測量組分對細胞活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生的作用的方法
【專利摘要】一種測定供試組分對細胞內(nèi)ROS水平的作用的方法。該方法可用于市場推廣或篩選在降低細胞中ROS水平方面有用的組分，細胞中ROS水平受增加的ROS產(chǎn)生不利影響。
【專利說明】測量組分對細胞活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生的作用的方法
[0001 ] 本申請為分案申請，原申請的申請日為2009年5月6日，申請?zhí)枮?00980116889.7(PCT/US2009/042958)，發(fā)明名稱為“測量組分對細胞活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生的作用的方法”。
[0002]發(fā)明背景
[0003]活性氧類物質(zhì)(ROS)是由氧的代謝而形成的細胞副產(chǎn)物，是造成細胞氧化傷害的原因，并且可為細胞損傷、細胞功能失調(diào)和細胞死亡(細胞凋亡)的原因。已經(jīng)充分證明ROS對細胞代謝的作用。ROS在組織中的聚集可引起氧化損傷，并且因此可能需要減少組織中ROS的量。需要監(jiān)測細胞中的ROS產(chǎn)生以確定ROS是否涉及包括心血管、炎癥和感染性疾病的疾病。正常情況下，細胞能夠用酶，例如超氧化物岐化酶或過氧化氫酶預(yù)防ROS的氧化傷害。其它化合物，包括抗氧化劑，例如維生素、尿酸和谷胱甘肽在預(yù)防這樣的傷害方面也是有用的。這樣的化合物(如抗氧化劑)可在清除自由基和保護宿主有機體免受病原體侵害中起重要的作用。
[0004]雖然已經(jīng)開發(fā)了許多方法測量組織中的ROS的量，但是很少方法實時測量細胞內(nèi)ROS濃度。測量ROS的量的能力是重要的，因為ROS濃度可隨時間而變化，如增加或減少。
[0005]因此，對于開發(fā)和給予有效的抗氧化劑組合物以預(yù)防ROS傷害存在持續(xù)的興趣。然而，幾乎沒有方法能夠?qū)崟r測量組合物對ROS產(chǎn)生的作用。因此，需要開發(fā)可測量組分對細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的作用的方法。
[0006]發(fā)明簡述
[0007]依據(jù)某些實施方案，提供可用于實時測量細胞內(nèi)ROS濃度的方法。此類實施方案的方法可用于測定供試組分對細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生和對細胞的氧化應(yīng)激的作用。此類方法也可用于測定供試組分減少細胞內(nèi)ROS組分的能力，其中ROS可為細胞內(nèi)源性的或外源性的。
[0008]因此，本文描述的某些實施方案包括測量供試組分對細胞中ROS的產(chǎn)生的作用的方法。該方法包括使細胞與能夠發(fā)熒光的材料接觸、使細胞與供試組分接觸、使細胞與ROS或ROS刺激物接觸和測量細胞熒光。此類實施方案還包括在使細胞與能夠發(fā)熒光的材料以及ROS或者ROS刺激物接觸后測量細胞熒光、在使細胞與供試組分接觸后測量細胞熒光、比較兩個熒光值和測定供試組分是否減少R0S。
[0009]附圖簡述
[0010]圖1顯示實施例1獲得的熒光值;和
[0011]圖2顯示如在實施例1中描述的各種供試組分的熒光值。
[0012]發(fā)明詳述
[0013]如在本說明書中通篇使用的，范圍用作描述在該范圍內(nèi)的各個值和每一個值的簡略的表達方式。在范圍內(nèi)的任何值可選作該范圍的終點。另外，本文所引用的所有參考文獻通過引用而全文結(jié)合于本文中。如發(fā)生與在本公開以及本文所引用的參考文獻中所定義的相沖突的情形時，以本公開的為準。
[0014]除非另有說明，在本文和說明書的其它地方表達的所有的百分比和量應(yīng)該被理解為是指重量百分比。給出的量基于材料的活性重量。
[0015]貫穿本說明書中，冠詞“該”、“一”、“一個”等的使用并不意欲將實施方案限制為該項的單數(shù)形式。例如，表達“一種組分”可表示單一組分或多個組分。實施方案中的組分包括化學(xué)化合物、小的和大的肽以及蛋白質(zhì)、表達小的和大的肽以及蛋白質(zhì)的DNA等。
