專利名稱：活性氧測定用試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為活性氧測定用試劑有用的化合物或其鹽。另外，本發(fā)明還涉及含有上述化合物或其鹽的活性氧測定用試劑。
因此，明確活性氧在生物體內(nèi)的作用的重要性日益增高，關(guān)于其測定方法的課題很多。對于測定羥基自由基的方法，有采用電子自旋共振(ESR)法進行測定的多種報道，但是按照ESR法使用活細胞作為測定試樣本身是很困難的，各個細胞水平上的測定評價實際上是不可能的。另一方面，已知將能夠廣泛測定活性氧種的DCHF-DA(2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯，Molecular Probes公司，商品目錄序號D-399)與其它活性氧種生成抑制劑一起使用并在顯微鏡下檢測羥基自由基的方法，但是抑制劑共存下的結(jié)果包含了與生物體內(nèi)反應不同的要素。另外，由于DCHF-DA非常容易受自動氧化，有必要對同一視野進行幾次觀察時，自動氧化產(chǎn)生的背景熒光會妨礙檢測。而且，在必需于暗處操作等操作性、保存性方面，是非常不方便的方法。
作為測定單線態(tài)氧的方法，已知化學發(fā)光法、ESR法、發(fā)光法等十幾種，但是特異性和靈敏度均很低，不能說是可信的方法(關(guān)于單重氧的特異性檢測法，參照Nagano，T.，et al.，F(xiàn)ree radicals inClinical Me dicine，Vol.7，pp.35-41，1993等)。也能夠?qū)⑸鲜鯠CHF-DA用于單線態(tài)氧的測定，但是并沒有消除DCHF-DA自身具有的問題。因此，需要開發(fā)在活性氧種的研究中能夠使用的特異性和靈敏度優(yōu)良，而且操作簡便的測定方法。
本發(fā)明人為了解決上述課題進行了不懈努力，成功地提供了對于單線態(tài)氧特異的檢測試劑(國際公開99/51586)。本發(fā)明人進一步進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下述通式(I)或(II)表示的實質(zhì)上為非熒光性的化合物與活性氧在生理條件下有效反應得到脫芳基化的熒光性化合物；以及使用通式(I)或(II)表示的化合物作為羥基自由基或單線態(tài)氧測定用試劑，測定與局部存在于活細胞或生物體組織中的活性氧反應生成的脫芳基化合物的熒光，能夠非常特異性且高靈敏度地測定活性氧；而且，通式(I)或(II)表示的化合物完全不被自動氧化?；谶@些發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供下述通式(I)或(II)表示的化合物或其鹽， (式中，R1和R2分別獨立地表示可以具有取代基的芳基，R3表示可以具有取代基的2-羧基苯基)。按照本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供R1和R2為被氨基或羥基取代的苯基的上述化合物或其鹽；以及R3為2-羧基苯基的上述化合物或其鹽。
從另一觀點來看，本發(fā)明提供含有上述通式(I)或(II)表示的化合物或其鹽的活性氧測定用試劑。而且，按照本發(fā)明還提供活性氧的測定方法，包括下述步驟(A)使上述通式(I)或(II)表示的化合物或其鹽與活性氧反應的步驟，以及(B)測定上述步驟(A)中生成的脫芳基化合物(上述通式(I)中R1為氫原子的化合物或上述通式(II)中R2為氫原子的化合物)或其鹽的熒光的步驟。
圖2表示向?qū)嵤├?得到的本發(fā)明化合物(ss-3F)10μM溶液中添加單線態(tài)氧發(fā)生系統(tǒng)——EP-1，測定熒光強度的時間變化的結(jié)果。
圖3表示圖2所示反應結(jié)束后的溶液的激發(fā)光譜和熒光光譜。
圖4表示向?qū)嵤├?得到的本發(fā)明化合物(ss-3F)10μM溶液中添加羥基自由基發(fā)生系統(tǒng)——過氧化氫和高氯酸亞鐵，測定熒光強度的時間變化的結(jié)果。
