專利名稱：一種甲硝唑的快速檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑盒和在檢測(cè)化妝品、消毒劑中添加甲硝唑上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲硝唑的檢測(cè)方法，具體涉及一種甲硝唑的快速檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑盒和在檢測(cè)化妝品、消毒劑中添加甲硝唑上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲硝唑(英文名稱為Metronidazole, MNZ)，商品名為滅滴靈、甲硝噠唑、甲硝基羥乙唑、滅滴唑。甲硝唑的化學(xué)名稱為2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇，分子式為C6H9N303。它是一種硝基咪唑類藥物，其硝基在無(wú)氧環(huán)境中還原成氨基而顯示廣譜抗厭氧菌和抗原蟲(chóng)的作用，臨床主要用于預(yù)防和治療厭氧菌引起的感染，如呼吸道、消化道、腹腔及盆膿感染，皮膚軟組織、骨和骨關(guān)節(jié)等部位的感染以及脆弱擬桿菌引起的心內(nèi)膜炎、敗血癥及腦膜炎等，同時(shí)還廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療口腔厭氧菌感染。此外，甲硝唑?qū)牝休^好的殺滅作用，可治療疥瘡，可殺滅引起炎癥性痤瘡的棒狀桿菌，故對(duì)痤瘡有效。
當(dāng)前許多除痘、祛螨類化妝品、用于陰道炎等婦科炎癥的消毒劑、動(dòng)物性食品以及口腔類醫(yī)藥用品中均違法添加有甲硝唑，雖然甲硝唑具有抗菌消炎的作用，但是長(zhǎng)期使用會(huì)引起皮膚糜爛、瘙癢等，還可能引起過(guò)敏性休克、哮喘等呼吸系統(tǒng)癥、泌尿道的不良反應(yīng)、白細(xì)胞和血小板減少、皰疹性皮炎、孕婦早產(chǎn)、癲癇發(fā)作和抑郁癥等，嚴(yán)重時(shí)可危及患者的生命，此外甲硝唑還會(huì)導(dǎo)致對(duì)抗生素的耐藥性，造成健康隱患。目前我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范2002年版》制定的化學(xué)指標(biāo)分析方法只有22個(gè)標(biāo)準(zhǔn)僅涉及57項(xiàng)，很多添加到化妝品的物質(zhì)由于缺乏系統(tǒng)的成分、毒性、功效檢測(cè)方法及評(píng)價(jià)要求，使得目前化妝品的衛(wèi)生質(zhì)量?jī)H僅是現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的"合格"，不能有效反映化妝品的真實(shí)衛(wèi)生質(zhì)量，特別是化妝品中藥物非法添加正受到越來(lái)越多的關(guān)注。我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》、歐盟化妝品規(guī)程規(guī)定甲硝唑、氯霉素、林可霉素等抗生素類物質(zhì)禁止在化妝品中使用。
北京市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生所對(duì)在北京、江蘇、江西地區(qū)銷售的122件祛痘除螨類化妝品進(jìn)行了檢測(cè)，122件樣品檢出甲硝唑14件，超標(biāo)率11.5%，最大添加量達(dá)至1」3.9%，其中廣東28件中檢出甲硝唑5件，超標(biāo)率達(dá)17.9%。
目前對(duì)于違法添加甲硝唑的檢測(cè)，主要是采用高效液相色譜、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、薄層層析等方法。高效液相色譜法是常用的現(xiàn)代分析方法，它具有色譜分離效率高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在相同的色譜條件下，甲硝唑?qū)φ掌啡芤汉蜆悠诽崛∷玫墓┰嚻啡芤悍謩e進(jìn)樣，根據(jù)色譜保留時(shí)間可判斷待測(cè)樣品是否含有甲硝唑。
