專利名稱：迷迭香酸、含迷迭香酸的夏枯草有效組分及其制備方法和其在防治癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用的制作方法
迷迭香酸、含迷迭香酸的夏枯草有效組分及其制備方法和 其在防治癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬中醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及迷迭香酸及含迷迭香酸的夏枯草有效組分及其 提取分離方法和其在制備預(yù)防或治療癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
迷迭香酸(Rosmarinicacid,簡(jiǎn)稱 RosA)的化學(xué)名為 R(+) 2-((3-(3，4- 二羥基苯基-1-氧代-2丙烯基)氧基)3，4-二羥基苯丙酸丨，是一種水溶性多酚類化合物，在 植物中的分布較為廣泛，主要存在于唇形科、紫草科、葫蘆科、椴樹(shù)科、傘形科的多種 植物中，中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)CN1995007A(申請(qǐng)?zhí)?00510131U9.7，
公開(kāi)日2007 年7月11日)公開(kāi)了從含迷迭香酸的藥材中制備迷迭香酸的方法。
迷迭香酸具有抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、護(hù)肝、抗血小板和血栓、抗抑郁、防紫外 線等作用。近年來(lái)迷迭香酸在抗腫瘤方面所表現(xiàn)的作用，逐漸引起廣大研究者重視。 Miyako等研究結(jié)果表明迷迭香酸對(duì)Hela細(xì)胞、B16F10具有明顯的抑制作用，GI5tl分別為 75 μ g/ml和16 μ g/ml，而對(duì)MK-1細(xì)胞抑制作用非常弱(GI5tl為119 μ g/ml)。Kang等、 Ahn等、Yun-Gyoung等分別報(bào)道了迷迭香酸抑制淋巴細(xì)胞的增殖的不同機(jī)理。Scheckel 等研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸可以抑制COX-2活性從而可以防治結(jié)腸癌。中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明 書(shū)CN101020637A(申請(qǐng)?zhí)?00710067381.5，
公開(kāi)日2007年8月22日)公開(kāi)了一種從 植物腫節(jié)風(fēng)制備迷迭香酸的方法和由迷迭香酸、含迷迭香酸總多酚以及迷迭香酸衍生物 制備的各種藥物在抗消化道腫瘤(包括胃、胰腺、肝、食道、直腸、結(jié)腸等惡性腫瘤)及 其他腫瘤的作用，藥效實(shí)驗(yàn)主要以腫瘤生長(zhǎng)抑制率為指標(biāo)。
腫瘤的治療是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，包括抗原發(fā)瘤生長(zhǎng)、抗復(fù)發(fā)或抗轉(zhuǎn)移。目前腫瘤 治療首選手術(shù)切除。以大腸癌為例，在我國(guó)大腸癌發(fā)病率和死亡率分別位于惡性腫瘤的 第三位和第四位。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率和死亡率居第二位。大腸癌手術(shù)后絕大多 數(shù)病人復(fù)發(fā)于手術(shù)后2年內(nèi)。50%大腸癌患者經(jīng)根治手術(shù)后可出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中 20%-30%患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)，50%-80%患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。只有小于15%患者發(fā)生單一部 位且有再次根治可能。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的研究也發(fā)現(xiàn)，癌癥轉(zhuǎn)移是90%的癌癥病人死亡的 原因，因此阻止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是最有效的治療癌癥手段。而腫瘤轉(zhuǎn)移包括原發(fā)癌生長(zhǎng)、腫 瘤血管形成、瘤細(xì)胞脫落并侵入基質(zhì)、進(jìn)入脈管系統(tǒng)、癌栓形成、繼發(fā)組織器官定位生 長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移癌繼續(xù)擴(kuò)散等過(guò)程，與原發(fā)癌相比有其獨(dú)特的特點(diǎn)。由于腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù) 雜的連續(xù)的多步驟過(guò)程，一般來(lái)說(shuō)，惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散起始于腫瘤細(xì)胞穿過(guò)基底膜向 其鄰近組織的侵襲浸潤(rùn)。