圖5表示溶解于磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中的本發(fā)明化合物(ss-3F)10μM的吸光光譜。
圖6表示采用HPLC對含有實施例3得到的本發(fā)明化合物(ss-3F)的溶液進行分析得到的結(jié)果。圖中，(A)表示10μM ss-3F溶液的結(jié)果；(B)表示向10μM ss-3F溶液中加入EP-1使最終濃度達到5mM，在37℃下反應8小時得到的反應溶液的結(jié)果；(C)表示向10μMss-3F溶液中加入過氧化氫使最終濃度達到1mM，再加入高氯酸亞鐵使最終濃度達到500μM，在室溫下放置約3小時得到的溶液的結(jié)果；(D)表示1μM熒光素溶液的結(jié)果。
圖7表示實施例1得到的本發(fā)明化合物(ss-3)10μM溶液的激發(fā)光譜和熒光光譜。
圖8表示實施例1得到的本發(fā)明化合物(ss-3)10μM溶液與單線態(tài)氧反應結(jié)束后的激發(fā)光譜和熒光光譜。
圖9表示討論本發(fā)明化合物(ss-1F和ss-3F)與HRP/H2O2的反應性的結(jié)果。圖中，(A)表示ss-1F的結(jié)果，(B)表示ss-3F的結(jié)果。圖中的數(shù)字表示H2O2濃度。
發(fā)明的最佳實施方式日本專利申請第2000-54557號說明書的公開作為參照全部包括在本說明書的公開中。
作為R1和R2表示的芳基，可以使用例如成環(huán)原子數(shù)約為6～14個的單環(huán)性、二環(huán)性或三環(huán)性芳基。優(yōu)選使用苯基或萘基，更優(yōu)選使用苯基。芳基可以在環(huán)上具有1個或2個以上的取代基。具有2個以上的取代基時，這些取代基可以相同也可以不同。取代基的種類和取代位置沒有特別的限定，例如可以使用C1-6烷基(烷基可以是直鏈狀、支鏈狀、環(huán)狀或其組合的任意一種。具有烷基部分的其它取代基的烷基部分也同樣)、C1-6鹵代烷基、C1-6烯基、C1-6烷氧基、鹵素原子(作為鹵素原子，可以是氟原子、氯原子、溴原子或碘原子中的任意一種)、氰基、硝基、有時具有取代基的氨基、羧基、烷氧基羰基、C1-6烷?；?、C1-6鹵代烷酰基、芳?；⒘u基、亞烷基二氧基等作為取代基。
作為R1或R2優(yōu)選取代苯基，更優(yōu)選單取代苯基。作為單取代苯基，具有未取代的氨基或羥基的苯基特別合適。作為取代基的位置，優(yōu)選鄰位或?qū)ξ?。R3表示的2-羧基苯基的苯環(huán)也可以具有1個或2個以上的取代基。具有2個以上的取代基時，這些取代基可以相同也可以不同。作為苯環(huán)上的取代基，可以使用關(guān)于上述芳基中記述的基團，作為R3優(yōu)選未取代的2-羧基苯基。
有時上述通式(I)或(II)的化合物作為鹽存在。作為鹽，可以例舉堿加成鹽、酸加成鹽、氨基酸鹽等。作為堿加成鹽，可以例舉鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等金屬鹽，銨鹽，或三乙胺鹽、哌啶鹽、嗎啉鹽等有機胺鹽；作為酸加成鹽，可以例舉鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽等無機酸鹽，甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、枸櫞酸鹽、草酸鹽等有機酸鹽。作為氨基酸鹽，可以例舉甘氨酸鹽等。當然，本發(fā)明的化合物的鹽并不限于此。
其中，生理學上允許的水溶性鹽能夠優(yōu)選用于本發(fā)明的試劑以及測定方法。另外，游離形態(tài)的通式(I)或(II)的化合物或其鹽有時作為水合物或溶劑合物存在，這些物質(zhì)也均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。形成溶劑合物的溶劑的種類沒有特別的限定，可以例舉乙醇、丙酮、異丙醇等溶劑。
