專利名稱：用作抗腫瘤劑的2,4－二(雜－)芳基氨基(－氧基)－5－取代的嘧啶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯，所述化合物具有細(xì)胞循環(huán)抑制活性，具有有用的抗癌(例如抗細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞遷移和/或細(xì)胞程序死亡)活性，并因此可用于治療溫血動物例如人的方法中。本發(fā)明還涉及制備所述嘧啶衍生物的方法，含有它們的藥物組合物，及其在制備藥物中的應(yīng)用或在溫血動物例如人中產(chǎn)生抗癌作用(抗細(xì)胞增殖/轉(zhuǎn)移和/或細(xì)胞程序死亡)地應(yīng)用。
稱為細(xì)胞周期蛋白的一族細(xì)胞內(nèi)蛋白在細(xì)胞周期中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期蛋白的合成和降解受到嚴(yán)格控制，這樣它們的表達(dá)水平在細(xì)胞周期期間波動。細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸激酶(CDKs)的結(jié)合和這種結(jié)合對于細(xì)胞內(nèi)的CDK(例如CDK1、CDK2、CDK4和/或CDK6)活性是必需的。雖然對于這些因子各自是如何組合來調(diào)控CDK活性的細(xì)節(jié)了解很少，但是兩個指令(是否細(xì)胞)之間的平衡貫穿整個細(xì)胞周期。
最近集中在原癌基因和腫瘤抑制基因的研究已經(jīng)確定了進(jìn)入細(xì)胞周期的調(diào)控是腫瘤有絲分裂發(fā)生的關(guān)鍵控制點。此外，CDK似乎在多種原癌基因信號傳導(dǎo)途徑的下游。由于細(xì)胞周期蛋白上調(diào)和/或缺失內(nèi)源性抑制劑而導(dǎo)致的CDK活性失控似乎是腫瘤細(xì)胞致有絲分裂信號傳導(dǎo)途徑與增殖之間的重要樞紐。
因此，已經(jīng)認(rèn)識到，細(xì)胞周期激酶抑制劑，特別是CDK2、CDK4和/或CDK6抑制劑(分別在S-期、G1-S和G1-S期作用)應(yīng)當(dāng)具有用作細(xì)胞增殖選擇性抑制劑例如哺乳動物癌細(xì)胞生長選擇性抑制劑的價值。
此外，據(jù)信抑制參與信號傳導(dǎo)途徑的粘著斑激酶(FAK)會誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡(細(xì)胞死亡)和/或抑制細(xì)胞遷移，因此FAK抑制劑具有用作抗癌劑的價值。
本發(fā)明是基于下列發(fā)現(xiàn)，即一些2，4-嘧啶化合物令人驚奇地抑制細(xì)胞周期激酶的作用，表現(xiàn)出對CDK2、CDK4和CDK6的選擇性，而且還抑制FAK，并因此具有抗癌(抗細(xì)胞遷移/增殖和/或細(xì)胞程序死亡)活性。預(yù)計這樣的活性在下列方面有價值治療與異常細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖有關(guān)的病癥，例如癌癥(實體瘤和白血病)、纖維增殖和分化病癥、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Kaposi′s肉瘤、血管瘤病(haemangioma)、急性和慢性腎病、粉瘤、動脈粥樣硬化、動脈再狹窄、自身免疫性疾病、急性和慢性炎癥、骨疾病和具有視網(wǎng)膜血管增殖的眼疾病。
本發(fā)明提供了式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯
其中
Q1和Q2獨立地選自芳基或碳連接的雜芳基；Q1和Q2當(dāng)中有一個或者Q1和Q2都在一個環(huán)碳原子上被一個選自下列的取代基取代N-(C1-2烷基)氨基、N，N-二-(C1-2烷基)氨基、苯基、雜環(huán)基、苯氧基、雜環(huán)基-O-、取代的C1-2烷基、取代的C1-2烷氧基、取代的C1-2烷氧基羰基、取代的N-(C1-2烷基)氨基、取代的C1-2烷氧基C1-2烷基、取代的C2-4鏈烯基和取代的C2-4炔基；其中對于C1-2烷基、C1-2烷氧基、C1-2烷氧基羰基、N-(C1-2烷基)氨基、C1-2烷氧基C1-2烷基、C2-4鏈烯基和C2-4炔基，所述取代基選自鹵素、羥基、巰基、硝基、甲酰基、甲酰胺基、羧基、氰基、氨基、脲基、氨基甲?；被酋；1-4鏈烷酰基、C1-4烷氧基羰基、苯基、雜環(huán)基、苯甲?；?、雜環(huán)基-C(O)-、其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a、N＇-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)脲基、N′-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-(C1-4烷基)氨磺?；?、N，N-二-(C1-4烷基)氨磺?；-C1-4烷基氨基甲?；，N-二-(C1-4烷基)氨基甲?；虲1-4鏈烷?；被?；其中任何苯基、芐基、苯甲?；螂s環(huán)基任選在環(huán)碳原子上被一個或多個選自Ra的基團(tuán)取代，并且如果雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Rb的基團(tuán)取代；
G是-O-或-NR2-；
R2選自氫、C1-6烷基、C3-6鏈烯基和C3-6炔基；其中所述C1-6烷基、C3-6鏈烯基和C3-6炔基可任選被一個或多個選自Rc的基團(tuán)取代；
R1選自氫、鹵素、羥基、硝基、氨基、N-(C1-3烷基)氨基、N，N-二-(C1-3烷基)氨基、氰基、三氟甲基、三氯甲基、C1-3烷基[任選被1或2個獨立地選自下列的取代基取代鹵素、氰基、氨基、N-(C1-3烷基)氨基、N，N-二-(C1-3烷基)氨基、羥基和三氟甲基]、C3-5鏈烯基[任選被最高達(dá)3個鹵素取代、或者被一個三氟甲基取代]、C3-5炔基、C1-3烷氧基、巰基、C1-3烷硫基、羧基和C1-3烷氧基羰基；
Q1任選在環(huán)碳原子上被1-4個獨立地選自下列的取代基取代鹵素、巰基、硝基、甲?；?、甲酰胺基、羧基、氰基、氨基、脲基、氨基甲酰基、氨磺?；1-4烷基、C2-4鏈烯基、C2-4炔基[其中所述C1-4烷基、C2-4鏈烯基和C2-4炔基任選被一個或多個選自Rd的取代基取代]、C1-4鏈烷?；1-4烷氧基羰基、雜環(huán)基、其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a[任選被羥基取代]、N′-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)脲基、N＇-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-(C1-4烷基)氨磺?；，N-二-(C1-4烷基)氨磺?；?、N-C1-4烷基氨基甲?；?、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基和C1-4鏈烷?；被?br> 獨立地，或者除了上述取代基以外，Q1可任選被1-2個獨立地選自芳基、C3-8環(huán)烷基和雜環(huán)基的取代基取代；其中所述芳基、C3-8環(huán)烷基或雜環(huán)基可任選在環(huán)碳原子上被一個或多個選自Re的基團(tuán)取代；并且如果雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Rf的基團(tuán)取代；
Q2任選在環(huán)碳原子上被1-4個獨立地選自下列的取代基取代鹵素、羥基、巰基、硝基、甲酰基、甲酰胺基、羧基、氰基、氨基、脲基、氨基甲?；?、氨磺酰基、C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基[其中所述C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C2-4炔基和C1-4烷氧基可任選被一個或多個選自Rg的基團(tuán)取代]、C1-4鏈烷?；?、C1-4烷氧基羰基、雜環(huán)基、其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a[任選被羥基取代]、N′-(C1-4烷基)脲基、N′，N＇-二-(C1-4烷基)脲基、N′-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N′，N＇-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-(C1-4烷基)氨磺?；?、N，N-二-(C1-4烷基)氨磺?；-C1-4烷基氨基甲?；，N-二-(C1-4烷基)氨基甲?；?、C2-4鏈烯氧基、C2-4炔氧基、C1-4鏈烷酰基氨基；
獨立地，或者除了上述取代基以外，Q2可任選被1-2個獨立地選自芳基、C3-8環(huán)烷基和雜環(huán)基的取代基取代；其中所述芳基、C3-8環(huán)烷基或雜環(huán)基可任選在環(huán)碳原子上被一個或多個選自Rh的基團(tuán)取代；并且如果雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Ri的基團(tuán)取代；
Rc、Rd和Rg獨立地選自羥基、鹵素、氨基、氰基、甲酰基、甲酰胺基、羧基、硝基、巰基、氨基甲?；被酋；?、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、C1-4鏈烷?；?、C1-4鏈烷酰氧基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基羰基、N-C1-4烷基氨基甲?；?、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C1-4鏈烷酰基氨基、其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a、C1-4烷基磺酰基氨基、N-(C1-4烷基)氨磺?；-(C1-4烷基)2氨磺?；?、N-(C1-4烷基)氨基甲?；?、N-(C1-4烷基)2氨基甲酰基、苯基、苯硫基、苯氧基、C3-8環(huán)烷基和雜環(huán)基；其中所述苯基、苯硫基、苯氧基、C3-8環(huán)烷基或雜環(huán)基可任選在環(huán)碳原子被一個或多個Rj的基團(tuán)取代；并且如果所述雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Rk的基團(tuán)取代；
Ra、Re、Rh和Rj獨立地選自羥基、鹵素、氨基、氰基、甲?；?、甲酰胺基、羧基、硝基、巰基、氨基甲?；?、氨磺酰基、C1-4烷基[任選被一個或多個選自鹵素、氰基、氨基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基或羥基取代]、C2-4鏈烯基[任選被一個或多個選自鹵素的基團(tuán)取代]、C2-4炔基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、C1-4鏈烷?；?、C1-4鏈烷酰氧基、C1-4烷氧基[任選被一個或多個選自鹵素的基團(tuán)取代]、C1-4烷氧基羰基、N-C1-4烷基氨基甲?；?、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C1-4鏈烷?；被?、其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a、C1-4烷基磺?；被?、N-(C1-4烷基)氨磺酰基、N-(C1-4烷基)2氨磺?；⒈交?、C3-8環(huán)烷基和雜環(huán)基；且
Rb、Rf、Ri和Rk獨立地選自C1-4烷基、C1-4鏈烷?；1-4烷基磺?；?、氨基甲酰基、N-(C1-4烷基)氨基甲酰基、N，N-(C1-4烷基)氨基甲?；⑵S基、芐氧基羰基、苯甲?；捅交酋；?。
“芳基”是含有4-12個原子的全不飽和或部分不飽和的單環(huán)或二環(huán)碳環(huán)?！胺蓟眱?yōu)選為含有5或6個原子的單環(huán)或含有9或10個碳原子的二環(huán)?！胺蓟备鼉?yōu)選為苯基、萘基、四氫萘基或二氫茚基?！胺蓟碧貏e是苯基、萘基或二氫茚基?！胺蓟备貏e是苯基。
“碳連接的雜芳基”是全不飽和的5-元或6-元單環(huán)或9-元或10-元二環(huán)，其中至少一個原子選自氮、硫或氧。該環(huán)是經(jīng)由碳原子連接在NH-(對于Q1)或G(對于Q2)上?！疤歼B接的雜芳基”優(yōu)選為呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、咪唑基、吡唑基、呋咱基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三嗪基、吲哚基、喹啉基或苯并咪唑基。“碳連接的雜芳基”更優(yōu)選為吡啶基、噻唑基或吡唑基?！疤歼B接的雜芳基”特別是吡啶基。
“雜環(huán)基”是含有4-12個原子的飽和、部分飽和或不飽和單環(huán)或二環(huán)，其中至少一個原子選自氮、硫或氧，除非另有說明，否則該基團(tuán)是經(jīng)由碳或氮連接的，其中-CH2-基可任選被-C(O)-代替，并且環(huán)硫原子可任選被氧化以形成S-氧化物?！半s環(huán)基”是吡咯烷基、嗎啉代、哌啶基、奎寧環(huán)基、吡啶基、吡喃基、吡咯基、異噻唑基、吲哚基、喹啉基、噻吩基、呋喃基、1，3-苯并二氧雜環(huán)戊烯基、噻二唑基、哌嗪基、噻唑烷基、吡咯烷基、琥珀酰亞氨基、硫代嗎啉代、吡唑基、吡咯啉基、高哌嗪基、四氫吡喃基、咪唑基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、異噁唑基、鄰苯二甲酰亞氨基、4-吡啶酮、1-異喹諾酮、2-吡咯烷酮、4-噻唑烷酮、咪唑并[1，2-a]吡啶或3-氮雜-8-氧雜二環(huán)[3，2，1]己烷。“雜環(huán)基”更優(yōu)選為吡咯烷基、嗎啉代、哌啶基、奎寧環(huán)基、哌嗪基、琥珀酰亞氨基、咪唑基或鄰苯二甲酰亞氨基。
在本說明書中，術(shù)語“烷基”包括直鏈或支鏈烷基，但是當(dāng)提及單獨的烷基例如“丙基”時，其僅特指直鏈型。類似約定適用于其它一般術(shù)語?！胞u素”是氟、氯、溴和碘。