在此過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞至少有三方面的性質(zhì)起著關(guān)鍵作用，即 腫瘤細(xì)胞間的同質(zhì)粘附力、腫瘤細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)能力以及腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)或基 底膜的能力，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著非常重要的作用。由此可見(jiàn)，治療或預(yù)防癌癥 術(shù)后轉(zhuǎn)移的藥物應(yīng)具有抗腫瘤細(xì)胞粘附、移動(dòng)和浸潤(rùn)的能力，并可有效的抑制瘤重和減 少轉(zhuǎn)移灶數(shù)。
夏枯草為唇形科植物夏枯草(Pmnella.VUlgariSL.)的干燥果穗，具有清火，明目，散結(jié)，消腫之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)夏枯草具有降壓、降血糖、細(xì)胞毒、抗病 毒、抗菌、抗氧化、抗過(guò)敏、免疫活性和抗炎活性等多種作用。臨床上以單味夏枯草制 得的夏枯草注射液用以治療肺癌胸水、白血病、中晚期胃、大腸癌等療效顯著。中國(guó)專 利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)CN101317883A(申請(qǐng)?zhí)?00710041690.5，
公開(kāi)日2008年12月10日) 公開(kāi)了夏枯草活性部位及其在制備藥物組合物中的應(yīng)用。但迄今未見(jiàn)有關(guān)迷迭香酸或含 有迷迭香酸的組合物治療或預(yù)防癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移的藥理作用的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種含迷迭香酸的夏枯草有效組分。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供一種迷迭香酸。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供該含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方 法。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之四是提供該迷迭香酸的制備方法。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之五是提供上述迷迭香酸和/或含迷迭香酸的夏枯草 有效組分在制備防治癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之六是提供一種防治癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移的藥物組合物。
中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)CN101317883A(申請(qǐng)?zhí)?00710041690.5)公開(kāi)了夏枯 草活性部位及其在制備藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明以夏枯草活性部位(HPLC圖譜見(jiàn)圖 1)的研究為基礎(chǔ)，對(duì)夏枯草活性部位進(jìn)一步分離純化，得到含迷迭香酸的夏枯草有效組 分(HPLC圖譜見(jiàn)圖2、和迷迭香酸(HPLC圖譜見(jiàn)圖幻，其具有抗腫瘤細(xì)胞粘附、移動(dòng)和 浸潤(rùn)的能力，并可有效的抑制瘤重和減少轉(zhuǎn)移灶數(shù)。
在本發(fā)明的一方面，提供一種含迷迭香酸的夏枯草有效組分，該有效組分是以 夏枯草藥材為原料，通過(guò)提取分離而獲得，其主要由迷迭香酸、迷迭香酸鹽(迷迭香酸 鈉)和甲酸鈉組成，其中迷迭香酸含量占30% (峰面積歸一化法)以上。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種迷迭香酸，該迷迭香酸由上述含迷迭香酸的夏 枯草有效組分進(jìn)一步分離純化而得，或?qū)ο目莶莘蛛x純化所得，其含量占95%以上。
在本發(fā)明的另一方面，提供了含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，包括 如下步驟
步驟(1)、取夏枯草藥材用水煎煮提取，水提液過(guò)濾，濃縮后加不同濃度的乙醇 沉淀，取上清液濃縮至一定相對(duì)密度的清膏，依次加入酸溶液、堿溶液，冷藏，濾過(guò)， 得夏枯草提取液；或
取夏枯草藥材用水煎煮提取，水提取液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂，用70%乙醇洗脫，收 集洗脫液，濃縮至一定相對(duì)密度的清膏，得夏枯草提取液；或
取夏枯草藥材用水煎煮提取，水提取液加吸附澄清劑，放置，高速離心，上清 液濃縮至一定相對(duì)密度的清膏，依次加入酸溶液、堿溶液，冷藏，抽濾，得夏枯草提取 液。
所述的夏枯草藥材用水煎煮提取時(shí)夏枯草與水的重量比為夏枯草水= 1 (10 16)，煎煮次數(shù)為2 4次；
