專利名稱：對(duì)過度增殖疾病的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)過度增殖疾病的治療的聯(lián)合化學(xué)療法，和有效地用于此方法的制劑。
背景技術(shù)：
通常認(rèn)為芬維A胺(fenretinide)[HPR；全反式-(4-羥基苯基)維安酰胺(retinamide)；CAS登記號(hào)65646-68-6]通過產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)而對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。見如D.Delia等，癌發(fā)生18,943-948(1997)；N.Oridata等，國(guó)立癌癥研究所雜志89,1191-1198(1997)。
授予Gibbs的美國(guó)專利U.S.4,665,098記載了有效地用于治療乳腺和膀胱癌的芬維A胺的藥物組合物。
授予Schwartz等的美國(guó)專利U.S.5,821,072提供了-種篩選能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡的蛋白激酶C抑制劑的方法，及篩選適于與能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡的蛋白激酶C抑制劑聯(lián)合治療的抗癌治療劑的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明基于意外的發(fā)現(xiàn)，即適當(dāng)劑量的芬維A胺在人腫瘤細(xì)胞系內(nèi)產(chǎn)生增加的和持續(xù)的神經(jīng)酰胺。因此，可以通過服用對(duì)神經(jīng)酰胺產(chǎn)生的細(xì)胞毒性的細(xì)胞代謝和細(xì)胞控制過程進(jìn)行控制的藥劑(如神經(jīng)酰胺降解抑制劑)，以促進(jìn)芬維A胺和其他此類產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的視黃酸衍生物對(duì)抗過度增殖疾病的細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒活性(包括以下定義的瘤性和非瘤性的過度增殖疾病)。這些藥劑包括但不局限于葡糖基神經(jīng)酰胺合酶抑制劑，鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑和蛋白激酶C抑制劑，可以單獨(dú)服用或相互合用。以下給出了特定的例子。優(yōu)選地，視黃酸衍生物具有導(dǎo)致在腫瘤細(xì)胞中的壞死、細(xì)胞凋亡或二者的有效量，并且神經(jīng)酰胺降解抑制劑為能有效地增加在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生壞死、細(xì)胞凋亡或二者的量，大于單獨(dú)由視黃酸衍生物產(chǎn)生的效果，或大于預(yù)期由視黃酸衍生物和神經(jīng)酰胺降解抑制劑分別產(chǎn)生的作用之和(這包括兩種化合物以分別服用不產(chǎn)生活性的數(shù)量聯(lián)合，產(chǎn)生一種有效活性的情況)。
一種治療體內(nèi)過度增殖疾病的方法，包括服用有效治療量的聯(lián)合制劑(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的視黃酸衍生物，如芬維A胺或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑(包括其藥學(xué)上可接受的鹽)，如1-苯基-2-棕櫚酰氨基-3-嗎啉代-1-丙醇或其藥學(xué)上可接受的鹽。服用促進(jìn)視黃酸衍生物有效量的葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑，使得兩個(gè)化合物共用能具有有效的活性。優(yōu)選地，視黃酸衍生物的量為在腫瘤細(xì)胞中有效地產(chǎn)生壞死、細(xì)胞凋亡或二者的量，葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑的量為有效地促進(jìn)細(xì)胞中的壞死、細(xì)胞凋亡或二者的量，并且其作用大于單獨(dú)服用視黃酸衍生物，或大于視黃酸衍生物和葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑分別服用產(chǎn)生的作用之和。也可以服用此處所述的其它化合物。
也公開了一種治療機(jī)體過度增殖的方法，包括使機(jī)體服用有效治療量的聯(lián)合制劑(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的視黃酸衍生物，如芬維A胺或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑，如D-赤-N,N-二甲基鞘氨醇或其藥學(xué)上可接受的鹽。服用能有效促進(jìn)視黃酸衍生物活性的量的鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑，使得兩個(gè)化合物一起具有有效的活性。優(yōu)選的，視黃酸衍生物的量為在腫瘤細(xì)胞中有效地產(chǎn)生壞死、細(xì)胞凋亡或二者的量，鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑的量為在腫瘤細(xì)胞中有效地產(chǎn)生壞死、細(xì)胞凋亡或二者的量，并且其作用大于單獨(dú)服用視黃酸衍生物，或大于視黃酸衍生物和鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑分別服用產(chǎn)生的作用之和。
也公開了一種治療機(jī)體過度增殖的方法，包括使機(jī)體服用有效治療量的聯(lián)合制劑(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的視黃酸衍生物，如芬維A胺或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)蛋白激酶C抑制劑，如L-蘇-二氫鞘氨醇或其藥學(xué)上可接受的鹽。服用促進(jìn)視黃酸衍生物活性的有效量的蛋白激酶C抑制劑，使得兩個(gè)化合物一起具有有效的活性。優(yōu)選的，視黃酸衍生物的量為在腫瘤細(xì)胞中有效地產(chǎn)生壞死、細(xì)胞凋亡的量或二者的量，蛋白激酶C抑制劑的量為在腫瘤細(xì)胞中有效地產(chǎn)生壞死、細(xì)胞凋亡或二者的量，并且其作用大于單獨(dú)服用視黃酸衍生物，或大于視黃酸衍生物和蛋白激酶C抑制劑分別服用產(chǎn)生的作用之和。
也公開了一種治療機(jī)體過度增殖的方法，包括使機(jī)體服用有效治療量的聯(lián)合制劑(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)至少兩種(如2或3)選自以下的化合物(ⅰ)葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑，(ⅱ)鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑，和(ⅲ)蛋白激酶C抑制劑。服用能有效地促進(jìn)類視色素活性的量的至少兩種化合物，使得這些化合物一起能產(chǎn)生有效的活性。此至少兩種化合物可以是相同或不同類別的。在一個(gè)實(shí)施方案中，此至少兩種化合物含有葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑和鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑。在另一實(shí)施方案中，此至少兩種化合物含有葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑和蛋白激酶C抑制劑。在另一實(shí)施例中，此至少兩種化合物含有鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑和蛋白激酶C抑制劑。在另一實(shí)施例中，此至少兩種化合物含有葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑、鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑和蛋白激酶C抑制劑。優(yōu)選的，視黃酸衍生物的量為在腫瘤細(xì)胞中有效地產(chǎn)生壞死、細(xì)胞凋亡或二者的量，至少兩種其他化合物的量為在腫瘤細(xì)胞中有效地促進(jìn)壞死、細(xì)胞凋亡或二者的量，并且其作用大于單獨(dú)服用視黃酸衍生物，或大于視黃酸衍生物和至少兩種其他化合物分別服用產(chǎn)生的作用之和。