市面上出售的一種硝基咪唑類檢測(cè)試劑盒，是采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的甲硝唑和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗甲硝唑抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其殘留物甲硝唑的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中甲硝唑的含量。
邊疆、楊立延等人邊疆.楊立延.陳奕樺.王艷秋，雙波長(zhǎng)線性回歸測(cè)定醋酸氯己定和甲硝唑.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜質(zhì).2000 (34) 1: 54-55采用雙波長(zhǎng)線性回歸法測(cè)定復(fù)方消毒劑中的甲硝唑，通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以及分光光度計(jì)測(cè)量，得到甲硝唑的含量。
上述的色譜法、ELISA方法和雙波長(zhǎng)線性回歸法等，雖然都能檢測(cè)出化妝
品或消毒劑中的甲硝唑，但是這些方法都存在操作復(fù)雜、樣品處理時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)于大批量待檢測(cè)樣品無(wú)法做到快速篩査，檢測(cè)工作量大等問(wèn)題，此外色譜法還存在儀器價(jià)格昂貴，色譜柱易受污染、分析成本高和不適合做流動(dòng)性大的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種不需貴重分析儀器、分析成本低、對(duì)甲硝唑檢測(cè)的專屬性強(qiáng)、靈敏度高且試驗(yàn)現(xiàn)象明顯、檢驗(yàn)結(jié)果正確率高、適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)樣品中是否違法添加有甲硝唑的快速檢測(cè)方法。
本發(fā)明的另一個(gè)冃的在于提供一種利用上述方法檢測(cè)甲硝唑的檢測(cè)試劑
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述快速檢測(cè)方法在檢測(cè)化妝品、消毒劑中是否添加有甲硝唑上的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
一種甲硝唑的快速檢測(cè)方法，該方法是利用甲硝唑的如下兩個(gè)性質(zhì)對(duì)其實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)
(1) 甲硝唑在不同溶劑中的溶解性是有差異的，它可溶于酸，但在石油醚、乙醚等有機(jī)溶劑中是極微弱溶解的；
(2) 芳香族硝基化合物易于被還原，因此當(dāng)甲硝唑被堿還原后會(huì)生成桔紅色的偶氮苯和無(wú)色的氫化偶氮苯。
利用甲硝唑的上述兩個(gè)性質(zhì)，木發(fā)明設(shè)計(jì)出先對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行酸溶解富集然后有機(jī)溶劑進(jìn)一歩純化，最后用堿顯色的方法，該方法包括如下步驟
(1) 向待測(cè)樣品中加入酸液，混勻；這一步的酸液可以將甲硝唑以及其它溶于酸的物質(zhì)從待測(cè)樣品中提取，分離出來(lái)，實(shí)現(xiàn)了甲硝唑的初步富集；
(2) 向上述混合液中加入有機(jī)溶劑，振搖萃取，靜置使分層；因?yàn)榧紫踹驑O微弱溶解于有機(jī)溶劑，所以混合液中能溶于有機(jī)溶劑的成分被有機(jī)溶劑萃取分離出去，而甲硝唑依然保持在酸液中；
(3) 向上述萃取液的下層酸液中加入氫氧化鈉固體，氫氧化鈉固體溶解釋放出熱量，正好可用于顯色反應(yīng)需要，根據(jù)溶液的顏色變化判斷待測(cè)樣品中是否添加有甲硝唑；如果溶液的顏色變?yōu)樽霞t色或粉紅色則說(shuō)明該待測(cè)樣品中添加有甲硝唑，如果溶液的顏色無(wú)變化則說(shuō)明該待測(cè)樣品中未添加有甲硝唑。
上述步驟(1)中，所述酸液可以采用本領(lǐng)域常用的任何一種酸液，如硫酸、醋酸、鹽酸等，所述酸液的加入體積可優(yōu)選2 3ml，這樣就可以將甲硝唑濃縮于2 3ml的酸中，增大甲硝唑的富集濃度。