通式(I)或(II)表示的化合物有時根據(jù)取代基的種類具有1個或2個以上的手性碳，有時存在光學異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體等立體異構(gòu)體。純形態(tài)的立體異構(gòu)體、立體異構(gòu)體的任意混合物、消旋體等均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明式(II)的化合物有時會在分子內(nèi)形成內(nèi)酯環(huán)，形成內(nèi)酯環(huán)的化合物當然也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，基于上述內(nèi)酯環(huán)的形成產(chǎn)生的光學活性體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
通式(I)或(II)表示的本發(fā)明化合物一般可以通過將對應的香豆素化合物(通式(I)中R1為氫原子的化合物)或熒光素化合物(通式(II)中R2為氫原子的化合物)芳基化制備。一般情況下，可以制備香豆素化合物或熒光素化合物的堿金屬鹽，在適當?shù)娜軇┲性诼然~存在下使之與碘化芳基化合物反應。本發(fā)明的上述通式(I)或(II)所示化合物的代表性化合物的制備方法如下述方案所示。另外，在本說明書的實施例中，更詳細且具體說明該方案記載的制備方法。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員以實施例的具體說明為基礎(chǔ)，適當選擇初始原料和反應試劑，根據(jù)需要適當變更反應條件和步驟或進行修飾，能夠制備本發(fā)明化合物的任意一種。
另外，有時通過在反應步驟中根據(jù)需要保護特定的官能團進行反應，能夠有效制備目的物，關(guān)于保護基，在Protective Groups inOrganic Synthesis，T.W.Green，John Wiley & Sons，Inc.，1981等中有詳細說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇適當?shù)谋Ｗo基。
另外，上述制備方法的產(chǎn)物的分離、精制可以將通常有機合成中采用的方法，例如過濾、萃取、洗滌、干燥、濃縮、結(jié)晶、各種層析等適當組合進行。另外，上述步驟中的制備中間體也可以不進行特別精制直接供于以下的反應。制備本發(fā)明化合物的鹽的場合，在上述制備方法中得到各化合物的鹽時，可以直接精制，得到游離形態(tài)的化合物時，可以將游離形態(tài)的化合物溶解或懸濁于適當?shù)娜軇┖?，加入堿使之形成鹽，根據(jù)需要進行精制。
上述通式(I)或(II)表示的本發(fā)明化合物或其鹽具有在緩和條件下，例如生理條件下與活性氧反應，得到脫芳基體——香豆素化合物(相當于通式(I)中R1為氫原子的化合物)或熒光素化合物(相當于通式(II)中R2為氫原子的化合物)或者它們的鹽的性質(zhì)。通式(I)或(II)的化合物或它們的鹽實質(zhì)上是非熒光性的，另一方面，脫芳基得到的香豆素化合物或熒光素化合物或者它們的鹽具有發(fā)出高強度熒光的性質(zhì)。因此，使上述式(I)或(II)表示的化合物或其鹽與活性氧反應后，通過測定脫芳基得到的化合物或其鹽的熒光，能夠選擇性且高靈敏度地測定活性氧。 (式中，R4表示對位氨基、鄰位氨基、對位羥基、鄰位羥基等，活性氧種(active oxygen species)為單線態(tài)氧或羥基自由基等。)采用本發(fā)明的試劑能夠測定的活性氧的種類沒有特別的限定，超氧陰離子、羥基自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫等均能夠測定，特別是能夠高靈敏度且選擇性地測定單線態(tài)氧和羥基自由基。例如，使用通式(I)或(II)的化合物或其鹽作為活性氧測定用試劑，能夠準確且簡便地測定局部存在于各細胞或特定組織中的活性氧。