進(jìn)行前述治療用的在單一藥物載體或賦形劑中含有上述化合物的組合的制劑，也是本發(fā)明的一個(gè)方面。
前述化合物在制備進(jìn)行上述治療的藥物中的用途，也是本發(fā)明的一個(gè)方面。
以下的附圖和說明書詳細(xì)描述了本發(fā)明的前述和其他目的和其他方面。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖解說明神經(jīng)酰胺和相關(guān)的前死亡途徑。
圖2圖解說明神經(jīng)酰胺的代謝途徑。
圖3說明在藥物敏感的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SMS-LHN中(實(shí)心圓)和在烷基化試劑和鬼臼乙叉甙神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系GHLA-90中(空心圓)，10μM芬維A胺(以HPR或H表示)對(duì)神經(jīng)酰胺生成的作用。
圖4說明芬維A胺(HPR；H)、L-蘇-二氫鞘氨醇(沙芬戈；S)，蛋白激酶C抑制劑和1-苯基-2-棕櫚酰氨基-3-嗎啉代-1-丙醇(PPMP；P)，葡糖基神經(jīng)酰胺合酶抑制劑的各種組合，在不同濃度，對(duì)在高HPR抗性的細(xì)胞系(SK-N-RA)中細(xì)胞存活的影響。實(shí)心圓代表沙芬戈和ppmp的組合；空心圓代表芬維A胺和沙芬戈的組合；實(shí)心三角代表芬維A胺和ppmp的組合；空心三角代表芬維A胺、沙芬戈和ppmp的組合。劑量表示在橫軸上。
圖5說明固定劑量為10μM的芬維A胺，與不同的所示劑量的化合物的各種組合，對(duì)SK-N-RA細(xì)胞的存活的影響。T或他莫昔芬指檸檬酸他莫昔芬。標(biāo)以H+P的實(shí)心圓代表芬維A胺和ppmp，標(biāo)以H+T的空心圓代表芬維A胺和他莫昔芬；標(biāo)以H+S的實(shí)心圓代表芬維A胺和沙芬戈；標(biāo)以H+S+T的空心圓代表芬維A胺和沙芬戈和他莫昔芬(1∶1)；實(shí)心三角代表芬維A胺和3μM他莫昔芬和沙芬戈。其它劑量表示在橫軸上。
圖6顯示低劑量的芬維A胺與其他化合物的組合對(duì)SK-N-RA細(xì)胞存活率的活性。實(shí)心圓代表3.3μM芬維A胺加沙芬戈；空心圓代表3.3μM芬維A胺加PPMP；實(shí)心三角代表PPMP加沙芬戈(1∶1)而沒有芬維A胺；空心三角代表3.3μM芬維A胺加PPMP加沙芬戈(1∶1)。其他劑量表示在橫軸上。
圖7顯示了各種藥物組合對(duì)SK-N-RA細(xì)胞存活率的影響。N-DMS(或N)指d-赤-N,N-二甲基鞘氨醇，一種鞘氨醇激酶抑制劑。實(shí)心圓代表N-DMS加ppmp；空心圓代表芬維A胺加ppmp；實(shí)心三角代表芬維A胺加N-DMS；空心三角代表芬維A胺加N-DMS加ppmp。劑量表示在橫軸上。
圖8說明各種藥物組合對(duì)SK-N-RA細(xì)胞存活的活性。標(biāo)以HPR的實(shí)心圓代表芬維A胺，標(biāo)以N-DMS的空心圓代表N-DMS；實(shí)心三角代表HPR加N-DMS；標(biāo)以10μMH+N的實(shí)心圓代表10μM固定劑量的芬維A胺加N-DMS；標(biāo)以5μM H+P+N的空心圓代表5μM固定劑量的芬維A胺加5μM ppmp加N-DMS。實(shí)線代表芬維A胺加ppmp。所標(biāo)出的劑量是固定的；其他劑量表示在橫軸上。
圖9說明藥物組合對(duì)SK-N-RA細(xì)胞存活的活性。實(shí)心圓代表芬維A胺，空心圓代表芬維A胺加N-DMS(3∶1)；實(shí)心三角代表芬維A胺加沙芬戈(3∶1)；空心三角代表芬維A胺加N-DMS加沙芬戈(3∶1∶1)。劑量表示在橫軸上。
圖10說明用HPR(芬維A胺)和沙芬戈處理的CHLA-90細(xì)胞，在不同的時(shí)間間隔去掉沙芬戈，并在所示的時(shí)間代之以預(yù)平衡的僅含HPR的培養(yǎng)基。
圖11說明用HPR和沙芬戈處理的sk-N-RA細(xì)胞，在不同的時(shí)間間隔去掉沙芬戈，并在所示的時(shí)間代之以預(yù)平衡的僅含HPR的培養(yǎng)基。
圖12說明用HPR和沙芬戈處理的A549細(xì)胞，在不同的時(shí)間間隔去掉沙芬戈，并在所示的時(shí)間代之以預(yù)平衡的僅含HPR的培養(yǎng)基。
圖13說明用沙芬戈和全反式-視黃酸(ATRA)，或沙芬戈和13-順式-視黃酸處理的CHLA-90細(xì)胞。
圖14說明用沙芬戈和全反式-視黃酸(ATRA)，或沙芬戈和13-順式-視黃酸處理的LAN-6細(xì)胞。
圖15說明神經(jīng)酰胺向無毒的葡糖基神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)化降低HPR和HPR+沙芬戈的毒性。HPR+沙芬戈的摩爾比為3∶1(如9μMHPR+3μM沙芬戈)。
圖16顯示用pan-caspace酶BOC-d-fmk處理使HPR的毒性顯著降低。
圖17顯示在暴露于HPR之前用BOC-d-fmk預(yù)處理，顯著降低作為細(xì)胞凋亡特征的核的形態(tài)學(xué)改變。
圖18顯示在24小時(shí)內(nèi)，BOC-d-fmk取消HPR誘發(fā)的亞G0/G1期DNA-片段化。
圖19顯示在暴露于HPR或HPR+沙芬戈之前，用BOC-d-fmk預(yù)處理，降低作為細(xì)胞凋亡特征的形態(tài)學(xué)改變，但BOC-d-fmk只能最小限度地影響由HPR+沙芬戈的組合導(dǎo)致的壞死的形態(tài)特征。
對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本申請(qǐng)的方法使用視黃酸衍生物和一種試劑(即一種加強(qiáng)劑)的聯(lián)合作用，所述試劑作用是對(duì)神經(jīng)酰胺產(chǎn)生的毒性的細(xì)胞代謝和細(xì)胞控制過程進(jìn)行控制，以對(duì)抗或防止腫瘤、癌、瘤組織和其他癌前和非瘤性過度增殖疾病的生長(zhǎng)，所有這些總稱為過度增殖或過度成形類疾病。此處所用的治療可以用于抑制生長(zhǎng)和/或降低靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性(通過壞死或細(xì)胞凋亡機(jī)制，或通過二者)，靶細(xì)胞一般是過度增殖細(xì)胞(包括腫瘤、癌、和瘤組織，同時(shí)有癌前和非瘤的或非噁性的過度增殖疾病)。
可以用本發(fā)明治療的腫瘤、癌和瘤組織的例子包括如下的噁性疾病，但不局限于此乳癌；骨肉瘤；血管肉瘤；纖維肉瘤和其他肉瘤；白血??；淋巴癌；竇道腫瘤；卵巢腫瘤，輸尿管、膀胱、前列腺和其他泌尿生殖癌；結(jié)腸食管和胃癌和其他胃腸癌；肺癌；骨髓瘤；胰管癌；肝癌；腎癌；內(nèi)分泌癌；皮膚癌；和腦癌或中樞和外周神經(jīng)(CNS)系統(tǒng)腫瘤，噁性的或良性的，包括神經(jīng)蝕質(zhì)瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