上述步驟(1)中，酸液的濃度一般選擇大于3體積％就可以，酸濃度過(guò)高會(huì)有強(qiáng)的腐蝕性，優(yōu)選3體積％硫酸溶液。
上述歩驟(2)中，所述有機(jī)溶劑可以采用本領(lǐng)域中任何一種常用的有機(jī)溶劑，如石油醚、氯仿等。由于氯仿等有機(jī)溶劑毒性比較大，所以優(yōu)選低毒的有機(jī)溶劑，如石油醚，石油醚分為三種，分別為石油醚I (30~60°C)、石油
醚n (6o力o。c)和石油醚ni (9o~i2o°c)，優(yōu)選石油醚n (6o—卯。c)。
對(duì)于一些液體類的樣品，因?yàn)橐后w類相對(duì)于膏類、栓劑和乳劑來(lái)說(shuō)，其添加劑相對(duì)較少，成分也不太復(fù)雜，所以可以選擇省去步驟(2)，直接加入酸液后再加氫氧化鈉固體進(jìn)行顯色反應(yīng)。堿對(duì)甲硝唑的顯色反應(yīng)是需要一定溫度的， 一般需要在6(TC以上，氫氧化
鈉固體溶于水后會(huì)釋放熱量從而使得溶液的溫度上升， 一般可達(dá)到6(TC，正好 符合顯色反應(yīng)所要求的溫度，因此本發(fā)明在步驟(3)中直接使用氫氧化鈉固 體，無(wú)需另外的加熱設(shè)備(如水浴鍋等)就可以進(jìn)行顯色反應(yīng)，并且根據(jù)顯色 結(jié)果判斷樣品中是否添加有甲硝唑。
上述步驟(3)中，對(duì)于氫氧化鈉固體的用量可以選擇25 40mg，優(yōu)選30mg。
利用本發(fā)明的快速檢測(cè)方法，制備針對(duì)甲硝唑的檢測(cè)試劑盒，如可將3體 積％硫酸、石油醚和氫氧化鈉固體分別裝入容器中，組裝成試劑盒，使用的時(shí) 候只需要根據(jù)樣品的量取用試劑盒中的試劑，按照本發(fā)明的方法就可以判斷待 測(cè)樣品中是否添加有甲硝唑。
本發(fā)明的快速檢測(cè)方法可用于檢測(cè)化妝品、消毒劑中是否添加有甲硝唑， 如婦女經(jīng)期衛(wèi)生用品衛(wèi)生栓(內(nèi)置棉條)、皮膚或粘膜衛(wèi)生用品、抗(抑)菌 洗劑等，此外，本發(fā)明的方法還可以用于動(dòng)物性食品、口腔類醫(yī)藥用品等產(chǎn)品 中是否添加有甲硝唑的檢測(cè)。
本發(fā)明的快速檢測(cè)方法主要是針對(duì)化妝品、消毒品等中是否違法添加了甲 硝唑進(jìn)行的初篩，只要是利用本發(fā)明方法進(jìn)行顯色后，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色的 化妝品，則可初步判斷該化妝品中可能添加有甲硝唑，如果顯色反應(yīng)為無(wú)變化， 則說(shuō)明該化妝品中肯定沒(méi)有添加甲硝唑，然后將可能添加有甲硝唑的化妝品再 進(jìn)行質(zhì)譜、色譜等更加精細(xì)的檢測(cè)。雖然只是初篩，但是本發(fā)明的方法采用了 酸和有機(jī)溶劑兩步純化，使甲硝唑在樣品中得到了富集，因此顯色反應(yīng)時(shí)排除 了很多的雜質(zhì)干擾，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率較高，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)大批量樣品進(jìn)行本 發(fā)明方法的檢測(cè)，并同時(shí)進(jìn)行色譜和質(zhì)譜驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法，其準(zhǔn)確率可以達(dá)到99%，假陰性率為0。此外，本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，所用時(shí)間 短， 一般2分鐘內(nèi)即可完成檢查，而且結(jié)果直觀通過(guò)看顏色就可以從大批量的 待測(cè)化妝品中挑出少量的可疑樣品，大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)的步驟，而且只需要對(duì)少 量可疑的樣品再進(jìn)行質(zhì)譜、色譜等精細(xì)檢測(cè)，這也使得檢測(cè)成本大大降低，適 合于監(jiān)管部門(mén)快速檢查的需要，對(duì)提高監(jiān)管部門(mén)的運(yùn)作效率、快速打擊不法分 子有著重大的杜會(huì)效益。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如卜有益效果 .