本說明書中使用的“測定”這一用語包括以定量、定性或診斷等目的進行的測定、檢查、檢測等，必須是最廣義的解釋。本發(fā)明的活性氧的測定方法包括(A)使上述通式(I)或(II)表示的化合物或其鹽與活性氧反應的步驟，以及(B)測定上述步驟(A)中生成的脫芳基化合物(相當于上述通式(I)中R1為氫原子的化合物或上述通式(II)中R2為氫原子的化合物)或其鹽的熒光的步驟。
測定脫芳基得到的化合物或其鹽的熒光能夠按照通常的方法進行，可以采用體外測定熒光光譜的方法，或者利用生物顯象術(shù)的方法在體內(nèi)測定熒光光譜的方法等。例如進行定量的場合，優(yōu)選按照常規(guī)方法制作標準曲線，作為定量的羥基自由基發(fā)生系統(tǒng)，可以利用例如γ-輻射分解法，作為單線態(tài)氧的發(fā)生系統(tǒng)，可以利用例如萘內(nèi)過氧化物體系(Saito，I.，et al.，J.Am.Chem.Soc.，107，pp.6329-6334，1985)等。本發(fā)明的試劑具有攝入細胞內(nèi)的性質(zhì)，采用生物顯象術(shù)方法能夠高靈敏度地測定局部存在于各細胞內(nèi)的活性氧。
另外，如果從另一方面來看本發(fā)明化合物或其鹽的特征，由于能夠特異地測定過氧化物酶等酶反應中與活性氧有關(guān)的酶的酶活性，含有本發(fā)明的化合物或其鹽的試劑作為用于測定過氧化物酶等與活性氧有關(guān)的酶的酶活性的試劑是有用的。
作為本發(fā)明的活性氧測定用試劑，可以直接使用上述式(I)或(II)表示的化合物或其鹽，也可以根據(jù)需要配合制備試劑通常使用的添加劑作為組合物使用。例如，作為為了在生理環(huán)境下使用試劑的添加劑，可以使用溶解助劑、pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、等滲劑等添加劑，其配合量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當選擇。這些組合物可以作為粉末形態(tài)的混合物、冷凍干燥物、顆粒劑、片劑、液體制劑等適當形態(tài)的組合物提供。
將叔丁醇鉀123mg(1.10mmol)溶解于苯8mL/甲醇3mL的混合液中。之后，加入7-羥基香豆素196mg(1.21mmol)，攪拌溶解。之后，減壓蒸餾除去溶劑，得到7-羥基香豆素鉀鹽。向裝有該7-羥基香豆素鉀鹽的25ml茄形燒瓶中加入將4-碘乙酰苯胺1.11g(4.26mmol)溶解于吡啶12mL中得到的溶液以及氯化亞銅124mg(1.25mmol)，在氬氣流下加熱回流9小時45分鐘。放冷至室溫后，向反應液中加入水55mL，再加入濃鹽酸調(diào)節(jié)為酸性。用乙酸乙酯(75mL×4)萃取，用飽和食鹽水洗滌收集的有機層，用Na2SO4干燥后，減壓蒸餾除去溶劑。用硅膠柱色譜法精制殘留物(2次，展開溶劑均僅為乙酸乙酯)，得到黃色晶體狀的pre ss-3(乙?；?(收量68.7mg，收率21.1％)。m.p.197.0℃-199.0℃。1H-NMR(300MHz丙酮-d6)；δ2.08(s，3H)、6.27(d，J＝9.5Hz，1H)、6.79(d，J＝2.4Hz，1H)、6.92(dd，J＝8.6Hz，2.4Hz，1H)、7.09(d，J＝9.0Hz，2H)、7.65(d，J＝8.6Hz，1H)、7.74(d，J＝9.0Hz，2H)、7.93(d，J＝9.5Hz，1H)EI Mass(M)+＝2953)ss-3的合成將pre ss-3(乙?；?67mg(0.227mmol)加入到1.2N鹽酸20mL中，完全密閉后加熱回流3小時，之后在室溫下攪拌1小時30分鐘。加入飽和碳酸氫鈉水溶液65mL，用乙酸乙酯(75mL×4)萃取，用飽和食鹽水洗滌有機層，用Na2SO4干燥后，減壓蒸餾除去溶劑。用硅膠柱色譜法精制殘留物(展開溶劑二氯甲烷/乙酸乙酯＝3/1)，得到黃色晶體狀的ss-3(收量38.0mg，收率66.2％)。m.p.132.5℃-133.5℃。