專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高親和力的抗cd20單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程產(chǎn)品領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種具有高親和力的抗 CD20單克隆抗體和其在制備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，在各種疾病所致死亡中高居第二 位。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin's lymphoma, NHL)是臨床最常見(jiàn)的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤， 其中B細(xì)胞來(lái)源的約占85 %，好發(fā)于青壯年，發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)。根據(jù)病情 特點(diǎn)，NHL可分為低、中、高三度。其中低度和部分中度NHL病程進(jìn)展緩慢，統(tǒng)稱(chēng)為惰性NHL。 它們對(duì)首次化療敏感，但很容易復(fù)發(fā)或耐藥，當(dāng)再次化療或放療時(shí)，療效明顯降低，因而被 認(rèn)為是難以治愈的惡性腫瘤。近年來(lái)，單克隆抗體及其導(dǎo)向治療NHL的臨床試驗(yàn)研究取得 了重大進(jìn)展，其中被廣泛使用且富有成效的是抗CD20的單抗制劑。CD20抗原是一種B細(xì)胞 分化抗原，僅位于前B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞，它在95%以上的B細(xì)胞性淋巴瘤中表達(dá)，且表面 密度很高，而在造血干細(xì)胞、血漿細(xì)胞和其他正常組織中不表達(dá)。更為重要的是，CD20分子 在與單克隆抗體結(jié)合后，無(wú)顯著內(nèi)化及脫落，故成為治療B細(xì)胞淋巴瘤的理想靶點(diǎn)[^cchi S,Federico M,Dastoli G,Fiorani C,Vinci G,Clo V,Casolari B.Treatment of B—cell non-Hodgkin' s lymphoma with anti CD 20 monoclonal antibodyRituximab. Crit Rev Oncol Hematol，2001，37(1) :13-25]。
目前采用抗CD20抗體治療非霍奇金淋巴瘤已取得了較好的療效。 Rituxan(Rituximab, C2B8)為美國(guó)基因科技公司研制的以⑶20為靶點(diǎn)的單克隆抗體，它 是一種人鼠嵌合基因工程抗體，包含了鼠單克隆抗體的可變區(qū)基因和人抗體的恒定區(qū)基因 [Reff ME, Carner K，Chambers KS, Chinn PC，Leonard JE, Raab R，Newman RA, Hanna N， Anderson DR. Depletionof B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood. 1994,83(2) :435-45]。Rituxan 已于 1997 年 11 月獲 FDA 的批準(zhǔn) 上市，用于復(fù)發(fā)性或頑固性低度或?yàn)V泡性非霍奇金淋巴瘤的臨床治療[Leget GAiCzuczman MS.Use of rituximab, the new FDA-approved antibody. Curr Opin Oncol. 1998 ；10 548-551]。盡管C2B8抗體在臨床治療中已顯示出較好的療效，仍有52%的病人對(duì)C2B8治 療不產(chǎn)生反應(yīng)。因此，尋求更為有效用于治療B淋巴瘤的CD20抗體藥物顯得尤為迫切。
最新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，對(duì)Rituximab耐受的細(xì)胞通常變現(xiàn)為⑶20表達(dá)減低； Bcl-2 ^iifiiiii^ [Title !Development of Rituximab-Resistant LymphomaClones withAltered Cell Signaling and Cross-Resistance to Chemotherapy. Author Jazirehi, A. R. ；Vega, Μ. I. ；Bonavida, B. Source :Cancer Research，2007，67(3) 1270-1281；Title -Acquirement ofRituximab Resistance in Lymphoma Cell Lines Is Associated with Both Global CD20 Gene andProtein Down-Regulaion Regulaed at the Pretranscriptional and Posttranscriptional Levels. Author :Czuczman， M. S. ；Ole jniczak, S. ；Gowda, A.(…)Source :Clinical Cancer Research，2008，14 (5)1561-1570]。而抗體親和力的提高能夠增強(qiáng)抗體的特異性，提高檢測(cè)靈敏度，增強(qiáng)抗體的功 能同時(shí)降低抗體的用量。因此，通過(guò)在臨床上廣泛使用具有較好治療效果的Rituximab的 基礎(chǔ)上，通過(guò)有限的幾個(gè)突變，顯著的提高Rituximab的親和力，從而提高Rituximab對(duì)腫 瘤的殺傷效果。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的申請(qǐng)人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建了多種具有高親和力 的抗⑶20單克隆抗體突變體。這些突變抗體與Rituximab相比具有更高的親和力活性，能 夠更加有效的識(shí)別CD20抗原。高親和力的抗CD20單克隆抗體突變體可用于制備治療B細(xì) 胞淋巴瘤的藥物。與Rituximab相比，突變抗體親和力提高，抗體特異性增強(qiáng)，對(duì)腫瘤的殺 傷效果也顯著提高。
