專利名稱：測(cè)量組分對(duì)細(xì)胞活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生的作用的方法
測(cè)量組分對(duì)細(xì)胞活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生的作用的方法
背景技術(shù)：
活性氧類物質(zhì)(R0Q是由氧的代謝而形成的細(xì)胞副產(chǎn)物，是造成細(xì)胞氧化傷害的 原因，并且可為細(xì)胞損傷、細(xì)胞功能失調(diào)和細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)的原因。已經(jīng)充分證明 ROS對(duì)細(xì)胞代謝的作用。ROS在組織中的聚集可引起氧化損傷，并且因此可能需要減少組織 中ROS的量。需要監(jiān)測(cè)細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生以確定ROS是否涉及包括心血管、炎癥和感染性 疾病的疾病。正常情況下，細(xì)胞能夠用酶，例如超氧化物岐化酶或過氧化氫酶預(yù)防ROS的氧 化傷害。其它化合物，包括抗氧化劑，例如維生素、尿酸和谷胱甘肽在預(yù)防這樣的傷害方面 也是有用的。這樣的化合物(如抗氧化劑)可在清除自由基和保護(hù)宿主有機(jī)體免受病原體 侵害中起重要的作用。雖然已經(jīng)開發(fā)了許多方法測(cè)量組織中的ROS的量，但是很少方法實(shí)時(shí)測(cè)量細(xì)胞內(nèi) ROS濃度。測(cè)量ROS的量的能力是重要的，因?yàn)镽OS濃度可隨時(shí)間而變化，如增加或減少。因此，對(duì)于開發(fā)和給予有效的抗氧化劑組合物以預(yù)防ROS傷害存在持續(xù)的興趣。 然而，幾乎沒有方法能夠?qū)崟r(shí)測(cè)量組合物對(duì)ROS產(chǎn)生的作用。因此，需要開發(fā)可測(cè)量組分對(duì) 細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的作用的方法。發(fā)明簡述依據(jù)某些實(shí)施方案，提供可用于實(shí)時(shí)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的方法。此類實(shí)施方案 的方法可用于測(cè)定供試組分對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生和對(duì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激的作用。此類方法也可 用于測(cè)定供試組分減少細(xì)胞內(nèi)ROS組分的能力，其中ROS可為細(xì)胞內(nèi)源性的或外源性的。因此，本文描述的某些實(shí)施方案包括測(cè)量供試組分對(duì)細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生的作用的 方法。該方法包括使細(xì)胞與能夠發(fā)熒光的材料接觸、使細(xì)胞與供試組分接觸、使細(xì)胞與ROS 或ROS刺激物接觸和測(cè)量細(xì)胞熒光。此類實(shí)施方案還包括在使細(xì)胞與能夠發(fā)熒光的材料以 及ROS或者ROS刺激物接觸后測(cè)量細(xì)胞熒光、在使細(xì)胞與供試組分接觸后測(cè)量細(xì)胞熒光、比 較兩個(gè)熒光值和測(cè)定供試組分是否減少R0S。附圖簡述

圖1顯示實(shí)施例1獲得的熒光值；和圖2顯示如在實(shí)施例1中描述的各種供試組分的熒光值。發(fā)明詳述如在本說明書中通篇使用的，范圍用作描述在該范圍內(nèi)的各個(gè)值和每一個(gè)值的簡 略的表達(dá)方式。在范圍內(nèi)的任何值可選作該范圍的終點(diǎn)。另外，本文所引用的所有參考文 獻(xiàn)通過引用而全文結(jié)合于本文中。如發(fā)生與在本公開以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所定義 的相沖突的情形時(shí)，以本公開的為準(zhǔn)。除非另有說明，在本文和說明書的其它地方表達(dá)的所有的百分比和量應(yīng)該被理解 為是指重量百分比。給出的量基于材料的活性重量。貫穿本說明書中，冠詞“該”、“一”、“一個(gè)”等的使用并不意欲將實(shí)施方案限制為該 項(xiàng)的單數(shù)形式。例如，表達(dá)“一種組分”可表示單一組分或多個(gè)組分。實(shí)施方案中的組分包 括化學(xué)化合物、小的和大的肽以及蛋白質(zhì)、表達(dá)小的和大的肽以及蛋白質(zhì)的DNA等。
