專利名稱：瑞香狼毒提取物及其抗腫瘤作用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥瑞香狼毒的新的提取物及其提取方法與用途。
背景技術：
瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)為瑞香科狼毒屬植物的根，是狼毒中的正 品，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂其性味辛、苦，平，有毒，入肺、肝、脾經(jīng)，具有“逐水祛痰散結”的 功能，主治“積聚飲食，寒熱水氣”。清 張志聰《本草崇原》注曰“破積聚，則飲食壅滯而為 寒熱之病，亦可治矣?！睂O思邈注“積聚者，氣道不行故耳。飲食寒熱者，氣失其治，氣滯水 蓄，此藥辛可開之。”李時珍因其“有毒”故在《本草綱目》中將其列為下品。南北朝 梁 甄 權的《藥性論》定其性味為“苦，辛，有毒?！绷?陶弘景在《名醫(yī)別錄》中記載狼毒“除胸下 積癖。”《圣惠方》以狼毒丸治積聚，心腹脹如鼓者，用狼毒為主藥?！堆a闕肘后方》治卒心腹 癥堅，兩脅下有氣結者，用狼毒為主藥。統(tǒng)計公元618-1911年間包含狼毒的方劑共約109張，其中以治療痰證、積聚等疑 難雜癥者居多。在我國民間，也有不少利用狼毒治療胃癌、肝癌、食管癌、乳腺癌腫瘤、甲狀 腺癌等惡性腫瘤的驗方。臨床上也有多篇文獻報道，瑞香狼毒提取物治療惡性腫瘤獲得良 效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗腫瘤作用，故國內(nèi)眾多學者對該中藥潛在的重要藥 用價值寄予厚望。近年來，國內(nèi)外來對瑞香狼毒化學與藥理學研究方興未艾。瑞香狼毒主要含有二 萜類、香豆素類、木脂素類及黃酮類化學成分，其中瑞香烷類化合物等萜類化合物是該中藥 特有的且具備較好的抗腫瘤生物活性，目前尚未獲得該類化合物的有效部位，現(xiàn)有文獻中的提取物有些屬于治標不治本，有些使用價格昂貴的成分，有些在開 發(fā)過程中由于療效不確切而中斷開發(fā)。本發(fā)明提供了一種療效確切、安全方便、副作用小、價格低廉的純中藥提取物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種狼毒提取物，所述提取物采用無水乙醇提取，得到一級提取物，將 一級提取物進一步采用大孔樹脂柱或聚酰胺柱層析，用水和乙醇洗脫得到二級提取物，二 級提取物中用大孔樹脂柱分離的二級提取物進一步采用聚酰胺柱層析，用水和乙醇洗脫得 到三級提取物，全部三個級別的提取物均屬于本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明的一級提取物制備方法如下狼毒藥材加乙醇，回流提取，提取液減壓回收乙醇，濃縮得到提取物2。本發(fā)明的二級提取物制備方法如下提取物2上大孔樹脂HPD100，依次用水、40%乙醇、80%乙醇洗脫，分別收集并分 別濃縮得到提取物3、4、5。提取物2上聚酰胺柱，依次用水、30%乙醇、60%乙醇、100%乙醇洗脫，分別收集并分別濃縮得到提取物15、16、17、18。本發(fā)明的三級提取物制備方法如下取提取物5上聚酰胺柱，依次用水、30 %乙醇、60 %乙醇、100 %乙醇洗脫，分別收 集并分別濃縮得到提取物11、12、13、14。本發(fā)明的一級提取物具體制備方法如下狼毒藥材500g加無水乙醇2L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇，水浴干燥后，減壓干燥(70°C )，得提取物2。本發(fā)明的二級提取物具體制備方法如下狼毒藥材2000g，加無水乙醇7L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮至 1/5體積，加等體積的水，揮發(fā)至無醇味，上大孔樹脂HPD100 (3. 3kg)，依次用水、40%乙醇、 80%乙醇各2. 5倍柱體積洗脫，水浴干燥后，減壓干燥(70°C )，分別得到提取物3、4、5。提取物2 (10. 0g)上聚酰胺柱(柱體積900ml，約280g，聚酰胺預處理)，依次用水、 30 %乙醇、60 %乙醇、100 %乙醇分別洗3個柱體積，減壓回收乙醇，水浴蒸干，真空常溫干 燥，分別得到提取物15、16、17、18。本發(fā)明的三級提取物具體制備方法如下取提取物5 (10. 0g)上聚酰胺柱(柱體積900ml，約280g，聚酰胺預處理)，依次用 水、30 %乙醇、60 %乙醇、100 %乙醇分別洗3個柱體積，減壓回收乙醇，水浴蒸干，真空常溫 干燥，分別得到提取物11、12、13、14。因此本發(fā)明的提取物包括，提取物2，提取物3，提取物4，提取物5，提取物15，提取 物16，提取物17，提取物18，提取物11，提取物12，提取物13，提取物14。