1. 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法利用酸進(jìn)行初提，對(duì)甲硝唑進(jìn)行第一次富集，接 著利用有機(jī)溶劑對(duì)甲硝唑進(jìn)行第二次純化，使得用于堿液顯色時(shí)的底物一甲硝
唑在樣品中具有一定的較高濃度，從而保證了顯色反應(yīng)結(jié)果正確率高于99%， 假陰性率為0，雖然可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，但是本發(fā)明主要是作為初篩的，而且 可以快速地將可疑樣品縮小到很小的范圍內(nèi)，最后只需要對(duì)這些極少的可疑樣 品再進(jìn)行色譜、質(zhì)譜等精確檢測(cè)，既可以檢測(cè)出違法含有甲硝唑的樣品；
2. 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法不需要使用貴重分析儀器，尤其是最后的堿液顯 色部分，利用氫氧化鈉固體溶解時(shí)候釋放的熱量，達(dá)到顯色反應(yīng)所需要的溫度， 不需要傳統(tǒng)顯色反應(yīng)中水浴設(shè)備加熱，更加方便流動(dòng)性大的檢測(cè)需要；
3. 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法其專屬性強(qiáng)、靈敏度高、試驗(yàn)現(xiàn)象明顯、檢驗(yàn)結(jié) 果正確率高、操作簡(jiǎn)便，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查樣品中是否違法添加了甲硝唑， 尤其符合監(jiān)管現(xiàn)場(chǎng)快速檢査的需要，可極大地提高監(jiān)管部門(mén)的運(yùn)作效率；
4. 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒能滿足基層藥品、化妝品監(jiān)督檢 驗(yàn)的需要。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā) 明做任何限定。
實(shí)施例l新膚螨靈霜
本實(shí)施例的新膚螨靈為霜?jiǎng)?，?guī)格為15g。
本實(shí)施例對(duì)該新膚螨靈中是否含有甲硝唑進(jìn)行快速檢測(cè)，其具體步驟如
下
(1) 取新膚螨靈霜0.5g加入10ml—次性注射器中，用注射器吸取3%硫酸 溶液2ml，用0.45nm有機(jī)相濾頭替換針頭，用力振搖使混勻；
(2) 取石油醚II 4ml加入上述混勻后的液體中，用力振搖萃取，靜置使分
層；
(3) 取下層酸液作為供試液置試管中，加入氫氧化鈉固體試劑30mg，溶 液立即有紫紅色出現(xiàn)，則可判斷本實(shí)施例新膚螨靈中含有甲硝唑。
實(shí)施例2雨森痘痘怕排毒祛痘精華液
本實(shí)施例的雨森痘痘怕排毒祛痘精華液為水劑，規(guī)格為30ml。
本實(shí)施例對(duì)該雨森痘痘怕排毒祛痘精華液中是否含有甲硝唑進(jìn)行快速檢 測(cè)，其具體步驟如下
(1) 取雨森痘痘怕排毒祛痘精華液3ml加入10ml—次性注射器中，用注射 器吸取3X硫酸溶液2ml，用0.45(im有機(jī)相濾頭替換針頭，用力振搖使混勻；
(2) 取上述混勻后的液體作為供試液置試管中，加入氫氧化鈉固體試劑 30mg，溶液立即有紫紅色出現(xiàn)，則可判斷本實(shí)施例雨森痘痘怕排毒祛痘精華 液中含有甲硝唑?qū)嵤├?婦科千金栓
本實(shí)施例的婦科千金栓為消毒品，規(guī)格為6枚/盒。
本實(shí)施例對(duì)該婦科千金栓中是否含有甲硝唑進(jìn)行快速檢測(cè)，其具體歩驟如
下
(1) 取l粒婦科千金栓于試管中，加入3X硫酸溶液3ml，水浴加熱至栓劑 溶解，吸取溶液于10ml—次性注射器中，用0.45pm有機(jī)相濾頭替換針頭，用 力振搖使混勻；
(2) 取石油醚II4ml加入上述混勻后的液體中，用力振搖萃取，靜置使分
層；
(3) 取下層酸液作為供試液置試管中，加入氫氧化鈉固體試劑30mg，溶 液立即有紫紅色出現(xiàn)，則可本實(shí)施例的婦科千金栓巾含有甲硝唑。
實(shí)施例4彩琳止痘活膚潔面乳
本實(shí)施例的彩琳止痘活膚潔面乳為乳劑，規(guī)格為20g。 本實(shí)施例對(duì)該彩琳止痘活膚潔面乳中是否含有甲硝唑進(jìn)行快速檢測(cè)，其具 體步驟如下