所述方法包括使細(xì)胞與當(dāng)氧化或還原時(shí)能夠發(fā)熒光的材料接觸、使細(xì)胞與供試組 分接觸、使細(xì)胞與ROS或ROS刺激物接觸和測(cè)量細(xì)胞熒光。優(yōu)選，能夠發(fā)熒光的材料是氧 化時(shí)發(fā)熒光的染料，更優(yōu)選是選自2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA)、二氫羅丹明(DHR 123)及其混合物的染料。所述方法也包括使用在還原時(shí)能夠發(fā)熒光的材料。優(yōu)選的方法包括使用抗氧化劑作為供試化合物。另一種優(yōu)選的方法包括作為ROS 的產(chǎn)生氧離子的化合物、產(chǎn)生自由基的化合物、過氧化物或其組合。優(yōu)選ROS為過氧化物， 更優(yōu)選為過氧化氫。其它優(yōu)選的方法包括使用ROS刺激物，例如炎性遞質(zhì)。優(yōu)選的實(shí)施方案的方法還包括作為ROS刺激物的(i)細(xì)菌內(nèi)毒素、外毒素或其組 合；或(ii)脂多糖、脂低聚糖或其組合。優(yōu)選ROS為脂多糖。可用于優(yōu)選的實(shí)施方案的多種方法中的細(xì)胞包括免疫細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成淋巴細(xì) 胞、巨噬細(xì)胞、有核細(xì)胞例如線粒體或其混合物。細(xì)胞可無限增殖化，或存在于組織培養(yǎng)物 中。優(yōu)選，細(xì)胞具有可被染料透過的細(xì)胞壁。另外，染料可聚集于細(xì)胞線粒體中。優(yōu)選從細(xì) 胞中洗滌任何過多的染料。在優(yōu)選的實(shí)施方案的方法中，主動(dòng)或者被動(dòng)地將供試化合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中。優(yōu)選， 從細(xì)胞中洗滌任何過多的供試化合物。按類似的思路(vein)，優(yōu)選主動(dòng)地或者被動(dòng)地使 ROS或ROS刺激物(如炎性遞質(zhì))轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且優(yōu)選從細(xì)胞中洗滌任何過多的ROS 或ROS刺激物。依據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案的多個(gè)方面，最初使細(xì)胞與在氧化或還原時(shí)能夠發(fā)熒光的 材料，優(yōu)選染料接觸。可用于本發(fā)明實(shí)施方案中的染料包括在氧化或還原時(shí)發(fā)熒光的染 料。優(yōu)選，這樣的染料在如通過ROS氧化或還原時(shí)發(fā)熒光。優(yōu)選使用染料，所述染料以不 發(fā)熒光的形式與細(xì)胞接觸，然后在與R0S，如產(chǎn)生自細(xì)胞內(nèi)或者由外部來源引入的ROS反 應(yīng)時(shí)發(fā)熒光。具有這些屬性的一些有用的染料為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所已知，并且可 包括熒光素類型的染料，例如2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA)。DCF-DA是能透過膜的 染料，其可擴(kuò)散穿越細(xì)胞脂質(zhì)膜。其在無活性時(shí)不發(fā)熒光，而在被ROS氧化時(shí)形成高度發(fā) 熒光的二氯熒光素(DCF)?？捎糜诒景l(fā)明中的其它染料可包括熒光素衍生物和類似物，例 如為DCF-DA的類似物的二氫羅丹明(DHR123)。DHR123聚集在線粒體中，并且因此可在 線粒體中具體用于測(cè)定ROS水平。其它有用的染料可包括熒光素的衍生物，例如Oregon Green、TokyoGreen、羧基半萘并焚光素(SNAFL-可從 Molecular Probes, (Invitrogen Corp. ), Carlsbad, CA獲得)、羧基萘并熒光素、Alexa Fluor染料(如Alexa 488 一也可從 Molecular Probes, (Invitrogen Corp. ), Carlsbad, CA 獲得)、DyLight Fluor 染料(如 DyLight 488，可從 Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA 購得)和 HiLyte Fluor 染料 (可從AnaSpec，San Jose, CA購得)?？蓪⒓?xì)胞與染料一起孵育，以使染料結(jié)合至細(xì)胞中。 然后，可洗滌細(xì)胞以去除殘余的染料。在用染料標(biāo)記后，可將細(xì)胞暴露于一種或多種供試化合物。這樣的供試化合物優(yōu) 選通過主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，如擴(kuò)散導(dǎo)入細(xì)胞，并且優(yōu)選留在細(xì)胞內(nèi)。可在這樣的供試化合物的 存在下孵育細(xì)胞，然后洗滌以去除殘余的供試化合物。在用供試化合物處理后，然后優(yōu)選將細(xì)胞暴露于R0S。ROS典型地包括氧離子、自 由基和過氧化物(無機(jī)和有機(jī)過氧化物兩者)，和在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生這樣的氧離子和自由基的 化合物。ROS(或ROS試劑)為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所已知，一般為高度反應(yīng)性的小分子，因?yàn)樗鼈兇嬖谖闯蓪?duì)價(jià)電子層電子。過氧化物的實(shí)例包括氫過氧化物、過氧化氫、堿金 屬和堿土金屬的過氧化物、有機(jī)過氧化合物、過氧酸及其混合物。