所述的水提取液濃縮至相對(duì)密度為1.05 1.09(60 65°C )，放至室溫，加 入75% 95%乙醇，使含醇量為70%，冷藏48小時(shí)以上，回收乙醇至溶液相對(duì)密度為 1.25 1J8(80°C)，放至室溫，再以乙醇調(diào)含醇量至70% 90%，優(yōu)選為85%，冷藏48 小時(shí)以上，上清液濃縮至1.25 1.28 (80°C )的清膏；
所述的大孔吸附樹(shù)脂為非極性樹(shù)脂，優(yōu)選HPD100或DlOl ；
所述的吸附澄清劑選自甲殼素、殼聚糖、101果汁澄清劑、ZTC1+1中的任一 種，優(yōu)選殼聚糖以及ZTC1+1系列中的ZTC-II、ZTC-III ；
所述的酸溶液優(yōu)選PH值為2以下的濃鹽酸，堿溶液優(yōu)選PH值7 8的40%氫 氧化鈉溶液；冷藏時(shí)間均在M小時(shí)以上。
步驟O)、夏枯草提取液依次以石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，提取 液溶劑為(1 幻1。將水飽和的正丁醇萃取部位回收溶劑，水飽和正丁醇提得的部 位即為夏枯草活性部位。
步驟(3)、取夏枯草活性部位溶液，采用制備薄層色譜分離的方法，使用展開(kāi)劑 展開(kāi)，熒光定位，分取Rf值最小的條帶裝硅膠柱，甲醇洗脫，回收溶劑，殘留物加少量 水溶解，干燥即得含迷迭香酸的夏枯草有效組分；或
取夏枯草活性部位溶液經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱，水或有機(jī)溶劑為洗脫液，收集 FeCl3-K3Fe(CN)6指示劑呈陽(yáng)性部分，溶液濃縮干燥即得含迷迭香酸的夏枯草有效組分； 或
取夏枯草活性部位溶液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱，用一定濃度的乙醇洗脫，收集洗脫 液，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得含迷迭香酸的夏枯草有效組分；或
將夏枯草活性部位溶液干燥，取干粉用甲醇溶解，裝硅膠柱，洗脫液洗脫，結(jié) 合薄層檢識(shí)收集合并相同流份或收集FeCl3或I^Cl3-K3Fe(CN)6指示劑呈陽(yáng)性流份，蒸去 溶劑，殘留物加少量水溶解，干燥即得含迷迭香酸的夏枯草有效組分。
所述對(duì)夏枯草活性部位進(jìn)行制備薄層色譜分離夏枯草有效組分的展開(kāi)劑可以為 氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、甲酸中的任意幾種，優(yōu)選氯仿、乙酸乙酯、甲酸的混合 液，比例為2 6 3 7 1。
所述對(duì)夏枯草活性部位進(jìn)一步分離用的葡聚糖凝膠為SephdexLH-20、 SephadexG 10、SephadexG 15 或 Sephacryl S 型。
所述對(duì)夏枯草活性部位進(jìn)一步分離用的大孔吸附樹(shù)脂為非極性樹(shù)脂，優(yōu)選 HPD100或DlOl ；乙醇濃度為30% 70% ；
步驟( 完成后采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)所述含迷迭香酸的夏枯草有效 組分中的迷迭香酸含量，色譜條件為反相色譜柱，流速lmL/η ι，流動(dòng)相為甲醇、乙 腈、酸的混合溶液，優(yōu)選甲醇0.05% 0.5%甲酸水溶液，比例為(20 70) (30 90)。檢測(cè)器可以為UV、DAD或ELSD。
在本發(fā)明的另一方面，提供了迷迭香酸的制備方法，包括如下步驟
取夏枯草用水煎煮提取，水提液過(guò)濾，經(jīng)制備液相，流動(dòng)相洗脫，收集含有迷 迭香酸單一成分的洗脫液，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得；或
取夏枯草提取液，經(jīng)制備液相，流動(dòng)相洗脫，收集含有迷迭香酸單一成分的洗 脫液，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得；或
取夏枯草活性部位溶液，經(jīng)制備液相，流動(dòng)相洗脫，收集含有迷迭香酸單一成 分的洗脫液，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得；或
取含迷迭香酸的夏枯草有效組分溶液，經(jīng)制備液相，流動(dòng)相洗脫，收集含有迷 迭香酸單一成分的洗脫液，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得；或
取含迷迭香酸的夏枯草有效組分干粉，甲醇溶解，上硅膠柱，洗脫液洗脫，結(jié) 合薄層檢測(cè)收集合并含有迷迭香酸單一成分的流份或收集FeCl3或FeCl3-K3Fe(CN)6指示 劑呈陽(yáng)性流份，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得。
上述的干燥方法可以為真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥或紅外線干燥等方法。
迷迭香酸制備液相的色譜條件為反相制備柱，流速1 lOOmL/η ι，流動(dòng)相 為甲醇、乙腈、酸的混合溶液，優(yōu)選甲醇0.05% 0.5%甲酸水溶液，比例為QO 70) (30 90)。檢測(cè)器可以為UV、DAD或ELSD。