1H-NMR(300MHz丙酮-d6)；δ4.57(br，2H)、6.10(d，J＝9.5Hz，1H)、6.60-6.78(m，5H)、7.47(d，J＝8.6Hz，1H)、7.77(d，J＝9.5Hz，1H)EI Mass(M)+＝253實施例2ss-1F(通式(II)中R2為對羥基苯基，R3為2-羧基苯基的化合物)的合成1)4-叔丁氧基碘苯的合成將4-碘苯酚18.7g(85.1mmol)溶解于二氯甲烷150mL，在冰冷條件下向其中通入異丁烯達到飽和。之后，加入濃硫酸10滴，在室溫下攪拌1夜。用2N氫氧化鈉水溶液50ml洗滌反應液2次，用Na2SO4干燥有機層后，減壓蒸餾除去溶劑，得到白色晶體狀的4-叔丁氧基碘苯(收量16.6g，收率70.7％)。m.p.40.0℃-41.5℃。1H-NMR(300MHz CDCl3)；δ1.33(s，9H)、6.75(dd，J＝9.0Hz，2.4Hz，2H)、7.55(dd，J＝9.0Hz，2.4Hz，2H)EI Mass(M)+＝2762)per ss-1F(叔丁基)的合成將熒光素鈉3.75g(9.97mmol)、氯化亞銅3.92g(39.6mmol)、叔丁氧基碘苯8.05g(29.2mmol)加入到吡啶50ml中，在氬氣流下加熱回流10小時15分鐘。向反應液中加入水50ml、濃鹽酸80ml，調(diào)節(jié)為酸性后，用二氯甲烷萃取。用飽和食鹽水洗滌有機層，用無水Na2SO4干燥后，減壓濃縮。用硅膠柱色譜法精制殘留物(展開溶劑乙酸乙酯/正己烷＝1/1)，得到黃色固體狀的pre ss-1F(叔丁基)(收量19.6mg，收率0.4％)。m.p.136.0℃-138.0℃1H-NMR(300MHz CD3CN)；δ1.33(s，9H)、6.62-6.82(m，6H)、7.06(m，4H)、7.30(d，J＝7.5Hz，1H)、7.71-7.83(m，2H)、7.98(d，J＝6.4Hz，1H)FAB Mass(M+1)+＝4813)ss-1F的合成將pre ss-1F(叔丁基)9.8mg(20.4μmol)溶解于2，2，2-三氟乙醇10mL中，在冰冷條件下加入三氟甲磺酸的稀釋液5滴，在氬氣流下，冰冷條件下攪拌25分鐘。反應結(jié)束后，向反應液中加入二氯甲烷40mL，用水(2次)、飽和食鹽水洗滌，用Na2SO4干燥后，減壓蒸餾除去溶劑，得到黃色晶體狀的ss-1(收量6.6mg，收率76.9％)。m.p.127.0℃-129.0℃。1H-NMR(300MHz丙酮-d6)；δ6.48-6.67(m，6H)、6.79(d，J＝9.0Hz，2H)、6.87(d，J＝9.0Hz，2H)、7.17(d，J＝7.5Hz，1H)、7.58-7.71(m，2H)、7.86(d，J＝7.5Hz，1H)FAB Mass(M+1)+＝425實施例3ss-3F(通式(II)中R2為對氨基苯基，R3為2-羧基苯基的化合物)的合成1)4-碘三氟乙酰苯胺的合成在冰冷條件下，向4-碘苯胺25.0g(114mmol)的二氯甲烷100ml溶液中加入三氟醋酸酐36.0ml(216mmol，45.0g)以及吡啶17.0ml(210mmol，16.6g)，在冰冷條件下攪拌直到發(fā)煙和發(fā)熱結(jié)束。之后，立即返回至室溫，接著攪拌19小時。減壓蒸餾除去溶劑后，用硅膠柱色譜法(洗脫液乙酸乙酯)精制，得到淡褐色固體狀的4-碘三氟乙酰苯胺(收量34.1g，收率94.8％)。m.p.148.5-149.0℃1H-NMR(300MHz，CDCl3/TMS)；δ7.35(d，J＝8.8Hz，2H)，7.71(d，J＝8.8Hz，1H)，7.90(br，1H)EI Mass(M)+＝3152)N’-三氟乙酰基-ss-3F(TFA鹽)的合成將熒光素鈉3.77g(10.0mmol)溶解于二甲基乙酰胺50ml中，攪拌20分鐘。向其中混合4-碘三氟乙酰苯胺12.8g(40.5mmol)的吡啶60ml溶液，再加入氯化銅2.55g(25.8mmol)，在氬氣流下加熱回流9小時。將該反應溶液放冷至室溫后，加入水100ml，再加入濃鹽酸65ml調(diào)節(jié)為酸性。將其用乙酸乙酯萃取3次，收集有機層，用飽和食鹽水洗滌后，在硫酸鈉上干燥，減壓蒸餾除去溶劑。