癌前和非瘤的或非噁性的過度增殖疾病的例子包括而不僅限于脊髓發(fā)育失調(diào)；原位頸癌；家族性腸內(nèi)息肉，如加德納綜合征；口腔粘膜白斑；組織細(xì)胞增多癥；瘢痕疙瘩；血管瘤；過度增殖性動(dòng)脈狹窄，炎性關(guān)節(jié)炎；表皮角化病和包括關(guān)節(jié)炎的丘疹鱗屑疹。也包括病毒導(dǎo)致的過度增殖性疾病，如疣和EBV導(dǎo)致的疾病(如傳染性的單核細(xì)胞增多癥)，疤痕形成和類似疾病。此文公開的方法可以用于已知或懷疑患有此處定義的過度增殖疾病或有產(chǎn)生此病的危險(xiǎn)的個(gè)體。
此處所用的“對(duì)過度增殖疾病的治療”指殺死、抑制或減慢過度增殖細(xì)胞的體積或群體的生長(zhǎng)或增加，或殺死、抑制或減慢腫瘤或癌的生長(zhǎng)。降低過度增殖的細(xì)胞的數(shù)量，或阻止擴(kuò)散到其他解剖部位，及降低過度增殖的體積或過度增殖的細(xì)胞的數(shù)量。此處所用的治療不必有治愈或完全阻止過度增殖的生長(zhǎng)的含義。如此處所用的，治療有效數(shù)量指殺死、減慢過度增殖細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、降低過度增殖細(xì)胞的體積、和/或降低過度增殖細(xì)胞的數(shù)量的有效數(shù)量。所包括的增強(qiáng)劑的數(shù)量足以促進(jìn)第一化合物的活性，因此兩種(或更多)化合物一起比分別使用單一化合物有更大的治療效果(例如由于協(xié)同作用；降低聯(lián)合的毒性等)。
如此處所用的，“聯(lián)合”服用兩或多種化合物指兩種化合物的服用時(shí)間足夠接近，使一種化合物的存在改變另一種的生物學(xué)效果?？梢酝瑫r(shí)或先后服用兩種化合物。可以通過在服用前混合化合物而同時(shí)服用，或在同一時(shí)間在不同的解剖位置或通過不同的解剖途徑而服藥。
短語(yǔ)“同時(shí)服用”、“聯(lián)合服用”、“一齊服用”指在同一時(shí)間點(diǎn)服用化合物或一種緊接另一種服用。在后一種情況下，在足夠接近的時(shí)間內(nèi)服用化合物，使所觀察到的結(jié)果與在同一時(shí)間點(diǎn)服用化合物沒有區(qū)別。
用本發(fā)明的方法治療的對(duì)象包括人體和用于獸醫(yī)目的的動(dòng)物。動(dòng)物優(yōu)選包括馬、牛、狗、貓、兔、羊等的哺乳動(dòng)物。
已知多種細(xì)胞內(nèi)分子引發(fā)或抑制細(xì)胞死亡(S.Rowan和D.Fisher，白血病11,457(1997)；K.Saini和N.Walker，分子與細(xì)胞生化學(xué)178,9(1998))?，F(xiàn)在許多工作集中在闡述程序性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)的途徑，其中細(xì)胞凋亡的引發(fā)因素(如DNA損壞)可以活化多種途徑(如p53,Fas和其他)，雖然可以用其他分子調(diào)節(jié)(如促-和抗-細(xì)胞凋亡蛋白的Bcl-2家族)，其caspase活化作用是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的最后進(jìn)程的后一步驟。然而，不是所有的細(xì)胞死亡都通過細(xì)胞凋亡發(fā)生，4-HPR導(dǎo)致的細(xì)胞死亡包括細(xì)胞凋亡和壞死(J.Clifford等，癌癥研究59,14(1999))。已知細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)神經(jīng)酰胺參與細(xì)胞凋亡(L.Obeid等，科學(xué)259,1769(1993)(圖1))和壞死(Guo等，美國(guó)生理學(xué)雜志276,F390(1999)；Condorelli等，英國(guó)藥理學(xué)雜志137,75(1999))。已顯示它導(dǎo)致細(xì)胞凋亡引起的線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)變(S.Susin等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志186,25(1997))，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡引起的線粒體絡(luò)合物Ⅲ抑制的ROS發(fā)生(A.Quillet-Mary等，生物化學(xué)雜志272,21388(1997))和活化死亡前JNK/SAPK途徑(S.Basu等，致癌基因17,3277(1998)；T.Okazaki等，細(xì)胞信號(hào)10,685(1998)；W.Jarvis,Curr.Opin.Oncol.10,552(1998))。神經(jīng)酰胺也活化蛋白激酶(CAPK)(S.Mathias等，生物化學(xué)雜志335(Pt3),465(1998))，磷酸化酶(PP2A)(L.Leoni等，生化藥物學(xué)，55,1105(1998))，并可以導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB的活化(L.Johns等，免疫學(xué)雜志，152,5877(1998)；C.Gamard等，生物化學(xué)雜志272,1682(1997))。癌細(xì)胞避免神經(jīng)酰胺的細(xì)胞毒性的機(jī)理包括代謝成其他型，包括無毒的葡糖基神經(jīng)酰胺(Y.Lavie等生物化學(xué)雜志272,1682(1997)；Y.Lavie等，生物化學(xué)雜志，271,19530(1996)；L.Yong-Yu等，生物化學(xué)雜志274,1140(1999))和鞘氨醇-1-磷酸酯。鞘氨醇-1-磷酸酯通過活化活化前(pro-life)ERK1/2途徑而對(duì)抗神經(jīng)酰胺導(dǎo)致的細(xì)胞死亡(O.Cuvillier等，自然381,800(1996)；O.Cuvillier等，生物化學(xué)雜志273,2910(1998))。因此，調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺的代謝提供了一種增進(jìn)4-HPR(芬維A胺)和其他產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素的細(xì)胞毒性的方法。
神經(jīng)酰胺的合成和代謝中的一些關(guān)鍵代謝途徑示于圖2(Y.Hannun，科學(xué)274,1855(1996))。通過活化(1)神經(jīng)酰胺合酶，從頭合成途徑或通過活化(2)導(dǎo)致鞘磷脂降解的中性或酸性鞘磷脂酶，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺。神經(jīng)酰胺經(jīng)神經(jīng)酰胺合酶代謝成(3)無毒的葡糖基神經(jīng)酰胺；并通過堿性或酸性神經(jīng)酰胺酶轉(zhuǎn)化成(4)無毒的鞘氨醇。鞘氨醇進(jìn)一步通過鞘氨醇激酶轉(zhuǎn)化成(5)鞘氨醇-1-磷酸。以下顯示對(duì)這些途徑的調(diào)節(jié)可以促進(jìn)甚至協(xié)同促進(jìn)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素如4-HPR的細(xì)胞毒性。
以下詳細(xì)描述可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的化合物及其制劑，及服用的方式。