以上本發(fā)明的提取物經(jīng)過試驗證明具有優(yōu)良的抗腫瘤活性，本發(fā)明還提供用本發(fā)明的提取物作為藥物活性成分制備成的藥物組合物，本發(fā)明 的藥物組合物，包括有效組分，根據(jù)需要該組合物還可以加入藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，是單位劑量的藥物制劑形式，所述單位劑量形式是指制劑的單 位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等。本發(fā)明的組合物其中的有效組分，其在制劑中所占重量百分比可以是 0. 1-99.9%，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，通過將上述有效組分和藥物可接受的載體混合制備得到。本發(fā)明的組合物，其藥物制劑形式可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片 劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒 劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜 劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的制劑，優(yōu)選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒 齊U、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。本發(fā)明的組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、 稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包 括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬 脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉?？赏ㄟ^混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進行反復混合可使活
5性物質分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑， 或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含 有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基 纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉 伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性 酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需 要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質和無菌載體。根據(jù)載體 和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質溶解在一種載 體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉 齊U、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這 種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的組合物，在制備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所 述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半 胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA 二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、 磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽 糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍 生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、 聚乙二醇、環(huán)糊精、3 _環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的組合物在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次 1-20劑，如1-20袋或?；蚱?。以下通過實驗數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果。瑞香狼毒提取物(提取物2、5、13、17)體內(nèi)藥效作用觀察1.實驗材料1.1實驗動物SPF級昆明種小鼠，雄性，6-8周齡，體重18_22g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院 實驗動物中心提供，許可證號SCXK (軍)2007-004。飼養(yǎng)在清潔級實驗動物房，室溫20°C， 相對濕度60%。1. 2移植瘤株小鼠H22肝癌細胞，購自中科院腫瘤細胞庫，由中國中醫(yī)科學院中藥研究所實驗 動物中心傳代保存。1. 3實驗試劑環(huán)磷酰胺(CTX)片天津金世制藥有限公司產(chǎn)品，批號20070201 ；氟尿嘧啶(5-Fu)注射液上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號080401 ；羧甲基纖維素鈉北京市東環(huán)聯(lián)合化工廠生產(chǎn)，批號971230 ；吐溫-80 廣州南方化玻公司分裝產(chǎn)品，批號021204 ；1. 4受試藥物灌胃法給藥時，受試藥以適量吐溫-80溶解后以0. 5%羧甲基纖維素鈉溶液混懸，吐溫-80終濃度為0. 5% ；溶劑對照組為含0. 5%吐溫-80與0. 5%羧甲基纖維素鈉溶液。 提取物5、13、17腹腔注射法給藥時，受試藥以適量吐溫-80溶解后用無菌生理鹽水定容至 所需濃度，吐溫-80終濃度為0. 5% ；溶劑對照組為含0. 5%吐溫-80的生理鹽水溶液。環(huán) 磷酰胺片為灌胃給藥法陽性對照，研成粉末后用0. 5%羧甲基纖維素鈉溶液混懸；氟尿嘧 啶注射液為腹腔注射給藥法陽性對照，原包裝濃度0. 25g/10ml，用無菌生理鹽水稀釋至所 需濃度。2.實驗方法2. 1皮下移植瘤模型建立按無菌操作程序，取腹腔接種H22 (第7-9天)的昆明種小鼠，腹部皮毛依次以碘 酒消毒、醫(yī)用酒精脫碘后，用無菌針筒從腹腔中抽取腫瘤細胞懸液，細胞懸液經(jīng)0.2%臺盼 蘭染色后計算活細胞數(shù)> 95%，加入無菌生理鹽水調(diào)整瘤細胞懸液胞濃度為lX107/ml， 接種至實驗小鼠的右腋皮下，每只0. 2ml。2. 3皮下移植瘤H22小鼠模型灌胃給藥法腫瘤抑制作用觀察皮下移植瘤H22小鼠模型建立后，提取物2高、中、低劑量組劑量分別為2g/kg、lg/ kg、0. 5g/kg(以生藥量計，下同)；提取物5、13、17高劑量組均取16g/kg，中、低劑量組分別 為8g/kg、4g/kg。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥10d，末次給藥次日稱重、處死小鼠，剝?nèi)∧[ 瘤、胸腺與脾臟并稱重，計算抑制率、瘤重系數(shù)、脾臟與胸腺指數(shù)。計算公式如下抑瘤率(％ )=(對照組平均瘤重_給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重X 100 % 瘤重系數(shù)=瘤重/小鼠體重；脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)重量/小鼠體重2. 3皮下移植瘤H22小鼠模型腹注給藥法腫瘤抑制作用觀察皮下移植瘤H22小鼠模型建立后，提取物5、13、17高劑量組取250mg/kg，中、低劑 量組分別為125mg/kg、62. 5mg/kg。腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)給藥10d，末次給藥次日 稱重、處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤、胸腺與脾臟并稱重，計算抑制率、瘤重系數(shù)、脾臟與胸腺指數(shù)。3.實驗結果3. 1瑞香狼毒提取物2體內(nèi)藥效作用觀察實驗結果表明提取物2的高劑量組對小鼠皮下移植瘤H22有顯著抑制作用(p < 0. 01)，抑瘤率為36. 24% ；中劑量組對H22抑制作用也具有統(tǒng)計意義(p < 0. 05)。見表 1。表1瑞香狼毒提取物提取物2灌胃給藥對皮下移植瘤H22的影響 注與溶劑對照組相比，*P <0. 05, **P < 0.013. 