在本發(fā)明的另一方面，提供了迷迭香酸和/或含迷迭香酸的夏枯草有效組分在 制備防治癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的抗癌轉(zhuǎn)移的作用包括肺、乳腺、骨骼、 泌尿生殖器、消化道及其它的癌癥。
本發(fā)明選擇轉(zhuǎn)移模型對(duì)所分離的迷迭香酸及含迷迭香酸的夏枯草有效組分進(jìn)行 體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究表明迷迭香酸及其組合物有極其或非常顯著的抗癌轉(zhuǎn)移的作用(ρ <0.001，ρ <0.01)。本發(fā)明分離制備的含迷迭香酸的夏枯草有效組分和迷迭香酸均可 用于制備預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的藥物。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種防治癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移的藥物組合物，該藥物組 合物含有有效量的迷迭香酸和/或含迷迭香酸的夏枯草有效組分，并含有常規(guī)的藥用載 體。本發(fā)明在用于預(yù)防或治療癌轉(zhuǎn)移時(shí)既可以是迷迭香酸、含迷迭香酸的夏枯草有效組 分單獨(dú)使用，也可以是與至少一種療效明確的其他抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物(包括抗腫瘤有效單 體和中藥提取有效部位)聯(lián)合使用，加入制藥中可接受的載體制成藥物制劑。該藥物 制劑可以通過(guò)口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或靜脈途徑給藥，包括片劑、膠囊、滴丸、糖 漿、口服液、粉針劑、注射劑等。本發(fā)明所提供的各種藥物劑型均可以采用常規(guī)的制劑 技術(shù)制備而成。本發(fā)明藥物組合物的用量和療程可根據(jù)劑型、患者的年齡、疾病的輕重 程度作適當(dāng)調(diào)整，如夏枯草有效組分制成的凍干粉針，一般為每日1次，每次1 2支 (每支含夏枯草有效組分7.5mg的凍干粉針)，以1個(gè)月為一個(gè)療程，可連續(xù)使用2個(gè)療 程或更長(zhǎng)時(shí)間。


圖1是夏枯草活性部位HPLC圖譜；
圖2是含迷迭香酸的夏枯草有效組分HPLC圖譜；
圖3是迷迭香酸HPLC圖譜。
圖1-圖 3 中，HPLC(ELSD)分析條件Diamonsil C18 柱 QOOmmX4.6mm， 5μιη)；流動(dòng)相為甲醇0.1%甲酸水溶液=45 55;柱溫25°C ；流速lml/η η， ELSD漂移管溫度為40°C，氣壓為3.5-3fbar。
圖4是本發(fā)明試驗(yàn)例1中夏枯草活性部位給藥期間各劑量組小鼠體重的示意 圖5是本發(fā)明試驗(yàn)例1中含迷迭香酸的夏枯草有效組分給藥期間各劑量組小鼠體 重的示意圖6是本發(fā)明試驗(yàn)例1中迷迭香酸給藥期間各組小鼠體重的示意圖7是本發(fā)明試驗(yàn)例2中含迷迭香酸的夏枯草有效組分抗細(xì)胞粘附作用的示意 圖，其中，與空白對(duì)照組比較，**p<0.01;
圖8是本發(fā)明試驗(yàn)例2中夏枯草有效組分對(duì)LS174-T細(xì)胞移動(dòng)能力的影響示意 圖，其中，與空白對(duì)照組比較，***p< 0.001;
圖9是本發(fā)明試驗(yàn)例2中不同濃度夏枯草有效組分對(duì)LS174-T細(xì)胞移動(dòng)能力的影 響示意圖10是本發(fā)明試驗(yàn)例2中夏枯草有效組分對(duì)LS174-T細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響示意 圖，其中，與空白對(duì)照組比較，*p<0.05，**p<0.01。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例1含迷迭香酸的夏枯草有效組分制備
取夏枯草3kg，加16倍水煎煮三次，第一次1.5h，第二次lh，第三次0.5h，合 并三次煎液，濾過(guò)，濃縮至3000ml，通過(guò)裝有DlOl大孔吸附樹(shù)脂的柱子，以7倍柱體 積70%乙醇洗脫至FeCl3-K3Fe(CN)6反應(yīng)呈陰性，合并洗脫液，濃縮為每毫升含4g生 藥，得夏枯草提取液，提取液依次以石油醚、乙酸乙酯各萃取5次(提取液提取溶劑= 2:1)，棄除萃取液，水溶液再用水飽和正丁醇萃取，回收正丁醇，得夏枯草活性部位 溶液，將溶液點(diǎn)樣于20cmX 20cm硅膠GF254板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸(5 4 1) 為展開(kāi)劑展開(kāi)，展距為13 17cm，取出，晾干，于254nm下熒光定位，分取不同的條 帶，將Rf值最小的條帶硅膠裝柱，以甲醇洗脫，回收溶劑，殘留物加少量水溶解，真空 干燥即得含迷迭香酸的夏枯草有效組分。
經(jīng)HPLC(ELSD)分析(面積歸一化法)迷迭香酸含量32.5%。分析條件 DiamonsilCw 柱 OOOmm X 4.6mm，5 μ m)；流動(dòng)相為甲醇0.1% 甲酸水溶液=45 55; 柱溫25°C ；流速lml/min，ELSD漂移管溫度為40°C，氣壓為3.5_3.6bar，含迷迭香 酸的夏枯草有效組分HPLC圖譜見(jiàn)圖2。