[0016]所述方法包括使細胞與當(dāng)氧化或還原時能夠發(fā)熒光的材料接觸、使細胞與供試組分接觸、使細胞與ROS或ROS刺激物接觸和測量細胞熒光。優(yōu)選，能夠發(fā)熒光的材料是氧化時發(fā)熒光的染料，更優(yōu)選是選自2，7_二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA)、二氫羅丹明(DHR 123)及其混合物的染料。所述方法也包括使用在還原時能夠發(fā)熒光的材料。
[0017]優(yōu)選的方法包括使用抗氧化劑作為供試化合物。另一種優(yōu)選的方法包括作為ROS的產(chǎn)生氧離子的化合物、產(chǎn)生自由基的化合物、過氧化物或其組合。優(yōu)選ROS為過氧化物，更優(yōu)選為過氧化氫。其它優(yōu)選的方法包括使用ROS刺激物，例如炎性遞質(zhì)。
[0018]優(yōu)選的實施方案的方法還包括作為ROS刺激物的:(i)細菌內(nèi)毒素、外毒素或其組合;或(ii)脂多糖、脂低聚糖或其組合。優(yōu)選ROS為脂多糖。
[0019]可用于優(yōu)選的實施方案的多種方法中的細胞包括免疫細胞、淋巴細胞、成淋巴細胞、巨噬細胞、有核細胞例如線粒體或其混合物。細胞可無限增殖化，或存在于組織培養(yǎng)物中。優(yōu)選，細胞具有可被染料透過的細胞壁。另外，染料可聚集于細胞線粒體中。優(yōu)選從細胞中洗滌任何過多的染料。
[0020]在優(yōu)選的實施方案的方法中，主動或者被動地將供試化合物轉(zhuǎn)運至細胞中。優(yōu)選，從細胞中洗滌任何過多的供試化合物。按類似的思路(vein)，優(yōu)選主動地或者被動地使ROS或ROS刺激物(如炎性遞質(zhì))轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)，并且優(yōu)選從細胞中洗滌任何過多的ROS或ROS刺激物。
[0021]依據(jù)優(yōu)選的實施方案的多個方面，最初使細胞與在氧化或還原時能夠發(fā)熒光的材料，優(yōu)選染料接觸。可用于本發(fā)明實施方案中的染料包括在氧化或還原時發(fā)熒光的染料。優(yōu)選，這樣的染料在如通過ROS氧化或還原時發(fā)熒光。優(yōu)選使用染料，所述染料以不發(fā)熒光的形式與細胞接觸，然后在與ROS，如產(chǎn)生自細胞內(nèi)或者由外部來源引入的ROS反應(yīng)時發(fā)熒光。具有這些屬性的一些有用的染料為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所已知，并且可包括熒光素類型的染料，例如2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA) C3DCF-DA是能透過膜的染料，其可擴散穿越細胞脂質(zhì)膜。其在無活性時不發(fā)熒光，而在被ROS氧化時形成高度發(fā)熒光的二氯熒光素(DCF)?？捎糜诒景l(fā)明中的其它染料可包括熒光素衍生物和類似物，例如為DCF-DA的類似物的二氫羅丹明(DHR 123) AHR123聚集在線粒體中，并且因此可在線粒體中具體用于測定ROS水平。其它有用的染料可包括焚光素的衍生物，例如Oregon Green、Tokyo Green、羧基半蔡并焚光素(SNAFL-可從 Mo I ecu Iar Probes, (Invitrogen Corp.) ,Carlsbad ,CA 獲得)、竣基萘并焚光素、Alexa Fluor染料(如Alexa 488-也可從Molecular Probes, (InvitrogenCorp.)，Carlsbad，CA獲得)、DyLight Fluor染料(如DyLight 488，可從Thermo FisherScientif ic ,Waltham,MA購得)和HiLyte Fluor染料(可從AnaSpec, San Jose ,CA購得)?？蓪⒓毎c染料一起孵育，以使染料結(jié)合至細胞中。然后，可洗滌細胞以去除殘余的染料。
[0022]在用染料標記后，可將細胞暴露于一種或多種供試化合物。這樣的供試化合物優(yōu)選通過主動或被動轉(zhuǎn)運，如擴散導(dǎo)入細胞，并且優(yōu)選留在細胞內(nèi)?？稍谶@樣的供試化合物的存在下孵育細胞，然后洗滌以去除殘余的供試化合物。
