專利名稱：產(chǎn)生人單克隆抗體的方法及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)的領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及人單克隆抗體的產(chǎn)生，特別是對特定細(xì)胞類型代表性表面抗原特異的人單克隆抗體的產(chǎn)生。體現(xiàn)在本發(fā)明中的組合物和方法對于產(chǎn)生具有重要診斷和/或治療潛力的人單克隆抗體是特別有用的。
由于大量的原因，在實踐上人單克隆抗體的產(chǎn)生一直是困難的。首先，用目的免疫原免疫人類是不實際的。已產(chǎn)生的人的抗體一直是以外來可用的脾臟存在為基礎(chǔ)的。雖然，已研究出了產(chǎn)生具有期望抗原結(jié)合特異性的人單克隆抗體的四種可選地方法，但是它們也有顯著的缺點。第一種方法涉及產(chǎn)生嵌合抗體的重組DNA技術(shù)的應(yīng)用。通過融合人免疫球蛋白重鏈和輕鏈的不變區(qū)和確?？乖Y(jié)合特異性的非人抗體的可變區(qū)，產(chǎn)生了這樣的抗體。雖然因此產(chǎn)生的嵌合部分異種抗體比用一個全部的異種抗體實質(zhì)上是更有用的，但是它仍然有大量的缺點。可變區(qū)和不變區(qū)的鑒定、分離和連接需要相當(dāng)大的工作。此外，源于一個物種的不變區(qū)和源于另一個物種的可變區(qū)的連接可能改變可變區(qū)特異性和親和力，以至于失去了可變區(qū)期望的屬性。而且，在可變區(qū)中，有對物種特異性的框架和超變序列。這些框架和超變序列可引起不期望的抗原反應(yīng)。這個方法的一個變化是用對應(yīng)的人序列置換非人的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的殘基(WO94/11509)。再一次，這樣的方法需要大量工作量。
人單克隆抗體產(chǎn)生的第二個方法是異種鼠的應(yīng)用，如在美國專利號5,814,318和美國專利號5,939,598中所說明的一樣。這些遺傳工程鼠能表達(dá)某些沒有重新排列的人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因，和被失活的它們內(nèi)源免疫球蛋白基因。盡管“異種鼠(xenomouse)”代表了一個產(chǎn)生人抗體的可替代系統(tǒng)，但是它未必完全模擬鼠的免疫系統(tǒng)首先，免疫球蛋白的所有組成部分在鼠中還沒有被復(fù)制；第二，內(nèi)源的免疫球蛋白基因的不完全失活可能產(chǎn)生嵌合抗體；第三，期望單克隆抗體的鑒定通常涉及傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)，接下來需要廣泛的篩選和亞克隆大量雜交瘤，以便于鑒定期望抗體。
產(chǎn)生人單克隆抗體的第三個方法是噬菌體展示文庫的構(gòu)建。用取自于人外周血細(xì)胞所有組成部分的mRNA提取物進(jìn)行這個方法，接著是包括優(yōu)選地所有免疫球蛋白可變區(qū)序列的cDNA文庫的構(gòu)建。然后，cDNA被插入進(jìn)噬菌體，在噬菌體中顯示作為Fab片段的免疫球蛋白可變區(qū)。理論上，如果噬菌體文庫足夠大，通過淘選抗目的抗原的噬菌體，分離顯示期望Fab片段的特定噬菌體是可能的。然而，這個方法通常僅僅對于實質(zhì)上純化抗原是適用的，而對于抗原的混合物，如在細(xì)胞上表達(dá)的大量這些表面抗原是不適用的。
最后，已經(jīng)利用永生化B細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體。這個方法涉及如下步驟(a)分離B細(xì)胞富集的外周血淋巴細(xì)胞；(b)用EBV-病毒轉(zhuǎn)化B-細(xì)胞，或用永生化人淋巴母細(xì)胞瘤細(xì)胞融合，接著對顯示期望抗原結(jié)合特異性的B-細(xì)胞轉(zhuǎn)化體或雜交瘤進(jìn)行大量篩選。B-細(xì)胞轉(zhuǎn)化體本身是一種無效的方法，最多產(chǎn)生0.1-10％穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，因此具有期望特異性的大多數(shù)B-細(xì)胞在用做隨后篩選過程的庫中被丟失了。盡管科研人員(例如，Abe，Tsutomu et al，in EP 0218158)通過用目的抗原在體外免疫/活化，曾經(jīng)試圖富集表達(dá)期望免疫球蛋白的B-細(xì)胞群，但是在非特異性B-細(xì)胞在這個過程中也增殖的意義上說，活化是無效的。這樣，特異性B-細(xì)胞的鑒定很大程度上取決于最后的篩選階段，在這個期間，檢測大量轉(zhuǎn)化B-細(xì)胞克隆的結(jié)合抗原的能力。如前面提及的方法一樣，這個方法費時，費力，而且不適于高生產(chǎn)能力抗體的篩選和產(chǎn)生。
因此，非常需要產(chǎn)生人單克隆抗體的可替代途徑。
具體地，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與期望抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的人單克隆抗體的一種方法，這個方法包括(a)提供分離的包含大量非轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的人淋巴細(xì)胞群；(b)篩選特異與期望抗原結(jié)合的非轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞；(c)在有利于B細(xì)胞增殖以產(chǎn)生大量可產(chǎn)生與期望抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的人單克隆抗體的分離的非轉(zhuǎn)化B-細(xì)胞克隆的條件下，培養(yǎng)(b)的B淋巴細(xì)胞；而且(d)可選地分離非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆。
在一個方面，篩選非轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞包括在有利于B淋巴細(xì)胞與期望抗原特異性結(jié)合的條件下，用期望抗原接觸人淋巴細(xì)胞群，而且將與期望抗原結(jié)合的B淋巴細(xì)胞與未結(jié)合的B淋巴細(xì)胞分離。
在另一個方面，上述概括的方法進(jìn)一步包括(e)從(d)的分離的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆中分離包括編碼人單克隆抗體重鏈抗原結(jié)合片段的序列的多核苷酸；(f)從(d)的分離的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆中分離包括編碼人單克隆抗體輕鏈抗原結(jié)合片段的序列的多核苷酸；而且(g)表達(dá)(e)和(f)的多核苷酸以產(chǎn)生人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。
編碼重鏈的多核苷酸的分離可以先于或隨后于，或同時和編碼輕鏈的多核苷酸的分離進(jìn)行。
在一個單獨的方面，被本發(fā)明多核苷酸編碼的抗原結(jié)合片段可以從雙特異性抗體，嵌合抗體，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab’)2，單鏈V區(qū)片段(svFv)和融合多肽中選擇，其中融合多肽包括與化學(xué)功能性部分綴合的抗原結(jié)合片段。在這個具體實施中，術(shù)語“部分”包括信號肽，增強免疫反應(yīng)性的因子，有利于與固相載體偶聯(lián)的因子，疫苗載體，生物反應(yīng)修飾劑，毒素，可檢測的標(biāo)記和藥物。
而在另一個單獨方面，用在抗體產(chǎn)生過程中的抗原是生物學(xué)或化學(xué)化合物?？乖赡苁羌?xì)胞蛋白，如受體配體，分泌蛋白，細(xì)胞表面受體，胞質(zhì)蛋白，和核蛋白。在優(yōu)選的具體實施方式
中，抗原是被完整細(xì)胞提呈的表面抗原。完整細(xì)胞被用于抗原提呈的，優(yōu)選地，細(xì)胞是表面沒有血清的真核細(xì)胞。
在另一個方面，在宿主細(xì)胞中一個或多個基因遞送載體表達(dá)編碼免疫球蛋白或其片段的多核苷酸。適合的基因遞送載體包括病毒載體，脂質(zhì)體和質(zhì)粒。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是一個具有進(jìn)行免疫球蛋白或它們的片段翻譯后修飾能力的真核細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了產(chǎn)生與特異細(xì)胞類型代表性抗原特異性結(jié)合的人單克隆抗體群的方法。這個方法包括(a)提供分離的包括大量非轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的人淋巴細(xì)胞群；(b)篩選與特定細(xì)胞類型特異性結(jié)合的非轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞；(c)在有利于B細(xì)胞增殖以產(chǎn)生大量的非轉(zhuǎn)化B-細(xì)胞克隆的條件下，培養(yǎng)(b)的B淋巴細(xì)胞，由此產(chǎn)生了顯示與特定細(xì)胞類型代表性抗原特異結(jié)合的人單克隆抗體群。
在這個
具體實施例方式
的一個方面中，這個方法進(jìn)一步包括(d)從大量非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆中分離包含編碼人單克隆抗體群重鏈或輕鏈抗原結(jié)合片段的序列的多核苷酸群；而且，(e)表達(dá)多核苷酸以產(chǎn)生人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的多肽群。
進(jìn)一步，提供了分離的多核苷酸群和由此編碼的多肽。在優(yōu)選的具體實施方式
中，多肽群中的至少一個多肽與化學(xué)功能性部分綴合。優(yōu)選的部分選自信號肽，增強免疫反應(yīng)性的因子，有利于與固相載體結(jié)合的因子，疫苗載體，生物反應(yīng)修飾劑，毒素，可檢測的標(biāo)記和藥物。
而且，本發(fā)明的另一實施方式是通過本發(fā)明公開的任何一種本發(fā)明方法產(chǎn)生的人單克隆抗體群。
圖2.A從被篩選抗人胎兒卵巢上皮細(xì)胞系的B細(xì)胞擴(kuò)增的B細(xì)胞集落顯微照片。B細(xì)胞用抗κ輕鏈的抗體染色(綠色箭頭所指)。注意B細(xì)胞仍舊與靶細(xì)胞結(jié)合(用黑色箭頭所指)。B用含有從體外擴(kuò)大的特異B細(xì)胞集落中擴(kuò)增的cDNA插入物的pTarge T質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，表達(dá)κ輕鏈的COS細(xì)胞抗κ輕鏈免疫細(xì)胞化學(xué)檢測的顯微照片。
圖3.示意產(chǎn)生人單克隆優(yōu)選發(fā)明方法的流程圖。
圖4.人免疫球蛋白的免疫組織化學(xué)顯微照片。A.HPED細(xì)胞與非轉(zhuǎn)染對照CHO細(xì)胞溫育和被免疫組織化學(xué)染色人免疫球蛋白。注意在培養(yǎng)物中沒有染色。B.HPED細(xì)胞吸附用含有免疫球蛋白重鏈cDNA插入物的pDisplay質(zhì)粒和含有從B細(xì)胞克隆擴(kuò)增的免疫球蛋白輕鏈cDNA插入物的pTarge T質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，而且染色免疫球蛋白。注意與hPED單層結(jié)合的CHO細(xì)胞對免疫球蛋白顯示了強的染色。被箭頭指向的是實例。C.如B組中被轉(zhuǎn)染，與hPED單層結(jié)合的CHO細(xì)胞，在人體免疫球蛋白免疫組織化學(xué)前被0.1％的辛基苯氧基聚乙氧乙醇(Triton)溶解，因此，僅僅在CHO細(xì)胞表面表達(dá)及結(jié)合在hPED細(xì)胞上的人抗體將保留在hPED細(xì)胞上，而且被免疫組織化學(xué)染色。箭頭所指的是實例。
實施本發(fā)明的方式貫穿于本公開中，各種出版物，專利和公開專利說明書通過區(qū)別引用被援引參考。這些出版物，專利和公開專利說明書在本發(fā)明中作為參考文獻(xiàn)被并入本發(fā)明公開中，以便更充分地說明本發(fā)明涉及領(lǐng)域的狀況。定義在本發(fā)明實踐中，除了特別指出，將利用常規(guī)的免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA技術(shù)，這些技術(shù)是這個領(lǐng)域熟知技術(shù)。參看，例如，Sambrook，et al.MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL 2ndediton(1989)；CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel，et al.eds(1987))系列從書METHOD IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)PCR 2A PRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995))，Harlow and Lane，eds.(1998)ANTIBODIES，A LABORATORYMANUAL，和ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney，ed.(1987))。
用在說明書和權(quán)利要求書中，除了上下文可以清楚表明外，單數(shù)形式“一個”，“那個”包括復(fù)數(shù)含義。例如，術(shù)語“細(xì)胞”包括復(fù)數(shù)細(xì)胞，包括細(xì)胞混合物。