實(shí)施例2含迷迭香酸的夏枯草有效組分制備
取夏枯草5kg，加14倍水煎煮二次，第一次Ih,第二次0.5h，合并兩次煎液， 濾過(guò)，濃縮至1.06 (60°C )，放至室溫，加乙醇，使含醇量為70%，冷藏48小時(shí)以上， 回收乙醇至溶液相對(duì)密度為1.28 (80°C )，放至室溫，再以乙醇調(diào)含醇量至85%，冷藏48 小時(shí)以上，上清液濃縮至1.27 (80°C)，用濃鹽酸調(diào)PH至2，冷藏M小時(shí)以上，濾過(guò)， 濾液以40%氫氧化鈉溶液調(diào)PH至7，得夏枯草提取液。提取液依次以石油醚、乙酸乙 酯各萃取5次(提取液提取溶劑=3 1)，水溶液再用水飽和正丁醇萃取，回收正丁 醇，得夏枯草活性部位溶液，將活性部位溶液，過(guò)Sephadex LH-20柱，以水洗脫，以 FeCl3-K3Fe(CN)6溶液為指示劑，收集與之反應(yīng)呈藍(lán)綠色的洗脫液，合并后回收水至干， 殘?jiān)蛹状蓟亓?，濾過(guò)，濾液回收甲醇至干，加少量水溶解，冷凍干燥即得含迷迭香酸 的夏枯草有效組分，經(jīng)HPLC (ELSD)分析(面積歸一化法)迷迭香酸含量85.0% (分析條件同實(shí)施例1)。
實(shí)施例3含迷迭香酸的夏枯草有效組分制備
取夏枯草lkg，加12倍水煎煮四次，前二次各lh，后二次各0.5h，合并煎液， 濾過(guò)，濃縮至6000ml，加入殼聚糖醋酸溶液300ml，搖勻，放至12h，高速離心 (4000rpm,離心IOmin)，取上清液，濃縮為每毫升含知生藥，以濃鹽酸調(diào)PH至2，冷藏 M小時(shí)以上，濾過(guò)，濾液以40%氫氧化鈉溶液調(diào)PH至7，得夏枯草提取液。提取液依次 以石油醚、乙酸乙酯各萃取5次(提取液提取溶劑=3 1)，棄除萃取液，水溶液再用 水飽和正丁醇萃取，回收正丁醇，得夏枯草活性部位溶液。將活性部位溶液，上HPDlOO 大孔吸附樹(shù)脂，用65%乙醇(鹽酸調(diào)溶液PH = 2 5)洗脫，以FeCl3-K3Fe(CN)6溶液 為指示劑，收集與之反應(yīng)呈藍(lán)綠色的洗脫液，合并后回收水至干，殘?jiān)蛹状蓟亓?，濾 過(guò)，濾液回收甲醇至干，加少量水溶解，冷凍干燥即得，經(jīng)HPLC(ELSD)分析(面積歸 一化法)迷迭香酸含量90.0%以上(分析條件同實(shí)施例1)。
實(shí)施例4含迷迭香酸的夏枯草有效組分制備
取夏枯草2kg，加10倍水煎煮三次，前二次各lh，第三次各0.5h，合并煎液， 濾過(guò)，濃縮至2000ml，加入5%的101果汁澄清劑800ml，攪拌15η ι，放冷，冷藏12h， 取上清液，濃縮為每毫升含4g生藥的溶液，以濃鹽酸調(diào)PH至2，冷藏M小時(shí)以上，濾 過(guò)，濾液以40%氫氧化鈉溶液調(diào)PH至7，得夏枯草提取液。提取液依次以石油醚、乙 酸乙酯各萃取5次(提取液提取溶劑=1 1)，棄除萃取液，水溶液再用水飽和正丁 醇萃取，回收正丁醇，冷凍干燥得夏枯草活性部位干粉。取層析柱，用氯仿甲醇甲 酸水=9 1 0.1 0.1混合溶劑作為初始洗脫液，濕法裝柱；稱取適量夏枯草活性 部位凍干粉，干法上樣，然后用氯仿甲醇甲酸水=9 1 0.1 0.1的混合溶劑 洗脫液洗脫，一個(gè)柱體積(BV)為一個(gè)流份收集，以FeCl3-K3Fe(CN)6作為指示劑，合并 陽(yáng)性反應(yīng)流份。回收溶劑，殘留物加少量水溶解，冷凍干燥即得。經(jīng)HPLC(ELSD)分 析(面積歸一化法)迷迭香酸含量92.1% (分析條件同實(shí)施例1)。
實(shí)施例5迷迭香酸的制備
取夏枯草lkg，加12倍水煎煮二次，每次各lh，合并煎液，濾過(guò)，濃縮至 2000ml,取ZTC-II天然澄清劑A組分用水配制成粘膠液，溶脹24h ； B組分用醋 酸配制成的粘膠液，溶脹24h。取上述夏枯草提取液，加熱至80°C，按3B 2A的比 例先加入組分B，邊加邊攪拌，保溫30η ι后在60°C時(shí)再加入組分A，邊加邊攪拌，保溫 30min,冷藏M小時(shí)，濾過(guò)，濾液濃縮為每毫升含知生藥，以濃鹽酸調(diào)PH至2，冷藏M 小時(shí)以上，濾過(guò)，濾液以40%氫氧化鈉溶液調(diào)PH至7，得夏枯草提取液。提取液依次以 石油醚、乙酸乙酯各萃取6次(提取液提取溶劑=3 1)，棄除萃取液，水溶液再用水 飽和正丁醇萃取，回收正丁醇，得夏枯草活性部位溶液。將活性部位溶液經(jīng)制備液相分 離，操作條件色譜柱Cw半制備柱(10 μ m，12nm； 250 X IOmm)；檢測(cè)器DAD; 流動(dòng)相甲醇/0.1%甲酸05/55，V/V)溶液；流速1.5ml/min;進(jìn)樣量200 μ 1 ；柱 溫25°C;收集含有迷迭香酸單一成分的洗脫液，回收溶劑，殘留物加少量水溶解，冷 凍干燥即得。經(jīng)HPLC(ELSD)分析(面積歸一化法)迷迭香酸含量98.5%，迷迭香酸 HPLC圖譜見(jiàn)圖3 (分析條件同實(shí)施例1)。
實(shí)施例6迷迭香酸的制備