[0023]在用供試化合物處理后，然后優(yōu)選將細胞暴露于ROSAOS典型地包括氧離子、自由基和過氧化物(無機和有機過氧化物兩者)，和在細胞內(nèi)產(chǎn)生這樣的氧離子和自由基的化合物。ROS(或ROS試劑)為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所已知，一般為高度反應(yīng)性的小分子，因為它們存在未成對價電子層電子。過氧化物的實例包括氫過氧化物、過氧化氫、堿金屬和堿土金屬的過氧化物、有機過氧化合物、過氧酸及其混合物。可將細胞暴露于來自外部來源的ROS試劑，其中可在含ROS試劑的培養(yǎng)基中孵育細胞，以在細胞內(nèi)，如通過主動轉(zhuǎn)運或者被動轉(zhuǎn)運，使細胞與ROS試劑結(jié)合。然后可洗滌細胞，以去除尚未結(jié)合至細胞的殘余的R0S。
[0024]在本發(fā)明的一個實施方案中，可在誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的化合物，如ROS刺激物，例如炎性遞質(zhì)的聯(lián)合下，使ROS與細胞接觸，其中所述遞質(zhì)在細胞中引起或已知引起ROS產(chǎn)生。還在另一個實施方案中，在沒有額外的ROS試劑存在下，使細胞與ROS刺激物接觸。如本領(lǐng)域已知的，炎性遞質(zhì)可包括細菌毒素，如內(nèi)毒素或外毒素，例如脂多糖或脂低聚糖。細胞可與ROS和炎性遞質(zhì)一起孵育，以便使ROS和炎性遞質(zhì)結(jié)合至細胞中。然后可洗滌細胞，以去除殘余的ROS和炎性遞質(zhì)?；蛘?，細胞可與炎性遞質(zhì)一起孵育，以便使炎性遞質(zhì)結(jié)合至細胞中。然后可洗滌細胞，以去除殘余的炎性遞質(zhì)。
[0025 ]本文描述的實施方案的方法考慮測量已經(jīng)與多種組分接觸的細胞的熒光。所述方法包括在使細胞與能夠發(fā)熒光的材料和ROS或ROS刺激物接觸后，測量熒光，然后，在使細胞與這些組分和供試化合物接觸后測量熒光?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員已知的和易于得到的任何方法測定熒光。這樣的已知的和商業(yè)上可獲得的方法包括光學(xué)活細胞陣列技術(shù)或顯微鏡成像系統(tǒng)。如已熟知的，典型地在激發(fā)和發(fā)射波長測量熒光。本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員能夠使用本文提供的指南測量和測定熒光。
[0026]不打算受限于任何理論，相信本發(fā)明的方法允許實時分析供試化合物對細胞內(nèi)ROS水平的作用。通過將能發(fā)熒光的組分、供試化合物結(jié)合至細胞，然后使ROS/炎性遞質(zhì)結(jié)合至細胞，人們能夠通過測量細胞熒光而測量供試化合物的抗氧化劑活性。在氧化或還原時能發(fā)熒光的組分，優(yōu)選染料，典型地具有一些背景熒光，但是結(jié)合自由基后，熒光強度增加。可易于測量熒光強度的該增加。可將供試化合物添加至細胞中，以評價它們減少形成ROS自由基(或通過反應(yīng)消耗它們)的能力，并且如果能減少自由基形成，則熒光強度應(yīng)減少。
[0027]因此，具有較大能力抑制ROS的供試化合物導(dǎo)致反應(yīng)，其中較少ROS能夠與染料反應(yīng)，因此熒光減少。另一方面，不抑制ROS的供試化合物導(dǎo)致反應(yīng)，其中較大量ROS能夠與染料反應(yīng)，因此有增加的熒光?？稍跒槠跀?shù)分鐘、數(shù)小時或數(shù)天的時間內(nèi)監(jiān)測細胞的熒光，以測定供試化合物對ROS/炎性遞質(zhì)的作用。
[0028]在一個實施方案中，使細胞與染料接觸，之后與供試化合物接觸。任選，使細胞與供試化合物接觸，之后與ROS和/或ROS刺激物接觸。在另一個實施方案中，將ROS導(dǎo)入細胞中，如ROS對細胞而言是外源性的。
[0029]可用于優(yōu)選的方法中的細胞包括具有線粒體的有核細胞。細胞可為無限增殖化的，如癌細胞，并且可為免疫細胞，例如淋巴細胞或成淋巴細胞?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法培養(yǎng)這樣的細胞。也可在手術(shù)或?qū)嶒炦^程期間原位培養(yǎng)細胞，然后進行實時測試，以評價某些供試化合物對抑制細胞的ROS產(chǎn)生的作用。