術(shù)語“抗體”或如本發(fā)明中所用的指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的抗原結(jié)合部分，免疫球蛋白分子即包含特異地與抗原結(jié)合(發(fā)生免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合位點的分子。結(jié)構(gòu)上，天然存在最簡單的抗體(例如IgG)包括四個多肽鏈，通過二硫鍵相互連接的兩個重鏈(H)和兩個輕鏈(L)。天然免疫球蛋白代表一個分子大家族，包括幾種類型的分子，如IgD，IgG，IgA，IgM和IgE。該術(shù)語也包含雜合抗體，或改變的抗體，和它們的片段，包括但不限定于Fab片段，和Fv片段。已表明可通過天然存在抗體的片段執(zhí)行抗體的抗原結(jié)合功能。這些片段也被稱為“抗原結(jié)合片段”。被包含在術(shù)語“抗原結(jié)合片段”內(nèi)的結(jié)合片段例子包括，但不限定于(i)由VL，VH，CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(iv)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward et al.，(1989 Nature 341544-546))；(v)分離的互補決定區(qū)(CDR)；和(vi)F(ab’)2片段，一種包括在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接兩個Fab片段的二價片段。而且，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域通常是被兩個分離基因編碼，但是通過重組方法可制備合成接頭，可使它們作為單一的蛋白質(zhì)鏈被產(chǎn)生(稱為單鏈Fv(scFv)；Bird et al.(1998)Science 242423-426；和Huston et al.(1988)PNAS855879-5883)。這樣的單鏈抗體也被包含在術(shù)語“抗原結(jié)合片段”內(nèi)。優(yōu)選的抗體片段是具有交聯(lián)它們靶抗原能力的那些抗體片段，例如，二價片段如F(ab’)2片段。可供選擇地，本身不能交聯(lián)它的靶抗原(如，F(xiàn)ab片段)的抗體片段能被用于和第二抗體連接，這個第二抗體起交聯(lián)抗體片段作用，由此交聯(lián)靶抗原。
抗體可以用本發(fā)明所說明的常規(guī)技術(shù)被分成片段，篩選片段的用途與篩選整個抗體用途所說明的方法是同樣方法。免疫球蛋白分子的Fab片段是由免疫球蛋白分子如下部分組成的多聚體蛋白質(zhì)并具有特異性地結(jié)合抗原的能力，其中所述部分包含共價結(jié)合在一起的免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的免疫活性部分。Fab片段可以用本領(lǐng)域公知的方法，用木瓜蛋白酶進(jìn)行實質(zhì)上完整免疫球蛋白的蛋白分解消化制備。然而，通過用本發(fā)明公開的方法和這個領(lǐng)域任何公知的方法，通過在適合宿主細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的期望部分可以制備Fab片段。
免疫球蛋白分子的Fv片段是由共價結(jié)合在一起的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的免疫活性部分組成的多聚體蛋白質(zhì)并具有特異性地結(jié)合抗原的能力。Fv片段典型地可以通過用本發(fā)明說明的方法和/或這個領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它方法，通過在適合宿主細(xì)胞表達(dá)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的期望部分，來制備。
本發(fā)明的抗體進(jìn)一步包括有期望結(jié)合部分的雙特異性分子和嵌合分子。脊椎動物的抗體，雜合抗體或嵌合抗體也包含在術(shù)語“抗體”內(nèi)。
術(shù)語“單克隆抗體”用在本發(fā)明中指有實質(zhì)上同質(zhì)的抗體群的抗體組合物。這并不意味在抗體源或抗體制備方法方面受到限制。單克隆抗體是高度特異性的，被定向抗單一的抗原位點。與通常包括抗不同決定簇(抗原表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆的)抗體制備物比較，每個單克隆抗體抗抗原上的單一決定簇。
被應(yīng)用于單克隆抗體或它的抗原結(jié)合片段的術(shù)語“人”指從如本發(fā)明討論的人B細(xì)胞中分離的或通過表達(dá)編碼該單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸而重組制備的抗體組合物。
“單克隆抗體群”指大量異質(zhì)單克隆抗體，即包含可以識別互相不同的抗原決定簇的群體的各單克隆抗體。
如果抗體與抗原結(jié)合的親和力或親和性比它與其它參照抗原(包括多肽或其它物質(zhì))結(jié)合的大，則抗體與該抗原“特異結(jié)合”。
用在本發(fā)明中的“抗原”指被抗體識別和特異結(jié)合的物質(zhì)?？乖ǖ幌抻陔?、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖類和脂類；它們的一部分和它們的聯(lián)合。
術(shù)語“免疫原”通常對這個領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。它是當(dāng)免疫原被注射進(jìn)入適合宿主或在體外用于B細(xì)胞免疫時，能刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性抗體的抗原。通過這個領(lǐng)域公知的許多技術(shù)，可以使一個化合物變得是免疫原性的，包括交聯(lián)或連接載體以增加效價，與促分裂原混合以增加免疫應(yīng)答，及和佐劑聯(lián)合以增加提呈。
應(yīng)用在用于體外B細(xì)胞免疫的細(xì)胞上的術(shù)語“異種的”指該細(xì)胞源于基因型不同于受體B細(xì)胞的實體。例如，異種細(xì)胞可以來自不同的種或受體細(xì)胞相同種的不同個體。從一個種的個體中得到的胚胎細(xì)胞與相同種的成體是異種的。同樣地，異種多核苷酸或抗原是在受體B細(xì)胞不存在的分子或結(jié)構(gòu)上與受體細(xì)胞中表達(dá)的對應(yīng)物不同的分子。
如果細(xì)胞分別衍生于胚胎的三個胚芽層-外胚層、內(nèi)胚層、或中胚層之一，那么細(xì)胞是“外胚層”，“內(nèi)胚層”或“中胚層”來源的。外胚層是產(chǎn)生表皮細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的外層。內(nèi)胚層是產(chǎn)生消化管及它相關(guān)器官內(nèi)層的內(nèi)層，包括但不限胰腺和肝。中層，中胚層產(chǎn)生了幾個器官(包括但不限于心臟、腎臟、生殖腺)，結(jié)締組織(例如，骨骼、肌肉、腱)和血細(xì)胞。
用在本發(fā)明中的“淋巴細(xì)胞”是特異性識別及對非自身或自身抗原應(yīng)答的細(xì)胞，而且，它負(fù)責(zé)特異性免疫產(chǎn)生。包含在“淋巴細(xì)胞”內(nèi)的是各種類型的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。
術(shù)語“介質(zhì)”、“細(xì)胞培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)基”可替換應(yīng)用。這個術(shù)語指含水的環(huán)境，其中真核或原核細(xì)胞培養(yǎng)生長。介質(zhì)包括物理化學(xué)的，營養(yǎng)的和激素的環(huán)境。當(dāng)介質(zhì)基本沒有源于任何哺乳動物源的血清(例如源于胎兒牛，馬，人，兔的血清)時，細(xì)胞培養(yǎng)基是“無血清”的。用“基本沒有”意味著細(xì)胞培養(yǎng)基包含大約0-5％之間的血清，優(yōu)選地大約0-1％之間的血清，而且最優(yōu)選地大約0-0.1％之間的血清。
“成分明確培養(yǎng)基”指的是包括對培養(yǎng)中細(xì)胞生存和/或生長必須的營養(yǎng)和激素需要的培養(yǎng)基，因此培養(yǎng)基的組分是公知的。習(xí)慣上，通過添加對生長和/或生存必需的營養(yǎng)和生長因子形成成分明確培養(yǎng)基。典型地，成分明確培養(yǎng)基提供至少一種源于一個或多個下面類別的組分a)所有必需氨基酸，和通常添加光氨酸的20種基本氨基酸組；b)能源，通常以碳水化合物形式，如葡萄糖；c)低濃度需要的維生素和/或其它有機化合物；d)游離脂肪酸；和e)痕量元素，其中痕量元素被定義為典型地需要很低的濃度，通常在微摩爾范圍的無機化合物或天然存在的元素。可選地，也可以用源于下面任何一個類別的一種或多種組分補充成分明確培養(yǎng)基a)一種或多種促有絲分裂劑；b)鹽和緩沖液，例如，鈣、鎂和磷酸鹽；c)核苷和堿基，例如腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷，次黃嘌呤；和d)蛋白質(zhì)和組織水解產(chǎn)物。
“促有絲分裂劑”或“生長因子”是刺激哺乳動物細(xì)胞有絲分裂的分子。通常，促有絲分裂劑或生長因子增強了細(xì)胞培養(yǎng)中哺乳動物細(xì)胞存活和增殖，并是多肽。促有絲分裂多肽可能是“天然的”或“天然序列的”多肽(即，有天然存在的生長因子的氨基酸序列)，而不管產(chǎn)生它的方法(即，它可能是從分子內(nèi)源被分離或通過包括重組技術(shù)的合成技術(shù)產(chǎn)生)，或是其變異體和突變體。優(yōu)選地，促有絲分裂多肽有人源生長因子，或它的片段的同樣的氨基酸序列，非限制性例子包括erbB受體家族一個或多個成員的激活因子；在培養(yǎng)基中提高cAMP水平的藥劑(例如毛喉素、霍亂毒素，cAMP或它們的類似物)；吸附分子，如神經(jīng)細(xì)胞吸附分子(N-CAM)，層粘連蛋白或纖連蛋白；孕酮；神經(jīng)營養(yǎng)因子，如骨骼衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)；神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)；或神經(jīng)生長因子，如NGF-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長因子，如酸性FGF(aFGF)和堿性FGF(bFGG)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，或TGF-β5；胰島素樣生長因子，包IGF-I，IGF-II和des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白質(zhì)；和激素，如雌激素、睪酮、甲狀腺激素、胰島素和任何一種列在Mather，J.P.and Robefts，P.E.(1998)“Introduction toCell and Tissue Culture”，Plenum Press，New York.的138-139頁中表8.2中的那些促細(xì)胞分裂劑。
用在本發(fā)明中的“細(xì)胞因子”，指的是各種細(xì)胞間信號分子(最公知的細(xì)胞因子參于哺乳動物體細(xì)胞的調(diào)節(jié))。大量的細(xì)胞因子家族(促進(jìn)生長和抑制生長作用的)被表征，包括，例如白細(xì)胞介素(如IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9(P40)，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14和IL-15)；CSF-型細(xì)胞因子，如GM-CSF，G-CSF，M-CSF，LIF，EPO，TPO(“血小板生成素”)，TNF-α和TNF-β)；干擾素(如IFN-α，IFN-β，IFN-γ)；TGF-β家族細(xì)胞因子(如TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，抑制素A，抑制素B，活化素A，活化素B)，生長因子(如EGF，VEGF，SCF(“干細(xì)胞生長因子”或“青灰因子”))TGF-α，aFGF，bFGF，KGF，PDGF-A，PDGF-B，PD-ECGF，INS，IGF-1，IGF-II，NGF-β)；α-型intercrine細(xì)胞因子(如，IL-8，GRO/MGSA，PF-4，PBP/CTAP/βTG，IP-10，MIP-2，KC9E3)；和β-型intercrine細(xì)胞因子(如MCAF，ACT-2/PAT744/G26，LD-78/PAT464，RANTES，G26，I309，JE，TCA3，MIP-1α，B，CRG-2)；和趨化因子(如NAP-1，MCP-1，MIP-1α，MIP-1β，MIP-2，SISβ，SISδ，SISε，PF-4，PBP，γIP-10，MGSA)。大量其它細(xì)胞因子對于這個領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員是公知的；這些細(xì)胞因子的來源、特性、靶和效應(yīng)子活性已被描述，而且對于許多細(xì)胞因子，編碼分子的DNA序列是公知的；參考，例如R.Callard & A.Gearing，The Cytokinefacts Book(Academic Press 1994)，和其中綜述和/或引用的具體出版物，它們以參考文獻(xiàn)形式整體被并入本發(fā)明中。正如目錄如TheCytokine facts Book中被參考的，通常，編碼這樣細(xì)胞因子的許多DNA和/或蛋白質(zhì)序列從序列數(shù)據(jù)庫，如GENBANK(DNA)和/或SWISSPROT(蛋白質(zhì))中也是可以得到的。典型地，雖然基于公開的序列信息也可能合成編碼細(xì)胞因子的多核苷酸，但是編碼這樣細(xì)胞因子的克隆DNA如質(zhì)粒一樣將已經(jīng)是可得到的。也可以用這個領(lǐng)域所說明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法得到編碼細(xì)胞因子的多核苷酸。參考，例如，Mullis & Faloona，Met.Enzymology，155355(1987)。細(xì)胞因子的檢測，純化和表征，包括鑒定對已知細(xì)胞類型有效的新細(xì)胞因子，也已經(jīng)在大量出版物和本發(fā)明的參考文獻(xiàn)說明。參考，例如，Lymphokines and Interferons，1987；和DeMaeyer，E.，et al.，“Interferons and Other Regulatory Cytokines，”(John Wiley &Sons 1998)。
術(shù)語“多核苷酸”，和“核酸”可交替地使用。它們指的是任何長度的，或是脫氧核糖核苷酸，或是核糖核苷酸，或它們的類似物等核苷酸的多聚體形式。多核苷酸可以有公知或未知的任何三維結(jié)構(gòu)，而且可以起公知或未知的任何作用。下面是非限定性的多核苷酸的例子基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)，從連鎖分析中確定的座位，外顯子，內(nèi)含子，信使RNA(mRNA)，轉(zhuǎn)移RNA，核糖體RNA，核酶，cDNA，重組多核苷酸，分枝多核苷酸，質(zhì)粒，載體，任何序列的分離DNA，任何序列分離的RNA，核酸探針及引物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果出現(xiàn)修飾，可以在聚合物裝配前或后給予核苷酸結(jié)構(gòu)修飾。核苷酸序列可被非核苷酸組分中斷。聚合后，可以對多核苷酸作進(jìn)一步修飾，如通過連接標(biāo)記組分。
術(shù)語“重組”多核苷酸指基因組，cDNA，半合成或合成來源的多核苷酸，它們或不天然存在，或以非自然排列方式與其它多核苷酸連接。