C2-4鏈烯基的實例是乙烯基和烯丙基；C2-6鏈烯基的實例是C3-5鏈烯基、乙烯基和烯丙基；C3-6鏈烯基的實例是烯丙基；C3-6炔基的實例是C3-5炔基和丙炔-2-基；C2-4炔基的實例是乙炔基和丙炔-2-基；C2-6炔基的實例是乙炔基和丙炔-2-基；C1-4鏈烷酰基的實例是乙?；捅；籆1-4烷氧基羰基的實例是C1-3烷氧基羰基、C1-2烷氧基羰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基和叔丁氧基羰基；C1-4亞烷基的實例是亞甲基、亞乙基和亞丙基；C1-4烷基的實例是C1-3烷基、C1-2烷基、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基；C1-6烷基的實例甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基和3-甲基丁基；C1-4烷氧基的實例是C1-3烷氧基、C1-2烷氧基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基和丁氧基；C2-4鏈烯氧基的實例是烯丙氧基；C2-4炔氧基的實例是丙炔氧基；其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a的實例是C1-3烷硫基、甲硫基、乙硫基、丙硫基、甲基亞磺酰基、乙基亞磺酰基、丙基亞磺酰基、甲磺酰基、乙基磺酰基和丙基磺?；?；N-C1-4烷基氨基甲酰基的實例是N-甲基氨基甲?；-乙基氨基甲?；蚇-丙基氨基甲?；?；N，N-二-(C1-4烷基)-氨基甲?；荖，N-二甲基氨基甲酰基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰基和N，N-二乙基氨基甲?；籒-C1-4烷基氨基的實例是N-(C1-3烷基)氨基、N-(C1-2烷基)氨基、甲基氨基、乙基氨基和丙基氨基；N，N-二-(C1-4烷基)氨基的實例是N，N-二-(C1-3烷基)氨基、N，N-二-(C1-2烷基)氨基、二甲基氨基、N-乙基-N-甲基氨基、二乙基氨基、N-甲基-N-丙基氨基和二丙基氨基；C1-4鏈烷?；被膶嵗且阴０被?、丙酰氨基和丁酰氨基；C3-8環(huán)烷基的實例是環(huán)丙基、環(huán)戊基和環(huán)己基；C1-4鏈烷?；膶嵗且阴；捅；?；C1-4鏈烷酰氧基的實例是乙酰氧基和丙酰氧基；N′-(C1-4烷基)脲基的實例是N-甲基脲基和N-乙基脲基；N′，N′-二-(C1-4烷基)脲基的實例是N′，N′-二甲基脲基、N′，N′-二異丙基脲基和N′-甲基-N′-丙基脲基；N′-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基的實例是N-甲基-N-乙基脲基和N′-甲基-N-甲基脲基；N′，N＇-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基的實例是N′，N′-二甲基-N-乙基脲基和N′-甲基-N′-丙基-N-丁基脲基；N-(C1-4烷基)氨磺酰基的實例是N-甲基氨磺?；蚇-異丙基氨磺?；?；N，N-二-(C1-4烷基)氨磺酰基的實例是N-甲基-N-乙基氨磺?；蚇，N-二丙基氨磺?；?；C1-4烷基磺?；被膶嵗羌谆酋；被?、乙基磺?；被捅酋；被?；雜環(huán)基-O-的實例是哌啶基氧基、吡啶基氧基和嘧啶基氧基；C1-2烷氧基C1-2烷基的實例是甲氧基甲基和乙氧基乙基；雜環(huán)基-C(O)-的實例是哌嗪基羰基、吡啶基羰基和嘧啶基羰基。
本發(fā)明嘧啶衍生物的合適的可藥用鹽是例如具有充分堿性的本發(fā)明嘧啶衍生物的酸加成鹽，例如與無機(jī)酸或有機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、檸檬酸或馬來酸形成的酸加成鹽。此外，具有充分酸性的本發(fā)明嘧啶衍生物的合適的可藥用鹽是堿金屬鹽，例如鈉鹽或鉀鹽，和堿土金屬鹽例如鈣鹽或鎂鹽，銨鹽或者與獲得生理可接受陽離子的有機(jī)堿形成的鹽，例如與甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、哌啶、嗎啉或三-(2-羥基乙基)胺形成的鹽。
本發(fā)明式(I)化合物可以以前藥的形式施用，所述前藥在人或動物體內(nèi)分解釋放出式(I)化合物。前藥的實例包括式(I)化合物的在體內(nèi)可水解的酯。
含有羧基或羥基的式(I)化合物的在體內(nèi)可水解的酯是例如在人或動物體內(nèi)水解以生成母酸或醇的可藥用酯。對于羧基，合適的可藥用酯包括C1-6烷氧基甲基酯例如甲氧基甲酯，C1-6烷酰氧基甲酯例如新戊酰氧基甲酯、苯并呋喃酮酯，C3-8環(huán)烷氧基羰基氧基C1-6烷基酯例如1-環(huán)己基羰基氧基乙酯；1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮基甲基酯例如5-甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮基甲酯；和C1-6烷氧基羰基氧基乙基酯例如1-甲氧基羰基氧基乙酯，并且可在本發(fā)明化合物中的任何羧基上形成。
含有羥基的式(I)化合物的在體內(nèi)可水解的酯包括無機(jī)酯例如磷酸酯和α-酰氧基烷基醚以及相關(guān)化合物，它們在體內(nèi)通過酯水解釋放出母羥基。α-酰氧基烷基醚的實例包括乙酰氧基甲氧基和2，2-二甲基丙酰氧基甲氧基。對于羥基，體內(nèi)可水解的酯形成基團(tuán)的選擇包括鏈烷?；?、苯甲?；?、苯基乙?；腿〈谋郊柞；捅交阴；?、烷氧基羰基(以生成烷基碳酸酯)、二烷基氨基甲?；蚇-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲?；?以生成氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙?；汪然阴；?。在苯甲?；系娜〈膶嵗◤沫h(huán)氮原子上經(jīng)由亞甲基連接在苯甲?；h(huán)的3-位或4-位上的嗎啉代和哌嗪子基。
某些式(I)化合物可能具有手性中心和/或幾何異構(gòu)中心(E-和Z-異構(gòu)體)，并且應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括具有CDK和/或FAK抑制活性的所有這樣的旋光、非對映異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體。
本發(fā)明涉及具有CDK和/或FAK抑制活性的任何和所有互變異構(gòu)形式的式(I)化合物。
還應(yīng)當(dāng)理解，一些式(I)化合物可以以溶劑化以及非溶劑化形式例如水合物形式存在。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括具有CDK和/或FAK抑制活性的所有這樣的溶劑化形式。
特別優(yōu)選的的本發(fā)明化合物包括式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯，其中R1、Q1、Q2、和G具有任何上文定義的含義，或者任何下列值。適當(dāng)?shù)脑?，任何定義、權(quán)利要求或上下文中的實施方案可使用這些值。
Q1和Q2優(yōu)選獨立地地選自苯基和吡啶基。
Q1優(yōu)選為苯基。
Q2優(yōu)選為苯基或吡啶基。
優(yōu)選地，Q1是苯基，Q2選自苯基和吡啶基。
優(yōu)選地，Q1和Q2當(dāng)中有一個或者Q1和Q2都在環(huán)碳原子上被一個選自下列的取代基取代N，N-二-(C1-2烷基)氨基、雜環(huán)基、雜環(huán)基-O-、取代的C1-2烷基、取代的C1-2烷氧基、取代的C1-2烷氧基羰基、取代的N-(C1-2烷基)氨基、取代的C1-2烷氧基C1-2烷基和取代的C2-4炔基；其中對于C1-2烷基、C1-2烷氧基、C1-2烷氧基羰基、N-(C1-2烷基)氨基、C1-2烷氧基C1-2烷基和C2-4炔基，所述取代基選自羥基、羧基、氨基、雜環(huán)基、雜環(huán)基-C(O)-、N-C1-4烷基氨基和N，N-二-(C1-4烷基)氨基；其中任何雜環(huán)基任選在環(huán)碳原子上被一個或多個選自Ra的基團(tuán)取代，并且如果雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Rb的基團(tuán)取代。
更優(yōu)選地，Q1和Q2當(dāng)中有一個或者Q1和Q2都在環(huán)碳原子上被一個選自下列的取代基取代N，N-二-(C1-2烷基)氨基、哌嗪子基(任選在4-氮上被甲基取代)、哌啶-3-基氧基(任選在氮上被甲基取代)、哌啶-4-基氧基(任選在氮上被甲基取代)、取代的C1-2烷基、取代的C1-2烷氧基、取代的C1-2烷氧基羰基、取代的N-(C1-2烷基)氨基、取代的C1-2烷氧基C1-2烷基和取代的C2-4炔基；其中對于C1-2烷基、C1-2烷氧基、C1-2烷氧基羰基、N-(C1-2烷基)氨基、C1-2烷氧基C1-2烷基和C2-4炔基，所述取代基選自羥基、羧基、氨基、琥珀酰亞胺-1-基、哌啶-3-基(任選在氮上被甲基取代)、鄰苯二甲酰亞胺-1-基、嗎啉代、奎寧環(huán)-3-基(任選被羥基取代)、哌啶-4-基、吡咯烷-1-基、哌嗪子基(任選在氮上被甲基取代)、咪唑-1-基、哌啶子基、哌嗪子基羰基(任選在氮上被異丙基取代)、N-C1-4烷基氨基和N，N-二-(C1-4烷基)氨基。
特別地，Q1和Q2當(dāng)中有一個或者Q1和Q2都在環(huán)碳原子上被一個選自下列的取代基取代二甲基氨基、4-甲基哌嗪子基、氨基甲基、2-羥基乙氧基甲基、琥珀酰亞胺-1-基甲基、2-吡咯烷-1-基乙基、2-氨基乙基、哌啶-4-基氧基、1-甲基哌啶-4-基氧基、1-甲基哌啶-3-基氧基、羧基甲氧基、1-甲基哌啶-2-基甲氧基、1-甲基哌啶-3-基甲氧基、哌啶-4-基甲氧基、4-異丙基哌嗪子基羰基甲氧基、2-鄰苯二甲酰亞胺-1-基乙氧基、2-嗎啉代乙氧基、2二甲基氨基乙氧基、2-二乙基氨基乙氧基、2-(4-甲基哌嗪子基)乙氧基、2-咪唑-1-基乙氧基、2-吡咯烷-1-基乙氧基、2-氨基乙炔基、2-二甲基氨基乙炔基、2-甲基氨基乙炔基、2-(3-羥基奎寧環(huán)-3-基)乙炔基、2-嗎啉代乙氧基甲基、2-二乙基氨基乙氧基甲基、2-吡咯烷-1-基乙氧基甲基、2-(4-甲基哌嗪子基)乙氧基甲基、2-二乙基氨基乙氧基羰基、2-哌啶子基乙基氨基或2-異丙基氨基乙基氨基。
更特別地，Q1和Q2當(dāng)中有一個或者Q1和Q2都在環(huán)碳原子上被一個選自下列的取代基取代1-甲基哌啶-4-基氧基、羧基甲氧基、2-二甲基氨基乙氧基、2-甲基氨基乙炔基、2-哌啶子基乙基氨基或2-異丙基氨基乙基氨基。
Q1優(yōu)選在環(huán)碳原子上被-個選自下列的取代基取代N-(C1-2烷基)氨基、N，N-二-(C1-2烷基)氨基、苯基、雜環(huán)基、苯氧基、雜環(huán)基-O-、取代的C1-2烷基、取代的C1-2烷氧基、取代的C1-2烷氧基羰基、取代的N-(C1-2烷基)氨基、取代的C1-2烷氧基C1-2烷基、取代的C2-4鏈烯基和取代的C2-4炔基；其中對于C1-2烷基、C1-2烷氧基、C1-2烷氧基羰基、N-(C1-2烷基)氨基、C1-2烷氧基C1-2烷基、C2-4鏈烯基和C2-4炔基，所述取代基選自鹵素、羥基、巰基、硝基、甲酰基、甲酰胺基、羧基、氰基、氨基、脲基、氨基甲?；?、氨磺酰基、C1-4鏈烷?；?、C1-4烷氧基羰基、苯基、雜環(huán)基、苯甲?；?、雜環(huán)基-C(O)-、其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a、N′-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)脲基、N′-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-(C1-4烷基)氨磺?；?、N，N-二-(C1-4烷基)氨磺?；?、N-C1-4烷基氨基甲?；?、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲?；虲1-4鏈烷酰基氨基；其中任何苯基、芐基、苯甲?；螂s環(huán)基任選在環(huán)碳原子上被一個或多個選自Ra的基團(tuán)取代；并且如果雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Rb的基團(tuán)取代，并且更優(yōu)選地，除了選自上面列出的一個取代基以外，Q1是未取代的。
Q1更優(yōu)選在-NH-的對位或間位被取代。
Q1特別優(yōu)選在-NH-的對位被取代。
在本發(fā)明一個方面，G優(yōu)選為-O-。
在本發(fā)明另一個方面，G優(yōu)選為-NR2-。
在本發(fā)明一個方面，當(dāng)G是-NR2-時，R2優(yōu)選為氫。
在另一個本發(fā)明方面，當(dāng)G是-NR2-時，R2優(yōu)選不是氫。
R1優(yōu)選為氫、氯或溴。
R1優(yōu)選為溴。
Q2優(yōu)選未取代或者被選自氟、溴、甲基、甲氧基和氰基的一個基團(tuán)取代。
Q2更優(yōu)選未取代或者被一個甲基取代。
Q2優(yōu)選是苯基、2-氰基苯基、3-甲基苯基、4-氟苯基、4-溴苯基、4-甲氧基苯基或6-甲基吡啶-2-基。
Q2更優(yōu)選為苯基或6-甲基吡啶-2-基。
因此，在一個優(yōu)選的本發(fā)明方面，本發(fā)明提供了如上所述的式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯，其中
Q1和Q2獨立地選自苯基和吡啶基；且Q1在環(huán)碳上被一個選自下列的取代基取代N，N-二-(C1-2烷基)氨基、雜環(huán)基、雜環(huán)基-O-、取代的C1-2烷基、取代的C1-2烷氧基、取代的C1-2烷氧基羰基、取代的N-(C1-2烷基)氨基、取代的C1-2烷氧基C1-2烷基和取代的C2-4炔基；其中對于C1-2烷基、C1-2烷氧基、C1-2烷氧基羰基、N-(C1-2烷基)氨基、C1-2烷氧基C1-2烷基和C2-4炔基，所述取代基選自羥基、羧基、氨基、雜環(huán)基、雜環(huán)基-C(O)-、N-C1-4烷基氨基和N，N-二-(C1-4烷基)氨基；其中任何雜環(huán)基任選在環(huán)碳原子上被一個或多個選自Ra的基團(tuán)取代；并且如果雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Rb的基團(tuán)取代；且Q2是未取代的或者被一個選自氟、溴、甲基、甲氧基和氰基的基團(tuán)取代；
G是-NH-；且
R1是氫、氯或溴。
因此，在更優(yōu)選的本發(fā)明方面中，本發(fā)明提供了如上所述的式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯，其中