1．產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素或視黃酸衍生物是在服藥的宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的化合物，并包括授予Gander的美國(guó)專利U.S.No.4,190,594(所參考的全部說明書引用于此作為參考)所述的化合物。產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素包括全反式視黃酸(ATRA)和視黃酸衍生物，包括但不局限于此(A)具有下式的全反式視黃酸的酯 其中X選自 2-環(huán)己乙基；10-甲酯基癸基；4-羥基丁基；膽甾醇基；混合的間和對(duì)乙烯基苯甲基；和4-溴苯甲基；(B)具有下式的全反式視黃酸的酯 其中Y選自氧化膽甾醇基(cholesteryloxy)；苯基；4-溴苯基；4-甲氧基苯基；4-硝基苯基；4-羥基苯基；4-甲基苯基；4-氰基苯基；4-乙氧基苯基；4-乙酰氧基苯基；2-萘基；4-二苯基；2,5-二甲氧基苯基；2,4-二氯苯基；2,4-二甲基苯基；3,4-二乙酰氧基苯基；3,4,5-三甲氧基苯基；和2,4,6-三甲基苯基；和(C)具有下式的全反式視黃酸的酰胺 其中Z選自正丙基氨基；叔-丁基氨基；1,1,3,3-四甲基丁基氨基；1-嗎啉代；4-羥基苯基氨基；4-甲酯基-2-羥基苯基氨基；β-(3,4-二甲氧基苯基)-乙氨基；2-苯并噻唑基氨基；1-咪唑基；1-(2-煙?；?nicotinoyl hydrazolyl))；1-苯并三唑基；1-(1,2,4-三唑基)； 尤其優(yōu)選的是全反式-N-(4-羥基苯)視黃酰胺，也叫芬維A胺，其CAS的登記號(hào)為65646-68-6，具有以下結(jié)構(gòu) 可以按本領(lǐng)域已知的方法制備上述化合物。如見授予Gander等的美國(guó)專利U.S.4,190,594，和授予Gibbs的美國(guó)專利U.S.4,665,098。
可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的其他視黃酸衍生物包括N-(4-羥苯基)視黃酰胺-O-葡萄糖醛酸化物的C-葡萄糖甙類似物。這些化合物及其制備見于授予Curley等的美國(guó)專利U.S.5,663,377和5,599,953，將其說明書全部引用于此作為參考。這些化合物具有以下通式 其中R是COOH,CH2OH,或H,n是0或1。
這些化合物的特定的例子包括4-(視黃酰胺基(retinamido))苯基-C-葡萄糖醛酸化物；4-(視黃酰胺基(retinamido))苯基-C-葡萄糖甙；4-(視黃酰胺基(retinamido))苯基-C-木糖甙；4-(視黃酰胺基(retinamido))苯甲基-C-葡萄糖醛酸化物；4-(視黃酰胺基(retinamido))苯甲基-C-葡萄糖甙；4-(視黃酰胺基(retinamido))苯甲基-C-木糖甙；1-(β-D-吡喃葡萄糖基)視黃酰胺；和1-(D-吡喃葡萄糖基uronosyl)視黃酰胺。
2．葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑可以使用任何抑制葡糖基神經(jīng)酰胺合成的化合物，尤其是葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑。這些化合物的例子包括而不局限于具有下式的化合物 其中R是如苯基等芳環(huán)、環(huán)己基或具有10-15個(gè)碳原子的alpiphatic基團(tuán)，R1是胺基，如嗎啉代基團(tuán)，n是4-18的整數(shù)(包括功能的同系物，異構(gòu)體和其藥學(xué)可接受的鹽)。優(yōu)選地，n是4、6、8、10、12或14，并優(yōu)選這些化合物的D對(duì)映體。例如這些化合物公開于授予Shayman和Radin的美國(guó)專利U.S.5,041,441中；和授予Inokuchi等的美國(guó)專利U.S.5,707,649。特定的葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑的例子包括1-苯基-2-?；被?3-嗎啉代-1-丙醇，其中n是6-12；1-苯基-2-癸?；被?3-嗎啉代-1-丙醇(PDMP)；1-苯基-2-棕櫚酰氨基-3-嗎啉代-1-丙醇(PPMP)；和他莫昔芬，包括檸檬酸他莫昔芬。
3．鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑可以用任何鞘氨醇-1-磷酸酯合成抑制劑完成本發(fā)明，通常優(yōu)選鞘氨醇激酶抑制劑如D-赤-N,N-二甲基鞘氨醇。其他鞘氨醇激酶抑制劑是已知的。如可以是日本專利申請(qǐng)9176083(1997)公開的SankyoCo.鞘氨醇激酶抑制劑F12509A(或其藥學(xué)上可接受的鹽)，其具有以下結(jié)構(gòu) 4．蛋白激酶C抑制劑蛋白激酶C抑制劑的例子包括授予Bell等的美國(guó)專利U.S.4,816,450所公開的。這些化合物包括具有以下通式的化合物見P13式Ⅱ 其中Q是CH3-(CH2)n-或CH3-(CH2)m-CH=CH-(CH2)p-，其中n是2-30,m是1-15,p是1-15；其中X是CH2-CH2-或-CH=CH-或被一或多個(gè)鹵素或C1-C3烷基取代；其中Y是-C(-OH)H-,-C(=O)-,-C(-SH)H-,-CH2-或-C(-W)H-其中W是鹵素(此處所用的術(shù)語(yǔ)“鹵素”指氟、氯、溴、碘)；其中R1和R2是相同或不同的，選自氫、具有1-7個(gè)碳的低級(jí)烷基、芳烷基和芳基的基團(tuán)。
其中Z選自含有磷酸酯、H、半乳糖基、磺基半乳糖基、葡萄糖基、乳糖基、三己糖基、磷酰膽堿、GalNAc-Gal-Glc,Gal-Gal-Glc,Sia-Gal-Glc， 優(yōu)選二氫鞘氨醇和異構(gòu)體D、L或DL-蘇-二氫鞘氨醇。更優(yōu)選的是L-蘇-二氫鞘氨醇，也稱為(2S,3S)-2-氨基-1,3-十八烷二醇或沙芬戈?？梢园词谟鐻yons的美國(guó)專利U.S.5,677,341所述的方法制備給藥用的這些化合物的乳劑。
注意根據(jù)被抑制的特定的PKC亞類型(subtype)，不是所有的蛋白激酶抑制劑都必須是活性的。在本申請(qǐng)中staurosporine衍生物UCNO1是非活性的，表明抑制劑應(yīng)抑制不被此化合物抑制的亞類型，或應(yīng)在一個(gè)比UCNO1更大的程度上抑制它們?，F(xiàn)在相信，應(yīng)選擇PKC抑制劑以抑制蛋白激酶C zeta。
不排除沙芬戈發(fā)揮一種區(qū)別于PKC抑制的對(duì)本發(fā)明的功效有貢獻(xiàn)的功效。因此，沙芬戈和其他發(fā)揮此功效的化合物在本發(fā)明中是活性的并包括在這里，不將申請(qǐng)人約束到下面所述的本發(fā)明的特殊的理論。
5．另外的活性化合物及其篩選可以用已知的技術(shù)產(chǎn)生另外的化合物，包括合理的藥物設(shè)計(jì)技術(shù)和/或隨機(jī)的藥物設(shè)計(jì)技術(shù)(或組合化學(xué)技術(shù))。
在與受體反應(yīng)的活性化合物中，反應(yīng)發(fā)生在穩(wěn)定的三維分子的表面易接近的位點(diǎn)。通過安排決定性的結(jié)合位點(diǎn)的殘基有一合適的構(gòu)象，可以按已知技術(shù)設(shè)計(jì)和合成出模仿活性化合物結(jié)合區(qū)域的必要的表面特征的化合物。一種具有對(duì)于活性化合物的結(jié)合表面必需的同樣的分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的表面區(qū)域的分子，將能模仿活性化合物與其對(duì)應(yīng)的受體的相互作用。設(shè)計(jì)活性化合物的三維結(jié)構(gòu)并制備其活性模擬物是已知的，并作為合理的藥物設(shè)計(jì)技術(shù)。見授予Chen的美國(guó)專利U.S.5,593,853和授予Balaji等的美國(guó)專利U.S.5,612,895和5,331,573；授予Geysen的美國(guó)專利U.S.4,833,092；授予Nestor的美國(guó)專利U.S.4,859,765；授予Pantoliano的美國(guó)專利U.S.4,853,871和授予Blalock的美國(guó)專利U.S.4,863,857(將所有這些美國(guó)專利的說明書引用于此作為參考)。