“核苷酸探針”指在雜交反應(yīng)中被用于檢測或鑒定對應(yīng)靶多核苷酸的多核苷酸。
“可操作地連接”指的是并置，其中所述的成分處于可使它們以它們期望的方式起作用的關(guān)聯(lián)中。例如，如果啟動子序列起始編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么啟動子序列可操作地連接到編碼序列上。
“基因”指的是包含至少一個可讀框的多核苷酸，可讀框被轉(zhuǎn)錄和翻譯后，能夠編碼特定的蛋白質(zhì)。
用在本發(fā)明中的術(shù)語“分離的”指的是與組分、細(xì)胞和其它物質(zhì)分開的，其中，多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或它們的片段天然通常與之相關(guān)。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員顯而易見的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或它們的片段不需要“分離”以使它與它的天然存在的對應(yīng)物區(qū)別。此外，“濃縮的”、“分離的”或“稀釋的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或它們的片段是可以和它的天然存在的相對應(yīng)物區(qū)別的，因為，濃度或每體積中的分子數(shù)比其天然存在的對應(yīng)物的更多地“濃縮”或更少地“分離”。
可以在一個絕對的基礎(chǔ)上測量富集，如每體積溶液的重量，也可以相對于源混合物中存在的另一潛在干擾物質(zhì)測量。本發(fā)明具體實施方式
的漸增富集是越多越是更優(yōu)選的。因此，例如，優(yōu)選2倍富集，更優(yōu)選10倍富集，更優(yōu)選100倍富集，甚至更優(yōu)選1000倍富集。通過人工組合方法，如化學(xué)合成或重組表達(dá)，也能提供分離狀態(tài)物質(zhì)。
“疾病相關(guān)”基因或多核苷酸指的是與非疾病對照的組織或細(xì)胞比較，在衍生于患病組織的細(xì)胞中以異常水平或以異常形式產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的任何基因或多核苷酸。它可以是變得以異常高的水平被表達(dá)的基因；它可以是變得以異常低的水平被表達(dá)的基因，其中改變的表達(dá)與疾病出現(xiàn)和/或發(fā)展是相關(guān)的。疾病相關(guān)基因也指有突變或遺傳變異的基因，這個突變或遺傳變異與疾病病因?qū)W有關(guān)基因直接相關(guān)或連鎖失衡。被轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物可以是已知或未知的，而且可以是正?；虍惓Ｋ健?br> 用在本發(fā)明中的“表達(dá)”指多核苷酸被轉(zhuǎn)錄成mRNA的過程，和/或被轉(zhuǎn)錄的mRNA(也稱為“轉(zhuǎn)錄物”)隨后被翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄物和被編碼的多肽被統(tǒng)稱為“基因產(chǎn)物”。如果多核苷酸衍生于基因組DNA，表達(dá)可以包括在真核細(xì)胞中mRNA剪接。
應(yīng)用在個體中核苷酸序列或多肽序列的“差異表達(dá)”指與對照中檢測到的比較，此序列的過量表達(dá)或過低表達(dá)。過低表達(dá)也包含缺少特定序列的表達(dá)，這可用當(dāng)與對照比較，在測試個體中可檢測表達(dá)的缺少來證實。
“基因遞送載體”定義為能攜帶插入的多核苷酸進(jìn)入宿主細(xì)胞的任何分子?；蜻f送載體的例子是脂質(zhì)體、病毒如桿狀病毒、腺病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒、噬菌體、粘粒、質(zhì)粒、真菌載體和典型地用在這個領(lǐng)域的其它重組載體，已描述了它們用于在各種真核或原核宿主中表達(dá)，而且除了簡單的蛋白表達(dá)，它們也可用于基因治療。
“載體”是自我復(fù)制的核酸分子，它能轉(zhuǎn)移插入的核酸分子至宿主細(xì)胞內(nèi)和/或之間。這個術(shù)語包括主要用于核酸分子插入宿主細(xì)胞的載體，主要對核酸分子復(fù)制起作用的復(fù)制載體，及對DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起作用的表達(dá)載體。也包括提供上述一個以上功能的載體。
“表達(dá)載體”定義多核苷酸，當(dāng)它被導(dǎo)入適合宿主細(xì)胞中能被轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽?！氨磉_(dá)系統(tǒng)”通常意味包括表達(dá)載體的適合宿主細(xì)胞，這個表達(dá)載體能起作用以產(chǎn)生期望的表達(dá)產(chǎn)物。
“宿主細(xì)胞”包括個體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，這個個體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物能或已是載體的受體或核酸分子和/或蛋白質(zhì)摻入的受體。宿主細(xì)胞包括單一宿主細(xì)胞的后代，而且由于自然的，偶然的或有意的突變，后代不必與原始母細(xì)胞完全相同(在形態(tài)上或在總DNA成分的基因組上)。宿主細(xì)胞包括體內(nèi)用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”指外源多核苷酸插入宿主細(xì)胞，而不管用于插入的方法，例如，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或電穿孔。外源多核苷酸可以作為非整合載體被維持，例如，質(zhì)粒，或可選地，可被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組。
“病毒載體”定義為重組產(chǎn)生的病毒或病毒顆粒，它包括或在體內(nèi)、離體或體外被遞送進(jìn)宿主細(xì)胞的多核苷酸。病毒載體的例子包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病載體等等。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換地用在本發(fā)明中，指任何長度氨基酸的聚合物。聚合體可以是線性或分枝的，它可以包括修飾的氨基酸，而且可被非氨基酸序列中斷。該術(shù)語也包括已被修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化作用、脂化作用、乙?；饔?、磷酸化作用或任何其它處理，如與標(biāo)記組分連接。用在本發(fā)明中的術(shù)語“氨基酸”指天然的和/或非天然的，或是合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光學(xué)異構(gòu)體，和氨基酸類似物及肽模擬物(peptidomimetics)。
“配體”指能被受體的配體結(jié)合域結(jié)合的分子。該分子可以被化學(xué)合成，或可以是自然界中出現(xiàn)的。配體可是能刺激受體生物活性的“激動劑”或是抑制受體生物活性的“拮抗劑”。
“細(xì)胞表面受體”或“表面抗原”是被錨定在原生質(zhì)膜上的分子。它們組成了蛋白質(zhì)，糖蛋白和多糖的大家族，它們不僅做為原生質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)組分起作用，而且做為支配各種生物功能的調(diào)節(jié)元件起作用。
用在本發(fā)明中的“膜蛋白”包括外周的和整體的膜多肽，它們與包括原生質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器膜的任何細(xì)胞膜結(jié)合。
用于細(xì)胞蛋白質(zhì)的術(shù)語“胞質(zhì)的”，“核的”和“分泌的”指細(xì)胞蛋白質(zhì)大部分被定位的細(xì)胞外和/或亞細(xì)胞位置。某些蛋白質(zhì)是“伴侶蛋白”，能夠在細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞核間來回轉(zhuǎn)運。
術(shù)語“發(fā)光”通常用于指由于除了溫度升高外任何原因，來自于物質(zhì)上的發(fā)射光。一般地，當(dāng)原子或分子從“激發(fā)”狀態(tài)移到低能量狀態(tài)(常常是基態(tài)狀態(tài))，它發(fā)射電磁能光子(例如，光)；這個過程常常被稱為“放射性衰變”。存在許多激發(fā)的原因。如果激發(fā)原因是光子，發(fā)光過程被稱為“光致發(fā)光”。如果激發(fā)原因是電子，發(fā)光過程被稱為“電致發(fā)光”。更具體地，電致發(fā)光由電子直接射入和遷移形成了電子-空穴對、而且隨后電子-空穴對復(fù)合發(fā)射光量子引起。由化學(xué)反應(yīng)引起的發(fā)光通常被稱為“化學(xué)發(fā)光”?；畹挠袡C體產(chǎn)生的發(fā)光通常被稱為“生物發(fā)光”。如果光致發(fā)光是旋轉(zhuǎn)容許躍遷(例如，單態(tài)-單態(tài)轉(zhuǎn)移，三態(tài)-三態(tài)轉(zhuǎn)移)的結(jié)果，光致發(fā)光過程通常被稱為“熒光”。典型地，由于通過這樣旋轉(zhuǎn)容許躍遷，短暫的激發(fā)狀態(tài)快速回落，結(jié)果激發(fā)原因除去后，熒光發(fā)射不是持續(xù)的。如果光致發(fā)光是不可旋轉(zhuǎn)躍遷(例如，三態(tài)-單態(tài)轉(zhuǎn)移)的結(jié)果，則該光致發(fā)光過程通常稱為磷光。典型地，由于僅僅通過這樣不可旋轉(zhuǎn)躍遷，長期的激發(fā)狀態(tài)才可以回落，結(jié)果激發(fā)原因除去后，熒光發(fā)射持續(xù)很久?！鞍l(fā)光標(biāo)記”可以有上述任何一個特性。
用在本發(fā)明中術(shù)語“抗原提呈細(xì)胞”指表達(dá)目的抗原的細(xì)胞，目的抗原通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生人單克隆抗體?？乖瓋?yōu)選在細(xì)胞表面上表達(dá)。抗原可以是細(xì)胞天然的，或當(dāng)它的表達(dá)由外源導(dǎo)入的多核苷酸控制時，抗原是細(xì)胞的異原的。
“雙特異性抗體”。單克隆抗體或抗體片段可摻入到雙特異性重組肽中，參見例如，Greenman等，(Greenman，J.，等，Mol.Immunol.(England)28(11)1243-54(1991))。在這個例子中，構(gòu)建了包含通過硫醚鍵連接的兩個F(ab’)的雙特異性F(ab’)2。當(dāng)兩個完整抗體被連在一起，也可得到雙特異性抗體。另一個得到雙特異性抗體方法是通過混合源于不同抗體或它們片段的鏈。這樣，雙特異性抗體的“左側(cè)”分枝有一個功能，而“右側(cè)”分枝有另一個功能。
“微生物體”是肉眼看不見的生物實體。這些實體組成了低等有機體的大門類，包括但不限于細(xì)菌，真菌，病毒和microplasma。
“哺乳動物”是脊椎動物，其特征在于生育后代，而且在它們身體上有毛發(fā)。用在本發(fā)明中的“哺乳動物”包括，但不限于人，寵物(如狗、貓、兔、大鼠和小鼠等等)，農(nóng)富(如山羊、綿羊和馬等等)，和運動動物(如狐貍，鹿等等)。
用在本發(fā)明的術(shù)語“哺乳動物的”指來源于哺乳動物。與期望抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的人單克隆抗體的產(chǎn)生非轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞的制備可用在本發(fā)明中的非轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞廣泛分部在源于人外周血、淋巴結(jié)、脾臟、肝、骨髓、臍帶或其它組織的淋巴細(xì)胞中。雖然對于人B細(xì)胞的來源沒有特定的限制，但是優(yōu)選使用外周血，因為它容易獲得(例如，來自于商業(yè)上來源或適合供體)，而且含有充足B細(xì)胞數(shù)量。盡管在他的或她的身體中產(chǎn)生B細(xì)胞的任何個體都是可候選供體，但是預(yù)先曾被暴露于特定目的抗原，而且可能含有免疫B細(xì)胞的那些個體是優(yōu)選的供體。
能根據(jù)這個領(lǐng)域公知的任何一種方法，進(jìn)行包含在人外周血或其它身體組織中的淋巴細(xì)胞提取。代表性方法是密度梯度離心和非B淋巴細(xì)胞的免疫親和除去。當(dāng)進(jìn)行密度梯度離心時，樣品，如外周血典型地用適合的等滲介質(zhì)稀釋，優(yōu)選無鈣和/或鎂離子的介質(zhì)。然后，稀釋的血液被加載到適合的分離介質(zhì)上，當(dāng)進(jìn)行離心時，引起外周血淋巴細(xì)胞(PBL)與紅血細(xì)胞和血小板分離。通常使用的分離介質(zhì)包括但不限于FICOLL(從Pharmacia可得到，瑞典)，LYMPHOPREPTM(密度1.077g/ml，Nycomed Pharma As，Oslo，挪威)和Percoll(Pharmacia，瑞典)。一旦完成離心，PBLs可從血清和分離培養(yǎng)基間的分界面處被吸出。純化的PBLs在使用前可保存在低溫(例如，液氮中)下。
制備富集B細(xì)胞的淋巴細(xì)胞的替代方法涉及通過與溴化2-氨乙基異硫脲鎓氫溴化物(AET)處理的綿羊紅細(xì)胞玫瑰花環(huán)形成除去T淋巴細(xì)胞。這個過程通常通過混合PBLs與處理過的紅細(xì)胞進(jìn)行，隨后通過離心方法在離心介質(zhì)上把B細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞分離。
B細(xì)胞進(jìn)一步的富集可以通過或保留B細(xì)胞或除去T細(xì)胞的親和色譜法，在單克隆抗體包被的培養(yǎng)容器上淘選，磁分離技術(shù)，或細(xì)胞分選器(如FACS)完成。兩種方法都使用了能區(qū)分兩種類型淋巴細(xì)胞的檢測劑。這樣的檢測劑包括但不限于特異性結(jié)合細(xì)胞表面分子的肽和糖蛋白，其中細(xì)胞表面分子在一種而不是兩種類型的淋巴細(xì)胞中優(yōu)先地被表達(dá)(如果不是專性地表達(dá)的話)。各種T細(xì)胞特異性標(biāo)記分子在這個領(lǐng)域是公知的。T細(xì)胞特異性標(biāo)記分子的非限定性的例子包括TCR/CD3復(fù)合物，CD2、CD4、CD8和CD28。B細(xì)胞特異性標(biāo)記分子的非限定性的例子包括CD19、CD20、CD21，HLA-DR，和B細(xì)胞抗原36kD。在制備包括大量非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的淋巴細(xì)胞組合物中，上述方法的任何一個，或由此修改的程序可以或單獨或以任何聯(lián)合進(jìn)行。