Q1是苯基，且Q2選自苯基和吡啶基；Q1在-NH-的對位或間位被一個選自下列的取代基取代二甲基氨基、4-甲基哌嗪子基、氨基甲基、2-羥基乙氧基甲基、琥珀酰亞胺-1-基甲基、2-吡咯烷-1-基乙基、2-氨基乙基、哌啶-4-基氧基、1-甲基哌啶-4-基氧基、1-甲基哌啶-3-基氧基、羧基甲氧基、1-甲基哌啶-2-基甲氧基、1-甲基哌啶-3-基甲氧基、哌啶-4-基甲氧基、4-異丙基哌嗪子基羰基甲氧基、2-鄰苯二甲酰亞胺-1-基乙氧基、2-嗎啉代乙氧基、2-二甲基氨基乙氧基、2-二乙基氨基乙氧基、2-(4-甲基哌嗪子基)乙氧基、2-咪唑-1-基乙氧基、2-吡咯烷-1-基乙氧基、2-氨基乙炔基、2二甲基氨基乙炔基、2-甲基氨基乙炔基、2-(3-羥基奎寧環(huán)-3-基)乙炔基、2-嗎啉代乙氧基甲基、2-二乙基氨基乙氧基甲基、2-吡咯烷-1-基乙氧基甲基、2-(4-甲基哌嗪子基)乙氧基甲基、2-二乙基氨基乙氧基羰基、2-哌啶子基乙基氨基或2-異丙基氨基乙基氨基；且Q2是未取代的或者被一個選自氟、溴、甲基、甲氧基和氰基的基團(tuán)取代；
G是-NH-；且
R1是氫、氯或溴。
在本發(fā)明的一個方面中，優(yōu)選的本發(fā)明化合物是實施例2、12、21、28、30或38的化合物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯。
在本發(fā)明另一個方面，優(yōu)選的本發(fā)明化合物包括任何實施例的化合物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯。
優(yōu)選的本發(fā)明方面是涉及本發(fā)明化合物或其可藥用鹽的那些。
式(I)嘧啶衍生物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯可通過適于制備在化學(xué)上相關(guān)的化合物的任何已知方法制得。當(dāng)用于制備式(I)嘧啶衍生物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯時，這樣的方法是作為本發(fā)明另外的特征提供的，并且可通過下述代表性實施例舉例說明，其中除非另有說明，否則R1、Q1、Q2和G具有上文關(guān)于式(I)嘧啶衍生物所定義的任何含義，并且除非在環(huán)Q1或Q2上畫出另一取代基，否則環(huán)可攜帶任何上述取代基(任選按照需要保護(hù)的)。當(dāng)在環(huán)Q1上畫出取代基時，這包括(除非另有說明)在環(huán)Q2上還攜帶取代基的可能性，或者環(huán)Q2上攜帶取代基以代替在環(huán)Q1上的取代基。必需原料可通過標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)化學(xué)方法獲得(參見例如Advanced Organic Chemistry(Wiley-Interscience)，Jerry March—還用于反應(yīng)條件和試劑的一般指導(dǎo))。在隨同的非限制性方法和實施例中描述了這樣的原料的制備。另外，必需原料可通過在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識范圍內(nèi)的類似于所舉例說明的方法的方法制得。
因此，作為本發(fā)明另一特征，本發(fā)明提供了下列方法，包括
a)對于其中G是-NR2-的式(I)化合物，將式(II)嘧啶化合物
其中L是如下所定義的可置換基團(tuán)，與式(III)化合物反應(yīng)
其中G是-NR2-；
b)將式(IV)嘧啶化合物
其中L是如下所定義的可置換基團(tuán)，與式(V)化合物反應(yīng)
然后如果需要的話
i)將式(I)化合物轉(zhuǎn)化成另一式(I)化合物；
ii)除去任何保護(hù)基；
iii)形成可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯。
L是可置換基團(tuán)，L的合適的值是例如鹵素、磺酰氧基或硫基，例如氯、溴、甲磺酰氧基、甲苯-4-磺酰氧基、甲磺?；?、甲硫基和甲基亞磺?；?。
上述反應(yīng)的具體反應(yīng)條件如下方法a)
式(II)嘧啶與式(III)化合物可以在下列條件下反應(yīng)
i)任選在合適的酸例如無機(jī)酸如鹽酸或硫酸存在下，或者在有機(jī)酸例如乙酸或甲酸存在下進(jìn)行反應(yīng)。該反應(yīng)優(yōu)選在合適的惰性溶劑或稀釋劑例如二氯甲烷(DCM)、乙腈、丁醇、環(huán)丁砜、四氫呋喃、1，2-二甲氧基乙烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷-2-酮中于例如0℃-150℃溫度下、方便起見在接近回流溫度下進(jìn)行；或者
ii)在標(biāo)準(zhǔn)Buchwald條件下(例如參見J.Am.Chem.Soc.，118，7215；J.Am.Chem.Soc.，119，8451；J.Org.Chem.，62，1568和6066)，例如在乙酸鈀存在下，在合適的溶劑例如芳族溶劑如甲苯、苯或二甲苯中，使用合適的堿例如無機(jī)堿如碳酸銫或有機(jī)堿例如叔丁氧基鉀，在合適的配體例如2，2′-二(二苯基膦基)-1，1′-聯(lián)萘存在下，在25-80℃溫度下進(jìn)行。
式(II)嘧啶可依據(jù)下述反應(yīng)方案制得
其中Ra是任選取代的烷基或芳基，且L是如上所定義的可置換基團(tuán)。Ra優(yōu)選為甲基、乙基或?qū)妆交?br> 式(III)化合物可商購獲得，或者通過本領(lǐng)域已知方法制得。方法b)
式(IV)嘧啶和式(V)苯胺可在下列條件下反應(yīng)
i)在合適的溶劑例如酮如丙酮或醇例如乙醇或丁醇或芳烴例如甲苯或N-甲基吡咯烷存在下，任選在合適的酸例如上文定義的酸(或合適的路易斯酸)存在下，在0℃-回流溫度下、優(yōu)選回流溫度下進(jìn)行反應(yīng)；或者
ii)在如上所述的標(biāo)準(zhǔn)Buchwald條件下進(jìn)行反應(yīng)。
式(IV)嘧啶可依據(jù)下述反應(yīng)方案制得
其中L是如上所定義的可置換基團(tuán)。
式(V)苯胺可商購獲得，或者可通過本領(lǐng)域已知方法制得。
式(IVA)嘧啶可商購獲得，或者可通過例如將其中L是-OH的式(IVA)化合物(即尿嘧啶)與POCl3反應(yīng)以生成其中L是-Cl的式(IVA)化合物來制得。
將一種式(I)化合物轉(zhuǎn)化成另一種式(I)化合物的實例有
i)當(dāng)G是-NR2-時，將作為氫的R2轉(zhuǎn)化成其它R2，例如
其中L是可置換基團(tuán)；
ii)當(dāng)G是-NR2-時，將作為取代的側(cè)鏈的R2轉(zhuǎn)化成另一取代的側(cè)鏈，例如
其中Ms是甲磺?；?，且Nu是引入如式(I)中所定義的R2的任選取代基的親核試劑(NB羥基部分無需在如上所示的末端碳上)；
iii)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將R1的一個值轉(zhuǎn)化成R1的另一個值，例如將作為羥基的R1轉(zhuǎn)化成C1-4烷氧基。
本發(fā)明優(yōu)選方法是方法b)。
應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明化合物中的各個環(huán)取代基可在進(jìn)行上述方法之前或者之后立即通過標(biāo)準(zhǔn)芳族取代反應(yīng)引入或者通過常規(guī)官能團(tuán)修飾來生成，并且這也包括在本發(fā)明方法中。這樣的反應(yīng)和修飾包括例如通過芳族取代反應(yīng)引入取代基、將取代基還原、將取代基烷基化和將取代基氧化。用于這些方法的試劑和反應(yīng)條件是化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。芳族取代反應(yīng)的特別實例包括使用濃硝酸引入硝基，在FriedelCrafts條件下使用例如酰鹵和路易斯酸(例如三氯化鋁)引入?；辉贔riedel Crafts條件下使用例如烷基鹵和路易斯酸(例如三氯化鋁)引入烷基；和引入鹵素基團(tuán)。修飾的特別實例包括通過例如用鎳催化劑催化氫化或者在鹽酸存在下、加熱條件下用鐵處理來將硝基還原成氨基；將烷硫基氧化成烷基亞磺酰基或烷基磺?；?。
還應(yīng)當(dāng)理解，在某些上述反應(yīng)中，可能必需/最好將化合物中的任何敏感基團(tuán)保護(hù)起來。需要或最好進(jìn)行保護(hù)的情況以及合適的保護(hù)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？梢罁?jù)標(biāo)準(zhǔn)實踐使用常規(guī)保護(hù)基(參見例如T.W.Green，Protective Groups in Organic Synthesis，JohnWiley and Sons，1991)。因此，在某些本文所述的反應(yīng)中，如果反應(yīng)物包含基團(tuán)例如氨基、羧基或羥基，可能最好將基團(tuán)保護(hù)起來。
對于氨基或烷基氨基，合適的保護(hù)基是例如?；珂溚轷；缫阴；檠趸驶缂籽趸驶?、乙氧基羰基或叔丁氧基羰基，芳基甲氧基羰基例如芐氧基羰基，或芳酰基例如苯甲?；?。上述保護(hù)基的脫保護(hù)條件必需根據(jù)所選的保護(hù)基而變。因此，例如，?；珂溚轷；蛲檠趸驶蚍减；赏ㄟ^例如用合適的堿如堿金屬氫氧化物例如氫氧化鋰或氫氧化鈉水解來除去?；蛘?，?；缡宥⊙趸驶赏ㄟ^例如用合適的酸如鹽酸、硫酸或磷酸或三氟乙酸處理來除去，芳基甲氧基羰基例如芐氧基羰基可通過例如用催化劑例如披鈀碳?xì)浠蛘咄ㄟ^用路易斯酸例如三(三氟乙酸)硼處理來除去。對于伯氨基，另外合適的保護(hù)基是例如鄰苯二甲?；?，其通過用烷基胺例如二甲基氨基丙基胺或肼處理來除去。
對于羥基，合適的保護(hù)基是例如酰基如鏈烷?；缫阴；?，芳?；绫郊柞；?，或芳基甲基例如芐基。上述保護(hù)基的脫保護(hù)條件必需根據(jù)所選的保護(hù)基而變。因此，例如，酰基如鏈烷?；蚍减；赏ㄟ^例如用合適的堿如堿金屬氫氧化物例如氫氧化鋰或氫氧化鈉水解來除去?；蛘撸蓟谆缙S基可通過例如用催化劑例如披鈀碳?xì)浠瘉沓ァ?br> 對于羧基，合適的保護(hù)基是例如酯化基團(tuán)，例如可通過例如用堿如氫氧化鈉水解來除去的甲基或乙基，或例如可通過例如用酸如有機(jī)酸例如三氟乙酸處理來除去的叔丁基，或例如可通過例如用催化劑如披鈀碳?xì)浠瘉沓サ钠S基。
可在合成中的任何適宜步驟使用化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)來除去保護(hù)基。
許多本文限定的中間體是新的，例如式II和IV中間體，它們作為本發(fā)明另外的特征。測定
如上所述，在本發(fā)明中限定的嘧啶衍生物具有抗細(xì)胞增殖活性例如抗癌活性，據(jù)信這是由于它們的CDK和/或FAK抑制活性所致。這些性質(zhì)可通過例如使用下列方法來評價CDK4抑制測定
使用下列縮寫-HEPES是N-(2-羥基乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)DTT是二硫蘇糖醇PMSF是苯基甲基磺酰氟
使用測定摻入到測試底物(GST-成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)內(nèi)的[γ-33-P]-三磷酸腺苷的閃爍近似測定法(SPA-得自Amersham)，在96孔格式板中在體外激酶測定中測試化合物。將測試化合物(在DMSO和水中稀釋至合適的濃度)置于每個孔中，將p16作為抑制劑對照或DMSO作為正對照置于對照孔中。
將在25μl培養(yǎng)緩沖液中稀釋的大約0.5μl CDK4/細(xì)胞周期蛋白D1部分純化酶(其量取決于酶活性)加到每個孔中，然后加入20μlGST-Rb/ATP/ATP33混合物(含有0.5μg GST-Rb和0.2μM ATP以及0.14μCi[γ-33-P]-三磷酸腺苷)，并將所得混合物輕微振搖，然后在室溫培養(yǎng)60分鐘。
然后向每個孔中加入含有(0.8mg/孔蛋白A-PVT SPA珠子(Amersham))、20pM/孔抗-谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、兔子IgG(得自分子探針)、61mM EDTA和含0.05％疊氮化鈉的50mM HEPES pH7.5的150μL終止溶液。
用Topseal-S板密封器將平板密封，放置2個小時，然后以2500rpm、1124×g旋轉(zhuǎn)5分鐘。將平板在Topcount上讀取，每個孔讀取30秒。
用于稀釋酶和底物混合物的培養(yǎng)緩沖液含有50mM HEPES pH7.5、10mM MnCl2、1mM DTT、100pM釩酸鈉、100μM NaF、10mM甘油磷酸鈉BSA(1mg/ml終體積)。
可使用另一已知的CDK4抑制劑代替p16作為對照。測試底物
在該測定中，僅使用一部分與GST尾融合的成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(Science 1987 Mar 13；235(4794)1394-1399；Lee W.H.，Bookstein R.，Hong F.，Young L.J.，Shew J.Y.，Lee E.Y.)。進(jìn)行成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤氨基酸379-928(得自成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤質(zhì)粒ATCCpLRbRNL)的PGR，將該序列克隆到用于擴(kuò)增氨基酸792-928的pGEX 2T融合載體內(nèi)(Smith D.B.和Johnson，K.S.Gene 67，31(1988)；該載體含有用于誘導(dǎo)表達(dá)的tac啟動子、用于在任何大腸桿菌宿主中使用的內(nèi)lac Iq基因、和用于凝血酶分裂的編碼區(qū)域-得自PharmaciaBiotech)。再將該序列克隆到pGEX 2T內(nèi)。
使用標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)將由此獲得的成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤792-928序列在大腸桿菌(BL21(DE3)pLysS細(xì)胞)中表達(dá)，并如下所述純化。