本發(fā)明公開(kāi)了
1，一種高親和力的抗⑶20單克隆抗體，其特征在于所述抗體包括如SEQ ID NO 5 所示的C2B8重鏈可變區(qū)和/或如SEQID NO 6所示的輕鏈可變區(qū)的下述任何一個(gè)或多個(gè)氨 基酸位點(diǎn)上的氨基酸取代，所述位點(diǎn)為重鏈可變區(qū)第57、102位，輕鏈可變區(qū)第93位氨基酸 的位置。
2，上述抗CD20單克隆抗體，其特征在于所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上由谷氨酸、 賴(lài)氨酸、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸取代。
3，上述1或2所述的抗⑶20單克隆抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合⑶20的親和 力與Rituximab相比提高至少2倍。
4，上述3所述的抗⑶20單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)(VH)的 氨基酸序列為 SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :11， 或SEQ ID N0:14，輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列為SEQID NO :6或SEQ ID NO :12。
5，上述1或2所述的抗⑶20單克隆抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合⑶20的親和 力與Rituximab相比提高至少4倍。
6，上述5所述的抗⑶20單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)(VH)的 氨基酸序列為SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:11或SEQ ID N0:14，輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序 列為 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
7，上述1或2所述的抗⑶20單克隆抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合⑶20的親和 力與Rituximab相比提高至少10倍。
8，上述7所述的抗⑶20單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)(VH)的 氨基酸序列為SEQID NO :14，輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列為SEQ ID NO 6或SEQ IDNO 12。
9，一種制劑，含有上述1至8任一所述的抗⑶20單克隆抗體和可藥用的載體。
10，上述1至9任一所述的抗⑶20單克隆抗體或其制劑在制備抗B細(xì)胞淋巴瘤的 藥物中的用途。
11，上述10的用途，其中B細(xì)胞淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤。
12，上述11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤為低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。
13，上述10的用途，其中B細(xì)胞淋巴瘤為慢性淋巴性白血病。
更具體地，本發(fā)明的申請(qǐng)人通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，首先參照美國(guó)專(zhuān)利6，399，061公開(kāi)的 抗CD20單抗資料及序列，構(gòu)建了抗CD20嵌合抗體C2B8的輕、重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)基因，然 后通過(guò)表達(dá)、純化，獲得嵌合抗體C2B8。根據(jù)圖1所示的氨基酸突變位點(diǎn)，采用overlapPCR 的方式對(duì)嵌合抗體C2B8進(jìn)行構(gòu)建，其構(gòu)建與表達(dá)、純化的方法與未突變的嵌合抗體C2B8相 同。所述突變抗體包括重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的下述任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上 的氨基酸取代，所述位點(diǎn)為重鏈可變區(qū)第57、102位，輕鏈可變區(qū)第93位氨基酸的位置，取 代氨基酸為谷氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
對(duì)于本發(fā)明，任何合適的真核表達(dá)載體都可以使用，這些載體可以為 pcDNA3. 1 (+)，pDRl, pDHFF 之一。