在組合化學(xué)(或隨機(jī)藥物設(shè)計(jì))技術(shù)中，用候選化合物的大的組合庫(kù)篩選其中的活性化合物?？梢杂酶鞣N任何拆分合成方法制備用于進(jìn)行本發(fā)明的庫(kù)。在拆分合成方法中將可釋放的標(biāo)記附加在粒子和感興趣的有機(jī)化合物上，此方法也被稱作同合成方法。已知多種此類方法。見A.Furka等，J.Pept.Protein Res.37,487(1991)；K.Lam等自然354,82(1991)；R.Zuckermann等,Int.J.Pept.ProteinRes.40,498(1992)；F.Sebestyen等，Bioorg.Med.Chem.Lett.3,413(1993)；K.Lam等，Bioorg.Med.Chem.Lett.3,419(1993)。例如，可以是有機(jī)金屬化合物的庫(kù)，其中化合物是金屬-配基絡(luò)合物。絡(luò)合物中的金屬可以是在高、低或零氧化態(tài)的早或晚躍遷金屬。金屬也可以是任何主族金屬，堿金屬，堿土金屬，鑭系元素或錒系元素.金屬配基絡(luò)合物中的配基可以由以下物質(zhì)組成或得自以下物質(zhì)手性或非手性形式的環(huán)戊二烯、氨基酯、噁唑烷酮(oxazolidoinone)、羥基酸、羥基酯、羥基酰胺、吡啶、稠合吡啶、氮雜環(huán)、噁唑、咪唑、吡咯、冠醚、穴狀配體、carcerands、磷化氫、二磷化氫、聚磷化氫、奎寧環(huán)、奎寧、生物堿、糊精、環(huán)糊精、salen、卟啉、聯(lián)芳、磺胺、Schiff堿、金屬茂、monool、二醇(diol)、多元醇、胺、二胺、多胺、銨鹽、肽、蛋白質(zhì)、核酸等。
作為第二個(gè)例子，可以是一個(gè)非金屬化合物的庫(kù)，包括但不局限于手性或非手性的環(huán)戊二烯、氨基酯、噁唑烷酮(oxazolidoinone)、羥基酸、羥基酯、羥基酰胺、吡啶、稠合吡啶、氮雜環(huán)、噁唑、咪唑、吡咯、冠醚、穴狀配體、carcerands、磷化氫、二磷化氫、聚磷化氫、奎寧環(huán)、奎寧、生物堿、糊精、環(huán)糊精、salen、卟啉、聯(lián)芳、磺胺、Schiff堿、金屬茂、monool、二醇(diol)、多元醇、胺、二胺、多胺、銨鹽、肽、蛋白質(zhì)、核酸等。
固體支持物可以是相互分離的，或在整個(gè)的反應(yīng)物的表面部分不連續(xù)的區(qū)域，此表面部分可以位于分界處，而使大多數(shù)不連續(xù)區(qū)域位于分界處。這些片型或針型固體支持物是已知的。見授予Ellman的美國(guó)專利5,288,514(針型)；授予Fodor等的美國(guó)專利5,510,270(片型)。通常優(yōu)選分離的不連續(xù)支持物(如顆?；蛑榱??？梢园匆阎夹g(shù)，如美國(guó)專利5,565,324所述的方法(將其全部引用于此作為參考)或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的此方法的變化方式，合成催化劑庫(kù)并將其連接到預(yù)計(jì)的固體支持物上。
對(duì)于按任何方法(包括但不局限于上述方法)選擇的化合物，可以按以下方法篩選其增強(qiáng)活性，包括附加地和協(xié)同地增強(qiáng)的活性，但優(yōu)選協(xié)同地增強(qiáng)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素對(duì)腫瘤細(xì)胞(或其他過度增殖的細(xì)胞)的細(xì)胞抑制活性和細(xì)胞毒活性，該方法包括(a)將第一對(duì)照腫瘤細(xì)胞與一定量的(如能夠或不能夠自身有效地抑制所述腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的量)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素接觸；(b)將第二對(duì)照腫瘤細(xì)胞與一定量的(如能夠或不能夠自身有效地抑制所述腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的量)測(cè)試化合物接觸；并(c)將實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞與步驟(a)所述數(shù)量的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素和步驟(b)所述數(shù)量的測(cè)試化合物接觸；并(d)測(cè)定以上步驟(a)、(b)、(c)的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，然后(e)將對(duì)步驟(c)的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制或細(xì)胞毒活性與對(duì)步驟(a)和(b)的對(duì)照腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制進(jìn)行比較，在步驟(c)的實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞中，測(cè)得比步驟(b)和(c)的對(duì)照腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合生長(zhǎng)抑制更大程度的抑制作用，表示測(cè)試化合物促進(jìn)了產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素的活性。
可以用任何合適的方法進(jìn)行比較，如通過計(jì)算聯(lián)合指數(shù)，其中小于1的值(如小于0.9)表示化合物具有協(xié)同作用?？梢允褂萌魏文[瘤細(xì)胞，包括但不局限于神經(jīng)母細(xì)胞、肺、黑素瘤、前列腺的、白血病、結(jié)腸、乳腺和胰腺等腫瘤細(xì)胞?？梢允褂萌魏萎a(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素如芬維A胺?？紤]上述治療條件，可以使用其他過度增殖的細(xì)胞包括癌前和非癌變的細(xì)胞代替腫瘤細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，試驗(yàn)化合物是一種神經(jīng)酰胺降解抑制劑，或操縱(manipulate)對(duì)神經(jīng)酰胺產(chǎn)生的細(xì)胞毒性進(jìn)行的細(xì)胞代謝或細(xì)胞控制過程的其他物質(zhì)。可以通過總體觀察生長(zhǎng)抑制或細(xì)胞毒性，或通過具體測(cè)定壞死、細(xì)胞凋亡，或通過兩種方式進(jìn)行測(cè)定?？梢杂么朔椒ù_定作為神經(jīng)酰胺降解抑制劑的活性化合物，其他操縱對(duì)神經(jīng)酰胺產(chǎn)生的細(xì)胞毒性進(jìn)行細(xì)胞代謝或細(xì)胞控制過程的化合物，或通過不同于此處所述的其他機(jī)理發(fā)揮作用的化合物。
除了神經(jīng)酰胺降解抑制劑之外，或作為代替其的另一種選擇，可以按照本申請(qǐng)所述方法制備、配制或應(yīng)用以前未被認(rèn)為與產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素聯(lián)用可有效地用于治療過度增殖疾病的化合物(包括其藥學(xué)上可接受的鹽)。根據(jù)所選的用于篩選的化合物的不同，這些化合物可以是新化合物，可以是已知的但以前未被用于醫(yī)療或藥物用途的化合物，可以是以前已被用于醫(yī)療或藥物用途，但未如本申請(qǐng)所述的與產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素聯(lián)合使用的化合物。
6．配制和服用可以將以上所述的化合物配制在單一藥物載體或分別的藥物載體中服用，治療各種疾病。根據(jù)本發(fā)明制備藥物制劑時(shí)，活性化合物包括其生理上可接受的鹽，或其酸性衍生物，一般地-特別是與一種可接受的載體混合。此載體當(dāng)然必須是可接受的，其含義是，能與配方中其他活性成分相容，并必須對(duì)人體無害。載體可以是固體或液體，或是兩種形式。優(yōu)選與化合物配制成單劑量的制劑，如片劑，可以含有重量0.5％-95％的活性化合物。本發(fā)明的制劑中可以含有一或多種活性化合物，可以用任何藥學(xué)已知的方法制備，必要時(shí)將這些成分混合，可選地包括一或多種附加成分。