[0030]所述實施方案的方法可用于測定化合物對在細胞中ROS產(chǎn)生的作用。如上所述，已知細胞中自由基的產(chǎn)生是不合需要的，常常導(dǎo)致細胞死亡。例如，某些細菌具有在人細胞中誘導(dǎo)自由基形成的作用，并且因此損害細胞。本文描述的方法能測定可減少自由基形成(導(dǎo)致比較低的熒光強度)的供試化合物，并因此可用于對抗細菌的有害作用。
[0031 ]許多這樣的細菌存在于口腔中和口腔粘膜上。細菌可引起許多有害作用。例如，細菌細胞可被用作優(yōu)選的實施方案的細胞，優(yōu)選兼性厭氧菌細胞。于是，所述方法可測量某些供試化合物減少這樣的細胞的自由基產(chǎn)生的能力。
[0032]所以，所述實施方案的方法可原位用于確定有效療法(給予足以減少熒光的有效的供試化合物)，用于治療易受自由基產(chǎn)生的影響的某些細胞。所述實施方案的方法也可用于證明某些化合物(或含這些化合物的組合物)對已知細胞，如細菌細胞的效力。例如，所述方法可用于向牙科專業(yè)人員顯示某些牙粉是如何有效減少通常在人口腔中發(fā)現(xiàn)的細菌細胞中的自由基產(chǎn)生。通過顯示在產(chǎn)品間(如多種競爭者的牙粉)的比較，在產(chǎn)品的市場推廣中所述方法也可用作比較工具。
[0033]現(xiàn)在，通過以下的非限制性實施例描述本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。實施例僅為闡述性的，并不以任何方式限制所述和要求保護的本發(fā)明的范圍。
[0034]實施例1
[0035]起初將人組織細胞淋巴瘤U937細胞(々了0:，1&111&88&8，￥4)在含10%血清和1%青霉素的RPM1-1640培養(yǎng)基(六了0:，1&111&88&8，￥4)中培養(yǎng)，然后于37°(:下以2乂 15個細胞/ml濃度轉(zhuǎn)移至含lng/ml PMA的培養(yǎng)基中，保持48小時。在暴露于染料之前，使細胞于無血清的培養(yǎng)基中饑餓過夜。
[0036]用PBS緩沖液洗滌細胞兩次，并分成兩組，與DCF-DA或DHR123 (Cal ibochem，LaJolla，CA)—起于30°C下孵育30分鐘。用PBS洗滌細胞兩次以去除殘余的染料。也保持適當(dāng)?shù)膶嶒瀸φ铡?br>[0037]然后將細胞分成幾組，并將各種量的α-生育酚(維生素E)、物質(zhì)I或物質(zhì)2的I%溶液添加至各組中，并于37°C下孵育15分鐘。然后用PBS洗滌細胞兩次，以去除殘余量的供試化合物。然后添加ROS試劑H2O2和LPS，并孵育不同的時期。然后，在激發(fā)波長485nm和發(fā)射波長530nm讀取細胞熒光值，最長達5小時。
[0038]如圖1和2中顯示，僅用染料，如DCF-DA和DHRl 23染色的細胞表現(xiàn)出背景熒光。參考圖1，孵育2個小時后，在缺乏供試化合物但是存在2.5mM ROS和ROS刺激物下孵育的細胞，與在供試化合物(α-生育酚)和2.5mM ROS和ROS刺激物的存在下孵育的細胞比較，發(fā)出較多熒光。
[0039]因此，細胞熒光的分析允許實時監(jiān)測細胞內(nèi)氧化應(yīng)激，該細胞內(nèi)氧化應(yīng)激可用于篩選供試化合物。可采用光學(xué)活細胞陣列技術(shù)和/或顯微鏡成像系統(tǒng)在各細胞中完成細胞熒光的測量。
[0040]參考圖2，將2ppm、1ppm或10ppm的α-生育酚、物質(zhì)I和物質(zhì)2與細胞一起孵育。圖2顯示，在2.5mM的過氧化氫的存在下，2ppm的α-生育酚和物質(zhì)I與ROS反應(yīng)，并使氧化水平降低約30%。在1ppm和100ppm，a-生育酸不顯示增強清除ROS或自由基的能力；然而，10ppm的物質(zhì)I使氧化水平降低50%。圖2也顯示物質(zhì)2提高氧化水平，與2ppm比較，10ppm的物質(zhì)2使自由基水平提高至接近3倍。