2灌胃給藥法提取物5、13、17對移植瘤H22的抑制作用灌胃給藥法提取物5、13、17對小鼠皮下移植瘤H22均有一定抑制作用，提取物5 高劑量組與提取物13中劑量組具有顯著抑瘤效果(P < 0. 01)，提取物5中劑量組、提取物 17中、高劑量組與提取物13低劑量組抑瘤作用具有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05)。提取物5對 H22的抑制作用具有良好的劑量依賴關系；提取物17中劑量(8g/kg)的抑瘤率(32. 36% ) 與提取物13中劑量(8g/kg)的抑瘤率(38. 11%).見表2。表2瑞香狼毒提取物5、13、17灌胃給藥對皮下移植瘤H22的影響( 注與浴劑對照組相比，*P <0. 05, **P < 0.013. 3腹注給藥法提取物5、13、17對移植瘤H22抑制的作用提取物5、13、17腹注給藥法對移植瘤H22具有較好的抑制效果，且具有一定的劑量依賴關系，其中提取物17對H22的抑制作用最強，劑量250mg/kg(折合成生藥量)時的 抑瘤率為48. 35%，且劑量依賴關系良好。提取物5、17在中高劑量時出現(xiàn)體重明顯降低的 情況。見表3。 表3瑞香狼毒提取物5、13、17腹腔注射給藥對皮下移植瘤H22的影響(又封) 瑞香狼毒提取物抑制人肝癌細胞株BEL-7402裸鼠皮下移植瘤的實驗研究1.實驗材料1. 1細胞株人肝癌細胞BEL-7402，為中國藥科大學新藥篩選中心惠贈。1.2實驗動物SPF級BALB/C裸小鼠，雌性，日齡35-40天，體重18_22g，由上海斯萊克實驗動物 有限責任公司提供。合格證編號滬動合證字122號。飼養(yǎng)在萬級屏障系統(tǒng)(SPF級)，室 溫25 °C，相對濕度60%。1. 3 藥物受試藥提取物17。配制以適量吐溫-80溶解后用無菌生理鹽水定容至所需濃度，吐溫-80終濃度為 0. 5% ；溶劑對照組為含0. 5%吐溫-80的生理鹽水溶液。陽性藥物氟尿嘧啶注射液，上海 旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號080401，原包裝濃度0. 25g/10ml，用無菌生理鹽水稀釋 至所需濃度。2.實驗方法2. 1皮下移植瘤BEL-7402裸小鼠模型建立
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由人肝癌BEL-7402細胞株接種于裸小鼠皮下而建立。細胞接種量為3 X 106，接種 形成移植瘤后再在裸小鼠體內(nèi)傳3代后使用。2. 2皮下移植瘤模型腫瘤觀察瑞香狼毒提取物體內(nèi)對人來源肝癌BEL-7402的抑 制作用參考文獻[19]取生長旺盛期的BEL-7402瘤組織剪切成1. 5mm3左右，在無菌條件 下，接種于裸小鼠右側腋窩皮下。裸小鼠移植瘤用游標卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至 100 300mm3后將動物體重與腫瘤體積進行配對后隨機分5組，溶劑對照組動物12只，陽 性對照組與提取物17給藥組各6只。使用測量瘤徑的方法，動態(tài)觀察被試物抗腫瘤的效應。 腫瘤直徑的測量次數(shù)為每周3次，每次測量同時稱鼠重。提取物17給藥劑量分別為250mg/ kg (高劑量，折合成生藥量，下同)、187. 5mg/kg (中劑量)、125mg/kg (低劑量)；陽性對照組 5-Fu注射液20mg/kg;溶劑對照組同時給等量含助溶劑的溶液，均為腹腔注射給藥，每周給 3次，給藥第21天，解剖裸鼠，剝?nèi)∧[瘤與脾臟，稱重，并按后續(xù)實驗要求留取腫瘤標本。附檢測指標及計算方法1)腫瘤體積(tumor volume, TV)，計算公式為TV = l/2XaXb2(其中 a、b 分別 表示長寬)；2)相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，計算公式為RTV = TVt/TVQ (其 中TV0為分籠給藥時，即屯腫瘤體積，TVt為每一次測量時的腫瘤體積)。3)相對腫瘤增殖率T/C(% )，計算公式為T/C(% ) = Tetv/CetvX 100 (Tetv 治療組 RTV;Cktv 陰性對照組RTV)。試驗結果以相對腫瘤增殖率T/C(% )作為抗腫瘤活性的評價指標(參考《細胞毒 類抗腫瘤藥物非臨床研究技術指導原則》)。3.實驗結果提取物17腹腔注射給藥高、中劑量對人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤有較強的生 長抑制作用，T/C分別為52. 65%,59. 94%；低劑量對人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤抑制作 用較弱，T/C為71. 60%。陽性對照組5-Fu腔注射給藥20mg/kg對人肝癌BEL-7402裸小鼠 移植瘤有較強的生長抑制作用，T/C為46. 