將大腸桿菌粘重懸在10ml/g NETN緩沖液(50mM Tris pH7.5，120mM NaCl，1mM EDTA，0.5％v/v NP-40，1mM PMSF，1ug/ml亮抑蛋白酶肽，1ug/ml抑肽酶和1ug/ml胃蛋白酶抑制劑)中，并超聲2×45秒/100ml勻化物。離心后，將上清液負(fù)載到10ml谷胱甘肽瓊脂糖柱(Pharmacia Biotech，Herts，UK)上，并用NETN緩沖液洗滌。用激酶緩沖液(50mM HEPES pH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM PMSF，1ug/ml亮抑蛋白酶肽，1ug/ml抑肽酶和1ug/ml胃蛋白酶抑制劑)洗滌，用50mM還原谷胱甘肽在激酶緩沖液中的溶液將蛋白稀釋。將含有GST-Rb(792-927)的級分匯集，并用激酶緩沖液透析過夜。通過使用8-16％Tris-甘氨酸凝膠(Novex，San Diego，USA)的十二烷基硫酸鈉(SDS)PAGE(聚丙烯酰胺凝膠)分析終產(chǎn)物。CDK4和細(xì)胞周期蛋白D1
按照下述方法將CDK4和細(xì)胞周期蛋白D1從RNA中克隆到MCF-7細(xì)胞系(得自ATCC號HTB22，乳腺癌系)內(nèi)。該RNA是由MCF-7細(xì)胞，然后用低聚dT引物逆轉(zhuǎn)錄制得的。使用PCR來擴(kuò)增每個基因的完全編碼序列[CDK4氨基酸1-303；Ref.Cell 1992 Oct 16；71(2)323-334；Matsushime H.，Ewen M.E.，Stron D.K.，Kato J.Y.，Hanks S.K.，Roussel M.F.，Sherr C.J.和細(xì)胞周期蛋白D1氨基酸1-296；Ref.Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，1991；5693-97；ArnoldA.，Motokura T.，Bloom T.，Kronenburg，Ruderman J.，JuppnerH.，Kim H.G.]。
定序后，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將PCR產(chǎn)物克隆到昆蟲表達(dá)載體pVL1393(得自Invitrogen 1995編入目錄號V1392-20)。然后將PCR產(chǎn)物雙重表達(dá)[使用標(biāo)準(zhǔn)病毒Baculogold共感染技術(shù)]到昆蟲SF21細(xì)胞系統(tǒng)(Spodoptera Frugiperda細(xì)胞，得自Fall Army Worm的卵巢細(xì)胞—可商購獲得)內(nèi)。
下列實施例提供了在SF21細(xì)胞中(在TC100+10％FBS(TCS)+0.2％Pluronic)(對于每個細(xì)胞周期蛋白D1 & CDK4的病毒，具有雙重感染MOI 3)制備細(xì)胞周期蛋白D1/CDK4的詳細(xì)描述。制備細(xì)胞周期蛋白CD1/CDK4的實施例
使用在滾式瓶培養(yǎng)物中生長至2.33×106個細(xì)胞/ml的SF21細(xì)胞以0.2×10E6個細(xì)胞/ml接種到滾式瓶中。將滾式瓶在滾柱裝置上于28℃培養(yǎng)。
3天(72小時)后，得自2個瓶的平均值為1.86×10E6個細(xì)胞/ml(99％存活)。然后用雙重病毒以MOI 3/每個病毒感染培養(yǎng)物。
感染10×500ml，JS303細(xì)胞周期蛋白D1病毒效價-9×10E7pfu/ml。JS304 CDK4病毒效價-1×10E8 pfu/ml。
細(xì)胞周期蛋白D1對于每個500ml瓶，1.86×10E6×500×3/0.9×108＝31ml病毒。
CDK4對于每個500ml瓶，1.86×10E6×500×3/1×108＝31ml病毒。
在加入培養(yǎng)物之前，將病毒混合在一起，并將培養(yǎng)物再置于滾柱裝置上于28℃培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)染3天(72小時)后，收獲5升培養(yǎng)物。收獲物中的總細(xì)胞數(shù)目為1.58×10E6個細(xì)胞/ml(99％存活)。將細(xì)胞以250ml批量在Heraeus Omnifuge 2.0 RS中以2500rpm于4℃旋轉(zhuǎn)30分鐘。棄去上清液，將20個沉降團(tuán)(~4×10E8個細(xì)胞/沉降團(tuán))在液氮中迅速冷凍，并在CCRF冷室中于-80℃貯存。然后通過重懸在裂解緩沖液(50mMHEPES pH7.5，10mM氯化鎂，1mM DTT，10mM甘油磷酸鹽，0.1mM PMSF，0.1mM氟化鈉，0.1mM原釩酸鈉，5ug/ml抑肽酶，5ug/ml亮抑蛋白酶肽和20％w/v蔗糖)中、并加入冰冷的去離子水將SF21細(xì)胞進(jìn)行低滲裂解。離心后，將上清液負(fù)載到Poros HQ/M 1.4/100陰離子交換柱(PE Biosystems，Hertford，UK)上。將CDK4和細(xì)胞周期蛋白D1用375mM NaCl在裂解緩沖液中的溶液共洗脫下來，通過蛋白質(zhì)印跡法，使用合適的抗-CDK4和抗-細(xì)胞周期蛋白D1抗體(得自Santa CruzBiotechnology，California，US)檢查其其存在。p16對照(Nature 366704-7071993Serrano M.Hannon GJ.ReachD)
將p16(CDK4/細(xì)胞周期蛋白D1的天然抑制劑)從HeLa cDNA(得自ATCC CCL2的Hela細(xì)胞，得自子宮頸的人上皮癌；Cancer Res.12264，1952)中擴(kuò)增，克隆到具有5′His尾的pTB 375 NBSE中，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS細(xì)胞(得自Promega；Ref.Studier F.W.和Moffat B.A.，J.Mol.Biol.，189，113，1986)中。將1升培養(yǎng)物生長至適當(dāng)OD，然后用IPTG誘導(dǎo)以過夜表達(dá)p16。然后通過在50mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，PMSF，0.5μg/ml亮抑蛋白酶肽和0.5μg/ml抑肽酶中超聲來裂解細(xì)胞。將該混合物旋轉(zhuǎn)，把上清液加到鎳蝥合物珠子中，并混合1.5小時。將珠子在磷酸鈉，NaCl pH6.0中洗滌，并將p16產(chǎn)物洗脫到具有200mM咪唑的磷酸鈉，NaCl pH7.4。
按照下列方法用pTB375 NBPE構(gòu)建pTB NBSE-pTB 375
用于生成pTB 375的背底載體是pZEN0042(參見UK專利2253852)，并在pAT153衍生背底中含有得自質(zhì)粒RP4的tetA/tetR誘導(dǎo)四環(huán)素抗性序列和得自質(zhì)粒pKS492的cer穩(wěn)定性序列。通過加入由T7基因10啟動子、多克隆位點和T7基因10終止序列構(gòu)成的表達(dá)試劑盒來生成pTB375。此外，設(shè)計用來減少從背底載體的轉(zhuǎn)錄讀取的終止子序列包括在表達(dá)試劑盒的上游。pTB 375 NBPE
除去存在于pTB 375中的獨特的EcoRI限制位點。將含有關(guān)于限制酶NdeI、BamHI、PstI和EcoRI的識別序列的新的多克隆位點引入到pTB 375內(nèi)，其中是引入到位于破壞存在于pTB 375中的初始BamHI位點的NdeI和BamHI位點之間。pTB 375 NBSE
將含有關(guān)于限制酶NdeI、BamHI、SmaI和EcoRI的識別序列的新的多克隆位點引入到pTB 375 NBPE內(nèi)NdeI和EcoRI位點之間。含有這些限制位點的低聚核苷酸在與存在于NdeI位點內(nèi)的起始密碼子(ATG)相同的閱讀框架中還含有6個位于NdeI和BamHI之間的6個組氨酸密碼子。
按照類似于上述的方法，可構(gòu)建設(shè)計用來評價CDK2和CDK6抑制的測定。CDK2(EMBL登記號X62071)可以與細(xì)胞周期蛋白A或細(xì)胞周期蛋白E(見EMBL登記號M73812)一起使用，關(guān)于這些測定的進(jìn)一步詳細(xì)描述公開于PCT國際出版物WO99/21845，該文獻(xiàn)的有關(guān)生物化學(xué)&生物學(xué)評價章節(jié)引入本發(fā)明以作參考。
如果使用具有細(xì)胞周期蛋白E部分的CDK2，可如下所述進(jìn)行共純化將Sf21細(xì)胞重懸在裂解緩沖液(50mM Tris pH8.2，10mM MgCl2，1mM DTT，10mM甘油磷酸鹽，0.1mM原釩酸鈉，0.1mM NaF，1mM PMSF，1ug/ml亮抑蛋白酶肽和1ug/ml抑肽酶)中，并在10ml Dounce均化器中均化2分鐘。離心后，將上清液負(fù)載到Poros HQ/M 1.4/100陰離子交換柱(PE Biosystems，Hertford，UK)上。在0-1M NaCl梯度(在沒有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中)將CDK2和細(xì)胞周期蛋白E共洗脫下來，洗脫20個柱體積。通過使用抗-CDK2和抗-細(xì)胞周期蛋白E抗體的蛋白質(zhì)印跡法(Santa Cruz Biotechnology，California，US)來檢查共洗脫。FAK3激酶抑制測定
該測定法確定了測試化合物抑制人粘著斑激酶(FAK)活性的能力。
編碼FAK的DNA是通過基因全合成獲得的(Edwards M，International
Biotechnology Lab 5(3)，19-25，1987)或者通過克隆獲得的。然后在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)這些基因以獲得具有酪氨酸激酶活性的多肽。例如，經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白而獲得的FAK表現(xiàn)出內(nèi)在的酪氨酸激酶活性。
將FAK(Andre等人描述的全長人cDNA(Biochemical andBiophysical Research Communications，1993，190(1)140-147；EMBL/GenBank登記號L05186))修飾，這樣當(dāng)翻譯時，所得蛋白在緊挨著起始蛋氨酸的前面具有一個6-組氨酸尾。之前已經(jīng)在使用類似的N-末端6-組氨酸t(yī)ag的桿狀病毒系統(tǒng)(Protein Expression AndPurification，1996，712-18)中表達(dá)了活性FAK蛋白。將人FAKcDNA克隆到桿狀病毒置換型載體pFastbac 1(Life Technologies)內(nèi)，將重組構(gòu)建物與病毒RNA共轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞(例如Spodopterafrugiperda 21(Sf21))中以制備重組桿狀病毒(關(guān)于裝配重組DNA分子的方法以及重組桿狀病毒的制備和應(yīng)用的詳細(xì)描述可參見標(biāo)準(zhǔn)教科書例如Sambrook等人，1989，Molecular cloning-A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbour Laboratory Press和O′Reilly等人，1992，Baculovirus Expression Vectors-ALaboratory Manual，W.H.Freeman和Co，New York。pFastbac(′Bacto Bac′)系統(tǒng)的應(yīng)用的專門詳細(xì)描述參見Anderson等人，1995，F(xiàn)OCUS(Life Technologies Bulletin Magazine)，17，p53)。
為了表達(dá)生物活性人FAK蛋白，用噬斑純FAK重組病毒在感染復(fù)數(shù)3將Sf21細(xì)胞感染，48小時后收獲。將收獲的細(xì)胞用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBS)(10mM磷酸鈉pH7.4，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)洗滌，然后重懸在冰冷的裂解緩沖液(50mM HEPES pH7.5，1mM二硫蘇糖醇，100uM氟化鈉，100uM原釩酸鈉，10mM甘油磷酸鹽，100uM苯基甲基磺酰氟(PMSF)，5ug/ml抑肽酶，5ug/ml亮抑蛋白酶肽，1％吐溫；PMSF是在臨用前從新制備的100mM甲醇溶液中加入的)，每一億個細(xì)胞使用250μl裂解緩沖液。然后將懸浮液在冰上培養(yǎng)15分鐘，并以13,000rpm于4℃離心10分鐘。取出上清液(酶貯備物)，分成等分試樣，迅速在液氮中冷卻，然后在-70℃貯存。對于典型的一批，用酶稀釋液(100mM HEPES pH7.4，0.2mM二硫蘇糖醇，200uM原釩酸鈉，0.1％Triton X-100)將酶貯備物進(jìn)行250倍的稀釋，對于每個測定孔，使用50ml新稀釋的酶(參見下文中的FAK3方案)。FAK3體外酶測定方案
由含有酪氨酸的無規(guī)共聚物例如聚(Glu，Ala，Tyr)6∶3∶1(Sigma P3899)制備底物貯備液，作為在PBS中的1 mg/ml貯備液于-20℃貯存，并用PBS稀釋500倍以用于鋪平板。
在測定的前一天，將100μl稀釋的底物溶液加到測定板(Maxisorp96孔免疫板Life technologies，Cat.No.439454A)的所有孔中，并平板密封器密封，并在4℃放置過夜。
在測定的當(dāng)天，棄去底物溶液，將測定板用200μl PBST(含有0.05％v/v吐溫20的PBS)洗滌一次，用200μl 50mM Hepes pH7.4洗滌一次。
將測試化合物在DMSO中制成10mM或30mM貯備液，然后在玻璃蒸餾水中進(jìn)一步稀釋至比最終的測定濃度高10倍的濃度。將10μl稀釋的化合物轉(zhuǎn)移到洗滌過的測定板的孔中。“無化合物”對照孔含有10μl玻璃蒸餾水以代替化合物。
將40微升含有6.25M腺苷-5′-三磷酸(ATP)的25mM氯化錳加到所有測試孔中。為了開始反應(yīng)，將50μl新稀釋的酶加到每個孔中，并將平板在23℃培養(yǎng)90分鐘。然后通過加入含有20mM EDTA的100μl PBS來終止反應(yīng)。棄去液體，并用PBST將孔洗滌2次。