由此富集和/或分選的B細(xì)胞群可用于篩選顯示與期望抗原特異性結(jié)合的B細(xì)胞，或可選地，在這樣篩選過程前，在體外用期望目的抗原進(jìn)行免疫/活化。在(a)刺激抗原特異性B細(xì)胞的產(chǎn)生；和(b)產(chǎn)生具有識別淋巴細(xì)胞供體從來沒有被暴露過的和/或不能激發(fā)強免疫應(yīng)答的自身抗原或抗原方面，在體外B細(xì)胞的免疫/活化特別有益的。
非轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞的體外免疫/活化B細(xì)胞體外免疫的步驟通常與確定的和常規(guī)的B細(xì)胞活化技術(shù)是一致的。這個過程包括在有利于B細(xì)胞和目的抗原特異性結(jié)合的條件下，用目的抗原接觸非轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞群。盡管引起B(yǎng)細(xì)胞和目的抗原穩(wěn)定和特異性相關(guān)的任何方法都是可用的，但是B細(xì)胞免疫優(yōu)選通過B細(xì)胞與抗原在“免疫培養(yǎng)基”中共培養(yǎng)進(jìn)行。一般，抗原被固定在B細(xì)胞生長的固體基質(zhì)上。在本發(fā)明的某些具體實施方案中，期望抗原被表達(dá)這樣抗原的單層細(xì)胞提呈。任何能培養(yǎng)生長的細(xì)胞都是抗原提呈的候選細(xì)胞。如果希望，能指導(dǎo)目的抗原表達(dá)的外源多核苷酸可被導(dǎo)入抗原提呈細(xì)胞。
適合于本發(fā)明的免疫培養(yǎng)基支持B淋巴細(xì)胞體外存活，維持它的形態(tài)、代謝能力和潛在的細(xì)胞分化能力。優(yōu)選地，使用成分明確培養(yǎng)基，這種成分明確培養(yǎng)基包含在培養(yǎng)中對B細(xì)胞生存和/或生長必需的營養(yǎng)和激素需要，以致于培養(yǎng)基的成分是公知的。支配哺乳動物細(xì)胞體外生存常用的參數(shù)在這個領(lǐng)域是公知的。可在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中控制的物理化學(xué)參數(shù)是，例如，pH，CO2，溫度和摩爾滲透壓濃度。常常以被改進(jìn)以提供最優(yōu)環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基組合物方式提供B細(xì)胞的營養(yǎng)需要。營養(yǎng)物質(zhì)能被分成幾類氨基酸和它們的衍生物、碳水化合物、糖、脂肪酸、復(fù)合脂質(zhì)體、核酸衍生物和維生素。除了維持細(xì)胞新陳代謝的營養(yǎng)物質(zhì)外，通常B細(xì)胞也需要來自于下面組至少一組中的一種或多種激素或促細(xì)胞分裂劑類固醇、前列腺素、生長因子、腦垂體激素、凝集素、佐劑肽及在無血清培養(yǎng)基中增殖的肽激素(Sato，G.H.et al.，in“Growth of Cells in Hormonally Defined Media”，ColdSpring Harbor Press，N.Y.，1982)。除了激素外，B細(xì)胞在體外生存和生長可能需要轉(zhuǎn)運蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白(原生質(zhì)離子轉(zhuǎn)運蛋白)，血漿銅藍(lán)蛋白(一種銅轉(zhuǎn)運蛋白)，和高密度脂蛋白(一種脂質(zhì)體載體)。
可用在體外活化過程的免疫原是被期望在人B細(xì)胞中誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的組合物。各種免疫原的變異在這個領(lǐng)域是公知的。各種類型免疫原非限定性例子包括生物學(xué)或化學(xué)的化合物，如簡單或復(fù)合的有機或無機分子，肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多核苷酸(如反義寡核苷酸)、核酶和它們的衍生物。大量化合物能被合成，例如聚合物，如多肽和多核苷酸，和基于各種核心結(jié)構(gòu)的合成有機化合物，而且這些也包括在術(shù)語“化學(xué)化合物”中，此外，各種天然來源，如植物或動物提取物，等等可以用于免疫。
為了產(chǎn)生與特異細(xì)胞類型的代表性抗原結(jié)合的人單克隆抗體，能利用由這樣細(xì)胞類型組成的組織，組織培養(yǎng)物或由此衍生的細(xì)胞及其后代，從這些資源中任何一個制備的切片或涂片和純化抗原的樣品。此外，細(xì)胞膜提取物，胞質(zhì)提取物，或目的抗原豐富的特定細(xì)胞類型的整個細(xì)胞也能用于體外免疫。特別有利的是差異地(過量表達(dá)或過低表達(dá))表達(dá)致病基因的細(xì)胞，在不同細(xì)胞周期點(G0，G1，G2，M，或S期)停滯的細(xì)胞，不同發(fā)育階段(成年的或胚胎的)或不同發(fā)育起源(例如，外皮層的，內(nèi)皮層的或中皮層的)的細(xì)胞，及被包括細(xì)菌，真菌和病毒在內(nèi)的一種或多種微生物感染的細(xì)胞。根據(jù)傳統(tǒng)組織培養(yǎng)技術(shù)，可以建立各種細(xì)胞系，這對于在這個領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員是顯而易見的。也可以從公共或私人的保藏中得到。最大的保藏代理機構(gòu)是美國典型培養(yǎng)物保藏中心(http//www.atcc.org)，它提供了衍生于大量生物體和組織樣品的各種很好地被鑒定特性的細(xì)胞系保藏。
目的細(xì)胞類型的代表性抗原可是下面類別的一個或多個受體配體、分泌蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面受體、胞質(zhì)蛋白質(zhì)，或核蛋白質(zhì)。特有利的是顯示限制性組織、細(xì)胞類型或亞細(xì)胞分布模式的抗原。在這些亞類內(nèi)，具有主要診斷和/或治療潛能的抗原是參與特異性生物過程，包括但不限于細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)，細(xì)胞分化，細(xì)胞凋亡，趨化性，細(xì)胞運動性和細(xì)胞骨架重排。其它類型有治療潛能的抗原包括與特定疾病或特定疾病階段相關(guān)的抗原。這樣的抗原包括但不限于與自身免疫疾病、肥胖癥、高血壓、糖尿病、神經(jīng)元和/或肌肉變性疾病、心臟病、內(nèi)分泌紊亂，它們的任何聯(lián)合相關(guān)的抗原。
為了產(chǎn)生針對特定細(xì)胞類型的細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，期望用活的和完整的所述類型細(xì)胞，優(yōu)選用表面沒有血清的那些細(xì)胞免疫非轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞。用在補充血清的培養(yǎng)基中繁殖的細(xì)胞免疫可能有顯著的缺點。血清是許多小和大生物分子與不明確活性的極其復(fù)雜的復(fù)合物。已知許多種類這些血清生物分子粘附細(xì)胞表面。這些生物分子包括但不限于轉(zhuǎn)移蛋白(如，白蛋白)、結(jié)合和伸展因子(例如，膠原蛋白和纖連蛋白)，及各種血清脂質(zhì)。這些外源分子吸附到細(xì)胞表面不僅引起與不代表特定細(xì)胞類型的分子起交叉反應(yīng)的抗體產(chǎn)生，也能掩蔽天然抗原提呈，因此進(jìn)一步逐漸損毀由此產(chǎn)生的單克隆抗體庫的“代表性”。
為了確保細(xì)胞表面沒有血清，細(xì)胞通常生長在成分明確培養(yǎng)基上，這種成分明確培養(yǎng)基缺少血清，但是用激素、生長因子或?qū)τ谔囟?xì)胞類型生存和/或生長必需的任何其它因子補充。在這個領(lǐng)域中配制用于特定細(xì)胞類型的成分明確培養(yǎng)基的步驟已是很明確的，因此在本發(fā)明中沒有詳述。(Barnes，D.and Sato，G.(1980)Anal，Biochem.，102255；Mather，J.P.and Roberts，P.E.(1998)“Introductionto Cell and Tissue Culture”，Plenum Press，New York)。
與目的抗原特異性結(jié)合的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的篩選在篩選顯示期望抗原結(jié)合特異性的B細(xì)胞前，用分離劑預(yù)處理富集的B細(xì)胞群或活化的B細(xì)胞，分離劑破壞細(xì)胞聚集，而且把結(jié)合抗原從B細(xì)胞表面上除去。當(dāng)應(yīng)用分離劑時，采取預(yù)防措施維持B細(xì)胞膜完整性和保護(hù)細(xì)胞膜的組分。不同于傳統(tǒng)的通過強蛋白分解酶如絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶作用分離錨定細(xì)胞或細(xì)胞層的方法，通常是通過對細(xì)胞表面分子最小化破壞的試劑從培養(yǎng)基質(zhì)中分離本發(fā)明的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞。這些試劑包括但不限于膠原蛋白酶、dispases、和中性蛋白酶。用這些試劑處理B細(xì)胞主要是引起聚集的破壞，同時保護(hù)細(xì)胞表面的免疫球蛋白。分離細(xì)胞聚集或從固體基質(zhì)上脫離錨定細(xì)胞所需的處理時間可以隨著選擇的蛋白酶而變化，但是正常地將是約3-60分鐘時間，而且優(yōu)選大約15-30分鐘。正常地，酶處理在大約37℃的室溫下進(jìn)行?？梢酝ㄟ^用含有生理學(xué)范圍pH和鹽濃度的緩沖液，或無血清介質(zhì)輕輕沖洗除去過量的酶，無血清介質(zhì)是被這個領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員常規(guī)制備的。
與期望抗原起免疫反應(yīng)的B細(xì)胞的隨后篩選包括下面步驟(a)在有利于B淋巴細(xì)胞和期望抗原特異性結(jié)合條件下，用期望抗原接觸包含B細(xì)胞的人淋巴細(xì)胞群；而且(b)將結(jié)合期望抗原的B淋巴細(xì)胞與沒有被結(jié)合的B淋巴細(xì)胞分離。典型地，通過在固體基質(zhì)上層疊抗原，接著在抗原層上平鋪B淋巴細(xì)胞進(jìn)行這個過程。接著在生理學(xué)條件下，B淋巴細(xì)胞可結(jié)合抗原，其中pH被維持在6和8之間，溫度在約20℃-40℃間。通過沖洗、吸取或任何其它適合方法除去沒有被結(jié)合的B淋巴細(xì)胞。
這個方法的變化是扣除篩選。例如，在篩選特異性結(jié)合結(jié)腸癌細(xì)胞時，人淋巴細(xì)胞所有組成成分與單層正常細(xì)胞溫育。展示抗正常結(jié)腸癌細(xì)胞的抗體的那些B細(xì)胞將結(jié)合細(xì)胞單層。收集沒有被結(jié)合的B細(xì)胞，與結(jié)腸癌細(xì)胞單層溫育。這次，僅僅產(chǎn)生特異性識別結(jié)腸癌細(xì)胞的單克隆抗體的B細(xì)胞將結(jié)合，而且可以洗去非特異性B細(xì)胞。
當(dāng)在篩選方法中利用表達(dá)期望抗原的完整細(xì)胞時，典型地，在無血清培養(yǎng)基中生長的單層活細(xì)胞以大約5％到100％的鋪滿在固相基質(zhì)上接種?？乖岢始?xì)胞被接種其上的基質(zhì)可由各種材料制造?；|(zhì)選擇主要由細(xì)胞類型決定。大多數(shù)細(xì)胞能在由例如玻璃、塑料或陶瓷材料制造的基質(zhì)上增殖。對于某些細(xì)胞類型，如神經(jīng)元，上皮和肌肉細(xì)胞，優(yōu)選用增強細(xì)胞粘附和伸展的帶電物質(zhì)預(yù)先包被基質(zhì)。常用的包被材料包括帶凈正電荷的生物基質(zhì)。生物基質(zhì)非限定性的例子包括細(xì)胞外基質(zhì)/粘附蛋白，如層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白或合成多肽，如多聚賴氨酸。各種非生物基質(zhì)，如由硝化纖維、尼龍、聚四氟乙烯，或任何其它植入材料制成的膜也可被用于支持無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長。
接種單層抗原提呈細(xì)胞后，接著，非轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞懸浮液被加入細(xì)胞單層中，在大約37℃溫育適合的時間?？墒笲細(xì)胞通過它們表面免疫球蛋白的特異性識別結(jié)合它們特異性抗原所需的溫育期間可隨著B淋巴細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的相對豐度而變化。正常地，它將是大約10-120分鐘的期間，而且優(yōu)選大約30-60分鐘的期間。一旦完成溫育，通過無Ca++/Mg++緩沖液沖洗，從單層抗原提呈細(xì)胞中除去沒有被結(jié)合B淋巴細(xì)胞。通過離心收集洗下的游離B淋巴細(xì)胞，然后用UV輻射。培養(yǎng)中，UV處理的B淋巴細(xì)胞在3天內(nèi)死亡，而且被用做篩選的B淋巴細(xì)胞隨后克隆生長的飼養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)合在單層抗原提呈細(xì)胞上的保留B細(xì)胞是在它們細(xì)胞表面表達(dá)期望免疫球蛋白的B細(xì)胞。這些細(xì)胞被命名為篩選的B淋巴細(xì)胞”。
篩選的B淋巴細(xì)胞的克隆擴(kuò)增在克隆擴(kuò)增前，用實質(zhì)上保護(hù)細(xì)胞生活力的適合方法從抗原分離篩選的B淋巴細(xì)胞。優(yōu)選的從抗原脫離出B細(xì)胞的方法是用如上所述溫和蛋白酶處理。為了產(chǎn)生篩選的B細(xì)胞的分離群落，分離的細(xì)胞以低密度平鋪在培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不僅支持非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的生存，也支持它的增殖。適合B細(xì)胞克隆擴(kuò)增的培養(yǎng)基包括對于維持細(xì)胞生長必需的營養(yǎng)和激素的需要，所述細(xì)胞生長倍增至少2倍，優(yōu)選3倍以上，更優(yōu)選5倍以上。正因為如此，非轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞分離群落在本發(fā)明中指細(xì)胞簇，包括從具有期望抗原結(jié)合特異性的單一B細(xì)胞衍生的至少2個后代細(xì)胞，優(yōu)選8個后代細(xì)胞，更優(yōu)選32個后代細(xì)胞。能支持非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞所需克隆擴(kuò)增的非限定性示例的培養(yǎng)基包括MEM、DMEM、RPMI、F-12，這些培養(yǎng)基包含細(xì)胞新陳代謝所需的補加成分，如谷氨酰胺和其它氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和有用的轉(zhuǎn)運蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白等等。培養(yǎng)基也可以包含防止酵母、細(xì)菌和真菌污染的抗生素。細(xì)胞培養(yǎng)適合的抗生素包括但不限于青霉素、鏈霉素、慶大霉素和潮霉素。雖然，可選擇地，培養(yǎng)基可含有1-10％源于牛、馬科動物、馬、雞等等的血清，但是優(yōu)選用本發(fā)明所述補加了至少一種生長因子或促細(xì)胞分裂劑的成分明確培養(yǎng)基。優(yōu)選的促細(xì)胞分裂劑包括商陸促細(xì)胞分裂劑、胰島素、IL-2、IL-4、IL6、IL10、抗CD40/CD-40配體。通常培養(yǎng)基中加入約1pg/ml到0.1mg/ml間濃度范圍的生長因子。通常大約1ng到10ug/ml間濃度是足夠的?？梢匀菀椎剡M(jìn)行簡單滴定試驗以測定特定生長因子的最優(yōu)濃度。