11%。提取物17對荷瘤裸小鼠的體重影響很大，高劑量組體重下降非常明顯，第一次給 藥后體重與溶劑對照組低2.5g左右(平均體重分別為17.47g、19.94g)，之后，每次給藥前 稱取的體重均在17. 5g左右波動；中、低劑量組在給藥初期體重也見明顯降低，之后略有回 升，一般在隔2天給藥時稱重發(fā)現(xiàn)體重回升明顯，而連續(xù)兩次隔天給藥后小鼠體重丟失現(xiàn) 象又重現(xiàn)，以致根據(jù)時間_體重繪制的曲線呈現(xiàn)波形變化趨勢。見表4、5，圖5、6與圖7。表4提取物17用藥前后人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤相對增殖率變化
10 注d0為分籠給藥時間，d21為給藥第21天；與溶劑對照組相比，*P < 0. 05, **P <0.01 ；與陽性對照組相比，AAP < 0. 01。表5.提取物17對人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤的抑制作用與脾臟指數(shù)的影響 注與溶劑對照組相比，*P <0. 05, **P < 0.01瑞香狼毒提取物對體外培養(yǎng)人來源肝癌細胞的抑制作用的半數(shù)有效濃度瑞香狼毒提取物2對人來源的肝癌細胞H印G2、BEL-7402、SMMC-7721的抑制作用 較弱，在200ii g/ml時抑制率能達到80%左右，但lOOii g/ml以下藥物濃度對腫瘤細胞的 抑制率急劇下降，線性回歸法計算IC5(1 > 100ug/ml ；提取物5、13、17對肝癌細胞H印G2、 BEL-7402,SMMC-7721均有較好的抑制作用，100 u g/m藥物濃度時其抑制率均在80%以上， IC5(1均在40i!g/ml以下，其中提取物17抑制作用最強。見表6。表6瑞香狼毒提取物體外對人來源肝癌細胞的抑制作用的IC5(1(單位y g/ml) 瑞香狼毒提取物對TGF- 0信號通路的影響實驗一
1.實驗材料1.1細胞株IfepG2細胞系(轉染TGF-0基因的穩(wěn)定細胞株)由美國耶魯大學醫(yī)學院藥理系建 立；人肝癌細胞BEL-7402，由中國藥科大學新藥篩選中心惠贈。1.2試劑儀器熒光素酶試劑盒美國Promega產(chǎn)品Cat. #4550 ；報告基因被動裂解液美國Promega產(chǎn)品Cat. #E153A ；TECAN Safire-2多功能酶標儀瑞士帝肯公司。1.3 藥物受試藥提取物2、5、13、17。配制樣品精確稱量后溶于DMS0中，然后以PBS液配成10 X母液，DMS0終濃度 < 0. 1%，現(xiàn)配現(xiàn)用。加藥時以細胞培養(yǎng)溶液稀釋成不同濃度。2.實驗方法熒光報告基因法篩選瑞香狼毒提取物對腫瘤細胞作用的靶標基因1)鋪板在96孔板中種入H印G2細胞(轉染了 TGF-0的穩(wěn)定細胞株)，5X 104/ 孔，培基采用無酚紅的RPMI與10% FBS ；2)在恒溫培養(yǎng)箱(37°C ,4% C02)孵育48h，細胞融合；3)換液，加藥受試藥終濃度為 0,0. 375u g/mlU. 25y g/ml、3. 75 u g/ml ；4)繼續(xù)孵育lh;5)加入2ng/mlTGF-0到經(jīng)藥處理后的細胞內(nèi)；6)孵育 4h;7)加入20 ill 5X報告基因被動裂解液；8)培養(yǎng)板-70°C冷凍過夜；。9)小心刮下所有的裂解細胞，用移液器將30 u 1裂解上清移入96孔酶標板；10)加入30 u 1熒光素酶在激發(fā)波長430nm、發(fā)射波長550nm設置下，使用TECAN 公司的多功能酶標儀檢測熒光強度。3.實驗結果提取物5、13、17對高濃度的TGF-0具有顯著下調(diào)作用，結果見圖8。實驗二1.提取物17對體外培養(yǎng)的BEL-7402細胞Smad4與p_Akt蛋白表達的影響提取物17能顯著抑制體外培養(yǎng)的肝癌細胞BEL-7402內(nèi)TGF-0信號通路下游因 子p-Akt與Smad4蛋白表達。用藥后p_Akt蛋白表達下降極其顯著，在12. 5 y g/ml時表達 與對照組相比就下降了 1/2左右，藥物濃度在25 y g/ml時p-Akt表達下降幅度最大，為對 照組的1/7左右。Smad4用藥后下降具有明顯的劑量依賴關系在12. 5 u g/ml藥物濃度時 Smad4表達下降不明顯，25ii g/ml時降至對照組的1/3左右，50 y g/ml時Smad4蛋白含量極 低。可見，用藥后P-Akt與Smad4蛋白表達均呈現(xiàn)下降趨勢，p_Akt在較低藥物濃度即出現(xiàn) 明顯抑制的改變；藥物濃度25 u g/ml時，p-Akt與Smad4相對含量都顯著降低且前者較后 者低，可能是提取物17通過TGF-0信號通路網(wǎng)絡對細胞成活與死亡調(diào)節(jié)很關鍵的藥物濃 度。見圖9、10與表7。