本發(fā)明的申請(qǐng)人對(duì)上述C2B8突變抗體進(jìn)行了親和力檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，申請(qǐng) 人構(gòu)建的C2B8抗體的親和力與市售的Rituxiamb的親和力相似。相對(duì)于未突變的原本 C2B8抗體或市售的Rituxiamb，提高親和力程度較高的單點(diǎn)突變抗體為重鏈可變區(qū)第57 位谷氨酸或第102位賴(lài)氨酸取代的突變抗體(H57DE或H102I)，親和力提高了至少4倍左 右；重鏈可變區(qū)第102位精氨酸或絲氨酸或蘇氨酸取代的突變抗體(H102YR或H102YS或 H102YT)，親和力提高了 2倍左右；輕鏈可變區(qū)第93位精氨酸取代的突變抗體(L93NR)，其 親和力也提高了。針對(duì)上述重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的突變點(diǎn)進(jìn)行兩點(diǎn)或三點(diǎn)的組合 突變，親和力均提高了 10倍以上，最終提高親和力程度最高的組合突變抗體為重鏈可變 區(qū)第57位谷氨酸、第102位賴(lài)氨酸，以及輕鏈可變區(qū)第93位精氨酸三個(gè)突變點(diǎn)同時(shí)取代的 突變抗體(H57DE，H102YK, L93NR)。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，高親和力的C2B8突變抗體，其最佳突變位點(diǎn)為重鏈可變區(qū)第 57、102位，輕鏈可變區(qū)第93位氨基酸的位置；取代的氨基酸為谷氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、絲 氨酸或蘇氨酸，其中，最佳取代的氨基酸為谷氨酸、賴(lài)氨酸或精氨酸。并且，多個(gè)單點(diǎn)組合突 變抗體的親和力要高于單點(diǎn)突變抗體。
申請(qǐng)人還針對(duì)Rituximab突變體(C2B8突變抗體)的功能進(jìn)行研究。通過(guò)對(duì) Rituximab突變體的ADCC功能檢測(cè)，隨著Rituximab突變體親和力的提高，ADCC功能也顯 著增強(qiáng)，三點(diǎn)組合突變Rmi^8的ADCC殺傷活性顯著高于Rituximab。通過(guò)對(duì)Rituximab突 變體凋亡功能檢測(cè)，結(jié)果顯示，親和力的提高不能顯著的增加Rituximab突變體的凋亡功 能，但是三突變體RmirtS卻顯示出了較強(qiáng)的凋亡能力；雖然加入不同濃度的caspase (半胱 氨酸蛋白酶)抑制劑可以部分的抑制RmirtS引起的凋亡，但是其仍然顯示出了較強(qiáng)的促凋 亡能力。通過(guò)研究高親和力Rituximab突變體(Rmut8)對(duì)Rituximab抵制型細(xì)胞的殺傷， 結(jié)果顯示，Rmi^8不能提高對(duì)Rituximab抵制型細(xì)胞的⑶C殺傷，但是能夠引起較強(qiáng)的ADCC 殺傷；RmirtS在Rituximab抵制型細(xì)胞株上仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的促凋亡能力。通過(guò)高親和力 Rituximab突變體體內(nèi)小鼠生存實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，Rmut8不僅僅在正常的Daudi細(xì)胞處理組 顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤效果(P < 0. 001)，而且在Rituximab抵制型細(xì)胞株(Daudi-R)上，顯 示出良好的治療效果(P < 0. 01)。
本發(fā)明公開(kāi)上述高親和力的C2B8突變抗體，可以和藥學(xué)上可以接受的輔料一起 組成藥物制劑組合物從而更穩(wěn)定地發(fā)揮療效，制劑可為制藥領(lǐng)域常用的混懸、水針、凍干等 制劑，優(yōu)選水針或凍干制劑，對(duì)于本發(fā)明公開(kāi)的上述C2B8突變抗體的水針或凍干制劑，藥 學(xué)上可以接受的輔料包括表面活性劑、溶液穩(wěn)定劑、等滲調(diào)節(jié)劑和緩沖液之一或其組合，其中表面活性劑包括非離子型表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或80)； poloxamer (如poloxamer 188) ；Triton ；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂硫酸鈉；十四烷基、 亞油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics ；M0NAQUAT 等，其加入量應(yīng)使C2B8突變抗體顆?；?趨勢(shì)最小，溶液穩(wěn)定劑可以為糖類(lèi)，包括還原性糖和非還原性糖，氨基酸類(lèi)包括谷氨酸單鈉 或組氨酸，醇類(lèi)包括三元醇、高級(jí)糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其組合，溶液穩(wěn)定劑的加入 量應(yīng)該使最后形成的制劑在本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)為達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)，等滲 調(diào)節(jié)劑可以為氯化鈉、甘露醇之一，緩沖液可以為T(mén)RIS、組氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液之一。
上述制劑為包含高親和力的C2B8突變抗體的組合物，在對(duì)包括人在內(nèi)的動(dòng)物給 藥后，抗腫瘤效果明顯。具體來(lái)講，對(duì)腫瘤的預(yù)防和/或治療有效，可以作為預(yù)防和/或治 療腫瘤的藥物使用。