將100微升在含有0.5％w/v胎牛血清白蛋白(BSA)的PBST中稀釋1500倍的鼠HRP-連接的抗磷酸酪氨酸抗體(Santa Cruz，Product SC7020-HRP)加到每個孔中，將平板在室溫培養(yǎng)1小時，然后棄去液體，并用200μl PBST將孔洗滌2次。向每個孔中加入100微升2，2′-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)溶液，該溶液是用一個50mgABTS片(Boehringer 1204 521)在50ml新制備的50mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液pH5.0+0.03％過硼酸鈉(每100ml蒸餾水使用具有過硼酸鈉(PCSB)膠囊(Sigma P4922)的1磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液)新制備的。然后將平板在室溫培養(yǎng)20-60分鐘，直至使用平板讀數(shù)分光光度計在405nm測定的“無化合物”對照孔的吸收度值大約為1.0。
使用Origin Software由吸收度讀數(shù)生成劑量反應(yīng)曲線。使用通過Origin Software分析確定的抑制濃度50(IC50)將化合物分級。
雖然式(I)化合物的藥理性質(zhì)隨著結(jié)構(gòu)的改變而變化，但是在上述測定中，可在250μM-1nM的IC50濃度或劑量證實式(I)化合物所具有的一般活性。
當(dāng)在上述體外測定中測試時，所測定的實施例31的CDK4抑制活性為IC50＝0.679μM。當(dāng)在上述體外測定中測試時，所測定的實施例25的FAK抑制活性為IC50＝0.218μM。
本發(fā)明化合物的體內(nèi)活性可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來評價，例如通過測定抑制細(xì)胞生長和評價細(xì)胞毒害作用來評價。例如，進(jìn)一步的詳細(xì)描述可參見下列參考文獻(xiàn)
a)在腫瘤細(xì)胞中減弱粘著斑激酶的表達(dá)會誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡。XuL-h等人。Cell Growth & Differentiation(1996)7，p413-418；
b)在人腫瘤細(xì)胞中粘著斑激酶的COOH-末端域引起粘著損失和細(xì)胞死亡。Xu L-h等人。Cell Growth & Differentiation(1998)9，p999-1005；
c)在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中抑制pp125-FAK導(dǎo)致細(xì)胞程序死亡。Hungerford J.E等人。The Journal of Cell Biology(1996)135，p1383-1390；
d)抑制粘著斑中的粘著斑激酶(FAK)信號傳導(dǎo)降低細(xì)胞能動性和增殖。Gilmore A.P和Romer L.H.Molecular Biology of the Cell(1996)7，p1209-1224。
細(xì)胞生長抑制可通過用Sulforhodamine B(SRB)將細(xì)胞染色來測定，SRB是一種熒光染料，其將蛋白染色，并因此給出孔中蛋白(即細(xì)胞)的估計量(參見Boyd，M.R.(1989)NCI臨床前抗腫瘤藥物開發(fā)篩選的狀況。Prin.Prac Oncol 10∶1-12)。因此，提供關(guān)于測定細(xì)胞生長抑制的下列詳細(xì)描述-
在96孔平板中，將細(xì)胞以100μl的體積鋪在適當(dāng)培養(yǎng)基中；培養(yǎng)基是用于MCF-7、SK-UT-1B和SK-UT-1的Dulbecco′s改性的Eagle培養(yǎng)基。將細(xì)胞過夜附著，然后將抑制劑化合物以最大濃度為1％DMSO(v/v)的不同濃度加入。測定對照平板以得到用藥前的細(xì)胞的值。將細(xì)胞在37℃(5％CO2)培養(yǎng)3天。
在3天結(jié)束時，將TCA以16％(v/v)的終濃度加到平板中。然后將平板在4℃培養(yǎng)1小時，取出上清液，用自來水洗滌平板。干燥后，加入100μl SRB染料(0.4％SRB在1％乙酸中的溶液)，在37℃培養(yǎng)30分鐘。取出過量SRB，用1％乙酸洗滌平板。將與蛋白結(jié)合的SRB溶解在10mM Tris pH7.5中，并在室溫振搖30分鐘。在540nm讀取OD，從抑制劑濃度對吸收度的半對數(shù)曲線確定出引起50％抑制的抑制劑濃度。將光密度降至低于當(dāng)在開始實驗時鋪細(xì)胞所獲得的光密度的化合物的濃度給出毒性的值。
當(dāng)在SRB測定中測試時，本發(fā)明化合物的一般IC50值為1mM-1nM。
依據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了包含如上所定義的式(I)嘧啶衍生物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯和可藥用稀釋劑或載體的藥物組合物。
本發(fā)明組合物可呈口服給藥的形式，例如呈片劑或膠囊形式，適于非胃腸道注射(包括靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、血管內(nèi)注射或輸注)的形式，例如呈無菌溶液、懸浮液或乳液的形式，適于局部給藥的形式，例如呈膏劑或霜劑的形式，或適于直腸給藥的形式，例如呈栓劑形式。
上述組合物一般可用常用賦形劑以常規(guī)方式制得。
本發(fā)明嘧啶化合物通常以5-5000mg/平方米身體面積，即約0.1-100mg/kg的單位劑量施用給溫血動物，并且這通常提供了治療有效劑量。單位劑型例如片劑或膠囊通常含有例如1-250mg活性組分。優(yōu)選使用1-50mg/kg的日劑量。然而，日劑量必須根據(jù)所治療的宿主、特定的給藥途徑、和所治療的疾病的嚴(yán)重程度而改變。因此，最佳劑量可由治療任何特定患者的醫(yī)師決定。
依據(jù)本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療溫血動物例如人的方法中的如上所定義的式(I)嘧啶衍生物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明嘧啶衍生物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯是有效的細(xì)胞周期抑制劑(抗細(xì)胞增殖劑)，據(jù)信該特征(不想受縛于理論)是由于其CDK抑制性質(zhì)所致。本發(fā)明化合物還是FAK的有效抑制劑。因此，預(yù)計本發(fā)明化合物可用于治療僅由或部分由CDK和/或FAK酶介導(dǎo)的疾病或病癥，即本發(fā)明化合物可用于在需要這樣的治療的溫血動物中產(chǎn)生CDK和/或FAK抑制作用。因此，本發(fā)明化合物提供了通過抑制CDK和/或FAK酶來治療惡性細(xì)胞增殖和/或遷移的方法，即化合物可用于產(chǎn)生僅由或部分由CDK和/或FAK抑制介導(dǎo)的抗增殖/遷移作用。通過誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(細(xì)胞程序死亡)，本發(fā)明化合物還可用作FAK抑制劑。預(yù)計本發(fā)明嘧啶衍生物具有寬范圍的抗癌性質(zhì)，這是因為CDK和/或FAK涉及多種常見的人癌癥例如白血病和乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌和卵巢癌。因此，預(yù)計本發(fā)明嘧啶衍生物具有抗這些癌的抗癌活性。此外還預(yù)計本發(fā)明嘧啶衍生物具有抗一系列白血病、淋巴惡性腫瘤和實體瘤例如組織中例如肝臟、腎、前列腺和胰腺中的癌和肉瘤。特別是，預(yù)計本發(fā)明化合物能有利地減慢原發(fā)性或復(fù)發(fā)性實體瘤例如結(jié)腸、乳腺、前列腺、肺和皮膚腫瘤的生長。更特別地，依據(jù)本發(fā)明化合物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯能抑制與CDK和/或FAK有關(guān)的這些原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤的生長，尤其是其生長和擴(kuò)散顯著依賴于CDK和/或FAK的腫瘤，包括例如一些結(jié)腸、乳腺、肺、外陰和皮膚的腫瘤。
還預(yù)計，本發(fā)明嘧啶衍生物具有抗廣泛的其它病癥中的其它細(xì)胞增殖/遷移疾病的活性，這些其它病癥包括白血病、纖維增殖和分化病癥、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Kaposi′s肉瘤、血管瘤病(haemangioma)、急性和慢性腎病、粉瘤、動脈粥樣硬化、動脈再狹窄、自身免疫性疾病、急性和慢性炎癥、骨疾病和具有視網(wǎng)膜血管增殖的眼疾病。
因此，依據(jù)本發(fā)明的該方面，本發(fā)明提供了用作藥物的如上所定義的式(I)嘧啶衍生物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯；和如上所定義的式(I)嘧啶衍生物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯在制備用于在溫血動物例如人中產(chǎn)生抗癌、細(xì)胞周期抑制(抗細(xì)胞增殖)作用和/或FAK抑制(抗細(xì)胞遷移和/或細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo))作用的藥物中的應(yīng)用。特別是，通過抑制CDK2、CDK4和/或CDK6，尤其是CDK4和CDK6而在S或G1-S期產(chǎn)生細(xì)胞循環(huán)抑制作用。
依據(jù)本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提供了在需要這樣的治療的溫血動物例如人中產(chǎn)生抗癌、細(xì)胞周期抑制(抗細(xì)胞增殖)作用和/或FAK抑制(抗細(xì)胞遷移和/或細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo))作用的方法，包括給所述動物施用有效量的如上所定義的嘧啶衍生物。特別是，抑制作用是通過抑制CDK2、CDK4和/或CDK6，尤其是CDK4和CDK6而在S或G1-S期產(chǎn)生的。
預(yù)防或治療特定細(xì)胞增殖疾病所需的上述劑量必須根據(jù)所治療的宿主、給藥途徑和所治療的疾病的嚴(yán)重程度而改變。可采用例如1-100mg/kg、優(yōu)選1-50mg/kg的單位劑量。
上文所定義的CDK和/或FAK抑制活性可作為單獨的治療應(yīng)用，或者除了本發(fā)明化合物以外，還包括一種或多種其它物質(zhì)和/或治療。這樣的聯(lián)合治療可通過同時、依次或分別單獨施用各組分來實現(xiàn)。在腫瘤醫(yī)療領(lǐng)域，聯(lián)合使用不同形式的治療來治療各癌癥患者是標(biāo)準(zhǔn)慣例。在腫瘤醫(yī)療領(lǐng)域，除了上文定義的細(xì)胞周期抑制治療以外，這樣的聯(lián)合治療的其它組分可以是手術(shù)、放療或化療。這樣的化療可使用下列3類主要的治療劑
(i)通過與上文限定的機(jī)制相同或不同的機(jī)制起作用的其它細(xì)胞周期抑制劑；
(ii)細(xì)胞抑制劑例如抗雌激素(例如他莫昔芬、托米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene)、孕激素(例如乙酸甲地孕酮)、芳香酶抑制劑(例如anastrozole、來曲唑、伏氯唑、依西美)、抗孕激素、抗雄激素(例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、乙酸環(huán)丙孕酮)、LHRH激動劑和拮抗劑(例如乙酸性瑞林、luprolide)、睪酮5α-二氫還原酶抑制劑(例如芬甾酮)、抗侵襲劑(例如金屬蛋白酶抑制劑如marimastat和尿激酶纖溶酶原激活劑受體功能抑制劑)以及生長因子功能抑制劑(這樣的生長因子包括例如血小板衍生生長因子和肝細(xì)胞生長因子，這樣的抑制劑包括生長因子抗體、生長因子受體抗體、酪氨酸激酶抑制劑和絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑)；和
(iii)腫瘤治療中使用的抗增殖/抗腫瘤藥物及其組合例如抗代謝物(例如抗葉酸劑如甲氨蝶呤、氟代嘧啶例如5-氟尿嘧啶、嘌呤和腺苷類似物、阿糖胞苷)；抗腫瘤抗體(例如蒽環(huán)例如阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素和去甲氧柔紅霉素，絲裂霉素-C、更生霉素、光輝霉素)；鉑衍生物(例如順鉑、卡鉑)；烷化劑(例如氮芥、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、亞硝脲、噻替派)；抗有絲分裂劑(例如長春花生物堿例如長春新堿和taxoids例如紫杉醇、taxotere)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替堪)。依據(jù)本發(fā)明的該方面，本發(fā)明提供了包含如上所定義的式(I)嘧啶衍生物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯和如上所定義的用于癌癥聯(lián)合治療的其它抗腫瘤物質(zhì)的藥物。還可以施用抗吐劑，例如當(dāng)施用如上所述的聯(lián)合治療時施用抗吐劑。
除了治療應(yīng)用，式(I)化合物及其可藥用鹽還可用作開發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)化體外和體內(nèi)測試系統(tǒng)的藥理工具，這樣的測試系統(tǒng)是為了在實驗動物例如貓、狗、兔子、猴子、大鼠和小鼠中評價細(xì)胞周期活性抑制劑的作用，這是開發(fā)新的治療劑的一部分。
在上述其它藥物組合物、加工、方法、應(yīng)用以及藥物制備特征中，也可以使用本文所述的本發(fā)明化合物的其它且優(yōu)選的實施方案。