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表7提取物17用藥前后體外培養(yǎng)BEL-7402細胞Smad4與p_Akt蛋白相對含量 實驗三1.提取物17對BEL-7402皮下移植瘤組織Smad4與T 0 R_I陽性表達的影響裸小鼠皮下人肝癌BEL-7402移植瘤組織內(nèi)，Smad4與T 0 R_I的陽性表達分級在 “+ ++”指間，受試藥各劑量組陽性表達下降，并出現(xiàn)1/6 1/3的陰性表達。見表8，9與 圖 11，12。表8提取物17對BEL-7402移植瘤組織Smad4陽性表達的影響(n = 6) 表9提取物17對BEL-7402移植瘤組織T ^ R-I陽性表達的影響(n = 6) 2.提取物17對BEL-7402皮下移植瘤組織Smad4mRNA表達的影響裸小鼠皮下移植瘤BEL-7402Smad4mRNA與GAPDH mRNA的比值為0. 92 士 0. 09，提取 物17各劑量組均能下調(diào)Smad4mRNA的表達，低劑量組比值降至0. 77士0. 14，且有統(tǒng)計學差 異(P < 0. 05)。藥物可能通過作用于信號通路Smad4上游的因子而下調(diào)了 Smad4mRNA的 表達，但在一定劑量下Smad4mRNA達到一個坪值，繼續(xù)提高藥物劑量不再繼續(xù)下降；且mRNA 表達下降的幅度沒有體外培養(yǎng)細胞蛋白表達水平明顯，可見受試藥對Smad4的抑制并非主 要在轉錄環(huán)節(jié)，可能對蛋白的合成與降解產(chǎn)生了重要影響。見表10。表10提取物17用藥前后BEL-7402移植瘤組織Smad4/GAPDH比值的變化(n = 6) 注與溶劑對照組相比，*P < 0. 05“其它提取物對小鼠皮下移植瘤H22的抑瘤率在30%左右”。本發(fā)明的有益效果為1.本發(fā)明的提取分離工藝中有效地除去了雜質，提高有效成分的含量，能快速準 確的得到有效成分。2.本發(fā)明提供的提取物化學成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機 制，在生產(chǎn)中更易于藥物的質量控制。本發(fā)明提供的方法首次從藥材中得到有效組分，并首次將其在多種腫瘤細胞株上 進行藥效篩選，由于成分確切，含量明確，制備工藝便捷，活性好，適宜開發(fā)成抗腫瘤中藥新藥。


圖1提取物2化學指紋圖譜圖2提取物5化學指紋圖譜圖3提取物13化學指紋圖譜圖4提取物17化學指紋圖譜圖5提取物17對人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤的實驗治療作用圖6提取物17對人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤的實驗治療作用圖7提取物17對荷瘤裸小鼠體重增長的影響圖8提取物2、5、13、17對高濃度的TGF-0具有顯著下調(diào)作用圖9提取物17用藥前后體外培養(yǎng)BEL-7402細胞Smad4與p_Akt蛋白表達圖10提取物17用藥前后BEL-7402細胞Smad4與p_Akt蛋白相對含量比較圖11BEL-7402移植瘤組織Samd4免疫組化圖片(X 200)圖12BEL-7402移植瘤組織T 0 R-I免疫組化圖片(X200)
具體實施例方式下面將結合本發(fā)明的實施例進一步詳細說明本發(fā)明的實質內(nèi)容，該實施例僅用于 說明本發(fā)明而對本發(fā)明并沒有限制。實施例1狼毒藥材500g加無水乙醇2L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙 醇，水浴干燥后，減壓干燥(70°C )，得提取物2。狼毒藥材2000g，加無水乙醇7L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮至 1/5體積，加等體積的水，揮發(fā)至無醇味，上大孔樹脂HPD100 (3. 3kg)，依次用水、40%乙醇、 80%乙醇各2. 5倍柱體積洗脫，水浴干燥后，減壓干燥(70°C )，分別得到提取物3、4、5。提取物2(10. 0g)上聚酰胺柱(柱體積900ml，約280g，聚酰胺預處理)，依次用水、 30 %乙醇、60 %乙醇、100 %乙醇分別洗3個柱體積，減壓回收乙醇，水浴蒸干，真空常溫干 燥，分別得到提取物15、16、17、18。取提取物5(10. 0g)上聚酰胺柱(柱體積900ml，約280g，聚酰胺預處理)，依次用 水、30 %乙醇、60 %乙醇、100 %乙醇分別洗3個柱體積，減壓回收乙醇，水浴蒸干，真空常溫 干燥，分別得到提取物11、12、13、14。