取夏枯草3kg，用13倍水煎煮二次，第一次lh，第二次0.5h，合并煎液，濾 過(guò)，濃縮至1.06-1.09 (60°C )，放至室溫，加入85%乙醇調(diào)含醇量至70%，冷藏48小 時(shí)，回收乙醇至1J6(80°C)，放至室溫，再以乙醇調(diào)含醇量至85%，冷藏48小時(shí)后回收 乙醇，濃縮至1.25 (80°C )，用濃鹽酸調(diào)pH至2，冷藏M小時(shí)以上，濾過(guò)，濾液以40% 氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8，得夏枯草提取液。將提取液依次以石油醚、乙酸乙酯各萃取 5次(提取液提取溶劑=1 1)，棄去萃取液，水溶液再用水飽和正丁醇萃取，揮去 正丁醇，得活性部位。取適量夏枯草活性部位上樣于硅膠柱，用氯仿甲醇甲酸水 =9 1 0.1 0.1混合溶劑洗脫，以FeCl3-K3Fe(CN)6作為指示劑，合并陽(yáng)性反應(yīng)流 份，得到夏枯草有效組分。將有效組分溶液經(jīng)SephadexGlO柱QOOX 10mm)；檢測(cè)器 UV；流動(dòng)相水；流速lOml/min;收集含有迷迭香酸單一成分洗脫液，冷凍干燥即 得。經(jīng)HPLC (ELSD)分析(面積歸一化法)迷迭香酸含量99.3%，迷迭香酸HPLC圖譜 見(jiàn)圖3 (分析條件同實(shí)施例1)。
實(shí)施例7迷迭香酸的制備
取夏枯草4kg，加10倍水煎煮三次，第一次lh，第二、三次各0.5h，合并煎 液，濾過(guò)，濃縮至1.05 (60°C)，放至室溫，加乙醇使含醇量為75%，冷藏48小時(shí)以上， 回收乙醇至溶液相對(duì)密度為1.27 (80°C )，放至室溫，再以乙醇調(diào)含醇量至85%，冷藏48 小時(shí)以上，上清液濃縮至1.27 (80°C)，用濃鹽酸調(diào)PH至2，冷藏M小時(shí)以上，濾過(guò)，濾 液以40%氫氧化鈉溶液調(diào)PH至7，得夏枯草提取液。提取液經(jīng)制備液相分離，色譜柱 Cw制備柱(ΙΟμιη，300 X 30mm)；檢測(cè)器DAD;流動(dòng)相甲醇/0.1%甲酸05/55， V/V)溶液；流速5ιη1/ ι;收集含有迷迭香酸單一成分洗脫液，冷凍干燥即得。經(jīng) HPLC(ELSD)分析(面積歸一化法)迷迭香酸含量95.4%，迷迭香酸HPLC圖譜見(jiàn)圖3 (分 析條件同實(shí)施例1)。
實(shí)施例8迷迭香酸的制備
取實(shí)施例1制得的含迷迭香酸的夏枯草有效組分，加甲醇溶解，上樣于硅膠 柱，用氯仿甲醇甲酸水=85 14 0.5 0.5的混合溶劑洗脫，收集含有迷迭香 酸單一成分洗脫液，冷凍干燥即得。
實(shí)施例9迷迭香酸的制備
取夏枯草3kg，加10倍水煎煮二次，第一次lh，第二次0.5h，合并煎液， 濾過(guò)，濾液依次以石油醚、乙酸乙酯各萃取5次(提取液提取溶劑=1 1)，棄 去萃取液，水溶液再用水飽和正丁醇萃取，蒸干，殘余物加水溶解后上樣于反相硅 膠柱(20μιη，300X40mm),先用水洗脫，再用甲醇和酸水的混合液洗脫，收集與 FeCl3-K3Fe (CN)6K應(yīng)呈陽(yáng)性的洗脫液，濃縮，再上樣于SephadexG 25柱，水洗脫，收集 與 FeCl3-K3Fe(CN)6 反應(yīng)呈陽(yáng)性的洗脫液，經(jīng) Sephadex LH-20 柱 Q50X 15mm) ； UV 檢 測(cè)器；氯仿甲醇(3 7)為流動(dòng)相；收集含有迷迭香酸單一成分洗脫液，冷凍干燥即 得。
實(shí)施例10夏枯草有效組分凍干粉針制備
取實(shí)施例1制得的夏枯草有效組分7.5g，抗壞血酸0.5g，加注射用水900ml使 其溶解，用NaOH調(diào)PH至6，濾過(guò)，加注射用水至1000ml，滅菌，冷藏，過(guò)0.65 μ m 濾膜，濾液灌入西林瓶中，5ml/支，凍干，制成每支含夏枯草有效組分7.5mg的凍干粉針。
實(shí)施例11夏枯草有效組分膠囊劑的制備
處方
夏枯草有效組分 9. Og 微晶纖維素45. Og乳糖36. Og25%乙醇適量
操作按處方量稱取夏枯草有效組分(實(shí)施例2制得)、微晶纖維素、乳糖，混 合均勻，加入25%乙醇適量，混勻。設(shè)置好擠出速度和滾圓速度，將混合物料投入加樣 漏斗，啟動(dòng)擠出機(jī)制成圓柱形物料，將圓柱形物料加入滾筒中，啟動(dòng)滾圓機(jī)，制得球形 微丸，將微丸裝入硬膠囊中，使每粒膠囊重450mg，即得。
以下通過(guò)試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明的有益效果作進(jìn)一步的闡述
試驗(yàn)例1藥效試驗(yàn)(抗癌轉(zhuǎn)移作用)
(一 )實(shí)驗(yàn)材料
1 藥物
按本發(fā)明方法制得的夏枯草活性部位(面積歸一化法迷迭香酸含量21.40% )
本發(fā)明夏枯草有效組分(面積歸一化法迷迭香酸含量92.1% )
本發(fā)明迷迭香酸(純度99.3% )
陽(yáng)性對(duì)照藥注射用硫酸長(zhǎng)春新堿(深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 0805V1)；
2 動(dòng)物
Lewis肺癌種鼠(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理學(xué)研究室)；C57BL/6N小鼠(復(fù)旦 大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；合格證號(hào)滬2007-0002 ；性別雄性；周齡6-8周；體重 20士&。
(二)實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
1劑量設(shè)置