除了上述細(xì)胞培養(yǎng)因子外，可以利用飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)非轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞克隆擴(kuò)增。用在本發(fā)明中“飼養(yǎng)細(xì)胞”是提供B細(xì)胞繁殖和共刺激功能的輔佐細(xì)胞?？梢酝ㄟ^這個領(lǐng)域公知技術(shù)獲得飼養(yǎng)細(xì)胞，如外周血單個核細(xì)胞，例如，通過白細(xì)胞去除術(shù)(leukaphoresis)，這個方法是具有最小風(fēng)險的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)用方法(參見，例如Weaveer et al.，(1993)Blood 821981-1984)；而且，在使用前，這些飼養(yǎng)細(xì)胞一直可以通過冷凍保藏貯存。其它例證性飼養(yǎng)細(xì)胞類型是EBV-轉(zhuǎn)化類淋巴母細(xì)胞(Crossland et al.(1991)J.Immunol.1464414-20)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞、肝基質(zhì)細(xì)胞及3T3成纖維細(xì)胞細(xì)胞系。優(yōu)選飼養(yǎng)細(xì)胞類型是不能結(jié)合期望抗原的淋巴細(xì)胞，它作為未被結(jié)合、游離的淋巴細(xì)胞在上述提到的篩選步驟期間被收獲。優(yōu)選地，飼養(yǎng)細(xì)胞與待擴(kuò)增非轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞的比率至少約是100∶1，更優(yōu)選約是104∶1，更優(yōu)選約是106∶1。
通常要阻止本發(fā)明的飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂。在這個領(lǐng)域中，抑制有絲分裂的技術(shù)是很明確的。最常用方法是輻射。例如，在約5cm-25cm距離，可以用波長約220-290nm(優(yōu)選254nm)范圍的短UV波輻射淋巴細(xì)胞約30分鐘?？梢杂眉s3,000到4,000rads范圍的γ射線輻射外周血單個核細(xì)胞(優(yōu)選，約3,600rads)?？梢杂眉s6,000到12,000rads范圍的γ射線輻射任何類淋巴母細(xì)胞(優(yōu)選，約10，000rads)。可以用約6,000到12,000rads范圍的γ射線輻射其它類型細(xì)胞。
因為在培養(yǎng)系統(tǒng)中擴(kuò)增細(xì)胞前，B細(xì)胞克隆的抗原特異性是被限定的，所以能用自體同源或異源細(xì)胞支持B細(xì)胞生長。在淋巴細(xì)胞供體被如，外周血中存在的病毒感染，因此可能污染B細(xì)胞培養(yǎng)物的情況下，添加異源飼養(yǎng)細(xì)胞是重要的。在這種情況下，可在培養(yǎng)方法中利用這樣的異源飼養(yǎng)細(xì)胞，這些異源飼養(yǎng)細(xì)胞衍生于從被篩選和被美國紅十字標(biāo)準(zhǔn)視為適合血液供體的個體。培養(yǎng)非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆的條件應(yīng)與生理條件接近。培養(yǎng)基的pH應(yīng)與生理pH接近，優(yōu)選pH6-8間，更優(yōu)選pH7到7.8間，最優(yōu)選pH7.4。生理溫度范圍約25℃-40℃間。優(yōu)選地，培養(yǎng)細(xì)胞在約32℃到約38℃間，更優(yōu)選地，在約35℃到約37℃間。
應(yīng)用上述常規(guī)技術(shù)，已產(chǎn)生了表達(dá)免疫球蛋白的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞群，所述免疫球蛋白識別人胎兒腦原代細(xì)胞系、人胎兒卵巢細(xì)胞系、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，及成人神經(jīng)鞘細(xì)胞系，胚胎胰腺管細(xì)胞。編碼期望人單克隆抗體或其片段的多核苷酸的分離和表達(dá)在本發(fā)明中具體實施的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆提供了分離和克隆具有期望結(jié)合特異性的編碼人單克隆抗體多核苷酸的特定試劑。
結(jié)構(gòu)上，天然存在最簡單的抗體(例如，IgG)包括四個多肽鏈，通過二硫鍵相互連接的兩個重鏈(H)和兩個輕鏈(L)。人抗體由包括幾類免疫球蛋白一個大分子家族組成，如IgD，IgG，IgA，IgM和IgE。通常，兩種類型鏈分別編碼。過去的幾十年中，編碼人抗體組的大量基因已被克隆和測序。廣泛的序列分析已表明相同類免疫球蛋白鏈包含帶有組成抗原結(jié)合位點的可變區(qū)的高度保守的“不變區(qū)”?；诟鞣N類免疫球蛋白的存在序列，可用各種重組DNA技術(shù)分離編碼期望免疫球蛋白的免疫球蛋白基因。代表性克隆方法包括PCR、cDNA文庫構(gòu)建和篩選、在現(xiàn)存核酸數(shù)據(jù)庫中的同源性查詢，或任何它們的聯(lián)合。常用數(shù)據(jù)庫包括但不限于GenBank，EMBL，DDBJ，PDB，SWISS-PROT，EST，STS，GSS和HTGS。
分離編碼本發(fā)明人單克隆免疫球蛋白基因的一個例證性方法包括步驟(a)從本發(fā)明非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆中提取核酸；(b)合成編碼期望抗體或其片段重鏈或輕鏈的cDNA；(c)擴(kuò)增cDNA產(chǎn)生足夠量用于亞克隆和/或基因表達(dá)的DNA。
根據(jù)這個領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法或本發(fā)明例示方法(實施例6)，可提取在非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆中的核酸。例如，根據(jù)Sambrook etal.，(“Molecular CloningA Laboratory Manual”，Second Edition，1989)中闡述方法，能用各種溶解酶或化學(xué)溶液分離DNA和RNA，或通過制造商提供說明書所附的核酸結(jié)合樹脂提取DNA和RNA?？衫梅崔D(zhuǎn)錄和各種擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)cDNA合成。對于本發(fā)明目的而言，擴(kuò)增指利用能以合理忠實性復(fù)制靶序列、依賴于引物的聚合酶的方法。
成功擴(kuò)增的限制性因素是提取充分拷貝的靶序列，以便進(jìn)行有效和可靠地擴(kuò)增。在本發(fā)明方法中，產(chǎn)生了靶免疫球蛋白基因的充分拷貝，因此，能以較大程度的成功和確定性進(jìn)行擴(kuò)增。在初期免疫/活化步驟中，基于對期望抗原的抗體細(xì)胞表面表達(dá)篩選選定非轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞。這些選定淋巴細(xì)胞沒有克隆擴(kuò)增步驟期間產(chǎn)生的它們后代成熟。這些更成熟的后代細(xì)胞以產(chǎn)生和分泌大量抗體為特征，部分原因是在這些細(xì)胞中有較多量的mRNA拷貝。因此，單一被分離，表達(dá)細(xì)胞表面抗體不太成熟的B淋巴細(xì)胞可能有大約103編碼其表達(dá)免疫球蛋白mRNA的拷貝，而較成熟的B淋巴細(xì)胞將有105以上或更多mRNA拷貝。在本發(fā)明中，在有利于B細(xì)胞增值條件下培養(yǎng)選擇的淋巴細(xì)胞，這樣產(chǎn)生了持續(xù)產(chǎn)生抗體的大量B細(xì)胞克隆。若本發(fā)明克隆擴(kuò)增步驟產(chǎn)生了例如20左右這類成熟B淋巴細(xì)胞的群落，擴(kuò)增可用的mRNA拷貝能是2×106以上。根據(jù)下面進(jìn)一步說明的方法，這個數(shù)量確保成功擴(kuò)增和隨后期望免疫球蛋白的表達(dá)。相比較，成功和可預(yù)測地擴(kuò)增被分離、不太成熟、至多僅有幾百mRNA拷貝的B細(xì)胞是極其困難的。同樣，成功和可預(yù)測地從失去持續(xù)產(chǎn)生抗體能力的B淋巴細(xì)胞克隆中，或從其它有非常低mRNA表達(dá)水平以致該克隆的抗體產(chǎn)生受到損害的B淋巴細(xì)胞克隆中擴(kuò)增mRNA是相似地極為困難?？梢酝ㄟ^天然或重組DNA聚合酶，如T7DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段，和/或RNA聚合酶，如反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行擴(kuò)增。優(yōu)選擴(kuò)增方法是PCR。常用PCR方法可在US.Patent Nos.4,683195(Mullis)和4,683,202(Mullis etal.)中學(xué)到。然而，用于每個擴(kuò)增反應(yīng)的PCR條件可用計算機軟件程序根據(jù)經(jīng)驗確定或估計。許多參數(shù)影響反應(yīng)的成功。它們中有退火溫度和時間、延伸時間、Mg2+ ATP濃度、pH、及引物、模板和脫氧核糖核苷酸的濃度。本發(fā)明例證的是復(fù)制人輕鏈和重鏈的特異性引物和條件(參見實施例6-7)。
擴(kuò)增后，由此產(chǎn)生的多核苷酸可用瓊脂糖凝膠電泳檢測，接著用溴乙錠染色和紫外線照射可見。通過證明擴(kuò)增的免疫球蛋白基因有預(yù)測的大小，顯示出預(yù)測的限制性消化模式，或與正確克隆的DNA序列雜交可證實免疫球蛋白基因的特異性擴(kuò)增。
包括期望序列、分離的多核苷酸可被插入適合載體中，而且隨后載體可被導(dǎo)入適合宿主細(xì)胞中。本發(fā)明宿主細(xì)胞尤其可被用作如編碼特異性人單克隆抗體基因的貯藏所，或產(chǎn)生單克隆抗體的載體。通過這個領(lǐng)域任何公知方法，多核苷酸可被導(dǎo)入宿主細(xì)胞。例如，通過直接攝取、胞飲作用、轉(zhuǎn)染、f-接合(f-mating)或電穿孔導(dǎo)入外源多核苷酸可轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。一旦導(dǎo)入，外源多核苷酸能作為非整合載體(如質(zhì)粒)被維持在細(xì)胞內(nèi)，或整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組。
本發(fā)明提供了多核苷酸群，其編碼與特異性細(xì)胞類型代表性抗原結(jié)合的人單克隆抗體群的鏈。優(yōu)選地，細(xì)胞是真核細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞、最優(yōu)選人細(xì)胞。特別感興趣的其它細(xì)胞是差異表達(dá)(過量表達(dá)或過低表達(dá))致病基因的細(xì)胞；顯示了細(xì)胞周期缺陷(例如在各個細(xì)胞周期點包括G0，G1，G2，M，或S期停滯)的細(xì)胞；不同發(fā)育階段(成年的或胚胎的)細(xì)胞；或不同發(fā)育起源(例如，外皮層的，內(nèi)皮層的或中皮層的)的細(xì)胞。
用各種基因遞送載體可將各多核苷酸導(dǎo)入適合宿主細(xì)胞。本發(fā)明所用的基因遞送載體包括病毒和非病毒載體，如裸質(zhì)粒DNA或DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物。通常載體分類為克隆和表達(dá)載體?？寺≥d體對于獲得其含有的多核苷酸復(fù)制拷貝是有用的，或做為在保藏所貯藏將來復(fù)活的多核苷酸的方法。表達(dá)載體(和含有這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞)可用于獲得從它們含有的多核苷酸中產(chǎn)生的多肽。適合克隆和表達(dá)載體包括任何在這個領(lǐng)域公知的，例如，用于細(xì)菌、哺乳動物、酵母和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的克隆和表達(dá)載體。在各種表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的多肽也在本盡管共導(dǎo)入宿主細(xì)胞的另一個多核苷酸序列能攜帶篩選標(biāo)記(例如，編碼被載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞生存或生長必需蛋白的基因)，但是克隆和表達(dá)載體通常含有這樣標(biāo)記基因。在篩選條件下，僅僅導(dǎo)入了可篩選基因的宿主細(xì)胞將生長。通常篩選基因可(a)提供對抗生素或其它毒素的抗性，例如，氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤；(b)互補營養(yǎng)缺陷；或(c)供應(yīng)從復(fù)合培養(yǎng)基中不能得到的至關(guān)重要營養(yǎng)物質(zhì)。適合標(biāo)記基因的選擇取決于宿主細(xì)胞，而且對于不同宿主適合的基因在這個領(lǐng)域是公知的。通常，載體也含有被宿主識別的復(fù)制系統(tǒng)。
可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建適合克隆載體，或從這個領(lǐng)域可用的大量適合克隆載體中篩選。盡管選擇的克隆載體可隨著計劃利用的宿主細(xì)胞而變化，但是通常有用的克隆載體將具有自我復(fù)制能力，可有對特定限制性內(nèi)切酶的單一靶，或可攜帶標(biāo)記基因。適合的例子包括質(zhì)粒和細(xì)菌病毒，及穿梭載體如pSA3和pAT28?？蓮纳虡I(yè)銷售商，如Clontech，BioRad，Stratagene，和Invitrogen中得到這些和其它克隆載體。