可將細(xì)胞暴露于來自外部 來源的ROS試劑，其中可在含ROS試劑的培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞，以在細(xì)胞內(nèi)，如通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn) 或者被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，使細(xì)胞與ROS試劑結(jié)合。然后可洗滌細(xì)胞，以去除尚未結(jié)合至細(xì)胞的殘余的 ROS。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可在誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的化合物，如ROS刺激物，例如炎 性遞質(zhì)的聯(lián)合下，使ROS與細(xì)胞接觸，其中所述遞質(zhì)在細(xì)胞中引起或已知引起ROS產(chǎn)生。還 在另一個(gè)實(shí)施方案中，在沒有額外的ROS試劑存在下，使細(xì)胞與ROS刺激物接觸。如本領(lǐng)域 已知的，炎性遞質(zhì)可包括細(xì)菌毒素，如內(nèi)毒素或外毒素，例如脂多糖或脂低聚糖。細(xì)胞可與 ROS和炎性遞質(zhì)一起孵育，以便使ROS和炎性遞質(zhì)結(jié)合至細(xì)胞中。然后可洗滌細(xì)胞，以去除 殘余的ROS和炎性遞質(zhì)?；蛘撸?xì)胞可與炎性遞質(zhì)一起孵育，以便使炎性遞質(zhì)結(jié)合至細(xì)胞 中。然后可洗滌細(xì)胞，以去除殘余的炎性遞質(zhì)。本文描述的實(shí)施方案的方法考慮測(cè)量已經(jīng)與多種組分接觸的細(xì)胞的熒光。所述方 法包括在使細(xì)胞與能夠發(fā)熒光的材料和ROS或ROS刺激物接觸后，測(cè)量熒光，然后，在使細(xì) 胞與這些組分和供試化合物接觸后測(cè)量熒光。可通過本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員已知的和易 于得到的任何方法測(cè)定熒光。這樣的已知的和商業(yè)上可獲得的方法包括光學(xué)活細(xì)胞陣列技 術(shù)或顯微鏡成像系統(tǒng)。如已熟知的，典型地在激發(fā)和發(fā)射波長測(cè)量熒光。本領(lǐng)域中的普通 技術(shù)人員能夠使用本文提供的指南測(cè)量和測(cè)定熒光。不打算受限于任何理論，相信本發(fā)明的方法允許實(shí)時(shí)分析供試化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi) ROS水平的作用。通過將能發(fā)熒光的組分、供試化合物結(jié)合至細(xì)胞，然后使ROS/炎性遞質(zhì)結(jié) 合至細(xì)胞，人們能夠通過測(cè)量細(xì)胞熒光而測(cè)量供試化合物的抗氧化劑活性。在氧化或還原 時(shí)能發(fā)熒光的組分，優(yōu)選染料，典型地具有一些背景熒光，但是結(jié)合自由基后，熒光強(qiáng)度增 加?？梢子跍y(cè)量熒光強(qiáng)度的該增加。可將供試化合物添加至細(xì)胞中，以評(píng)價(jià)它們減少形成 ROS自由基(或通過反應(yīng)消耗它們)的能力，并且如果能減少自由基形成，則熒光強(qiáng)度應(yīng)減 少。因此，具有較大能力抑制ROS的供試化合物導(dǎo)致反應(yīng)，其中較少ROS能夠與染料反 應(yīng)，因此熒光減少。另一方面，不抑制ROS的供試化合物導(dǎo)致反應(yīng)，其中較大量ROS能夠與 染料反應(yīng)，因此有增加的熒光?？稍跒槠跀?shù)分鐘、數(shù)小時(shí)或數(shù)天的時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的熒光， 以測(cè)定供試化合物對(duì)ROS/炎性遞質(zhì)的作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，使細(xì)胞與染料接觸，之后與供試化合物接觸。任選，使細(xì)胞與 供試化合物接觸，之后與ROS和/或ROS刺激物接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將ROS導(dǎo)入細(xì) 胞中，如ROS對(duì)細(xì)胞而言是外源性的。可用于優(yōu)選的方法中的細(xì)胞包括具有線粒體的有核細(xì)胞。細(xì)胞可為無限增殖化 的，如癌細(xì)胞，并且可為免疫細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞或成淋巴細(xì)胞。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的任何方法培養(yǎng)這樣的細(xì)胞。也可在手術(shù)或?qū)嶒?yàn)過程期間原位培養(yǎng)細(xì)胞，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè) 試，以評(píng)價(jià)某些供試化合物對(duì)抑制細(xì)胞的ROS產(chǎn)生的作用。