本發(fā)明中C2B8突變抗體及其組合物在對(duì)包括人在內(nèi)的動(dòng)物給藥時(shí)，給藥劑量因 病人的年齡和體重，疾病特性和嚴(yán)重性，以及給藥途徑而異，可以參考動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和種 種情況，總給藥量不能超過(guò)一定范圍。具體講靜脈注射的劑量是0.廣3000mg/天。
本發(fā)明公開(kāi)的C2B8突變抗體及其組合物還可以和其他的抗腫瘤藥聯(lián)合給藥，用 于腫瘤的治療，這些抗腫瘤藥包括1、細(xì)胞毒類(lèi)藥物(1)作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物烷 化劑如氮芥類(lèi)、亞硝尿類(lèi)、甲基磺酸酯類(lèi)；鉬類(lèi)化合物如順鉬、卡鉬和草酸鉬等；絲裂霉素 (MMC) ； (2)影響核酸合成的藥物二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等； 胸腺核苷合成酶抑制劑如氟尿嘧啶類(lèi)(5FU、FT-207、卡培他濱)等；嘌呤核苷合成酶抑制劑 如6-巰基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸還原酶抑制劑如羥基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制 劑如阿糖胞苷(Ara-C)和健擇(Gemz)等；(3)作用于核酸轉(zhuǎn)錄的藥物選擇性作用于DNA模 板，抑制DNA依賴(lài)RNA聚合酶，從而抑制RNA合成的藥物如放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、 表阿霉素、阿克拉霉素、光輝霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的藥物紫杉醇、泰索 帝、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春瑞濱、鬼白鹼類(lèi)、高三尖杉酯堿；( 其他細(xì)胞毒藥門(mén)冬酰胺酶主要抑 制蛋白質(zhì)的合成；2、激素類(lèi)抗雌激素三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制劑 氨魯米特、蘭特隆、來(lái)曲唑、瑞寧德等；抗雄激素氟它氨RH-LH激動(dòng)劑/拮抗劑諾雷德、依 那通等；3、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑主要通過(guò)機(jī)體免疫功能抑制腫瘤干擾素；白細(xì)胞介素-2 ；胸腺 肽類(lèi)；4、單克隆抗體Cetuximab (C225)；赫賽汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin) ；5、 其他括一些目前機(jī)制不明和有待進(jìn)一步研究的藥物；細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑如維甲類(lèi)；細(xì)胞凋亡 誘導(dǎo)劑。本發(fā)明公開(kāi)的C2B8突變抗體及其組合物可以和上述的抗腫瘤藥物之一或其組合 聯(lián)合用藥。
本發(fā)明所指的B細(xì)胞淋巴瘤，包括B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病，B細(xì)胞原淋巴細(xì)胞 淋巴瘤，濾泡淋巴瘤，毛細(xì)胞白血病，Burkitt淋巴瘤，淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤等，這里不再一一 列舉。
本發(fā)明所稱(chēng)的抗腫瘤藥物，指具有預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫 瘤生長(zhǎng)相關(guān)癥狀發(fā)展的延遲和/或這些癥狀嚴(yán)重程度的降低，它進(jìn)一步還包括已存在的腫 瘤生長(zhǎng)伴隨癥狀的減輕并防止其他癥狀的出現(xiàn)，還也減少或防止轉(zhuǎn)移。


圖1. Rituxiamb (又稱(chēng)C2B8抗體)重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中第一行序列表示Rituxiamb的重鏈、輕鏈的堿基序列，第二行序列表示氨基酸序 列。其中有下劃線的地方表示構(gòu)建突變體的突變點(diǎn)。
圖2. biacore檢測(cè)Rituxiamb及C2B8抗體突變體。不同突變體按照相同濃度，等 倍比稀釋在50μ Ι/min流速和25°C環(huán)境下進(jìn)行檢測(cè)。圖中所示為，不同C2B8抗體突變體在 相同濃度下的sensorgram圖。WT，表示申請(qǐng)人自行構(gòu)建的未突變的C2B8抗體。
圖3. Rituximab突變體結(jié)合飽和曲線。檢測(cè)125碘標(biāo)記的不同rituximab突變體 對(duì)Daudi細(xì)胞的結(jié)合飽和曲線。對(duì)不同的抗體突變體按照相同濃度等倍比稀釋?zhuān)?7°C孵育 2h，通過(guò)離心分離，檢測(cè)結(jié)合在細(xì)胞上的碘標(biāo)記的抗體片段。飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)通過(guò) 非線性最小二乘法進(jìn)行擬合并確定結(jié)合常數(shù)。
圖4. Rituximab突變體ADCC功能檢測(cè)。圖中A-D分別顯示的是E T為50 1， 25 1,5 1和1 1四種比率下，ADCC殺傷作用與不同濃度Rituximab突變體的關(guān)系。
圖5. Rituimab突變體凋亡功能檢測(cè)。圖5A顯示不同條件下的Rituximab突變 體的凋亡功能檢測(cè)結(jié)果；圖5B-C顯示加入不同濃度的caspase抑制劑ZVAD (圖5B)和 VDVAD(圖5C)后，Rituximab突變體的凋亡功能檢測(cè)結(jié)果。