以迷迭香酸的含量為標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)計(jì)活性部位、有效組分給藥劑量，使其高、 中、低劑量組所含迷迭香酸質(zhì)量與迷迭香酸相應(yīng)劑量組相等，具體見(jiàn)表1。
表1各樣品給藥劑量設(shè)置表
權(quán)利要求
1.一種含迷迭香酸的夏枯草有效組分，其特征在于，該有效組分是以夏枯草藥材為 原料，通過(guò)提取分離而獲得，其主要由迷迭香酸、迷迭香酸鹽和甲酸鈉組成，其中迷迭 香酸含量占30%以上。
2.—種迷迭香酸，其特征在于，所述的迷迭香酸由權(quán)利要求1所述的含迷迭香酸的夏 枯草有效組分進(jìn)一步分離純化而得，或?qū)ο目莶莘蛛x純化所得，其含量占95%以上。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在 于，包括如下步驟(1)取夏枯草藥材用水煎煮提取，水提液過(guò)濾，濃縮后加不同濃度的乙醇沉淀，取上 清液濃縮至一定相對(duì)密度的清膏，依次加入酸溶液、堿溶液，冷藏，濾過(guò)，得夏枯草提 取液；或者取夏枯草藥材用水煎煮提取，水提取液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂，用乙醇洗脫，收集洗脫 液，濃縮至一定相對(duì)密度的清膏，得夏枯草提取液；或者取夏枯草藥材用水煎煮提取，水提取液加吸附澄清劑，放置，高速離心，上清液濃 縮至一定相對(duì)密度的清膏，依次加入酸溶液、堿溶液，冷藏，抽濾，得夏枯草提取液；(2)取夏枯草提取液依次以石油醚、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取，將水飽和的正 丁醇萃取部位回收溶劑，得夏枯草活性部位溶液；(3)取夏枯草活性部位溶液，采用制備薄層色譜分離的方法，使用展開(kāi)劑展開(kāi)，熒光 定位，分取Rf值最小的條帶裝入硅膠柱，甲醇洗脫，回收溶劑，殘留物加少量水溶解， 干燥即得含迷迭香酸的夏枯草有效組分；或取夏枯草活性部位溶液經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱，水或有機(jī)溶劑為洗脫液，收集 FeCl3-K3Fe(CN)6指示劑呈陽(yáng)性部分，溶液濃縮干燥即得含迷迭香酸的夏枯草有效組分； 或取夏枯草活性部位溶液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱，用一定濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液， 回收乙醇，殘留物加少量水溶解，干燥即得含迷迭香酸的夏枯草有效組分；或?qū)⑾目莶莼钚圆课蝗芤焊稍?，取干粉用甲醇溶解，濕法裝硅膠柱，干法上樣，洗脫 液洗脫，結(jié)合薄層檢識(shí)收集合并相同流份或收集FeCl3或FeCl3-K3Fe(CN)6指示劑呈陽(yáng)性 流份，回收溶劑，殘留物加少量水溶解，干燥即得含迷迭香酸的夏枯草有效組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在于， 步驟(1)中所述的夏枯草藥材用水煎煮提取時(shí)，夏枯草與水的重量比為夏枯草水= 1 (10 16)，煎煮次數(shù)為2 4次。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在于，步 驟(1)中所述的水提取液濃縮至相對(duì)密度為1.05 1.09，放至室溫，加入乙醇，使含醇 量為60% 90%，優(yōu)選為70%，冷藏48小時(shí)以上，回收乙醇至溶液相對(duì)密度為1.25 1.28，放至室溫，加乙醇，使含醇量至70% 90%，冷藏48小時(shí)以上，上清液濃縮至 1.25 1.28的清膏。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在于，步 驟(1)中所述的大孔吸附樹(shù)脂為非極性樹(shù)脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在于， 步驟(1)中所述的吸附澄清劑選自甲殼素、殼聚糖、101果汁澄清劑、ZTC1+1中的任一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在于，步 驟(1)中所述的酸溶液是Wi值為2以下的濃鹽酸，所述的堿溶液為PH值7 8的40% 氫氧化鈉溶液；所述冷藏時(shí)間均在24小時(shí)以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在于，步 驟(2)中所述的夏枯草提取液依次以石油醚、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取，該夏枯 草提取液與該溶劑的比例為(1 3) 1。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在于， 步驟(3)中所述對(duì)夏枯草活性部位進(jìn)行制備薄層色譜分離夏枯草有效組分的展開(kāi)劑為氯 仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、甲酸中的任意幾種。