所述實(shí)施方案的方法可用于測(cè)定化合物對(duì)在細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的作用。如上所述， 已知細(xì)胞中自由基的產(chǎn)生是不合需要的，常常導(dǎo)致細(xì)胞死亡。例如，某些細(xì)菌具有在人細(xì)胞 中誘導(dǎo)自由基形成的作用，并且因此損害細(xì)胞。本文描述的方法能測(cè)定可減少自由基形成(導(dǎo)致比較低的熒光強(qiáng)度)的供試化合物，并因此可用于對(duì)抗細(xì)菌的有害作用。許多這樣的細(xì)菌存在于口腔中和口腔粘膜上。細(xì)菌可引起許多有害作用。例如， 細(xì)菌細(xì)胞可被用作優(yōu)選的實(shí)施方案的細(xì)胞，優(yōu)選兼性厭氧菌細(xì)胞。于是，所述方法可測(cè)量某 些供試化合物減少這樣的細(xì)胞的自由基產(chǎn)生的能力。所以，所述實(shí)施方案的方法可原位用于確定有效療法(給予足以減少熒光的有效 的供試化合物)，用于治療易受自由基產(chǎn)生的影響的某些細(xì)胞。所述實(shí)施方案的方法也可用 于證明某些化合物(或含這些化合物的組合物)對(duì)已知細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞的效力。例如，所 述方法可用于向牙科專業(yè)人員顯示某些牙粉是如何有效減少通常在人口腔中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌 細(xì)胞中的自由基產(chǎn)生。通過顯示在產(chǎn)品間(如多種競(jìng)爭者的牙粉)的比較，在產(chǎn)品的市場(chǎng) 推廣中所述方法也可用作比較工具?，F(xiàn)在，通過以下的非限制性實(shí)施例描述本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。實(shí)施例僅為闡 述性的，并不以任何方式限制所述和要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1起初將人組織細(xì)胞淋巴瘤U937細(xì)胞(ATCC，Manassas，VA)在含10%血清和青 霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基(ATCC，Manassas，VA)中培養(yǎng)，然后于37°C下以2X105個(gè)細(xì)胞/ml 濃度轉(zhuǎn)移至含lng/ml PMA的培養(yǎng)基中，保持48小時(shí)。在暴露于染料之前，使細(xì)胞于無血清 的培養(yǎng)基中饑餓過夜。用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，并分成兩組，與DCF-DA或DHR123 (Calibochem, La Jolla, CA) 一起于30°C下孵育30分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞兩次以去除殘余的染料。也保持 適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照。然后將細(xì)胞分成幾組，并將各種量的α -生育酚(維生素Ε)、物質(zhì)1或物質(zhì)2的 1 %溶液添加至各組中，并于37°C下孵育15分鐘。然后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，以去除殘余量 的供試化合物。然后添加ROS試劑H2O2和LPS，并孵育不同的時(shí)期。然后，在激發(fā)波長485nm 和發(fā)射波長530nm讀取細(xì)胞熒光值，最長達(dá)5小時(shí)。如圖1和2中顯示，僅用染料，如DCF-DA和DHR123染色的細(xì)胞表現(xiàn)出背景熒光。 參考圖1，孵育2個(gè)小時(shí)后，在缺乏供試化合物但是存在2. 5mM ROS和ROS刺激物下孵育的 細(xì)胞，與在供試化合物(α -生育酚)和2. 5mMR0S和ROS刺激物的存在下孵育的細(xì)胞比較， 發(fā)出較多熒光。因此，細(xì)胞熒光的分析允許實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，該細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激可用于 篩選供試化合物?？刹捎霉鈱W(xué)活細(xì)胞陣列技術(shù)和/或顯微鏡成像系統(tǒng)在各細(xì)胞中完成細(xì)胞 熒光的測(cè)量。參考圖2，將2ppm、IOppm或IOOppm的α -生育酚、物質(zhì)1和物質(zhì)2與細(xì)胞一起孵 育。圖2顯示，在2. 5mM的過氧化氫的存在下，2ppm的α -生育酚和物質(zhì)1與ROS反應(yīng)，并 使氧化水平降低約30%。在IOppm和lOOppm，α -生育酚不顯示增強(qiáng)清除ROS或自由基的 能力；然而，IOOppm的物質(zhì)1使氧化水平降低50%。圖2也顯示物質(zhì)2提高氧化水平，與 2ppm比較，IOOppm的物質(zhì)2使自由基水平提高至接近3倍。