本發(fā)明的制劑包括適于口、直腸、局部、口腔(如舌下)、陰道、胃腸外(如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部(即皮膚和粘膜表面，包括表面導(dǎo)管)和經(jīng)皮給藥，但在某一情況下需根據(jù)所治療病情的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，和所用的特定活性化合物的性質(zhì)決定最適宜的途徑。
適于口服給藥的制劑可以是分散的劑量單位，如膠囊、扁囊劑(cachet)、錠劑、或片劑，各自含有預(yù)定數(shù)量的活性化合物；可以是粉劑或顆粒劑；是水溶液或非水溶液中的溶液或懸浮液；或是水包油或油包水乳劑?？梢杂萌魏嗡帉W(xué)的適宜方法制備這些制劑，包括將活性化合物與適宜的載體(可以一或多種上述附加成分)結(jié)合的步驟。一般地，是將活性化合物與液體和/或精細(xì)分散固體載體均勻而密切地混合，然后如果需要將所得混合物成型而制備本發(fā)明的制劑。如，可以通過將含有活性化合物的粉末或顆粒壓片或模塑而制備片劑，可選地在制備過程中可以加入一或多種附加成分?？梢杂靡贿m宜的機(jī)器將處于自由流動(dòng)狀態(tài)-如為粉末或顆粒態(tài)，可選地可混有一種粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性劑/分散劑-的化合物壓制成片劑?？梢杂靡贿m宜的機(jī)器將用惰性液體粘合劑濕潤(rùn)的粉末狀的化合物鑄型而制備模塑片劑。
適于口腔(舌下)給藥的制劑包括在有味的基質(zhì)中含有活性化合物的糖錠劑，這些基質(zhì)通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或西黃蓍膠；和在一惰性基質(zhì)如凝膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠中含有化合物的香錠劑。
本發(fā)明適于腸胃外或陰道給藥的制劑通常包括活性化合物的無菌水溶液制劑，這些制劑優(yōu)選與受體的血液是等滲的。這些制劑可以用皮下、靜脈內(nèi)或真皮內(nèi)注射的方式給藥。通?？梢詫⒒衔锱c水或甘氨酸緩沖液混合，并將所得溶液滅菌，及調(diào)節(jié)成與血液等滲而制備這些制劑。
適于直腸的給藥的制劑優(yōu)選單劑量栓劑。可以通過將活性化合物與一或多種通常的固體載體，如可可脂混合，然后使所得混合物成型而制備。
適于皮膚局部給藥的制劑優(yōu)選采用軟膏、霜、洗液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油的形式。所用的載體包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇、透皮促進(jìn)劑，及兩或三種這些物質(zhì)的組合。
適于透皮給藥的制劑可以是分散的片，能與受體的表皮密切接觸更長(zhǎng)的時(shí)間。適于透皮給藥的制劑也可以通過電離子滲入療法給藥(如，見藥物研究3(6):318(1986))，一般采取活性化合物的緩沖水溶液的形式。適宜的制劑含有檸檬酸鹽或bis/tris緩沖劑(pH6)或乙醇/水，并含有0.1-0.2M活性組分。
如上所述，本申請(qǐng)?zhí)峁┝嗽诠┛诜⒅蹦c、局部、口腔、腸胃外、肌內(nèi)、真皮內(nèi)或靜脈內(nèi)，和經(jīng)皮給藥的藥學(xué)可接受的載體中含有活性化合物的藥物制劑(包括其藥學(xué)上可接受的鹽)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用時(shí)，任一活性成分的治療有效劑量，將根據(jù)具體化合物、具體的病人，并根據(jù)一些因素如病情和給藥途徑作些調(diào)整?？梢詤⒄毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)步驟，尤其是本文所公開的方法確定這些活性成分的劑量。
芬維A胺用于系統(tǒng)治療時(shí)，將采用能達(dá)到約1、2或3μM至10或20μM的血漿濃度的濃度；典型的(口服劑量)為每日50或100至500或1000、2000或3000mg/m2體表面積。
對(duì)于他莫昔芬，血清水平1.5至2μM可達(dá)到臨床所需的效果，在約150至300或500mg/天檸檬酸他莫昔芬P.O.，或300或400至500或700mg/m2每天的劑量時(shí)可達(dá)到此水平。在用更高的400-500mg/天的P.O.脈沖劑量基礎(chǔ)上可達(dá)到這些水平。
服用沙芬戈達(dá)到約為1-10μM(如7.5)峰形血清水平，或服用劑量為5或10-30或40mg/kg(如20mg/kg)。
用以下非限定性的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本申請(qǐng)。
例1細(xì)胞毒性作用的測(cè)定用DIMSCAN測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞毒性(R.Proffitt等，血細(xì)胞計(jì)數(shù)24,204-213(1996)；T.Frgala等，AACR學(xué)報(bào)36,303(1995))；此系統(tǒng)使用數(shù)字成像顯微鏡計(jì)數(shù)活細(xì)胞的個(gè)數(shù)，活細(xì)胞選擇性地積聚熒光黃二醋酸鹽變成亮色的熒光。此系統(tǒng)能通過用曙紅Y淬滅已死亡或?yàn)l臨死亡的細(xì)胞的殘存熒光，并用數(shù)字閾測(cè)定活細(xì)胞的總熒光，而在4-5 log動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)測(cè)定細(xì)胞毒性。所測(cè)定的熒光與活細(xì)胞數(shù)量成正比。將經(jīng)藥物治療的細(xì)胞群體的總熒光和相似數(shù)量的未經(jīng)治療的細(xì)胞的熒光對(duì)比，得出存活率。簡(jiǎn)而言之，在有0.1cc培養(yǎng)基的96-孔組織培養(yǎng)板中的60個(gè)孔中重復(fù)植入5000-10,000SK-N-RA神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞/孔，過夜。然后加入0.05cc含藥培養(yǎng)基，使藥物濃度達(dá)到標(biāo)示的終濃度。用每種藥物濃度處理12個(gè)孔。12個(gè)孔僅接受適宜的終濃度的藥物媒介物，并作為對(duì)照培養(yǎng)板。細(xì)胞在5％CO2中，在37℃條件下溫育96-120小時(shí)。然后在每孔中加入含熒光黃雙醋酸酯的0.05cc培養(yǎng)基，使其終濃度達(dá)8mg/cc。在37℃再將細(xì)胞溫育15分鐘，在每孔中加入0.5％曙紅Y0.03cc。然后用數(shù)字成像顯微鏡測(cè)定存活細(xì)胞的總熒光。
例2測(cè)定神經(jīng)酰胺按如下方法測(cè)定神經(jīng)酰胺。在6孔組織培養(yǎng)板中重復(fù)植入500,000神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞/孔，使其過夜。將氚化(3H)-棕櫚酸(一種脂質(zhì)前體)加至1微居里/cc，加入芬維A胺至終濃度為10μM。對(duì)照細(xì)胞僅接受氚標(biāo)記物，而不接受藥物。在所標(biāo)示的時(shí)間，從三份重復(fù)的孔中采集細(xì)胞，洗滌，用甲醇、乙酸、水和氯仿提取脂質(zhì)。分離有機(jī)層(含有結(jié)合在脂質(zhì)中的氚標(biāo)記物)并在氮?dú)饬髦懈稍?。將脂質(zhì)樣品溶解在氯仿∶甲醇中，測(cè)定各樣品的10％以確定脂質(zhì)樣品中的總氚。然后用薄層色譜法分離樣品中的氚和未標(biāo)記的神經(jīng)酰胺基準(zhǔn)物，用碘蒸汽使薄層顯色。刮下與神經(jīng)酰胺基準(zhǔn)物對(duì)應(yīng)的薄層區(qū)域，測(cè)定共遷移樣品神經(jīng)酰胺的氚。然后將總樣品的神經(jīng)酰胺表示為神經(jīng)酰胺中標(biāo)記的氚相對(duì)于總脂質(zhì)中的氚的百分比。