圖6. Rituximab突變體對(duì)rituximab抵制型細(xì)胞株的殺傷情況。圖6A顯示Daudi 或者Daudi-R細(xì)胞與不同濃度的抗體(Rituximab或者Rmut8)作用，Rituximab抵制型細(xì)胞 株的CD20表達(dá)下降；圖6B顯示Raji-R和Daudi-R與10 μ g/mL的抗體和人補(bǔ)體(1 10) 作用的CDC殺傷情況；圖6C顯示Raji-R和Daudi-R與10 μ g/mL的抗體和PBMC (外周血單 核細(xì)胞)(E T = 40 1)作用的ADCC殺傷結(jié)果；圖6D顯示Rituximab或者Rmut8 (10 μ g/ mL)在有二抗交聯(lián)(20yg/mL的羊抗人KF(ab' )2的片段)或者無(wú)交聯(lián)的情況下的細(xì)胞 凋亡情況。
圖7.高親和力Rituximab突變體小鼠生存率實(shí)驗(yàn)。每日觀察小鼠狀況，當(dāng)出 現(xiàn)后肢癱瘓情況時(shí)，處死該小鼠。生存曲線做圖參照Kaplan-Meier的方法進(jìn)行，組間比 較采用 log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行分析[Bland JM, Altman DG. Survival probabilities (the Kaplan-Meier method). BMJ. 1998 ；317 :1572.]。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施 例不包括對(duì)傳統(tǒng)方法的詳細(xì)描述，如那些用于構(gòu)建載體和質(zhì)拉的方法，將編碼蛋白的基因 插入到這樣的載體和質(zhì)粒的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細(xì)胞的方法。這樣的方法對(duì)于本領(lǐng)域 中具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook， J.，F(xiàn)ritsch，Ε.F. and Maniais，Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual， 2nedition, Cold spring Harbor Laboratory Press.
實(shí)施例1.人抗體輕、重鏈恒定區(qū)基因的克隆
用淋巴細(xì)胞分離液(鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展公司產(chǎn)品)分離健康人淋巴細(xì)胞，用 iTrizol 試劑 Qnvitrogen 公司產(chǎn)品)提取總 RNA，根據(jù)文獻(xiàn)(Cloned human and mouse kappaimmunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments. HieterPA, Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder P. Cell. 1980Nov ；22(1 Pt 1) 197-207.)禾口文獻(xiàn)(The nucleotide sequence of a human immunoglobulin Cgamma1 gene. Ellison Jff,Berson BJ,Hood LE. Nucleic Acids Res. 1982 Jul 10 ； 10 (13) 4071-9.)報(bào)道的序列分別設(shè)計(jì)引物采用RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到PGEM-T載體(promega公司)中，測(cè)序驗(yàn)證后確 認(rèn)獲得了正確的克隆。SEQ ID NO 1和SEQID NO 2分別顯示了重鏈恒定區(qū)(CH)的核苷酸 序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4分別顯示了輕鏈恒定區(qū)(CL)的核苷酸序 列和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。
實(shí)施例2.抗⑶20嵌合抗體C2B8的表達(dá)載體構(gòu)建
參照美國(guó)專(zhuān)利6，399，061公開(kāi)的抗⑶20單抗資料及序列，委托上海生工生物工程 有限公司全基因合成抗CD20單克隆抗體C2B8重鏈可變區(qū)基因(C2B8VH)及輕鏈可變區(qū)基 因(C2B8VL)。圖1顯示了 C2B8重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列。
以C2B8VH基因和pGEM_T/CH載體為模板通過(guò)重疊PCR合成嵌合抗體重鏈基因，反 應(yīng)條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘。并使 此嵌合抗體重鏈基因的5’端含有限制酶位點(diǎn)HindIII和信號(hào)肽基因序列，3’端含有翻譯 終止密碼TAA和限制酶位點(diǎn)EcoR I。信號(hào)肽基因序列為ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTCTTCC TCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC。最后瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的條帶 并克隆到PGEMT載體中，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。挑選測(cè)序正確的克隆用HindIII和EcoR I酶 切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收嵌合抗體重鏈片段C2B8VHCH，與用HindIII和EcoR I酶切 的質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)(美國(guó)hvitrogen公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接，構(gòu)建成嵌合重鏈真核表達(dá)載 體 pcDNA3. 1(+)(C2B8VHCH)。