用下列非限制性實施例舉例說明本發(fā)明，其中在適當(dāng)時可使用化學(xué)技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和類似于這些實施例中描述的技術(shù)，并且除非另有說明，否則
(i)蒸發(fā)是通過在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行的，并且后處理操作是在通過過濾除去殘余固體例如干燥劑后進(jìn)行的；
(ii)除非另有說明，否則操作是在室溫、一般是18-25℃在空氣中進(jìn)行的，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員可在惰性氣氛下例如氬氣氛下進(jìn)行的；
(iii)柱色譜(快速操作)和中等壓力液相色譜(MPLC)是在得自E.Merck，Darmstadt，Germany的Merck Kieselgel二氧化硅(Art.9385)或Merck Lichroprep RP-18(Art.9303)反相二氧化硅上進(jìn)行的；結(jié)合洗脫色譜是用得自Varian Sample Preparation Products，California，USA的Varian Mega Bond Elut柱(10g，指令碼1225-6034)進(jìn)行的；
(iv)給出產(chǎn)率僅是為了舉例說明，并且不一定是可達(dá)到的最大產(chǎn)率；
(v)式(I)終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)一般是通過核(一般是質(zhì)子)磁共振(NMR)和質(zhì)譜技術(shù)證實的；質(zhì)子磁共振化學(xué)位移值是在氘化DMSOd6(除非另有說明)中以δ標(biāo)度(距離四甲基甲硅烷的ppm低場)使用在300MHz場強度操作的Varian Gemini 2000或在250 MHz場強度操作的BrukerAM250光譜計測定的；峰多重性如下所示s，單峰；d，雙峰；dd，雙雙峰；t，三重峰；tt，三三重峰；q，四重峰；tq，三四重峰；m，多重峰；br，寬的；質(zhì)譜(MS)是通過電噴霧在VG平臺上進(jìn)行的；
(vi)除非在本文中具體給出進(jìn)一步的詳細(xì)說明，分析高效液相色譜(HPLC)是在Waters Spherisorb ODS1 25cm柱上進(jìn)行的，流速為2ml/分鐘，使用乙腈/水/三氟乙酸(60∶40∶0.1 v/v)作為洗脫劑，在254nm波長檢測，數(shù)據(jù)作為以分鐘為單位的保留時間(RT)給出；
(vii)機(jī)器人合成是使用Zymate XP機(jī)器人進(jìn)行的，其中溶液加入是經(jīng)由Zymate Master Laboratory Station進(jìn)行的，攪拌是經(jīng)由Stem RS5000 Reacto-Station于25℃進(jìn)行的；
(viii)得自機(jī)器人合成的反應(yīng)混合物的后處理和純化是如下所述進(jìn)行的蒸發(fā)是在真空下使用Savant AES 2000進(jìn)行的；柱色譜是用Anachem SympurMPLC或Jones Flashmaster MPLC系統(tǒng)在使用VarianMega Bond Elut柱的二氧化硅上進(jìn)行的；終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)是通過LCMS在使用下列的Micromass OpenLynx系統(tǒng)上證實的，并且作為以分鐘為單位的保留時間(RT)給出；
柱 4.6mm×10cm Hichrom RPB 100(系統(tǒng)A)
2.1mm×3cm Waters Symmetry C18 3.5μm(系統(tǒng)B)
溶劑I＝水+0.1％甲酸，
II＝乙腈+0.1％甲酸
運行時間10分鐘，其中6分鐘5-95％II(系統(tǒng)A)的梯度
5分鐘，其中4.5分鐘5-95％II(系統(tǒng)B)的梯度
波長254nm，帶寬10nm
質(zhì)量檢測器平臺LC
(ix)中間體的特征沒有完全確定，并且純度是通過薄層色譜(TLC)、HPLC、紅外(IR)、MS或NMR分析評價的；
(x)當(dāng)干燥溶液時，干燥劑是硫酸鎂；
(xi)可在上下文中使用下列縮寫
DCM 二氯甲烷；
DMF N，N-二甲基甲酰胺；
DMSO 二甲亞砜；
NMP N-甲基吡咯烷-2-酮；
THF 四氫呋喃。實施例14-苯氨基-5-溴-2-[4-(4-甲基哌嗪子基)苯氨基]嘧啶
將4-(4-甲基哌嗪子基)苯胺鹽酸鹽(按照在J.Med.Chem.1993，36，2716-25中描述的方法制得的；156mg，0.56mmol)在甲醇(1ml)中的溶液加到4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(方法1，250mg，0.90mmol)在正丁醇(2ml)內(nèi)的溶液中。將該混合物在100℃加熱5小時，收集不溶性固體，并用正丁醇(5ml)和乙醚(5ml)洗滌，獲得了產(chǎn)物，為鹽酸鹽(50mg，14％)。
NMR2.2(s，3H)，2.4(m，4H)，3.0(m，4H)，6.8(m，2H)，7.1(m，1H)，7.3-7.5(m，4H)，7.7(m，2H)，8.2(s，1H)，8.4(s，1H)，9.0(s，1H)；MS(MH+)438.9，440.9.實施例2-6
下列化合物是通過類似于實施例1中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(方法1)和合適的苯胺鹽酸鹽(按照J(rèn).Med.Chem.，1993，36，2716-25；Eur.Pat.Appl.EP 487252；Eur.Pat.Appl.EP401358；J.Med.Chem.，1972，15，523-9；J.Med.Chem.，1985，28，1427中描述的方法制得的)制得的
1產(chǎn)物是作為游離堿通過結(jié)合洗脫色譜分離出來的，用0-4％2.0M氨甲醇溶液在DCM中的溶液洗脫2HPLC(RT)6.333反應(yīng)是在1.0M氯化氫乙醚溶液(2當(dāng)量)中進(jìn)行的，并且產(chǎn)物是作為二鹽酸鹽分離出來的4反應(yīng)是在1.0M氯化氫乙醚溶液(2當(dāng)量)中進(jìn)行的，并且產(chǎn)物是作為三鹽酸鹽分離出來的實施例7-9
下列化合物是通過類似于實施例1中描述的方法，由合適的4-苯氨基-2-氯-5-鹵代嘧啶(方法2-3，或者按照在PCT Int.Appl.WO 9719065中描述的方法制得的)和合適的苯胺鹽酸鹽(按照在Eur.Pat.Appl.EP401358；J.Med.Chem.，1985，28，1427；Ger.Offen.DE 2315791中描述的方法制得的)制得的，并且產(chǎn)物是作為游離堿通過結(jié)合洗脫色譜分離出來的，用0-4％2.0M氨甲醇溶液在DCM中的溶液洗脫。
實施例10-12
下列化合物是通過類似于實施例1中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(方法1)和合適的苯胺鹽酸鹽(商購獲得或者按照在Bioorg.Med.Chem.Lett.，1997，7，1921-1926；J.Med.Chem.，1984，27，967-78中描述的方法制得的)制得的，并且產(chǎn)物是作為游離堿通過結(jié)合洗脫色譜分離出來的，用0-4％2.0M氨甲醇溶液在DCM中的溶液洗脫。
1HPLC(RT)5.73實施例134-苯氨基-5-溴-2-[4-(氨基甲基)苯氨基]嘧啶
將4-氨基芐基胺(122mg，1.0mmol)和氯化氫乙醚溶液(1.0M；1.0ml，1.0mmol)加到4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(256mg，0.9mmol)在正丁醇(4ml)內(nèi)的溶液中，并將該混合物在100℃加熱16小時。過濾出不溶性固體，并溶解在甲醇(5ml)中。加入二氧化硅(2g)，通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性材料。通過結(jié)合洗脫色譜純化殘余物，用0-4％2.0M氨甲醇溶液在DCM中的溶液洗脫，獲得了產(chǎn)物(163mg，49％)LCMS(MH+)370，372；HPLC(RT，系統(tǒng)A)2.04。實施例14-15
下列化合物是用Zymate XP機(jī)器人，通過類似于實施例13中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(方法1)和合適的苯胺制得的
1System B實施例16-17
下列化合物是按照類似于實施例1中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(方法1)和合適的苯胺鹽酸鹽(按照J(rèn).Med.Chem.，1971，14，836-42；PCT Int.Appl.WO 9921846中描述的方法制得的)制得的，并且產(chǎn)物是作為游離堿通過結(jié)合洗脫色譜分離出來的，用0-4％2.0M氨甲醇溶液在DCM中的溶液洗脫。
實施例18-19
下列化合物是按照類似于實施例1中描述的方法，由合適的4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(方法1，4)和4-(4-異丙基哌嗪子基)甲氧羰基苯胺鹽酸鹽(方法13)制得的，并且產(chǎn)物是作為游離堿通過結(jié)合洗脫色譜分離出來的，用0-4％2.0M氨甲醇溶液在DCM中的溶液洗脫。
實施例20-23
下列化合物是按照類似于實施例13中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(方法1)和合適的苯胺(方法15-17)制得的
1直接從4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶與4-[1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基]苯胺(按照PCT Int.Appl.WO 9952895中描述的方法制得的)的反應(yīng)分離出來的2HPLC(RT)3.50實施例244-苯氨基-5-溴-2-[3-(1-甲基哌啶-3-基)甲氧基苯氨基]嘧啶
將碳酸鉀(160mg，1.2mmol)、4-苯氨基-5-溴-2-(3-羥基苯氨基)嘧啶(方法10，200mg，0.6mmol)和3-氯甲基-1甲基哌啶(按照Eur.J.Med.Chem.1994，29，967-73中描述的方法制得的；0.11ml，0.62mmol)在DMSO(2ml)中的混合物在100℃加熱18小時。加入二氧化硅(1g)，通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)。將殘余物負(fù)載到Varian Mega Bond Elut柱上，并用0-10％2.0M氨甲醇溶液洗脫，獲得了產(chǎn)物，為棕色固體(40mg，15％)。
NMR1.0(m，1H)，1.4(m，1H)，1.6(m，3H)，1.8(m，2H)，2.1(s，3H)，2.6-2.8(m，2H)，3.6(m，2H)，6.4(d，1H)，7.0-7.4(m，6H)，7.6(m，2H)，8.2(s，1H)，8.5(s，1H)，9.2(s，1H)；MS(MH+)468.5，470.5.實施例25-26
下列化合物是按照類似于實施例24中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-(4-羥基苯氨基)嘧啶(方法9)和合適的2-(二烷基氨基)乙基氯化物制得的
實施例27-30
下列化合物是按照類似于實施例1中描述的方法，由合適的4-取代的5-溴-2-氯嘧啶(方法1，5-7)和合適的苯胺鹽酸鹽(方法21-22)制得的，并且產(chǎn)物是作為游離堿通過結(jié)合洗脫色譜分離出來的，用0-4％2.0M氨甲醇溶液在DCM中的溶液洗脫。
實施例314-苯氨基-5-溴-2-[4-(2-羥基乙氧基)甲基苯氨基]嘧啶
將4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(方法1，2.0g，7.03mmol)溶解在正丁醇(40ml)和甲醇(10ml)中。加入4-氨基芐基醇(778mg，6.33mmol)和氯化氫乙醚溶液(1.0M；6.33ml，6.33mmol)，并將該溶液在100℃加熱20小時。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘余物溶解在乙二醇(20ml)中。將該溶液在100℃加熱6小時，通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)。通過柱色譜純化殘余物，用含有0.5％氨水溶液的0-4％甲醇在DCM中的溶液洗脫，獲得了產(chǎn)物，為白色固體(550mg，19％)。
NMR3.40(t，2H)，3.50(dt，2H)，4.37(s，2H)，4.57(t，1H)，7.09(d，2H)，7.10(s，1H)，7.15(t，1H)，7.36(dd，2H)，7.54(d，2H)，7.60(d，2H)，8.09(s，1H)，8.54(s，1H)，9.29(s，1H)；MS(MH+)415.2，417.2.實施例324-苯氨基-5-溴-2-(4-[2-(二乙基氨基)乙氧基甲基苯氨基}嘧啶
在0℃將三乙胺(33ml，0.241mmol)和甲磺酰氯(19ml，0.241mmol)加到4-苯氨基-5-溴-2-[4-(2-羥基乙氧基)甲基苯氨基]嘧啶(實施例31；100mg，0.241mmol)在DCM(5ml)內(nèi)的溶液中。將該溶液溫?zé)嶂潦覝兀㈧o置1小時。加入二乙胺(2ml)，并將該混合物在50℃加熱3小時。通過蒸發(fā)除去溶劑，通過柱色譜純化殘余物，用含有0.5％氨水溶液的0-2％甲醇在DCM中的溶液洗脫，獲得了產(chǎn)物，為乳白色固體(38mg，34％)。
NMR(CDCl3)1.03(t，6H)，2.58(q，4H)，2.69(t，2H)，3.54(t，2H)，4.48(s，2H)，7.06(d，2H)，7.17(t，1H)，7.22(s，1H)，7.26(s，1H)，7.38(dd，2H)，7.49(d，2H)，7.58(d，2H)，8.15(s，1H)；MS(MH+)470.4，472.4.實施例33-35
下列化合物是按照類似于實施例32中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-[4-(2-羥基乙氧基)甲基苯氨基]嘧啶(實施例31)和合適的胺制得的，并且產(chǎn)物是作為二鹽酸鹽或三鹽酸鹽分離出來的。