含有分離的人免疫球蛋白基因或基因片段的表達(dá)載體對于獲得產(chǎn)生抗體或抗體片段，如抗原結(jié)合片段的載體系統(tǒng)是有用的。它意味這些表達(dá)載體在宿主有機體中，或做為游離基因或做為染色體DNA整合部分必須是可復(fù)制的。適合的表達(dá)載體包括質(zhì)粒、病毒載體，包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、粘粒等。適合在真核細(xì)胞(包括酵母、禽、和哺乳動物細(xì)胞)中表達(dá)的大量表達(dá)載體在這個領(lǐng)域是公知的。表達(dá)載體的一個例子是pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)，其中轉(zhuǎn)錄是被巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子/增強子驅(qū)動的。特別有用的表達(dá)載體(系統(tǒng))是桿狀病毒/昆蟲系統(tǒng)。在桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的適合載體包括pBackPack9(Clontech)，pPbac和pMbac(Strategene)。因為在體外和體內(nèi)腺病毒載體細(xì)胞高水平表達(dá)和有效轉(zhuǎn)化，所以腺病毒載體對于導(dǎo)入基因進(jìn)入體內(nèi)組織特別有用。
也可修飾多核苷酸以包含可檢測標(biāo)記，例如用于淋巴細(xì)胞中核酸和/或相應(yīng)基因表達(dá)檢測的酶溶標(biāo)記或放射性同位素。各種廣泛適合的可檢測標(biāo)記在這個領(lǐng)域是公知的，包括熒光、放射性、酶溶或其它配體，如抗生物素蛋白/生物素，它們能給出可檢測信號。在優(yōu)選具體實施中，人們可能希望用熒光標(biāo)記或酶標(biāo)簽，如脲酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶代替放射性或其它的環(huán)境不期望的試劑。在酶標(biāo)簽情況下，公知的是比色指示劑底物，能用它提供人眼或分光光度計可見的方法，以識別與含有樣品互補核酸特異性雜交。
本發(fā)明的多核苷酸能包括附加序列，如相同轉(zhuǎn)錄單元中附加編碼序列，控制元件，如啟動子，核糖體結(jié)合位點和多聚腺苷酸化位點、在相同或不同啟動子控制下的附加轉(zhuǎn)錄單元、允許宿主細(xì)胞克隆、表達(dá)和轉(zhuǎn)化的序列，及可期望提供本發(fā)明實施方式的結(jié)構(gòu)等任何這類結(jié)構(gòu)。此外，多核苷酸可以與其它期望序列融合以擴(kuò)大由此產(chǎn)生多肽的免疫反應(yīng)，或有利于多肽純化。
本發(fā)明多肽包括被上述多核苷酸群編碼的免疫球蛋白鏈或它們片段的群體。優(yōu)選免疫球蛋白片段包含整個免疫球蛋白序列的部分，但保留抗原結(jié)合特異性。特定優(yōu)選抗原結(jié)合片段是單鏈V區(qū)片段(“scFV”)。單鏈V區(qū)片段通過用短連接肽連接L和/或H鏈的V區(qū)產(chǎn)生。Bird et al.，(1998)Science 242423-426。任何有充分可靈活性和長度的肽都可用作scFV的接頭。通常選擇在宿主細(xì)胞中有極少到無免疫原性的接頭。接頭肽的一個例子是(GGGGS)3，它跨一個V區(qū)羧基末端和另一個V區(qū)氨基末端間大約3.5nm。也可用其它的接頭序列，而且其也能提供附加功能，如結(jié)合藥物或固體載體的手段。
可通過任何聯(lián)合形式利用H或L鏈所有或任何部分。通常，免疫球蛋白的整個V區(qū)被包括在scFV中。例如，L鏈V區(qū)可與H鏈V區(qū)連接?？蛇x地，L鏈V區(qū)的一部分可與H鏈V區(qū)或它的一部分連接?？梢钥紤]在scFV中H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)源于不同的免疫球蛋白?？赡軜?gòu)建雙相scFV，其中一個組分源于本發(fā)明選擇的B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白，另一個組分是不同的多肽，如T細(xì)胞表位。
可通過重組或合成產(chǎn)生scFVs。對于scFV合成產(chǎn)生，可用自動合成儀。對于scFV重組產(chǎn)生，含有編碼scFV多核苷酸的適合質(zhì)粒可被導(dǎo)入適合宿主細(xì)胞中，該宿主細(xì)胞或是真核的，如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞，或是原核的，如大腸桿菌(E.coli)，而且可用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離多核苷酸表達(dá)的蛋白質(zhì)。
對于scFV產(chǎn)生特別有用的系統(tǒng)是在E.coli中的質(zhì)粒pET-22b(+)(Novagen，Madison，WI)。pET-22b(+)包含由6個順序組氨酸殘基組成的鎳離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域可使表達(dá)蛋白質(zhì)在適合的親和樹脂上被純化。另一個適合載體的例子是pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)，如上所述。
表達(dá)條件應(yīng)確保scFV采取功能性的，優(yōu)選地，最優(yōu)的三級結(jié)構(gòu)。取決于所用質(zhì)粒(特別是啟動子的活性)和宿主細(xì)胞，可能必需調(diào)節(jié)產(chǎn)率。例如，用弱啟動子，或在較低溫度下表達(dá)，對優(yōu)化在原核系統(tǒng)中正確折疊的scFV產(chǎn)生可能是必要的，優(yōu)選地，可在真核細(xì)胞中表達(dá)scFV。
本發(fā)明也包含與化學(xué)功能性部分綴合的人單克隆抗體或它的片段。通常，這個部分是可產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記。這些綴合的抗體是有用的，例如，在靶抗原檢測中。大量適合標(biāo)記在這個領(lǐng)域是公知的，包括但不限于，放射性同位素、酶和熒光化合物。這個部分可被共價連接到抗體上，重組連接，或通過第二試劑如第二抗體、蛋白質(zhì)A、或生物素-抗生物素蛋白復(fù)合物綴合到抗體上。
其它功能性部份包括信號肽、增強免疫反應(yīng)性的因子、有利于偶聯(lián)固體載體的因子、疫苗載體、生物應(yīng)答修飾因子和藥物。信號肽是短序列，通常存在于N-末端，而且引導(dǎo)源于細(xì)胞的蛋白質(zhì)的分泌。增強免疫反應(yīng)性的因子包括，但不限于細(xì)菌超抗原。有利于偶聯(lián)固體載體的因子包括但不限于生物素、抗生素蛋白。免疫原載體包括，但不限于任何生理上可接受的緩沖劑。生物反應(yīng)修飾劑包括細(xì)胞因子、特別是腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-4、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和γ-干擾素。
適合的藥物部分包括抗瘤劑。這些包括但不限于放射性同位素、長春花生物堿，如長春布寧、長春新堿和長春地辛硫酸鹽、阿酶素、博來酶素硫酸鹽、卡鉑、順鉑、環(huán)磷酰胺、阿糖胞嘧啶、甲氮咪胺、duanorubicin鹽酸鹽、鹽酸阿霉素、足葉乙甙、氟尿嘧啶、環(huán)己亞硝脲、鹽酸氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥、巰基嘌呤、氨甲蝶呤、絲裂霉素、氯苯二氯乙烷、戊咪二氮、雙溴丙酰哌嗪、鹽酸甲(基)芐肼、鏈脲霉素、紫杉醇、硫鳥嘌呤和尿嘧啶氮芥。
免疫毒素，包括可通過重組方法產(chǎn)生的單鏈分子。各種免疫毒素的產(chǎn)生在這個領(lǐng)域是公知的，而且方法可參見，例如，“MonoclonalAntibody-toxin ConjugatesAiming the Magic Bullet，”Thorpe etal.(1982) Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine，AcademicPress，pp 168-190；Vitatta(1987)Science 2381098-1104；和Winter and Milstein(1991)Nature 349293-299。適合的毒素包括但不限于蓖麻毒蛋白、放射性核素、美洲商陸抗病毒蛋白、假單胞菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白A鏈、真菌毒素如局限曲菌素和磷脂酶。一般地，參看“Chimeric Toxins”，Olshes andPihl，Pharmac.Ther.15355-381(1981)；和“MonoclonalAntibodies for Cancer Detection and Therapy”，eds.Baldwin andByers，pp.159-179，224-266，Academic Press(1985)。本發(fā)明組合物的用途本發(fā)明的多核苷酸和基因遞送載體有幾種用途。例如它們在產(chǎn)生與特異性抗原起免疫反應(yīng)的人單克隆抗體和它們的片段的表達(dá)系統(tǒng)中是有用的。它們做為雜交探針檢測生物樣品中編碼期望人單克隆抗體的免疫球蛋白基因存在是有用的。而且，多核苷酸做為引物完成期望多核苷酸擴(kuò)增是有用的。本發(fā)明多核苷酸在包括疫苗的藥物組合物和基因治療中也是有用的。本發(fā)明具體實施的抗體和多核苷酸提供了用于標(biāo)準(zhǔn)診斷方法中的特異性試劑。特別地，它們的免疫反應(yīng)片段可用在免疫檢測中，檢測靶抗原。為了進(jìn)行本發(fā)明的診斷方法，本發(fā)明組合物之一被提供做為試劑，檢測與它起反應(yīng)樣品中的靶抗原。通過從將要測定診斷參數(shù)的個體中獲得適合生物樣品提供靶抗原。相關(guān)生物樣品是懷疑含有靶的細(xì)胞或組織樣品。進(jìn)行免疫檢測的方法在這個領(lǐng)域是很明確的，因此在此不詳述。
通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的人單克隆抗體也可有治療或預(yù)防人疾病的用途。單克隆抗體也可用于調(diào)節(jié)如下靶抗原的活性，該靶抗原在疾病的發(fā)育和/或發(fā)展中起重要作用。例如，人源化抗-Her2抗體，商業(yè)上可得到，商標(biāo)是HERCEPTIN，它選擇性抑制人乳腺癌細(xì)胞生長，現(xiàn)在被用做治療大量過量表達(dá)乳腺癌抗原Her2的乳腺癌患者。因此，本發(fā)明人單克隆抗體也可被檢測它們擴(kuò)大或抑制靶抗原生物活性的能力。
雖然本發(fā)明已經(jīng)公開了源于人細(xì)胞的人單克隆抗體，顯而易見，對于這個領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，通過本發(fā)明公開的技術(shù)，本發(fā)明也可用于制備源于除了人以外其它哺乳動物的單克隆抗體。
下面實施例提供了本發(fā)明代表性單克隆抗體的制備、表征和用途。這些實施例并不意味著以任何方式限制本發(fā)明。
實施例實施例1外周血淋巴細(xì)胞的分離從國家血液庫(National Blood Bank)得到的“血沉棕黃層”中分離人淋巴細(xì)胞。“血沉棕黃層”用1體積無Ca++/Mg++的PBS稀釋。稀釋的血沉棕黃層在每50ml離心管中10ml LYMPHOPREPTM分離介質(zhì)(密度1.077g/ml，Nycomed Pharma As，Oslo，Norway)中被仔細(xì)分層，20℃，800g離心，30分鐘。離心后，當(dāng)紅血細(xì)胞沉淀在離心管底部時，淋巴細(xì)胞在LYMPHOPREPTM溶液中形成了白色帶。收集淋巴細(xì)胞到新鮮離心管中，用PBS洗兩次。每個制備中淋巴細(xì)胞的產(chǎn)量在3-5×108間。分離的淋巴細(xì)胞或立即用于特異性B細(xì)胞篩選，或與抗原/目的抗原培養(yǎng)約24-48小時后用于特異性B細(xì)胞篩選。實施例2體外用目的抗原免疫/活化B淋巴細(xì)胞通過這個方法，在篩選前用抗原活化特異性B細(xì)胞。上面分離的淋巴細(xì)胞在體外用免疫介質(zhì)(F12/DMEM，用10μg/ml胰島素，10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，10nM硒，3nM孕酮，2.5mg/ml商陸促細(xì)胞分裂劑，10ng/ml IL-2補充)稀釋到濃度為107細(xì)胞/ml。細(xì)胞然后平鋪在對其形成單克隆抗體的單層細(xì)胞上。我們用人胎兒腦初級細(xì)胞系(primary cell line)、人胎兒卵巢細(xì)胞系、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCC保藏號CCL185)，及成人神經(jīng)鞘細(xì)胞系。
用前述用于鼠神經(jīng)上皮細(xì)胞的修改方法，從妊娠8周的胎兒腦中培養(yǎng)人胎兒腦初級細(xì)胞系。參見，例如，Li，R.H.et al.Endocrine15 205-217(1996)。在用胰島素(5μg/ml，Sigma cat.No.I0259)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(10μg/ml，Sigma cat.#T4132)、硒化鈉(10nM，Sigmacat.#S5621)、孕酮(3nM，Sigma cat.#P0130)、α-維生素E、毛猴素(3μM，Calbiochem，cat.#344270)、表皮生長因子(10ng/ml，Life Technologies，cat.#13247051)、牛血漿纖連蛋白10μg/ml(Sigma cat.#F1141)，及30％神經(jīng)鞘細(xì)胞的條件培養(yǎng)基補充的無血清培養(yǎng)基F12/DMEM中在層粘連蛋白(Life Technologies，cat.#23017015)包被平板上保存細(xì)胞。
用在待決美國專利申請09/545,659中公開方法得到人胎兒卵巢細(xì)胞系，這個申請全部內(nèi)容作為整體并入了參考文獻(xiàn)中。
通過這個領(lǐng)域普通技術(shù)人員，利用下面在Li，et al.Journal ofNeuroscience 162012-2019(1996)中概述方法獲得成人神經(jīng)鞘細(xì)胞系。實施例3篩選有期望抗原結(jié)合特異性的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞在篩選抗特定抗原的B淋巴細(xì)胞前，在無血清培養(yǎng)基中用0.25％膠原酶/dispase與淋巴細(xì)胞一起溫育30分鐘，以清潔淋巴細(xì)胞表面。為了減少B細(xì)胞選擇性結(jié)合期間的細(xì)胞聚集，并除去結(jié)合在B細(xì)胞表面的抗原，特別對于在體外免疫期間曾暴露給抗原的細(xì)胞，這步是重要的。然后用無血清介質(zhì)洗細(xì)胞兩次除去殘留的酶。計數(shù)洗凈的細(xì)胞，在無血清介質(zhì)中稀釋密度為107細(xì)胞/ml，準(zhǔn)備進(jìn)行淘選。