以C2B8VL基因和pGEM_T/CL載體為模板通過(guò)重疊PCR合成嵌合抗體輕鏈基因，反 應(yīng)條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個(gè)循環(huán)；72°C 10分鐘，得到 PCR產(chǎn)物C2B8VLCL，其5’端含有限制酶位點(diǎn)HindIII和信號(hào)肽基因序列，，3’端含有翻譯終 止密碼TAA和限制酶位點(diǎn)EcoR I。信號(hào)肽基因序列為ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATTTTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCT TCA GTC ATA ATG TCC AGA GGA。挑選測(cè)序正確的克隆 用HindIII和EcoR I酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收嵌合抗體輕鏈片段C2B8VLCL，與用 HindIII和EcoR I酶切的質(zhì)粒pcDNA3. 1載體(美國(guó)hvitrogen公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接，構(gòu) 建成嵌合輕鏈真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (C2B8VLCL)。
實(shí)施例3.嵌合抗體的穩(wěn)定表達(dá)與純化
于3. 5cm組織培養(yǎng)皿中接種3 X IO5CHO-Kl細(xì)胞(ATCC CRL-9618)，細(xì)胞培養(yǎng) 至90% -95%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染取質(zhì)粒1(^8(質(zhì)粒？00嫩3.1(+) (C2B8VHCH)4y g，質(zhì)粒 pcDNA3. 1 (C2B8VLCL) 6 μ g)禾口 20 μ 1 Lipofectamine2000 Reagent (Invitrogen 公司產(chǎn)品) 分別溶于500 μ 1無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20 分鐘以使DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成，其間用3ml無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的含血 清培養(yǎng)基，然后將形成的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入到板中，CO2孵箱培養(yǎng)4小時(shí)后補(bǔ)加2ml含 10%血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于(X)2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染進(jìn)行24h后細(xì)胞換含600 μ g/ ml G418選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆。取細(xì)胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)篩選高表達(dá)克隆羊抗 人IgG (Fe)包被于ELISA板，4°C過(guò)夜，用2% BSA-PBS于37°C封閉池，加入待測(cè)的抗性克隆 培養(yǎng)上清或標(biāo)準(zhǔn)品(Human myeloma IgGl，κ )，37°C溫育2h，加入HRP-羊抗人IgG ( κ )進(jìn) 行結(jié)合反應(yīng)，37°C溫育lh，加入TMB (四甲基聯(lián)苯胺)于37°C作用5min，最后用H2SO4終止8反應(yīng)，測(cè)A45tl值。將篩選得到的高表達(dá)克隆用無(wú)血清培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用ftOtein A親和柱 (GE公司產(chǎn)品)分離純化嵌合抗體C2B8。將純化抗體用PBS進(jìn)行透析，最后以紫外吸收法 定量確定純化后抗體的濃度。
實(shí)施例4. C2B8抗體突變體的構(gòu)建及表達(dá)
采用overlapPCR的方式進(jìn)行C2B8抗體突變體的構(gòu)建，其構(gòu)建與表達(dá)、純化的方法 與C2B8嵌合抗體相同。構(gòu)建的抗體突變體共10個(gè)，分別為Rmutl至RmutlO，突變抗體的重 鏈恒定區(qū)(CH)和輕鏈恒定區(qū)(CL)的氨基酸序列分別見(jiàn)SEQ ID NO 2和SEQID NO 4，重鏈 可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列分別見(jiàn)SEQ ID NO 5 14。
實(shí)施例5. C2B8及突變體的biacore鑒定