[0041]本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)該認識到，可對以上描述的實施方案進行變化和更改，而不背離其廣義的發(fā)明概念。因此，應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于所公開的具體的實施方案，而將涵蓋在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種修改。
【主權(quán)項】
1.一種測量供試組分在減少細胞中ROS組分的效力的方法，所述方法包括: a.使細胞與能夠發(fā)熒光的材料接觸； b.使細胞與供試組分接觸； c.從細胞中洗滌任何過多的供試組分； d.使細胞與ROS和ROS刺激物接觸;和 e.測量細胞熒光； 其中所述ROS選自產(chǎn)生氧離子的化合物、產(chǎn)生自由基的化合物、過氧化物及其混合物； 其中所述ROS刺激物選自細菌內(nèi)毒素、外毒素及其混合物；以及 其中所述供試組分轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述能夠發(fā)熒光的材料是氧化時發(fā)熒光的染料。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述染料選自2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA)、二氫羅丹明(DHR 123)及其混合物。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述能夠發(fā)熒光的材料是還原時發(fā)熒光的染料。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述供試組分是抗氧化劑。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述ROS是過氧化物。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述過氧化物是過氧化氫。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述ROS刺激物包括脂多糖。9.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞是免疫細胞。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞選自淋巴細胞、成淋巴細胞、巨噬細胞、細菌、兼性厭氧菌及其混合物。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞具有壁，該壁可被能夠發(fā)熒光的材料透過。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述供試組分經(jīng)主動或被動轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述ROS通過主動或被動轉(zhuǎn)運方式轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞發(fā)熒光。15.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法測量細胞的ROS含量。16.一種測量供試組分在減少細胞中ROS組分的效力的方法，所述方法包括: a.使細胞與能夠發(fā)熒光的材料接觸； b.使細胞與供試組分接觸； c.從細胞中洗滌任何過多的供試組分； d.測量細胞熒光； e.使細胞與ROS和ROS刺激物接觸； f.測量細胞熒光;和 g.將來自d的細胞熒光與來自f的熒光進行比較，并確定供試組分在減少ROS中的效力； 其中所述ROS選自產(chǎn)生氧離子的化合物、產(chǎn)生自由基的化合物、過氧化物及其混合物； 其中所述ROS刺激物選自細菌內(nèi)毒素、外毒素及其混合物；以及 其中所述供試組分轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。
【文檔編號】C12Q1/02GK105907835SQ201610228368
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2009年5月6日
【發(fā)明人】H.M.特里韋迪, 陳丹丹
【申請人】高露潔-棕欖公司