1作為二鹽酸鹽分離出來的2作為三鹽酸鹽分離出來的實施例364-苯氨基-5-溴-2-[4-(2-吡咯烷-1-基乙基)苯氨基]嘧啶
使用類似于實施例32中描述的方法，但是由4-苯氨基-5-溴-2-[4-(2-羥基乙基)苯氨基]嘧啶(方法11)和吡咯烷合成，獲得了產(chǎn)物。MS(MH+)438.1，440.1；HPLC(RT)5.64。實施例374-苯氨基-5-溴-2-[4-(3-二甲基氨基-1-丙炔基)苯氨基]嘧啶
將4-苯氨基-5-溴-2-(4-碘苯氨基)嘧啶(方法12；200mg，0.40mmol)、N，N-二甲基炔丙基胺(0.09ml，0.85mmol)和四(三苯基膦)鈀(O) (25mg，0.02mmol)在吡咯烷(3ml)中的溶液攪拌60小時，然后在80℃加熱2小時。將該混合物用DCM(10ml)稀釋，并加入二氧化硅(2g)。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性材料，將殘余物負(fù)載到Varian MegaBond Elut柱上。用0-10％2.0M氨甲醇溶液在DCM中的溶液洗脫，獲得了產(chǎn)物(30mg，17％)。
NMR2.2(s，6H)，3.4(s，2H)，7.2(m，3H)，7.4(m，2H)，7.6(m，4H)，8.2(s，1H)，8.6(s，1H)，9.5(s，1H)；MS(MH+)422.3，424.3.實施例38-39
下列化合物是按照類似于實施例37中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-(4-碘苯氨基)嘧啶(方法12)和合適的炔烴(商購獲得或者按照PCT Int.Appl.WO 9425459中描述的方法制得)制得的
實施例404-苯氨基-5-溴-2-[4-(3-氨基-1-丙炔基)苯氧基]嘧啶
將三氟乙酸(0.25ml)加到4-苯氨基-5-溴-2-{4-[3-(叔丁氧基羰基氨基)-1-丙炔基]苯氨基)嘧啶(方法25；30mg，0.06mmol)在DCM(1ml)內(nèi)的溶液中。將該溶液靜置3小時，通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)。用乙醚研制殘余物，獲得了產(chǎn)物，為三氟乙酸鹽(25mg，81％)。
NMR4.0(m，2H)，7.2(m，2H)，7.4(m，2H)，7.5-7.7(m，4H)，7.8(m，1H)，8.2(br s，2H)，8.7(s，1H)，9.6(s，1H)；MS(MH+)394.3，396.3.實施例414-苯氨基-5-溴-2-[4-(哌啶-4-基)甲氧基苯氨基]嘧啶
使用類似于實施例40中描述的方法，但是由4-苯氨基-5-溴-2-{4-[1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基]甲氧基苯氨基}嘧啶(方法26)來開始，獲得了產(chǎn)物。
NMR1.4-1.6(m，2H)，1.8-2.0(m，3H)，2.8-3.0(m，2H)，3.2-3.3(m，2H)，3.8(d，2H)，6.8(d，2H)，7.25(t，1H)，7.3-7.4(m，4H)，7.55(d，2H)，8.35(s，1H)，8.6-9.0(br d，1H)，9.0-9.2(br s，1H)，9.5(br s，1H)；MS(MH+)453.9，455.9.制備原料
用于上述實施例的原料是商購獲得的，或者易于通過標(biāo)準(zhǔn)方法由已知物質(zhì)制得。例如，下列反應(yīng)舉例說明但不是限制了上述反應(yīng)中所用的某些原料。方法14-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶
將5-溴-2，4-二氯嘧啶(6.84g，30.0mmol)、苯胺(2.79g，30.0mmol)和N，N-二異丙基乙基胺(3.87g，30.0mmol)在正丁醇(75ml)中的溶液加熱回流4小時。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，并將殘余物溶解在DCM(100ml)中。將該溶液用水(3×100ml)和飽和鹽水(100ml)洗滌，并干燥。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，通過柱色譜純化殘余物，用15％乙酸乙酯/異己烷洗脫，獲得了產(chǎn)物，為油狀物，其在靜置時會固化(5.12g，60％)。
NMR7.t(t，1H)，7.4(t，2H)，7.55(d，2H)，8.4(s，1H)，9.2(br s，1H)；MS(MH+)284，286，288.方法2-7
下列中間體是通過類似于方法1中描述的方法，使用合適的取代的苯胺和5-溴-2，4-二氯嘧啶或2，4，5-三氯嘧啶(方法8)制得的
1NMR7.22(m，2H)，7.55(m，2H)，8.42(s，1H)，9.32(s，1H)方法82，4，5-三氯嘧啶
將5-氯尿嘧啶(10.0g，68.5mmol)溶解在三氯氧化磷(60ml)中，并加入五氯化磷(16.0g，77.0mmol)。將該混合物加熱回流16小時，冷卻，然后在劇烈攪拌下緩慢地倒入水(200ml)中。將該混合物攪拌1.5小時，然后加入乙酸乙酯(250ml)。分離出有機(jī)層，再用另部分乙酸乙酯(250ml)萃取水層。將合并的萃取液用飽和碳酸氫鈉(200ml)和飽和氯化鈉(200ml)洗滌，然后干燥。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，通過柱色譜純化殘余物，用DCM洗脫，獲得了產(chǎn)物，為黃色液體(6.37g，51％)。NMR(CDCl3)8.62(s，1H)；MS(MH+)182，184，186.方法94-苯氨基-5-溴-2-(4-羥基苯氨基)嘧啶
將4-氨基苯酚(0.73g，7.8mmol)和濃鹽酸(1.30ml，7.1mmol)加到在正丁醇(30ml)內(nèi)的4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(方法1；3.0g，7.1mmol)中，并將該混合物在100℃加熱12小時。過濾出在冷卻后沉淀出的固體，用正丁醇和乙醚洗滌，獲得了產(chǎn)物(0.80g，32％)。MS(MH+)357，359。方法10-12
下列中間體是通過類似于方法9中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-氯嘧啶(方法1)和合適的取代的苯胺制得的
方法134-(4-異丙基哌嗪子基)甲氧羰基苯胺
將4-[(4-異丙基哌嗪子基)甲氧羰基]硝基苯(方法14，830mg，2.70mmol)在乙醇(25ml)中的溶液用10％披鈀碳(60mg)氫化2小時。通過硅藻土過濾除去催化劑，并將濾液濃縮至5ml體積。加入氯化氫乙醚溶液(1.0M，3ml)，通過過濾收集沉淀出的固體，獲得了產(chǎn)物，為鹽酸鹽(613mg，82％)。
NMR0.9(d，6H)，2.4(m，4H)，2.7(m，1H)，3.4(m，2H)，4.6(m，4H)，6.4(d，2H)，6.6(d，2H)；MS(MH+)277.9.方法144-[(4-異丙基哌嗪子基)甲氫羰基]硝基苯
在0℃，將1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(2.14g，11.0mmol)加到4-硝基苯氧基乙酸(按照J(rèn).Med.Chem.，1984，27，967-78中描述的方法制得的；2.0g，10.0mmol)、4-異丙基哌嗪(2.56g，20.0mmol)和1-羥基苯并三唑(2.06g，15.0mmol)在DMF(50ml)內(nèi)的溶液中。將該混合物攪拌16小時，通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)。加水(50ml)，并用乙酸乙酯(3×100ml)萃取該混合物。將萃取液干燥，并通過蒸發(fā)濃縮，獲得了產(chǎn)物，為黃色固體(600mg，22％)。
NMR1.0(d，6H)，2.4(m，4H)，2.7(m，1H)，3.4(m，4H)，5.0(s，2H)，7.1(d，2H)，8.2(d，2H)；MS(MH+)307.9.方法15-17
下列中間體是按照類似于方法13中描述的方法由合適的取代的硝基苯(方法18-20)制得的
方法184-(1-甲基哌啶-4-基氧基)硝基苯
將三苯基膦(7.9g，30.0mmol)加到4-硝基苯酚(1.39g，10.0mmol)在DCM(100ml)內(nèi)的攪拌溶液中，并將該溶液攪拌30分鐘。加入4-羥基-1-甲基哌啶(1.15g，11.0mmol)在DCM(5ml)中的溶液，并將該溶液攪拌2分鐘。滴加偶氮二甲酸二乙酯(4.9ml，30.0mmol)，并將該混合物攪拌4小時。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘余物溶解在乙酸乙酯(200ml)中。將該溶液用水(2×100ml)洗滌，然后用2M鹽酸(2×50ml)萃取。將合并的酸性萃取液用乙醚(2×100ml)洗滌，然后通過加入0.88氨溶液來堿化。用乙醚(2×100ml)萃取該堿性溶液，將萃取液用水(2×100ml)和飽和氯化鈉(100ml)洗滌，并干燥。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，向殘余物中加入飽和氯化氫甲醇溶液。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，用乙醇和乙醚的混合物將殘余物重結(jié)晶，獲得了產(chǎn)物，為鹽酸鹽(350mg)。
NMR(373K)2.0-2.1(m，2H)，2.2-2.3(m，2H)，2.75(s，3H)，2.8-3.0(m，2H)，3.2-3.4(m，2H)，4.9(br s，1H)，7.2(d，2H)，8.2(d，2H)；MS(MH+)237.方法194-(1-甲基哌啶-2-基)甲氧基]硝基苯
將氫化鈉(60％油分散液；400mg，10.0mmol)加到2-羥基甲基-1-甲基哌啶(1.29g，10.0mmol)在DMF(20ml)內(nèi)的溶液中，并將該混合物攪拌2小時。加入4-氟硝基苯(1.4g，10.0mmol)，并將該混合物在80℃加熱17小時。將該混合物倒入水(100ml)中，并用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。將萃取液用水(2×100ml)洗滌，然后用2M鹽酸(2×50ml)萃取。將合并的酸性萃取液用乙醚(2×100ml)洗滌，然后通過加入0.88氨溶液來堿化。用乙醚(2×100ml)萃取該堿性溶液，將萃取液用水(2×100ml)和飽和氯化鈉(100ml)洗滌，并干燥。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，向殘余物中加入飽和氯化氫甲醇溶液。蒸發(fā)，獲得了產(chǎn)物的鹽酸鹽，為油狀物(2.4g)。NMR(星號是指構(gòu)象異構(gòu)形式)
1.4-1.6(m，1H)，1.6-1.9(m，4H)，1.9-2.0(m，1H)，2.75(s，3H)*，2.8(s，3H)*，3.0-3.2(m，2H)*，3.3-3.4(m，2H)*，3.4-3.6(m，1H)*，3.7-3.9(m，1H)*，4.4(m，2H)，7.2(d，2H)，8.2(d，2H)，10.6-10.8(br s，1H)*.11.0-11.1(br s，1H)*；MS(MH+)251.2.方法204-(1-甲基哌啶-3-基氧基)硝基苯
使用類似于方法18中描述的方法，但是由4-硝基苯酚和3-羥基-1-甲基哌啶開始，獲得了產(chǎn)物。MS(MH+)237。方法21-22
下列中間體是按照類似于方法13中描述的方法，由合適的硝基苯(方法23-24)制得的
方法234-[2-(異丙基氨基)乙基氨基]硝基苯
將N-異丙基乙二胺(4.87ml，39.0mmol)和碳酸鉀(6.37g，46.0mmol)加到4-氟硝基苯(5.0g，35.0mmol)在DMF(50ml)內(nèi)的溶液中，并將該混合物在氮氣氛下于70℃加熱3小時。通過過濾除去不溶性物質(zhì)，并將濾液濃縮。將殘余物溶解在乙酸乙酯(300ml)中，并將該溶液用水(3×100ml)和飽和氯化鈉(50ml)洗滌，并干燥。通過蒸發(fā)除去溶劑，獲得了產(chǎn)物，為橙色油狀物，其在靜置時會結(jié)晶(7.55g，95％)。
NMR1.0(d，6H)，1.7(m，1H)，2.7(m，3H)，3.2(m，1H)，6.6(m，2H)，7.1(m，1H)，8.0(m，2H)；MS(MH+)224.方法244-[2-(哌啶子基)乙基氨基]硝基苯
使用類似于方法23中描述的方法，但是由4-氟硝基苯和1-(2-氨基乙基)哌啶開始，獲得了產(chǎn)物。
NMR1.3(m，2H)，1.5(m，4H)，2.3(m，4H)，2.4(t，2H)，3.2(m，2H)，6.6(d，2H)，7.1(m，1H)，8.0(d，2H)；MS(MH+)250.方法254-苯氨基-5-溴-2-(4-[3-(叔丁氧基羰基氨基-1-丙炔基]苯氨基)嘧啶
使用類似于實施例37中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-(4-碘苯氨基)嘧啶(方法12)和3-(叔丁氧基羰基氨基)丙炔開始，獲得了產(chǎn)物。
NMR1.4(s，9H)，3.9(d，2H)，7.1-7.3(m，4H)，7.4(m，2H)，7.6(m，4H)，8.2(s，1H)，8.6(s，1H)，9.5(s，1H)；MS(MH+)494.3，496.3.方法264-苯氨基-5-溴-2-{4-[1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基]甲氧基苯氨基}嘧啶
使用類似于實施例24中描述的方法，由4-苯氨基-5-溴-2-(4-羥基苯氨基)嘧啶(方法9)和1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-甲苯磺酰氧基)甲基哌啶(按照在PCT Int.Appl.WO 9427965中描述的方法制得的)，獲得了產(chǎn)物。實施例42
下面舉例說明用于治療或預(yù)防的含有式(I)化合物或其可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯(下文中稱為化合物X)的代表性藥物劑型注解
上述制劑可通過藥物領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法制得。可通過常規(guī)方法將片劑(a)-(c)包衣，以例如提供鄰苯二甲酸乙酸纖維素包衣。
權(quán)利要求