例3-9對(duì)細(xì)胞毒性和神經(jīng)酰胺的研究用圖3-9分別說明例3-9。按以上例1和例2的方法進(jìn)行例3-9。
圖3說明在20％O2中的10μM芬維A胺(標(biāo)以HPR或H)對(duì)在藥物敏感的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SMS-LHN(實(shí)心圓)中和在抗藥的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系CHLA-90(空心圓)中產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的影響。注意發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞系均對(duì)芬維A胺有反應(yīng)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺。
圖4說明芬維A胺(HPR或H)、L-蘇-二氫鞘氨醇(沙芬戈；S)、蛋白激酶C抑制劑和1-苯基-2-棕櫚酰氨基-3-嗎啉代-1-丙醇(ppmp；P)、葡糖基神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑等各種組合，對(duì)在各種濃度、在20％O2條件下，在高穩(wěn)定性的細(xì)胞系(sk-N-RA)中細(xì)胞存活的影響。注意藥物的聯(lián)合效果。實(shí)心圓代表沙芬戈與ppmp的組合；空心圓代表芬維A胺與沙芬戈的組合；實(shí)心三角代表芬維A胺和PPmP的組合；空心三角代表芬維A胺、沙芬戈與ppmp的組合。劑量標(biāo)示在橫軸上。
圖5說明固定劑量10μM的芬維A胺與所標(biāo)示的劑量變化的各種化合物的組合，對(duì)SK-N-RA細(xì)胞在20％O2條件下細(xì)胞存活的影響。T或他莫昔芬代表檸檬酸他莫昔芬。注意各個(gè)化合物具有低的細(xì)胞毒性，而化合物的組合產(chǎn)生高的細(xì)胞毒性。標(biāo)以H+P的實(shí)心圓代表芬維A胺加ppmp；標(biāo)以H+T的空心圓代表芬維A胺加他莫昔芬；標(biāo)以H+S的實(shí)心圓代表芬維A胺加沙芬戈；標(biāo)以H+S+T的空心圓代表芬維A胺加沙芬戈加他莫昔芬(1∶1)；實(shí)心三角代表芬維A胺加3μM他莫昔芬加沙芬戈。其他劑量標(biāo)示在橫軸上。
圖6顯示在與其他化合物的組合中，低劑量的芬維A胺對(duì)20％O2中SK-N-RA細(xì)胞的存活率的活性。實(shí)心圓代表3.3μM芬維A胺加沙芬戈；空心圓代表3.3μM芬維A胺加ppmp；實(shí)心三角代表ppmp加沙芬戈(1∶1)而無芬維A胺；空心三角代表3.3μM芬維A胺加ppmp加沙芬戈(1∶1)。其他劑量標(biāo)示在橫軸上。
圖7顯示各種化合物的組合對(duì)20％O2中sk-N-RA細(xì)胞的存活率的影響。N-DMS(或N)指d-赤-N,N-二甲基鞘氨醇，一種鞘氨醇激酶抑制劑。實(shí)心圓代表N-DMS加PPMP；空心圓代表芬維A胺加ppmp；實(shí)心三角代表芬維A胺加N-DMS；空心三角代表芬維A胺加N-DMS加PPMP.其他劑量標(biāo)示在橫軸上。
圖8說明各種藥物組合對(duì)20％O2中的sk-N-RA細(xì)胞的存活的活性。標(biāo)以HPR的實(shí)心圓代表芬維A胺；標(biāo)以N-DMS的空心圓代表N-DMS；實(shí)心三角代表HPR加N-DMS；標(biāo)以10μMH+N的實(shí)心圓代表10μM固定劑量的芬維A胺加N-DMS；標(biāo)以5μMH+P+N的空心圓代表5μM固定劑量的芬維A胺加5μM固定劑量的PPMP加N-DMS。實(shí)線代表芬維A胺加PPMP。已標(biāo)出的劑量是固定的；其他劑量如橫軸所示。注意當(dāng)N-DMS加入芬維A胺和PPMP中時(shí)，細(xì)胞毒性增加。
圖9說明藥物組合對(duì)20％O2中的SK-N-RA細(xì)胞的存活的活性。實(shí)心圓代表芬維A胺；空心圓代表芬維A胺加N-DMS(3∶1)；實(shí)心三角代表芬維A胺加沙芬戈(3∶1)；空心三角代表芬維A胺加N-DMS加沙芬戈(3∶1∶1).劑量如橫軸所示。注意三個(gè)化合物的組合的細(xì)胞毒性。
例10在整個(gè)治療周期中不需要全部化合物同時(shí)出現(xiàn)在一些細(xì)胞系中，我們發(fā)現(xiàn)沙芬戈只需要在整個(gè)治療周期中的一段與HPR同時(shí)出現(xiàn)，就可得到增加的抗腫瘤細(xì)胞活性。在這些實(shí)驗(yàn)中，在時(shí)間=0的一點(diǎn)，一起加入沙芬戈和HPR。然后在不同時(shí)間，除去含有兩種藥的細(xì)胞培養(yǎng)基并代之以僅含有相似濃度的HPR的培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞溫育96-120小時(shí)，將其存活率與如前所述在整個(gè)96-120小時(shí)內(nèi)暴露于兩種藥物下的細(xì)胞比較。結(jié)果顯示即使為使本發(fā)明得到高于HPR單獨(dú)治療的腫瘤細(xì)胞殺死效果，沙芬戈也不需要與HPR共同出現(xiàn)在整個(gè)治療過程中。在一些情況下，在HPR治療的96-120小時(shí)治療周期中，沙芬戈與HPR共同出現(xiàn)少于12小時(shí)就足以獲得本發(fā)明所致的細(xì)胞殺死量方面大比例的增長(zhǎng)。這證實(shí)為使本發(fā)明發(fā)揮作用，本發(fā)明所要求的所有化合物不需要在全部時(shí)間內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)。
方法在如前所述的DIMSCAN細(xì)胞毒性測(cè)定所用的96孔微量板中的每孔中的全部100μl培養(yǎng)基中加入細(xì)胞。所用的細(xì)胞系包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系CHLA-90和SK-N-RA，和肺噁性腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549。在時(shí)間+0時(shí)，在每孔的50μ1全部培養(yǎng)基中(每孔最終為150μl培養(yǎng)基)，加入HPR和沙芬戈至所標(biāo)出的最終藥物濃度。也在時(shí)間+0時(shí)，將在50μl培養(yǎng)基中的同樣濃度的HPR作為單一試劑，加入到重復(fù)的微量板中的孔中(每孔中最終總培養(yǎng)基量為150μl)。將培養(yǎng)板在37℃溫育。在標(biāo)出的時(shí)間，從HPR+沙芬戈培養(yǎng)板的12個(gè)孔中分別移出150μl培養(yǎng)基，棄去，代之以從僅有HPR的培養(yǎng)板中的12個(gè)孔中分別得到的150μl培養(yǎng)基(預(yù)平衡培養(yǎng)基)。HPR+沙芬戈培養(yǎng)板的孔中的培養(yǎng)基被預(yù)平衡的培養(yǎng)基代替，而不是在新培養(yǎng)基中加入新的HPR，以模擬培養(yǎng)基的任何可能的情況或可能在原有的兩藥物的孔中隨時(shí)間發(fā)生的HPR降解。各培養(yǎng)板重復(fù)制備并在所標(biāo)示的+96-120小時(shí)用DIMSCAN測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞毒性。在各圖上的最終數(shù)據(jù)點(diǎn)表示兩種藥物共同溫育整個(gè)+96-120小時(shí)細(xì)胞的存活率。整個(gè)方法試圖模擬在整個(gè)HPR治療周期內(nèi)，僅在一段時(shí)間內(nèi)同時(shí)暴露于沙芬戈的體內(nèi)的情況。