在無血清培養(yǎng)基中以大約5％到100％的鋪滿接種單層細(xì)胞進(jìn)行篩選過程。加淋巴細(xì)胞懸浮液到單層中，37℃溫育1小時，使B細(xì)胞通過它們表面免疫球蛋白的特異性識別與它們的特異抗原結(jié)合。每約15分鐘，輕輕進(jìn)行攪拌培養(yǎng)物以混合細(xì)胞。溫育后，用無Ca++/Mg++的PBS從靶細(xì)胞單層中沖洗除去游離淋巴細(xì)胞，收集，1500rpm，離心10分鐘。
通過暴露于UV輻射35分鐘殺死游離淋巴細(xì)胞，其中用短波UV(254nm)30分鐘，在10cm距離內(nèi)用UVGL-58。培養(yǎng)中，UV處理的淋巴細(xì)胞在3天內(nèi)死亡，而且用做篩選的B淋巴細(xì)胞克隆生長的飼養(yǎng)細(xì)胞。經(jīng)過沖洗結(jié)合在靶細(xì)胞單層上的保留B細(xì)胞是在它們細(xì)胞表面有特異性免疫球蛋白的B細(xì)胞。這些細(xì)胞被命名為“篩選的B淋巴細(xì)胞”。然后，在37℃，通過在有0.02％EDTA的PBS中溫育15分鐘，細(xì)胞和靶單層細(xì)胞一起從培養(yǎng)皿中被釋放。收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基沖洗。實施例4篩選的B細(xì)胞的克隆擴(kuò)增在用胰島素(10μg/ml)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(10μg/ml)，硒(10nM)，孕酮(3nM)，商陸促細(xì)胞分裂劑(2.5μg/ml)，IL-2(10ng/ml)和滅活的胎兒牛血清(5％)補充的F12/DMEM培養(yǎng)基中，在96孔組織培養(yǎng)微量滴定板上接種篩選的B細(xì)胞。胎兒牛血清的添加是可選的。這個培養(yǎng)基可支持篩選前以前激活的B細(xì)胞克隆擴(kuò)增。在一個96孔板上接種每108起始淋巴細(xì)胞篩選的B細(xì)胞。對于從淋巴細(xì)胞庫中篩選的，沒有被抗原預(yù)先選擇活化的B淋巴細(xì)胞，添加飼養(yǎng)細(xì)胞，飼養(yǎng)細(xì)胞或是用UV輻射的淋巴細(xì)胞(106細(xì)胞/孔)，或是人肝臟基質(zhì)細(xì)胞。兩種飼養(yǎng)細(xì)胞都支持B細(xì)胞增殖。在37℃，5％CO2中培養(yǎng)細(xì)胞。3天后，培養(yǎng)基被改變一半。在培養(yǎng)末期，通常是6-10天，或固定培養(yǎng)物進(jìn)行免疫組織化學(xué)，或用培養(yǎng)物進(jìn)行總RNA提取。
實施例5免疫組織化學(xué)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析確定擴(kuò)增的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞保持有產(chǎn)生抗體的能力。2500rpm，離心96孔板上的培養(yǎng)物10分鐘。小心除去培養(yǎng)基，立刻用乙醇(-20℃)固定，空氣中干燥。然后，室溫下，在100％乙醇中，用3％H2O2處理固定的培養(yǎng)物30分鐘以滅活內(nèi)源過氧化物酶活性，接著用PBS輕洗3次除去殘余H2O2。培養(yǎng)物與用10％胎兒牛血清和0.1％吐溫20在PBS中以1∶100比例稀釋的綴合人κ輕鏈抗體的辣根過氧化物酶(Sigma，Cat#A7164)溫育。室溫下溫育2小時后，用PBS洗培養(yǎng)物3次，用新制備的Milli-Q水洗兩次。最后，用在pH5.05，H2O2(0.003％)的乙酸鈉緩沖液中制備的辣根過氧化物酶底物二氨基聯(lián)苯胺(1mg/ml)與培養(yǎng)物溫育5分鐘。在溫育末期，用水洗培養(yǎng)物，在顯微鏡下檢查。表達(dá)κ輕鏈的B細(xì)胞被染成紅褐色。計數(shù)含有κ輕鏈陽性集落孔數(shù)和每孔中陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明不同制備中，含有κ輕鏈陽性集落孔比例變化很大，從0到95％。變化取決于淋巴細(xì)胞的單個供體，因此是預(yù)料中的。集落平均大小是約20個細(xì)胞。最大集落有100個細(xì)胞。
實施例6免疫球蛋白基因的分離用Qiagen Mini-spin總RNA分離試劑盒從培養(yǎng)物每個孔中提取總RNA。最后洗脫物體積是30μl?；蛴幂p鏈反轉(zhuǎn)錄引物(ctc tcc cct gttga)，或用重鏈反轉(zhuǎn)錄引物(agt ttt gtc aca aga)(1μM)，在4.6μl總RNA樣品，20mM Tris，pH8.3，100mM KCl，5mM MgCl2，1mM每種脫氧核糖核苷酸(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)，25單位RNA酶抑制劑，和10單位AMV反轉(zhuǎn)錄酶組成的10μl反應(yīng)混合物中，用第一條鏈cDNA合成試劑盒合成第一條鏈cDNA。在設(shè)定為37℃、10分鐘，42℃、60分鐘，99℃、10分鐘熱循環(huán)儀中進(jìn)行這個反應(yīng)。
用簡并引物(gga gaa ata gtg atg ac(c/t/g)cag(t/a)ct c)，1單位Taq聚合酶，和1單位DNA聚合酶的Klenow片段合成第二條輕鏈cDNA鏈。37℃下進(jìn)行反應(yīng)10分鐘，然后以每分鐘2℃速率升高溫度到50℃，最后72℃1分鐘。用加入擴(kuò)增引物(tca ctc tcc cct gttgaa gct ctt)和50μl的10mM Tris，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2反應(yīng)混合物稀釋液，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)完成輕鏈擴(kuò)增。95℃、30秒，63℃、60秒，72℃、20秒，進(jìn)行45個循環(huán)PCR。在循環(huán)末期，最后延伸可在72℃下進(jìn)行7分鐘。PCR產(chǎn)物在Tris-硼酸EDTA緩沖液中0.1％瓊脂糖凝膠上，在75伏電壓下分離5小時。預(yù)測的輕鏈產(chǎn)物大小是約630bp。
重鏈的合成和擴(kuò)增與輕鏈相似。在第二個鏈合成期間，引物(ct cagtgt cag atc ctc a(c/t)c atg g)被退火到重鏈起始密碼子位點。對于PCR，用擴(kuò)增引物(tca agt ttt gtc aca aga ttt ggg ctc aa)。熱循環(huán)儀設(shè)定與輕鏈?zhǔn)峭瑯拥摹?br> 實施例7PCR產(chǎn)物的克隆擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。切下預(yù)測大小的cDNA條帶，用Qiagen凝膠純化試劑盒純化。立刻用購自Promega的TA克隆試劑盒，連接重鏈cDNA到pTarge T載體上，4℃過夜。對于輕鏈，通過第2輪PCR連接信號肽cDNA(所用引物atg gaa acc cca gct cag ctt ctc ttc ctc cta cta ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtgatg ac和tca gtt gaa gct ctt tgt gac)到5’-端(prime)，而且再一次用凝膠純化試劑盒純化產(chǎn)物。最終產(chǎn)物被連接到pTarge T載體上。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到大腸桿菌的J109株系中，而且接種在LB/氨芐青霉素/x-Gal/IPTG平板中。在37℃過夜培養(yǎng)平板。正常地，每個平板產(chǎn)生幾百個白色克隆。實施例8免疫球蛋白cDNA在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)pTarge T載體含有允許在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)cDNA插入物的CMV啟動子，進(jìn)行原核表達(dá)的T7啟動子，及編碼G418抗性的neo基因。為了證實來源于B細(xì)胞的免疫球蛋白mRNA被成功擴(kuò)增和克隆進(jìn)pTarge T質(zhì)粒，從生長在上述每個LB平板上約200個白色菌落庫中提取小量制備質(zhì)粒DNA。然后，用Gibco BRL的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA進(jìn)入COS細(xì)胞。簡而言之，在100μl F12 DMEM中稀釋1μg質(zhì)粒DNA，而且在100μl F12/DMEM中稀釋5μg脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑。為了制備轉(zhuǎn)染混合物，兩種溶液立刻被混合在一起，室溫下放置15分鐘。然后用800μl F12/DMEM稀釋混合物，涂層在有50％鋪滿的COS細(xì)胞單層上，用無血清培養(yǎng)基沖洗。在37℃，COS細(xì)胞與轉(zhuǎn)染混合物溫育4小時。然后除去轉(zhuǎn)染混合物，用無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞一次，用具有10％血清的F12/DMEM飼養(yǎng)。24小時后，用PBS洗培養(yǎng)物，用乙醇固定，進(jìn)行培養(yǎng)物的免疫細(xì)胞化學(xué)。
一旦鑒定出表達(dá)免疫球蛋白的COS細(xì)胞，接著，質(zhì)粒庫被再次轉(zhuǎn)染進(jìn)COS細(xì)胞以分離特異性集落。用PCR，抗體檢測的原核表達(dá)，及哺乳動物表達(dá)被用于篩選特異性克隆。當(dāng)從單獨B細(xì)胞克隆中克隆出重鏈和輕鏈時，重鏈和輕鏈亞克隆進(jìn)含有Fc片段的載體后，在哺乳動物細(xì)胞中共表達(dá)重鏈和輕鏈以產(chǎn)生或直接作為Fab，或作為整個免疫球蛋白的人單克隆抗體。可建立連續(xù)產(chǎn)生人抗體的穩(wěn)定細(xì)胞系。
實施例9制備抗人胎兒胰腺細(xì)胞的人抗體B細(xì)胞的培養(yǎng)從血沉棕黃層中通過LYMPHOPREPTM層離心(1500rpm，30分鐘)分離人淋巴細(xì)胞。用PBS通過1500rpm，10分鐘離心沖洗淋巴細(xì)胞。大約5×108淋巴細(xì)胞被加入hPED細(xì)胞鋪滿的新鮮平板(100mm皿)中，hPED細(xì)胞已在無血清培養(yǎng)基中被沖洗。hPED細(xì)胞是人胎兒胰腺祖細(xì)胞，可通過公開在共同待決美國專利申請09/546,577中的方法獲得人胎兒胰腺祖細(xì)胞，這個申請內(nèi)容作為整體并入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。37℃下，溫育培養(yǎng)物1小時使得B細(xì)胞與hPED細(xì)胞結(jié)合。溫育后，用PBS沖洗細(xì)胞培養(yǎng)物平板5次以除去游離白血細(xì)胞。離心收集游離淋巴細(xì)胞，在10ml無血清F12/DMEM中重懸浮，分在兩個100mm皿中。放置平板在Stratalinker(購自Stratagene的UV連接儀)，而且以高能量設(shè)置與蓋子一起被暴露于UV光中15分鐘。UV輻射的細(xì)胞被用作飼養(yǎng)層，用于結(jié)合的B細(xì)胞培養(yǎng)。通過在37℃，0.02％EDTA/PBS中溫育結(jié)合的B細(xì)胞和單層hPED細(xì)胞15分鐘，結(jié)合的B細(xì)胞和單層hPED細(xì)胞被從平板中脫離出來。然后，1500rpm，離心10分鐘收集細(xì)胞，而且涂抹在3個96孔平板上。每個孔含有150μl用5％牛血清，IL-2(10ng/ml)，商陸促細(xì)胞分裂劑(2.5μg/ml)及從游離白血細(xì)胞中制備的UV輻射的飼養(yǎng)細(xì)胞補充的F12/DMEM。在培養(yǎng)的第3天，除去一半培養(yǎng)基(即，從150μl總體積中除去75μl)，用同樣體積如第1天一樣培養(yǎng)基取代。在第6天，用乙醇固定一個平板，用抗人κ鏈免疫組織化學(xué)染色。幾乎每個培養(yǎng)孔中都含有Igκ集落。在第7天，用Qiagen RNeasy試劑盒(Cat No.74104)提供的溶解緩沖液溶解其它兩個平板中細(xì)胞，并冷凍在-80℃。
從B細(xì)胞集落中克隆免疫球蛋白cDNA從B細(xì)胞集落中克隆免疫球蛋白基因的測略是基于以細(xì)胞表面展示系統(tǒng)。用這個方法，如下面更充分詳述的，重鏈和輕鏈都是從第一條鏈cDNA中被擴(kuò)增，第一條鏈cDNA是從B細(xì)胞集落制備的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的。通過限制性位點Bgl II和Sal I，克隆重鏈進(jìn)入pDisplay(Invitrogen cat no.V660-20)。重鏈Fd區(qū)域作為融合蛋白表達(dá)，包含有血細(xì)胞凝集素A-Fd-myc-PDGF跨膜結(jié)構(gòu)域(Fd區(qū)域指免疫球蛋白重鏈從N-末端到鉸鏈范圍)。通過這個策略，重鏈在B細(xì)胞表面被展示。然而，輕鏈作為分泌蛋白在pTarge T載體中表達(dá)。因此，輕鏈和重鏈共表達(dá)在細(xì)胞表面產(chǎn)生了Fab。通過宿主細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合證實了Fab與它的抗原特異性結(jié)合。同時，從細(xì)胞表面提取Fab融合蛋白檢測特異性結(jié)合。
更詳而言之，用Qiagen RNeasy試劑盒(Cat No.74104)從一個平板中提取總RNA。在10/3/2000，用Promega cDNA合成試劑盒(catNo.A3500)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。如下制備每個樣品的反應(yīng)混合物

總反應(yīng)體積是20μl，65℃下變RNA樣品5分鐘，使用前立刻在冰上冷卻。
反應(yīng)混合物被放在熱循環(huán)儀中(Genius型，Techne制造)，而且參數(shù)如下25℃、10分鐘，42℃、30分鐘，99℃、10分鐘，用Qiagen熱起始DNA聚合酶擴(kuò)增特異性cDNA。
如下面表格中所說明制備PCR反應(yīng)混合物

重鏈引物組HHR1gccagatctcccgtkgtgcagtcyggrscwgaggtgHHF1ttcgtcgacctgtttgtcacaagatttgggctcaa其中，y＝c或t，w＝a或t，s＝c或g，ra或g，k＝t或g.