1.式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯
其中
Q1和Q2獨立地選自芳基或碳連接的雜芳基；Q1和Q2當(dāng)中有一個或者Q1和Q2都在一個環(huán)碳原子上被一個選自下列的取代基取代N-(C1-2烷基)氨基、N，N-二-(C1-2烷基)氨基、苯基、雜環(huán)基、苯氧基、雜環(huán)基-O-、取代的C1-2烷基、取代的C1-2烷氧基、取代的C1-2烷氧基羰基、取代的N-(C1-2烷基)氨基、取代的C1-2烷氧基C1-2烷基、取代的C2-4鏈烯基和取代的C2-4炔基；其中對于C1-2烷基、C1-2烷氧基、C1-2烷氧基羰基、N-(C1-2烷基)氨基、C1-2烷氧基C1-2烷基、C2-4鏈烯基和C2-4炔基，所述取代基選自鹵素、羥基、巰基、硝基、甲?；?、甲酰胺基、羧基、氰基、氨基、脲基、氨基甲酰基、氨磺酰基、C1-4鏈烷酰基、C1-4烷氧基羰基、苯基、雜環(huán)基、苯甲酰基、雜環(huán)基-C(O)-、其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a、N＇-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)脲基、N′-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-(C1-4烷基)氨磺?；，N-二-(C1-4烷基)氨磺酰基、N-C1-4烷基氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲?；虲1-4鏈烷?；被?；其中任何苯基、芐基、苯甲?；螂s環(huán)基任選在環(huán)碳原子上被一個或多個選自Ra的基團(tuán)取代，并且如果雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Rb的基團(tuán)取代；
G是-O-或-NR2-；
R2選自氫、C1-6烷基、C3-6鏈烯基和C3-6炔基；其中所述C1-6烷基、C3-6鏈烯基和C3-6炔基可任選被一個或多個選自Rc的基團(tuán)取代；
R1選自氫、鹵素、羥基、硝基、氨基、N-(C1-3烷基)氨基、N，N-二-(C1-3烷基)氨基、氰基、三氟甲基、三氯甲基、C1-3烷基[任選被1或2個獨立地選自下列的取代基取代鹵素、氰基、氨基、N-(C1-3烷基)氨基、N，N-二-(C1-3烷基)氨基、羥基和三氟甲基]、C3-5鏈烯基[任選被最高達(dá)3個鹵素取代、或者被一個三氟甲基取代]、C3-5炔基、C1-3烷氧基、巰基、C1-3烷硫基、羧基和C1-3烷氧基羰基；
Q1任選在環(huán)碳原子上被1-4個獨立地選自下列的取代基取代鹵素、巰基、硝基、甲?；?、甲酰胺基、羧基、氰基、氨基、脲基、氨基甲?；被酋；1-4烷基、C2-4鏈烯基、C2-4炔基[其中所述C1-4烷基、C2-4鏈烯基和C2-4炔基任選被一個或多個選自Rd的取代基取代]、C1-4鏈烷酰基、C1-4烷氧基羰基、雜環(huán)基、其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a[任選被羥基取代]、N′-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)脲基、N′-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-(C1-4烷基)氨磺酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨磺?；?、N-C1-4烷基氨基甲?；?、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基和C1-4鏈烷?；被?；
獨立地，或者除了上述取代基以外，Q1可任選被1-2個獨立地選自芳基、C3-8環(huán)烷基和雜環(huán)基的取代基取代；其中所述芳基、C3-8環(huán)烷基或雜環(huán)基可任選在環(huán)碳原子上被一個或多個選自Re的基團(tuán)取代；并且如果雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Rf的基團(tuán)取代；
Q2任選在環(huán)碳原子上被1-4個獨立地選自下列的取代基取代鹵素、羥基、巰基、硝基、甲?；?、甲酰胺基、羧基、氰基、氨基、脲基、氨基甲?；?、氨磺酰基、C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基[其中所述C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C2-4炔基和C1-4烷氧基可任選被一個或多個選自Rg的基團(tuán)取代]、C1-4鏈烷?；?、C1-4烷氧基羰基、雜環(huán)基、其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a[任選被羥基取代]、N＇-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)脲基、N′-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-(C1-4烷基)氨磺酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨磺?；-C1-4烷基氨基甲?；?、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C2-4鏈烯氧基、C2-4炔氧基、C1-4鏈烷?；被?；
獨立地，或者除了上述取代基以外，Q2可任選被1-2個獨立地選自芳基、C3-8環(huán)烷基和雜環(huán)基的取代基取代；其中所述芳基、C3-8環(huán)烷基或雜環(huán)基可任選在環(huán)碳原子上被一個或多個選自Rh的基團(tuán)取代；并且如果雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Ri的基團(tuán)取代；
Rc、Rd和Rg獨立地選自羥基、鹵素、氨基、氰基、甲?；?、甲酰胺基、羧基、硝基、巰基、氨基甲?；被酋；?、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、C1-4鏈烷?；?、C1-4鏈烷酰氧基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基羰基、N-C1-4烷基氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C1-4鏈烷?；被?、其中a是0-2的C1-4烷基S(O)a、C1-4烷基磺?；被?、N-(C1-4烷基)氨磺酰基、N-(C1-4烷基)2氨磺酰基、N-(C1-4烷基)氨基甲?；-(C1-4烷基)2氨基甲?；?、苯基、苯硫基、苯氧基、C3-8環(huán)烷基和雜環(huán)基；其中所述苯基、苯硫基、苯氧基、C3-8環(huán)烷基或雜環(huán)基可任選在環(huán)碳原子被一個或多個Rj的基團(tuán)取代；并且如果所述雜環(huán)基含有-NH-部分，該氮可任選被一個選自Rk的基團(tuán)取代；
Ra、Re、Rh和Rj獨立地選自羥基、鹵素、氨基、氰基、甲?；?、甲酰胺基、羧基、硝基、巰基、氨基甲?；被酋；?、C1-4烷基[任選被一個或多個選自鹵素、氰基、氨基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基或羥基取代]、C2-4鏈烯基[任選被一個或多個選自鹵素的基團(tuán)取代]、C2-4炔基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、C1-4鏈烷?；1-4鏈烷酰氧基、C1-4烷氧基[任選被一個或多個選自鹵素的基團(tuán)取代]、C1-4烷氧基羰基、N-C1-4烷基氨基甲?；?、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C1-4鏈烷?；被⑵渲衋是0-2的C1-4烷基S(O)a、C1-4烷基磺?；被?、N-(C1-4烷基)氨磺?；-(C1-4烷基)2氨磺?；?、苯基、C3-8環(huán)烷基和雜環(huán)基；且
Rb、Rf、Ri和Rk獨立地選自C1-4烷基、C1-4鏈烷?；?、C1-4烷基磺?；被柞；-(C1-4烷基)氨基甲?；，N-(C1-4烷基)氨基甲酰基、芐基、芐氧基羰基、苯甲酰基和苯基磺?；?。
2.權(quán)利要求1的嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯，其中Q1是苯基。
3.權(quán)利要求1或2的嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯，其中Q2是苯基或吡啶基。
4.權(quán)利要求1-3任一項的嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯，其中Q1和Q2當(dāng)中有一個或者Q1和Q2都在環(huán)碳原子上被一個選自下列的取代基取代二甲基氨基、4-甲基哌嗪子基、氨基甲基、2-羥基乙氧基甲基、琥珀酰亞胺-1-基甲基、2-吡咯烷-1-基乙基、2-氨基乙基、哌啶-4-基氧基、1-甲基哌啶-4-基氧基、1-甲基哌啶-3-基氧基、羧基甲氧基、1-甲基哌啶-2-基甲氧基、1-甲基哌啶-3-基甲氧基、哌啶-4-基甲氧基、4-異丙基哌嗪子基羰基甲氧基、2-鄰苯二甲酰亞胺-1-基乙氧基、2-嗎啉代乙氧基、2-二甲基氨基乙氧基、2-二乙基氨基乙氧基、2-(4-甲基哌嗪子基)乙氧基、2-咪唑-1-基乙氧基、2-吡咯烷-1-基乙氧基、2-氨基乙炔基、2-二甲基氨基乙炔基、2-甲基氨基乙炔基、2-(3-羥基奎寧環(huán)-3-基)乙炔基、2-嗎啉代乙氧基甲基、2-二乙基氨基乙氧基甲基、2-吡咯烷-1-基乙氧基甲基、2-(4-甲基哌嗪子基)乙氧基甲基、2-二乙基氨基乙氧基羰基、2-哌啶子基乙基氨基或2-異丙基氨基乙基氨基。
5.權(quán)利要求1-4任一項的嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯，其中Q1在-NH-的對位或間位上被取代。
6.權(quán)利要求1-5任一項的嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯，其中G是-NH-。
7.權(quán)利要求1-6任一項的嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯，其中R1是氫、氯或溴。
8.權(quán)利要求1-7任一項的嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯，其中Q2未取代或者被一個選自氟、溴、甲基、甲氧基和氰基的基團(tuán)取代。
9.權(quán)利要求1-8任一項的嘧啶衍生物，其中所述化合物選自
4-苯氨基-5-溴-2-[4-(2-二甲基氨基乙氧基)苯氨基]嘧啶；
4-苯氨基-5-溴-2-[4-(羧基甲氧基)苯氨基]嘧啶；
4-苯氨基-5-溴-2-[4-(1-甲基哌啶-4-基氧基)苯氨基]嘧啶；
4-(6-甲基吡啶-2-基)-5-溴-2-[4-(2-哌啶-1-基乙基氨基)苯氨基]嘧啶；
4-苯氨基-5-溴-2-[4-(2-異丙基氨基乙基氨基)苯氨基]嘧啶；或
4-苯氨基-5-溴-2-[4-(3-甲基氨基-1-丙炔基)苯氨基]嘧啶；
或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯。
10.制備權(quán)利要求1-9任一項的嘧啶衍生物的方法，包括
a)對于其中G是-NR2-的式(I)化合物，將式(II)嘧啶
其中L是如下所定義的可置換基團(tuán)，與式(III)化合物反應(yīng)
其中G是-NR2-；
b)將式(IV)嘧啶
其中L是如下所定義的可置換基團(tuán)，與式(V)化合物反應(yīng)
然后如果需要的話
i)將式(I)化合物轉(zhuǎn)化成另一式(I)化合物；
ii)除去任何保護(hù)基；
iii)形成可藥用鹽或在體內(nèi)可水解的酯。
11.包含權(quán)利要求1-9任一項的式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯和可藥用稀釋劑或載體的藥物組合物。
12.權(quán)利要求1-9任一項的式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯用于預(yù)防或治療溫血動物例如人的方法中。
13.權(quán)利要求1-9任一項的式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯用作藥物。
14.權(quán)利要求1-9任一項的式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯在制備用于在溫血動物例如人中產(chǎn)生抗癌、細(xì)胞周期抑制(抗細(xì)胞增殖)作用和/或FAK抑制(抗細(xì)胞遷移和/或細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo))作用的藥物中的應(yīng)用。
15.在溫血動物例如人中產(chǎn)生抗癌、細(xì)胞周期抑制(抗細(xì)胞增殖)作用和/或FAK抑制(抗細(xì)胞遷移和/或細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo))作用的方法，包括給所述動物施用有效量的權(quán)利要求1-9任一項的式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了式(I)嘧啶衍生物、或其可藥用鹽或其在體內(nèi)可水解的酯，其中Q1、Q2、G和R1如說明書中所定義。本發(fā)明還公開了制備所述化合物的方法，含有它們的藥物組合物，及其作為細(xì)胞周期蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸激酶(CDK)和粘著斑激酶(FAK)抑制劑的應(yīng)用。
文檔編號C07D403/12GK1416423SQ0180584
公開日2003年5月7日 申請日期2001年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月1日
發(fā)明者E·J·皮斯, E·J·威廉斯, R·H·布拉德博里, S·E·皮爾森 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司