽的濃度范圍為10-7 5mM。
[0166] 24.第10項(xiàng)的組合物，其中含水組合物中所述鹽的濃度范圍為20-60mM。
[0167] 25.第1-11項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中所述含水組合物包含糖，且其中所述糖是選 自薦糖、甘露糖、海藻糖、乳糖、麥牙糖、山梨醇、棉子糖、糊精、環(huán)糊精的糖或糖醇及其衍生 物、類似物和混合物。
[0168] 26.第12項(xiàng)的組合物，其中所述糖和糖醇的濃度介于0.1%和8.5% (重量/重量)之 間。
[0169] 27.第1-13項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中所述含水組合物包含氨基酸，且其中所述氨 基酸選自甘氨酸、組氨酸和精氨酸。
[0170] 28.第1-14項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中所述含水組合物包含緩沖液，且其中所述緩 沖液選自巧樣酸鹽、組氨酸、憐酸鋼、班巧酸鹽和TRIS。
[0171] 29.第1-15項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中所述含水組合物還包含一種或多種選自W 下的其它組分:非離子型表面活性劑、還原劑、馨合劑、抗氧化劑、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、 填充劑、張力調(diào)節(jié)劑和兩性離子物質(zhì)。
[0172] 30.第1-16項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物是粉末形式。
[0173] 31.第1-17項(xiàng)中任一項(xiàng)的組合物，其中所述干燥組合物含有3% W下的水分含量。
[0174] 32.第18項(xiàng)的組合物，其中所述干燥組合物含有1% W下的水分含量。
[0175] 33.制備第1-19項(xiàng)中任一項(xiàng)的干燥組合物的方法，所述方法通過將包含轉(zhuǎn)谷氨酷 胺酶、鹽和至少一種另外的選自糖、氨基酸和緩沖液的組分的含水組合物干燥，其中所述含 水組合物中鹽的濃度范圍為5-lOOmM。
[0176] 34.第20項(xiàng)的方法，其中所述含水組合物的干燥通過凍干或噴霧干燥進(jìn)行。
[0177] 35.第20-21項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用來產(chǎn)生因子XIII組合物，所述組 合物在復(fù)溶后包含不超過1%的非蛋白酶水解活化的因子XIII。
[0178] 36.包含轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶的復(fù)溶溶液，其中所述溶液通過將第1-19項(xiàng)中任一項(xiàng)的干 燥組合物用稀釋劑復(fù)溶而制得。
[0179] 37.第23項(xiàng)的溶液，其中所述稀釋劑是蒸饋水。
[0180] 38.第23項(xiàng)的溶液，其中所述稀釋劑是包含一種或多種選自W下其它組分的稀釋 劑:鹽、糖、氨基酸、緩沖液、非離子型表面活性劑、還原劑、馨合劑、抗氧化劑、防腐劑、潤濕 劑、乳化劑、填充劑、張力調(diào)節(jié)劑、油性溶媒、蛋白質(zhì)和兩性離子物質(zhì)。
[0181] 39.第23-25項(xiàng)中任一項(xiàng)的溶液，其中所述轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶是因子XIII化合物。
[0182] 40.第26項(xiàng)的溶液，其中不超過1%的所述因子XIII化合物是非蛋白酶水解活化的 因子xni。
[0183] 41.第27項(xiàng)的溶液，其中不超過0.5%的所述因子XIII化合物是非蛋白酶水解活化 的因子XIII。
[0184] 42.包含第23-28項(xiàng)中任一項(xiàng)的溶液或第1-19項(xiàng)中任一項(xiàng)的干燥組合物的藥物組 合物。
[01化]43.第29項(xiàng)的藥物組合物，其用于減少失血。
[0186] 44.第29項(xiàng)的藥物組合物，其用于預(yù)防早產(chǎn)嬰兒的腦室出血。
[0187] 45.第29項(xiàng)的藥物組合物，其用于在手術(shù)期間或手術(shù)后減少患者的手術(shù)相關(guān)失血。
[0188] 46.第29項(xiàng)的藥物組合物，其用于治療血友病A。
[0189] 47.第29項(xiàng)的藥物組合物，其用于治療血友病B。
[0190] 48.第29項(xiàng)的藥物組合物，其用于治療血小板疾病。
[0191] 49.第29項(xiàng)的藥物組合物，其用于治療馮威勒布蘭特氏病。
[0192] 50.治療或預(yù)防出血事件的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者有效量的 第29項(xiàng)的藥物組合物。
[0193] 51.用于縮短受治療者的凝血時(shí)間的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者 第29項(xiàng)的藥物組合物。
[0194] 52.用于縮短受治療者的凝血時(shí)間的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者 第29項(xiàng)的藥物組合物。
[01M] 53.用于加強(qiáng)血塊強(qiáng)度的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者第29項(xiàng)的藥 物組合物。
[0196] 54.用于促進(jìn)血纖蛋白凝塊形成的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者第 29項(xiàng)的藥物組合物。
[0197] 55.用于預(yù)防早產(chǎn)嬰兒的腦室出血的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者 有效量的第29項(xiàng)的藥物組合物。