(1) 取彩琳止痘活膚潔面乳0.5g加入10ml—次性注射器中，用注射器吸取 3X硫酸溶液2ml，用0.45(im有機(jī)相濾頭替換針頭，用力振搖使混勻；
(2) 取石油醚II 4ml加入上述混勻后的液體中，用力振搖萃取，靜置使分
層；
(3) 取下層酸液作為供試液置試管中，加入氫氧化鈉固體試劑30mg。溶 液無(wú)顏色變化，不顯紫紅色，則可判斷樣品中不含有甲硝唑。本實(shí)施例的救膚醫(yī)生除痘專家為水劑，規(guī)格為20ml。 本實(shí)施例對(duì)該彩琳止痘活膚潔面乳中是否含有甲硝唑進(jìn)行快速檢測(cè)，其具 體步驟如下(1) 取救膚醫(yī)生除痘專家3ml加入10ml—次性注射器中，用注射器吸取3 ^硫酸溶液2ml，用0.45pm有機(jī)相濾頭替換針頭，用力振搖使混勻；(2) 取上述混勻后的液體作為供試液置試管中，加入氫氧化鈉固體試劑 30mg，溶液無(wú)顏色變化，不顯紫紅色，則可判斷樣品中不含有甲硝唑。
權(quán)利要求
1、一種甲硝唑的快速檢測(cè)方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)向待測(cè)樣品中加入酸液，混勻；(2)向上述混合液中加入有機(jī)溶劑，振搖萃取，靜置使分層；(3)取上述萃取液的下層酸液，向其中加入氫氧化鈉固體，根據(jù)溶液的顏色變化判斷待測(cè)樣品中是否含有甲硝唑。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述檢測(cè)方法，其特征在于歩驟(1)屮，所述酸液為 硫酸、醋酸、鹽酸。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)中所述有機(jī)溶劑 為石油醚、氯仿。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1)中，所述酸液的 用量為2 3ml。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)方法，其特征在于所述酸液為3體積％硫酸溶液。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑為石油醚n。
7、 一種檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒是利用權(quán)利要求l所述檢測(cè)方法 檢測(cè)甲硝唑，該試劑盒包含3體積％硫酸溶液、石油醚II和固體氫氧化鈉。
8、 權(quán)利要求1所述檢測(cè)方法在檢測(cè)化妝品、消毒劑中添加甲硝唑上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種甲硝唑的快速檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑盒和在檢測(cè)化妝品、消毒劑中添加甲硝唑上的應(yīng)用，該檢測(cè)方法是先對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行酸溶解富集然后有機(jī)溶劑進(jìn)一步純化分離，最后用堿顯色，根據(jù)顏色變化來(lái)判斷樣品中是否含有甲硝唑。本發(fā)明的檢測(cè)方法可針對(duì)化妝品、消毒劑中是否添加有甲硝唑進(jìn)行快速檢測(cè)，檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，不需要大型儀器，檢測(cè)成本低。本發(fā)明的方法采用酸和有機(jī)溶劑兩步純化，使得甲硝唑濃濃縮富集保證了堿顯色的正確率。本發(fā)明的堿顯色反應(yīng)采用氫氧化鈉固體，利用氫氧化鈉溶解所釋放的熱量達(dá)到顯色反應(yīng)的溫度，省去了水浴設(shè)備，更加有利于基層現(xiàn)場(chǎng)的流動(dòng)性檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07D233/94GK101504372SQ200910037870
公開(kāi)日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月12日
發(fā)明者李楊杰, 蔣忠軍 申請(qǐng)人:廣東省藥品檢驗(yàn)所