11.如權(quán)利要求10所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在于，所 述展開(kāi)劑為氯仿、乙酸乙酯和甲酸的混合液，混合比例為(2 6) (3 7) 1。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在 于，步驟(3)中所述對(duì)夏枯草活性部位進(jìn)一步分離用的葡聚糖凝膠為SephdexLH-20、 SephadexGlO、SephadexG 15 或 Sephacryl S 型。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分的制備方法，其特征在于， 步驟(3)中所述對(duì)夏枯草活性部位進(jìn)一步分離用的大孔吸附樹(shù)脂為非極性樹(shù)脂；乙醇濃 度為30% 70%。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的迷迭香酸的制備方法，其特征在于，通過(guò)下述步驟制備取夏枯草用水煎煮提取，水提液過(guò)濾，經(jīng)制備液相，流動(dòng)相洗脫，收集含有迷迭香 酸單一成分的洗脫液，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得；或取權(quán)利要求3中步驟(1)制得的夏枯草提取液，經(jīng)制備液相，流動(dòng)相洗脫，收集含有 迷迭香酸單一成分的洗脫液，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得；或取權(quán)利要求3中步驟(2)制得的夏枯草活性部位溶液，經(jīng)制備液相，流動(dòng)相洗脫，收 集含有迷迭香酸單一成分的洗脫液，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得；或取權(quán)利要求3制得的含迷迭香酸的夏枯草有效組分溶液，經(jīng)制備液相，流動(dòng)相洗 脫，收集含有迷迭香酸單一成分的洗脫液，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得；或取權(quán)利要求3制得的含迷迭香酸的夏枯草有效組分干粉，甲醇溶解，上硅膠柱， 洗脫液洗脫，結(jié)合薄層檢測(cè)收集合并含有迷迭香酸單一成分的流份或收集FeCl3或 FeCl3-K3Fe(CN)6指示劑呈陽(yáng)性流份，蒸干，殘留物加少量水溶解，干燥即得。
15.權(quán)利要求1 2所述的迷迭香酸和/或含迷迭香酸的夏枯草有效組分在制備防治 癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用，其特征是，抗癌轉(zhuǎn)移的作用包括抗肺、乳腺、骨骼、泌尿 生殖器、消化道及其它癌癥術(shù)后的轉(zhuǎn)移。
16.一種防治癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其特征是，該藥物組合物含有有效量的權(quán) 利要求2所述的迷迭香酸和/或權(quán)利要求1所述的含迷迭香酸的夏枯草有效組分，并含有 常規(guī)的藥用載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的防治癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其特征是，該藥物組合 物還含有至少一種療效明確的其他抗癌轉(zhuǎn)移藥物，包括抗癌轉(zhuǎn)移有效單體和中藥提取有
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的防治癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移的藥物組合物，其特征是，所述的藥物 組合物通過(guò)口服、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)肌肉或靜脈途徑給藥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種迷迭香酸、含迷迭香酸的夏枯草有效組分及其提取分離制備方法，此外還公開(kāi)了迷迭香酸或/和含迷迭香酸的夏枯草有效組分在制備預(yù)防或治療癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用，公開(kāi)了含有預(yù)防或治療癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移有效量的迷迭香酸或/和含迷迭香酸的夏枯草有效組分的藥物組合物。本發(fā)明公開(kāi)的迷迭香酸及含其的夏枯草有效組分是經(jīng)過(guò)對(duì)夏枯草進(jìn)行提取、分離得到。經(jīng)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，用本發(fā)明方法制得的迷迭香酸及含其的夏枯草有效組分具有抗癌癥轉(zhuǎn)移的作用，可用于制備預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的藥物。
文檔編號(hào)C07C69/732GK102018759SQ20091005790
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者劉力, 徐德生 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院