將SA芯片(GE公司)在50 μ 1/min的PBS溶液中25 °C平衡30min，然后用IM NaCl 50mMNa0H的活化液活化3次，每次Imin ；將biotin標(biāo)記的抗原肽(為人⑶20分子 膜外區(qū)的部分片段，制備方法請(qǐng)見(jiàn)Title :Structural Basis for Recognition of CD20 by TherapeuticAntibody Rituximab. Author :Du, J. ；Wang, H. ； Zhong, C.(…)Source: J Biol Chem,2007,282(20) :15073-15080)稀釋成終濃度為 1μ g/ml,10y 1/min 的流速包被 ARu = 1000 ；然后用PBS緩沖液50 μ 1/min平衡lOmin。將平衡后的芯片用0. 04%的生物 素溶液封閉芯片。將抗體等兩倍比稀釋五個(gè)濃度，50 μ 1/min上樣75sec，然后用PBS解離 IOmin0圖2顯示了在相同樣品濃度下biacore檢測(cè)的sensorgram圖；具體檢測(cè)親和力數(shù) 值見(jiàn)表1。其中，我們構(gòu)建的C2B8抗體的親和力與市售的Rituxiamb的親和力相似。
相對(duì)于未突變的原本C2B8抗體，提高親和力程度較高的單點(diǎn)突變抗體為=Rmutl 和Rmut5,親和力分別提高了 6. 08和3. 96倍；Rmut2, 3,4,親和力提高了近2倍。最終，親 和力提高最高的為三點(diǎn)組合突變體RmutS，其親和力最終提高了 15. 47倍。
相對(duì)于市售的Rituxiamb，提高親和力程度較高的單點(diǎn)突變抗體為=Rmutl和 Rmut5,親和力分別提高了 7. 73和5. 04倍；Rmut2, 3,4,親和力提高了 2倍多。最終，親和力 提高最高的為三點(diǎn)組合突變體RmutS，其親和力最終提高了 19. 68倍。
表1. biacore檢測(cè)抗體突變體的親和力
權(quán)利要求
1.一種高親和力的抗⑶20單克隆抗體，其特征在于所述抗體包括如SEQ ID N0:5所 示的C2B8重鏈可變區(qū)和/或如SEQ ID NO :6所示的輕鏈可變區(qū)的下述任何一個(gè)或多個(gè)氨 基酸位點(diǎn)上的氨基酸取代，所述位點(diǎn)為重鏈可變區(qū)第57、102位，輕鏈可變區(qū)第93位氨基酸 的位置。
2.權(quán)利要求1所述抗CD20單克隆抗體，其特征在于所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上由谷 氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸取代。
3.權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合CD20的親和 力與Rituximab相比提高至少2倍。
4.權(quán)利要求3所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基 酸序列為 SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO :14，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO 6或SEQ ID NO :12。
5.權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合CD20的親和 力與Rituximab相比提高至少4倍。
6.權(quán)利要求5所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸 序列為SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 14，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
7.權(quán)利要求1或2所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合CD20的親和 力與Rituximab相比提高至少10倍。
8.權(quán)利要求7所述的抗CD20單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸 序列為SEQ ID NO :14，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO 6或SEQ ID NO :12。
9.一種制劑，含有上述1至8任一所述的抗CD20單克隆抗體和可藥用的載體。
10.權(quán)利要求1至9任一所述的抗CD20單克隆抗體或其制劑在制備抗B細(xì)胞淋巴瘤的 藥物中的用途。
11.權(quán)利要求10的用途，其中B細(xì)胞淋巴瘤為非霍奇金淋巴瘤。
12.權(quán)利要求11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤為低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。
13.權(quán)利要求10的用途，其中B細(xì)胞淋巴瘤為慢性淋巴性白血病。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有高親和力的抗CD20單克隆抗體和其在制備抗腫瘤藥物中的用途。所述抗體包括C2B8重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的下述任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的氨基酸取代。這些突變抗體與Rituximab相比具有更高的親和力活性，抗體特異性增強(qiáng)，對(duì)腫瘤的殺傷效果也顯著提高。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102030826SQ20091005795
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者侯盛, 李博華, 王皓, 趙磊, 郭亞軍 申請(qǐng)人:上?？贵w藥物國(guó)家工程研究中心有限公司