用硅膠柱色譜法(洗脫液乙酸乙酯/正己烷＝1/1)精制殘渣，得到黃色固體狀的前(プレ)ss-3F(TFA)(收量76.6mg，收率1.48％)。m.p.116.5-118.5℃1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)；δ6.57-6.87(m，6H)，7.18(d，J＝9.0Hz，2H)，7.30(d，J＝7.5Hz，1H)，7.70-7.82(m，4H)，8.00(d，J＝7.5Hz，1H)FAB Mass(M+1)+＝5203)ss-3F的合成將前ss-3F(TFA)76.6mg(0.148mmol)以及無水碳酸鉀90.3mg溶解于乙醇20ml和水1.2ml的混合液中，加熱回流4小時。將該溶液放冷至室溫后，減壓蒸餾除去乙醇和水。向殘渣中加入水20ml，再加入2N鹽酸10ml調(diào)節(jié)為酸性(pH1)。將其用二氯甲烷萃取2次，收集有機層，減壓蒸餾除去溶劑。用硅膠柱色譜法(洗脫液乙酸乙酯/正己烷＝1/1)精制殘渣，得到黃色固體狀的ss-3F(收量13.6mg，收率21.8％)。m.p.153.5-155.0℃1H-NMR(300MHz，丙酮-d6)；δ6.60-6.89(m，10H)，7.29(d，J＝7.5Hz，1H)，7.72(td，J＝7.5Hz，1.5Hz，1H)，7.80(td，J＝7.5Hz，1.5Hz，1H)，7.98(d，J＝7.5Hz，1H)FAB Mass(M+1)+＝424
其次，為了考察ss-3F與單線態(tài)氧的反應，向10μM ss-3F溶液中加入EP-1(單線態(tài)氧的發(fā)生系統(tǒng)——萘內(nèi)過氧化物類化合物Saito，I.，et al.，J.Am.Chem.Soc.，107，pp.6329-6334，1985)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液使最終濃度達到1mM、2mM和5mM，測定熒光強度的時間變化(EP-1系統(tǒng))。其中，這時溶液的溫度為37℃。結(jié)果如圖2所示。另外，在與上述同樣的條件下，測定反應結(jié)束后的溶液的激發(fā)光譜和熒光光譜。結(jié)果如圖3所示。由圖2可知，使ss-3F與EP-1共存時，熒光強度依賴于EP-1的濃度和時間而上升。而且在圖3中認為有熒光發(fā)生，確認通過ss-3F與單線態(tài)氧的反應產(chǎn)生熒光。
而且，為了考察ss-3F與羥基自由基的反應，向10μM ss-3F溶液中加入過氧化氫使最終濃度達到1mM，之后加入高氯酸亞鐵共計5次，每次均使最終濃度達到100μM，測定熒光強度的時間變化(Fenton系統(tǒng))。結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，熒光強度隨高氯酸亞鐵添加的度而上升，確認通過ss-3F與羥基自由基的反應產(chǎn)生熒光。2)吸光光譜將ss-3F溶解于DMF中達到10mM的濃度后，加入100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)溶解使最終濃度達到10μM。測定該10μM ss-3F溶液的吸光光譜。結(jié)果如圖5所示。確認ss-3F在455nm附近具有極大吸收。3)HPLC色譜用HPLC分析以下所示的溶液。柱使用XTerraTMRP185μM(4.6×250mm)，洗脫液為乙腈/0.1M NaHCO3水溶液＝1/1(含有0.1％的三氟醋酸)，洗脫速度為1ml/分鐘，測定460nm處的吸光度。
(A)10μM ss-3F溶液(B)向10μM ss-3F溶液中加入EP-1使最終濃度達到5mM，在37℃下反應8小時得到的反應溶液(C)向10μM ss-3F溶液中加入過氧化氫使最終濃度達到1mM，再加入高氯酸亞鐵使最終濃度達到500μM，在室溫下放置約3小時得到的溶液(D)1μM熒光素溶液