權利要求
一種瑞香狼毒的提取物，包括三級提取物，其特征在于，瑞香狼毒藥材采用無水乙醇提取，得到一級提取物，將一級提取物進一步采用大孔樹脂柱或聚酰胺柱層析，用水和乙醇洗脫得到二級提取物，二級提取物中用大孔樹脂柱層析分離的二級提取物進一步采用聚酰胺柱層析，用水和乙醇洗脫得到三級提取物。
2.權利要求1的提取物，其特征在于，其中 一級提取物制備方法如下狼毒藥材加乙醇，回流提取，提取液減壓回收乙醇，濃縮得到提取物2 ； 二級提取物制備方法如下提取物2上大孔樹脂HPD100，依次用水、40 %乙醇、80 %乙醇洗脫，分別收集并分別濃 縮得到提取物3、4、5 ；提取物2上聚酰胺柱，依次用水、30%乙醇、60%乙醇、100%乙醇洗脫，分別收集并分 別濃縮得到提取物15、16、17、18 ； 三級提取物制備方法如下取提取物5上聚酰胺柱，依次用水、30%乙醇、60%乙醇、100%乙醇洗脫，分別收集并 分別濃縮得到提取物11、12、13、14。
3.權利要求2的提取物，其特征在于，其中 一級提取物制備方法如下狼毒藥材500g加無水乙醇2L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇，水 浴干燥后，減壓干燥，得提取物2 ； 二級提取物制備方法如下狼毒藥材2000g，加無水乙醇7L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮至1/5 體積，加等體積的水，揮發(fā)至無醇味，上大孔樹脂HPD100，依次用水、40%乙醇、80%乙醇各 2. 5倍柱體積洗脫，水浴干燥后，減壓干燥，分別得到提取物3、4、5 ；提取物2上聚酰胺柱，依次用水、30%乙醇、60%乙醇、100%乙醇分別洗3個柱體積，減 壓回收乙醇，水浴蒸干，真空常溫干燥，分別得到提取物15、16、17、18 ； 三級提取物制備方法如下取提取物5上聚酰胺柱，依次用水、30%乙醇、60%乙醇、100%乙醇分別洗3個柱體積， 減壓回收乙醇，水浴蒸干，真空常溫干燥，分別得到提取物11、12、13、14。
4.權利要求3的提取物，其特征在于，其中 一級提取物制備方法如下狼毒藥材500g加無水乙醇2L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇，水 浴干燥后，減壓干燥(70°C )，得提取物2 ； 二級提取物制備方法如下狼毒藥材2000g，加無水乙醇7L，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮至1/5 體積，加等體積的水，揮發(fā)至無醇味，上大孔樹脂HPD100 (3. 3kg)，依次用水、40%乙醇、80% 乙醇各2. 5倍柱體積洗脫，水浴干燥后，減壓干燥(70°C )，分別得到提取物3、4、5 ；提取物2 (10. Og)上聚酰胺柱(柱體積900ml，約280g，聚酰胺預處理)，依次用水、30% 乙醇、60%乙醇、100%乙醇分別洗3個柱體積，減壓回收乙醇，水浴蒸干，真空常溫干燥，分 別得到提取物15、16、17、18 ；三級提取物具體制備方法如下取提取物5 (10. Og)上聚酰胺柱(柱體積900ml，約280g，聚酰胺預處理)，依次用水、 30 %乙醇、60 %乙醇、100 %乙醇分別洗3個柱體積，減壓回收乙醇，水浴蒸干，真空常溫干 燥，分別得到提取物11、12、13、14。
5.權利要求1的提取物，其特征在于，包括，提取物2，提取物3，提取物4，提取物5，提 取物15，提取物16，提取物17，提取物18，提取物11，提取物12，提取物13，提取物14。
6.含有權利要求1的提取物的藥物組合物。
7.權利要求6的藥物組合物，其特征在于，是任何可藥用的劑型。
8.權利要求7的藥物組合物，其特征在于，是注射劑。
9.權利要求1的提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
10.權利要求1的提取物在制備對TGF-β具有下調(diào)作用的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及瑞香狼毒提取物及其抗腫瘤作用，本發(fā)明所述的瑞香狼毒提取物采用無水乙醇提取，得到一級提取物，將一級提取物進一步采用大孔樹脂柱或聚酰胺柱層析，用水和乙醇洗脫得到二級提取物，二級提取物中用大孔樹脂柱分離的二級提取物進一步采用聚酰胺柱層析，用水和乙醇洗脫得到三級提取物。
文檔編號A61P35/00GK101926844SQ200910150669
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權日2009年6月25日
發(fā)明者劉安, 朱曉新, 李玉潔, 楊慶, 潘國鳳, 翁小剛 申請人:中國中醫(yī)科學院中藥研究所