[0198] 56.用于在手術(shù)期間或手術(shù)后減少受治療者的手術(shù)相關(guān)失血的方法，所述方法包 括給予有需要的受治療者有效量的第29項(xiàng)的藥物組合物。
[0199] 57.用于治療血友病A的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者有效量的第29 項(xiàng)的藥物組合物。
[0200] 58.用于治療血友病B的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者有效量的第29 項(xiàng)的藥物組合物。
[0201] 59.用于治療血小板疾病的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者有效量的 第29項(xiàng)的藥物組合物。
[0202] 60.用于治療馮威勒布蘭特氏病的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者有 效量的第29項(xiàng)的藥物組合物。
[0203] 61.-種W干燥形式膽存使轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物穩(wěn)定的方法，該方法使得非蛋白 酶水解活化的轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶的水平占在復(fù)溶后立即測定的轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶總含量的1% W 下，其中所述穩(wěn)定效果的實(shí)現(xiàn)在于將包含轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶、鹽和至少一種另外的選自糖、氨基 酸和緩沖液的組分的含水組合物干燥，其中含水組合物中鹽的濃度范圍為5-1 OOmM。
[0204] 62.第48項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)谷氨酷胺酶組合物是因子XIII組合物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種干燥轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物，所述組合物可通過將含水組合物凍干或噴霧干燥 獲得，所述含水組合物包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、鹽和至少一種選自糖、氨基酸和緩沖液的另外的 組分，其中含水組合物中的鹽濃度為5-100 mM。2. 權(quán)利要求1的組合物，其中因子XIII化合物是人因子XIII。3. 權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述鹽是一價(jià)鹽。4. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述一價(jià)鹽是氯化鈉鹽。5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的組合物，其中含水組合物中所述鹽的濃度為10-75 mM。6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物為粉末形式。7. -種制備權(quán)利要求1 _6中任一項(xiàng)的干燥組合物的方法，所述方法包括將包含轉(zhuǎn)谷氨 酰胺酶、鹽和至少一種選自糖、氨基酸和緩沖液的另外的組分的含水組合物干燥，其中含水 組合物中的鹽濃度為5-100 mM。8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述方法用于生產(chǎn)因子XIII組合物，所述組合物在復(fù)溶后包 含不超過1%的非蛋白酶水解活化的因子XIII。9. 包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的復(fù)溶溶液，其中所述溶液通過將權(quán)利要求1-6項(xiàng)中任一項(xiàng)的干 燥組合物用稀釋劑復(fù)溶制得。10. 權(quán)利要求9的溶液，其中不超過1%的所述因子XIII化合物是非蛋白酶水解活化的因 子XIII。11. 一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求10-11中任一項(xiàng)的溶液或權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng) 的干燥組合物。12. -種以干燥形式貯存使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物穩(wěn)定的方法，使得非蛋白酶水解活化 的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的水平占在復(fù)溶后立即測得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶總含量的1%以下，其中所述穩(wěn) 定效果的實(shí)現(xiàn)在于將包含轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、鹽和至少一種選自糖、氨基酸和緩沖液的另外的 組分的含水組合物干燥，其中含水組合物中的鹽濃度為5-100 mM。13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶組合物是一種因子XIII組合物。
【文檔編號】C12N9/96GK105925545SQ201610285066
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2009年4月20日
【發(fā)明人】M.布拉德, T.法爾克, G.K.克里斯琴森
【申請人】諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司