本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可對(duì)以上描述的實(shí)施方案進(jìn)行變化和更 改，而不背離其廣義的發(fā)明概念。因此，應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于所公開的具體的實(shí)施方案， 而將涵蓋在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種修改。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)量供試組分在減少細(xì)胞中ROS組分的效力的方法，所述方法包括a.使細(xì)胞與能夠發(fā)熒光的材料接觸；b.使細(xì)胞與供試組分接觸；c.使細(xì)胞與ROS或ROS刺激物接觸；和d.測(cè)量細(xì)胞熒光。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述能夠發(fā)熒光的材料是氧化時(shí)發(fā)熒光的染料。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述染料選自2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA)、二氫羅 丹明(DHR 123)及其混合物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述能夠發(fā)熒光的材料是還原時(shí)發(fā)熒光的染料。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述供試組分是抗氧化劑。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述ROS選自產(chǎn)生氧離子的化合物、產(chǎn)生自由基的化合物、 過氧化物及其混合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述ROS是過氧化物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述過氧化物是過氧化氫。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述ROS還包括ROS刺激物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述ROS還包括選自細(xì)菌內(nèi)毒素、外毒素及其混合物的 ROS刺激物。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述ROS刺激物包括脂多糖。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是免疫細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞選自淋巴細(xì)胞、成淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、細(xì)菌、兼 性厭氧菌及其混合物。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞具有壁，該壁可被能夠發(fā)熒光的材料透過。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述供試組分轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述供試組分經(jīng)主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述ROS通過主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞發(fā)熒光。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法測(cè)量細(xì)胞的ROS含量。
20.一種測(cè)量供試組分在減少細(xì)胞中ROS組分的效力的方法，所述方法包括a.使細(xì)胞與能夠發(fā)熒光的材料接觸；b.使細(xì)胞與供試組分接觸；c.測(cè)量細(xì)胞熒光；d.使細(xì)胞與ROS或ROS刺激物接觸；e.測(cè)量細(xì)胞熒光；和f.將來自c的細(xì)胞熒光與來自e的熒光進(jìn)行比較，并確定供試組分在減少ROS中的效
全文摘要
一種測(cè)定供試組分對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的作用的方法。該方法可用于市場(chǎng)推廣或篩選在降低細(xì)胞中ROS水平方面有用的組分，細(xì)胞中ROS水平受增加的ROS產(chǎn)生不利影響。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102124334SQ200980116889
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月6日
發(fā)明者H·M·特里韋迪, 陳丹丹 申請(qǐng)人:高露潔-棕欖公司