用Gibco BRL常規(guī)制備引物。在熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR，其中在95℃起始變性2分鐘，接著95℃、30秒，55℃、30秒，72℃、30秒進(jìn)行45個循環(huán)，最后在72℃下延伸7分鐘。
在1％的瓊脂糖凝膠上電泳分離產(chǎn)物，用Qiagen的凝膠純化試劑盒(cat.No.28706)純化DNA片段。在50μl EB緩沖液中洗脫DNA。用限制性酶消化純化的cDNA片段。加下列試劑到50μlDNA樣品中6.5μl 10×緩沖液H和5μl Sal I(cat no.567 663，10單位/μl)，5μl Bal II(cat no.567 639，10單位/μl)。兩種酶均購自Roche Molecular Biochemicals。37℃溫育反應(yīng)混合物1小時。在反應(yīng)末期，用PCR純化試劑盒(cat.No.28106)純化反應(yīng)混合物，并用試劑盒提供的30μl洗脫緩沖液洗脫。
質(zhì)粒pDisplay購自Invitrogen。為了擴(kuò)增質(zhì)粒，溶解20μg質(zhì)粒DNA于200μl pH7.0的Tris-EDTA中。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞(Promega pTarge T載體系統(tǒng)cat.No，A1410)，而且涂抹在LB/氨芐青霉素(100μg/ml)平板中。篩選單菌落，而且在25ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長過夜。用Qiagen-midi-prep試劑盒分離質(zhì)粒DNA。在緩沖液H中，用200單位的Sal I和Bal II消化約100μg分離質(zhì)粒DNA4小時。消化的DNA在1％瓊脂糖凝膠上被分離2次，用凝膠試劑盒純化(Qiagen cat.#2806)。純化的pDisplay Sal I/Bal II片段在分散等份中被分散，用之前貯藏在-80℃。
用T4 DNA連接酶(Promega，cat.No.M1794)在供應(yīng)商提供的連接緩沖液中10×(300mM tris-HCl(PH7.80)，100mM MgCl2，100mMDTT，10mM ATP)連接重鏈cDNA片段到pDisplay Sal I和Bal II，過夜。連接的DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，并涂抹在氨芐青霉素/LB平板上。背景氨芐青霉素抗性克隆數(shù)約2-3個克隆，如在同樣條件下通過質(zhì)粒DNA單獨連接所測定的一樣。從每個培養(yǎng)皿中，收集10個克隆，生長在5ml LB/氨芐青霉素中，過夜。用Qiagen-mini-prep試劑盒(cat.No.27106)分離質(zhì)粒DNA。
通過兩個PCR反應(yīng)擴(kuò)增輕鏈cDNA。第一個循環(huán)用輕鏈引物組進(jìn)行g(shù)gagaaatagtgatgacbcagwctc，和tcactctcccctgttgaagctctt，其中w＝a或t，b＝t或c或g。凝膠純化PCR產(chǎn)物，在5’末端結(jié)合信號序列進(jìn)行第二個循環(huán)PCR。所用引物是atg gaa acc cca gcg cag cttctc ttc ctc ctg cta ctc tgg ctc cca gtt tca gat acc act gga gaaata gtg atg ac，和tca gtt gaa gct ctt tgt gac。熱循環(huán)儀設(shè)定是起始在95℃、2分鐘，50℃、3分鐘，72℃、30秒，接著95℃、30秒，55℃、30秒，72℃、30秒進(jìn)行40個循環(huán)。產(chǎn)物再一次被凝膠純化，連接到pTarge T哺乳動物表達(dá)載體上(PromegapTarge T載體系統(tǒng)cat.No，A1410)。轉(zhuǎn)化連接到DNA進(jìn)入JM109細(xì)胞中。在LB/氨芐青霉素平板上過夜培養(yǎng)后，收集10個克隆進(jìn)行質(zhì)粒DNA小量制備。
篩選特異性抗體輕鏈cDNA庫和它們各自重鏈cDNA共轉(zhuǎn)染CHO-k1細(xì)胞以表達(dá)細(xì)胞表面展示的抗體。CHO-k1細(xì)胞系購自Bio-Whitaker’s，并生長在有5％胎兒牛血清的F12/DMEM中。為了轉(zhuǎn)染35mm皿CHO細(xì)胞，從B細(xì)胞克隆中制備輕鏈cDNA和它們各自重鏈cDNA，每輕鏈cDNA和它們各自重鏈cDNA 1μg(在100μl F12/DMEM培養(yǎng)基中)與100μl含有7μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco BRL cat no.1081302)的F12/DMEM混合?？稍谑覝叵路胖没旌衔?0分鐘以形成脂質(zhì)。然后用0.8ml F12/DMEM稀釋混合物，加入到已用無血清培養(yǎng)基沖洗過的CHO細(xì)胞單層中。在除去轉(zhuǎn)染混合物前，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物4小時，用5％胎兒牛血清補充的F12/DMEM飼養(yǎng)細(xì)胞。
培養(yǎng)24小時后，用PBS沖洗轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，并在37℃，用無Ca2++和Mg2++、有0.02％EDTA的PBS溫育15分鐘。用吸量管輕輕吹打，細(xì)胞與培養(yǎng)皿分離。由此產(chǎn)生的細(xì)胞懸浮液1000rpm，離心10分鐘進(jìn)行沉淀。除去上清液后，在無Ca2++，Mg2++，有0.02％EDTA和0.5％BSA的PBS中重懸浮細(xì)胞沉淀。
室溫下，生長在35mm皿中的單層hPED細(xì)胞，在3％蔗糖溶液中0.125％戊二醛中固定1小時。用PBS洗固定的細(xì)胞3次，在37℃，在0.1M NH4HCO3溶液的1％BSA中封閉1小時。再一次在PBS中洗固定的細(xì)胞。為了檢測在CHO細(xì)胞表面表達(dá)的抗體是否與hPED細(xì)胞結(jié)合，加入上面制備的轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞懸浮液到固定的hPED細(xì)胞，并在4℃溫育，過夜。非結(jié)合的細(xì)胞用流動的PBS洗去。結(jié)合的細(xì)胞或立刻被固定在原位置，或在用乙醇固定前，用PBS中0.2％Triton X-100(Sigamacat no.T9284)溶解。固定的培養(yǎng)物再一次在正常羊血清(PBS中5％)中被封閉，并在4℃溫育在抗人IgG(H+L)-過氧化物酶(SouthernBiotechnology Associates，Inc.，Cat.No.6005-05，以1∶100稀釋)中，過夜。溫育后，用PBS洗細(xì)胞3次，用Milli-Q水洗2次，每次5分鐘。沖洗后，在室溫下，在0.1M pH5.05乙酸鈉緩沖液和0.003％H2O2的二氨基聯(lián)苯胺(1mg/ml，Sigama cat.No.D5637)中溫育細(xì)胞20分鐘。檢測了從20孔B細(xì)胞擴(kuò)增的20組輕鏈和重鏈cDNA后，發(fā)現(xiàn)3組顯示了對hPED細(xì)胞的特異性結(jié)合。圖4是3#克隆的一個例子。沒有人免疫球蛋白cDNA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系，作為對照，在這個檢測中顯示了陰性染色(A圖)。用來自于克隆3#的輕鏈和重鏈免疫球蛋白cDNA共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞結(jié)合到hPED細(xì)胞上，對人免疫球蛋白顯示了特異性染色(B圖)。為了排除共轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞是由于除了在細(xì)胞表面人抗體的特異性結(jié)合外的機理結(jié)合的可能性，在固定前，在Triton X-100溶液中溶解結(jié)合的CHO細(xì)胞。因此，僅僅特異性與hPED細(xì)胞結(jié)合的人抗體保留在原位置，而且染成褐色染色(C圖)。在CHO細(xì)胞表面表達(dá)的抗體特異性與hPED細(xì)胞結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生與期望抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的哺乳動物單克隆抗體的方法，包括(a)提供分離的哺乳動物淋巴細(xì)胞群，其包含大量非轉(zhuǎn)化的哺乳動物B淋巴細(xì)胞；(b)篩選特異性地與期望抗原結(jié)合的非轉(zhuǎn)化的哺乳動物B淋巴細(xì)胞；(c)在有利于B細(xì)胞增殖以制備大量可產(chǎn)生與期望抗原起免疫反應(yīng)的哺乳動物單克隆抗體的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆的條件下，培養(yǎng)(b)的B淋巴細(xì)胞；和(d)可選地分離非轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞克隆。
2.一種產(chǎn)生與期望抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的人單克隆抗體的方法，包括(a)提供分離的人淋巴細(xì)胞群，其包含大量非轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞；(b)篩選特異性地與期望抗原結(jié)合的非轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞；(c)在有利于B細(xì)胞增殖以制備大量可產(chǎn)生與期望抗原起免疫反應(yīng)的人單克隆抗體的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆的條件下，培養(yǎng)(b)的B淋巴細(xì)胞；和(d)可選地分離非轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞克隆。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中篩選非轉(zhuǎn)化哺乳動物B淋巴細(xì)胞包括在有利于B淋巴細(xì)胞與期望抗原特異性結(jié)合的條件下，用期望抗原接觸哺乳動物淋巴細(xì)胞群，和將與期望抗原結(jié)合的B淋巴細(xì)胞與未結(jié)合的B淋巴細(xì)胞分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中篩選非轉(zhuǎn)化人B淋巴細(xì)胞包括在有利于B淋巴細(xì)胞與期望抗原特異性結(jié)合條件下，用期望抗原接觸人淋巴細(xì)胞群，和將與期望抗原結(jié)合的B淋巴細(xì)胞與未結(jié)合的B淋巴細(xì)胞分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，進(jìn)一步包括(e)從(d)中分離的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆中分離包含編碼人單克隆抗體重鏈抗原結(jié)合片段的序列的多核苷酸；(f)從(d)中分離的非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆中分離包含編碼人單克隆抗體輕鏈抗原結(jié)合片段的序列的多核苷酸；和(g)表達(dá)(e)和(f)的多核苷酸以產(chǎn)生人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述序列編碼選自雙特異性抗體、嵌合抗體、Fab、F(ab’)2、單鏈V區(qū)片段(scFV)和融合多肽的多肽，其中融合多肽包含與化學(xué)功能性部分綴合的抗原結(jié)合片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述部分選自信號肽，增強免疫反應(yīng)性的因子，有利于與固相載體偶聯(lián)的因子，疫苗載體，生物反應(yīng)修飾劑，毒素，可檢測的標(biāo)記和藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中增強免疫反應(yīng)性的因子是細(xì)菌超級抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中有利于與固相載體偶聯(lián)的因子選自生物素和抗生物素蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中生物反應(yīng)修飾劑是細(xì)胞因子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中細(xì)胞因子選自腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素12、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和γ-干擾素。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中可檢測的標(biāo)記選自酶、放射性部分和發(fā)光部分。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中抗原是生物學(xué)或化學(xué)化合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中抗原是選自受體配體，分泌蛋白，細(xì)胞表面受體，胞質(zhì)蛋白，和核蛋白的細(xì)胞蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中抗原被提呈在完整細(xì)胞表面上。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中細(xì)胞表面無血清。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中細(xì)胞是真核細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中在宿主細(xì)胞中一個或多個基因遞送載體表達(dá)所述多核苷酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中基因遞送載體選自病毒載體、脂質(zhì)體和質(zhì)粒。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
21.一種產(chǎn)生與特定細(xì)胞類型代表性抗原特異性結(jié)合的哺乳動物單克隆抗體群的方法，包括(a)提供分離的哺乳動物淋巴細(xì)胞群，其包含大量非轉(zhuǎn)化的哺乳動物B淋巴細(xì)胞；(b)篩選特異性地與特定類型細(xì)胞結(jié)合的非轉(zhuǎn)化的哺乳動物B淋巴細(xì)胞；(c)在有利于B細(xì)胞增殖以產(chǎn)生大量非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆的條件下，培養(yǎng)(b)的B淋巴細(xì)胞，由此產(chǎn)生對特定細(xì)胞類型代表性抗原顯示結(jié)合特異性的哺乳動物單克隆抗體群。
22.一種產(chǎn)生與特定細(xì)胞類型代表性抗原特異結(jié)合的人單克隆抗體群的方法，包括(a)提供分離的人淋巴細(xì)胞群，其包含大量非轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞；(b)篩選特異性地與特定類型細(xì)胞結(jié)合的非轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞；(c)在有利于B細(xì)胞增殖以產(chǎn)生大量非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆的條件下，培養(yǎng)(b)的B淋巴細(xì)胞，由此產(chǎn)生對特定細(xì)胞類型代表性抗原顯示結(jié)合特異性的人單克隆抗體群。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，進(jìn)一步包括(d)從大量非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆中分離包含編碼哺乳動物單克隆抗體重鏈或輕鏈抗原結(jié)合片段的序列的多核苷酸群；和(e)表達(dá)該多核苷酸以產(chǎn)生哺乳動物單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的多肽群。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，進(jìn)一步包括(d)從大量非轉(zhuǎn)化B細(xì)胞克隆中分離包含編碼人單克隆抗體重鏈或輕鏈抗原結(jié)合片段的序列的多核苷酸群；和(e)表達(dá)該多核苷酸以產(chǎn)生人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段的多肽群。
25.通過權(quán)利要求21或23的方法產(chǎn)生的哺乳動物單克隆抗體群。
26.通過權(quán)利要求22或24的方法產(chǎn)生的人單克隆抗體群。
27.權(quán)利要求23或24的多核苷酸編碼的多肽群。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的多肽群，其中多肽群中至少一個多肽與化學(xué)功能性部分綴合。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的多肽群，其中所述部分選自信號肽，增強免疫反應(yīng)性的因子，有利于與固相載體偶聯(lián)的因子，疫苗載體，生物反應(yīng)修飾劑，毒素，可檢測的標(biāo)記和藥物。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的多肽群，其中增強免疫反應(yīng)性的因子是細(xì)菌超級抗原。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的多肽群，其中有利于與固相載體結(jié)合的因子選自生物素和抗生物素蛋白。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的多肽群，其中生物反應(yīng)修飾劑是細(xì)胞因子。
33.根據(jù)權(quán)利要求29的多肽群，其中細(xì)胞因子選自腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素12、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和γ-干擾素。
34.根據(jù)權(quán)利要求29的多肽群，其中可檢測的標(biāo)記選自酶、放射性部分和發(fā)光部分。
35.根據(jù)權(quán)利要求29的多肽群，其中多肽與治療性部分綴合，治療性部分選自放射性同位素、抗腫瘤劑、免疫調(diào)節(jié)劑、生物反應(yīng)修飾劑、凝集素和毒素。
36.根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其中細(xì)胞以單層形式生長。
37.根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其中細(xì)胞是胚胎或成年動物來源的。
38.根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其中細(xì)胞是外胚層、內(nèi)胚層或中胚層來源的。
39.根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其中細(xì)胞表面無血清。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中細(xì)胞生長在無血清培養(yǎng)基中。
41.根據(jù)權(quán)利要求15或22的方法，其中所述細(xì)胞感染了選自細(xì)菌、真菌、病毒和支原體(mycroplasma)的微生物。
全文摘要
本發(fā)明提供了產(chǎn)生人單克隆抗體，特別是對特定細(xì)胞類型代表性表面抗原特異的人單克隆抗體的方法。本發(fā)明也包括通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的單克隆抗體群，含有編碼能結(jié)合目的細(xì)胞類型代表性抗原的該免疫球蛋白或其片段的序列的多核苷酸群。
文檔編號C07K16/18GK1420893SQ01805699
公開日2003年5月28日 申請日期2001年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月26日
發(fā)明者李榮皓 申請人:雷文生物技術(shù)公司