ss-3F單獨的場合(A)，在保留時間3.0分鐘檢測出峰。單線態(tài)氧發(fā)生系統(tǒng)(B)檢測出與(A)不同的2.3分鐘的峰，羥基自由基發(fā)生系統(tǒng)(C)檢測出與(A)不同的2.3分鐘的峰。(B)、(C)檢測出的峰與熒光素(D)的峰2.3分鐘一致。由上述內(nèi)容確認ss-3F與單線態(tài)氧或羥基自由基反應，生成熒光素。
(b)加入EP-1 100μM。
(c)加入KO2100μM。
(d)加入過氧化氫1mM。
(e)加入NOCl3100μM。
(f)在熒光燈正下方放置2小時30分鐘。
以羥基自由基(條件a)為首，DCHF也與其它活性氧種充分反應。另外，對于本來不希望反應的自動氧化(條件f)的反應性也同樣強。另一方面，ss-1F和ss-3F完全不受自動氧化(條件f)，而且對羥基自由基具有較強的反應性。實施例7過氧化物酶活性的特異性檢測將本發(fā)明的化合物ss-1F或ss-3F溶解于DMF達到10mM的濃度后，加入100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)溶解使最終濃度達到10μM。向該ss-1F或ss-3F溶液中加入西洋山崳菜過氧化物酶的100mM磷酸緩沖液(pH7.4)，再添加過氧化氫使最終濃度達到0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0μM，立即測定熒光光譜。另外，除了在熒光波長515nm下測定以外，在與實施例4之1)同樣的條件下進行測定。結(jié)果如圖9所示。由圖9可以確認，ss-1F和ss-3F均在過氧化氫濃度0～5.0μM的范圍內(nèi)熒光強度依賴于濃度上升。
由實施例6的結(jié)果已經(jīng)得知ss-1F和ss-3F與過氧化氫自身不反應，而且不受自動氧化。因此，由本實施例7的結(jié)果可以確認本發(fā)明的化合物能夠僅特異性地測定過氧化物酶的活性。
工業(yè)實用性本發(fā)明的化合物作為羥基自由基、單線態(tài)氧等活性氧的測定用試劑是有用的。含有本發(fā)明化合物的活性氧測定用試劑以及使用上述化合物的活性氧測定方法，特別是作為用于采用生物顯象術(shù)的方法準確且簡便地測定局部存在于生物體內(nèi)的特定細胞或組織中的活性氧的試劑和測定方法是有用的。
權(quán)利要求
1.下述通式(I)或(II)表示的化合物或其鹽， 式中，R1和R2分別獨立地表示可以具有取代基的芳基，R3表示可以具有取代基的2-羧基苯基。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物或其鹽，R1和R2為被氨基或羥基取代的苯基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的化合物或其鹽，R3為2-羧基苯基。
4.活性氧測定用試劑，含有權(quán)利要求1至3中任意一項所述的化合物或其鹽。
5.活性氧的測定方法，包括下述步驟(A)使上述權(quán)利要求1至3中任意一項所述的化合物或其鹽與活性氧反應的步驟，以及(B)測定上述步驟(A)中生成的脫芳基化合物或其鹽的熒光的步驟。
6.測定酶活性中與活性氧有關(guān)的酶的酶活性的方法，使用權(quán)利要求1至3中任意一項所述的化合物或其鹽。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，酶為過氧化物酶。
8.用于測定酶活性中與活性氧有關(guān)的酶的酶活性的試劑，含有權(quán)利要求1至3中任意一項所述的化合物或其鹽。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑，酶為過氧化物酶。
全文摘要
通式(I)或(II)表示的化合物或其鹽，以及含有該化合物或其鹽的活性氧測定用試劑。(式中，R
文檔編號C07D311/16GK1418208SQ01805847
公開日2003年5月14日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月29日
發(fā)明者長野哲雄, 蒲野泰照, 瀨月內(nèi)健一 申請人:第一化學藥品株式會社, 長野哲雄