結(jié)果圖10、11、12代表在短于整個(gè)HPR治療周期的一段時(shí)間內(nèi)沙芬戈與HPR共同出現(xiàn)，從各種細(xì)胞系得到的細(xì)胞毒性結(jié)果。在一些情況下，通過在短于整個(gè)HPR治療周期的時(shí)間內(nèi)共同使用藥物，會(huì)得到由本發(fā)明引起的腫瘤細(xì)胞殺死的大比例的增長(zhǎng)。在一些情況下，在整個(gè)HPR治療周期內(nèi)的一段時(shí)間共同使用沙芬戈和HPR足以使本發(fā)明發(fā)揮作用。這證實(shí)為使本發(fā)明發(fā)揮作用，不需要所有化合物出現(xiàn)在全部時(shí)間內(nèi)。
例11沙芬戈增加其他類視色素的細(xì)胞毒性類視色素全反式視黃酸(ATRA)已被發(fā)現(xiàn)在Neuro 2a神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的神經(jīng)酰胺的水平上能產(chǎn)生適度的(1.5x)增長(zhǎng)(L.Riboni等，生物化學(xué)雜志270:26868(1995))。此處我們證實(shí)與沙芬戈共同使用ATRA，或類視色素13-順-視黃酸，與各種類視色素分別單獨(dú)使用相比，使CHLA-90和LAN-6神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞存活率顯著降低。這證實(shí)本發(fā)明與各種不同的類視色素共同使用是具有活性的。
方法在如前所述的DIMSCAN細(xì)胞毒性測(cè)定所用的96孔微量板的每孔中的全部100μl培養(yǎng)基中加入細(xì)胞。所用的細(xì)胞系包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系CHLA-90和LAN-6。在0時(shí)，在50μl培養(yǎng)基中加入全反式視黃酸(ATRA)，或13-順式視黃酸(13-cis-RA)，或類視色素與沙芬戈以3∶1摩爾比的組合。溫育培養(yǎng)板并用DIMSCAN測(cè)定法在+120小時(shí)對(duì)CHLA-90細(xì)胞，在+144小時(shí)對(duì)LAN-6細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞毒性。
結(jié)果示于圖13-14的數(shù)據(jù)證實(shí)在ATRA或13-順式-RA中加入沙芬戈，使CHLA-90和LAN-6細(xì)胞系的存活率產(chǎn)生顯著的降低。沙芬戈在4μM(在以下實(shí)驗(yàn)中所用的最大濃度)時(shí)對(duì)CHLA-90的存活率為0.11，對(duì)LAN-6細(xì)胞的存活率為0.39。這證實(shí)本發(fā)明與一些不同類視色素使用時(shí)具有活性。
例12神經(jīng)酰胺向無毒的葡糖基神經(jīng)酰胺的特定的轉(zhuǎn)化降低HPR和HPR+沙芬戈的細(xì)胞毒性我們已看到HPR按依賴劑量和時(shí)間的方式在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中產(chǎn)生神經(jīng)酰胺(B.Maurer等，國(guó)立癌癥研究所雜志(1999)(印刷中))。葡糖基神經(jīng)酰胺(GC)是神經(jīng)酰胺的無毒的代謝產(chǎn)物。神經(jīng)酰胺通過葡糖基神經(jīng)酰胺合酶(GCS)的作用轉(zhuǎn)化成葡糖基神經(jīng)酰胺。葡糖基神經(jīng)酰胺合酶(GCS)已使用MCF7/GCS細(xì)胞系中的四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染進(jìn)人MCF7乳腺腫瘤細(xì)胞(Y.Liu等，生物化學(xué)雜志274:1140-46(1999))。已發(fā)現(xiàn)在含多西環(huán)素(一種四環(huán)素)的培養(yǎng)基中溫育MCF7/GCS細(xì)胞能增加GCS活性，增加神經(jīng)酰胺向葡糖基神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)化，降低阿霉素-一種已知能增加這些細(xì)胞中的神經(jīng)酰胺的藥物-的毒性(Y.Liu等，supra)。我們將MCF7/GCS細(xì)胞暴露于有或無多西環(huán)素條件下的HPR、沙芬戈和HPR+沙芬戈中。我們發(fā)現(xiàn)用多西環(huán)素在MCF7/GCS細(xì)胞中增加GCS的活性，顯著降低HPR的細(xì)胞毒性并顯著降低HPR+沙芬戈藥物組合的細(xì)胞毒性。這證實(shí)在MCF7/GCS細(xì)胞中由HPR產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺具有細(xì)胞毒性，本發(fā)明至少部分依賴神經(jīng)酰胺和其細(xì)胞毒性的增加。
方法將MCF7/GCS細(xì)胞置于培養(yǎng)板中，并與10％胎牛血清和用于上述DIMSCAN細(xì)胞毒測(cè)定的200mg/ml HygromycinB(tet關(guān)閉)在RPMI培養(yǎng)基中溫育。為增加GCS表達(dá)，也將MCF7/GCS細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中與3mg/ml多西環(huán)素(tet開放)溫育3天，然后將其再次置于培養(yǎng)板上進(jìn)行DIMSCAN細(xì)胞毒測(cè)定。用多西環(huán)素誘導(dǎo)的(tet開放)細(xì)胞進(jìn)行的DIMSCAN細(xì)胞毒測(cè)定在培養(yǎng)基中也包括3mg/ml多西環(huán)素?！皌et關(guān)閉”和“tet開放”MCF7/GCS細(xì)胞均暴露于HPR、沙芬戈及HPR+沙芬戈(3∶1摩爾比)96小時(shí)，如前所述用DIMSCAN測(cè)定存活百分率。
結(jié)果典型的結(jié)果示于圖15。MCF7/GCS細(xì)胞與多西環(huán)素(tet開放)共同溫育，先顯示促進(jìn)GCS表達(dá)并增加神經(jīng)酰胺向無毒的葡糖基神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)化(Y.Liu等，supra)，與“tet關(guān)閉”MCF7/GCS細(xì)胞相比顯著降低HPR和HPR+沙芬戈的細(xì)胞毒性(在≥6μMHPR時(shí)，用student’st檢驗(yàn)得到P＜.005)。在研究HPR+沙芬戈組合所用濃度范圍內(nèi)(0-4μM)，沙芬戈沒有顯著的細(xì)胞毒性的降低。這證實(shí)HPR細(xì)胞毒性部分依賴于具有細(xì)胞毒性的神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生。進(jìn)一步證明HPR+沙芬戈藥物組合(本發(fā)明的一部分)的活性也至少部分依賴于具有細(xì)胞毒性的神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生和其毒性的增強(qiáng)。
例13HPR和HPR+沙芬戈通過細(xì)胞凋亡和壞死的組合導(dǎo)致細(xì)胞死亡；如果細(xì)胞凋亡受到抑制，HPR和HPR+沙芬戈可以通過壞死導(dǎo)致細(xì)胞死亡通常認(rèn)為在細(xì)胞發(fā)生生化損害后，有兩種主要的機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞死亡細(xì)胞凋亡和壞死(G.Nunez G.等致癌基因17:3237-45(1998)；G.Cohen，生物化學(xué)雜志326:1-16(1997)；Y.Hannun，血液89:1845-53(1997)；N.Thornberry，化學(xué)與生物學(xué)5:R97-103(1998)；N.Zamzami等，Bioenerg Biomembr.,29:185-193(1997)；D.McConkey，毒物學(xué)快報(bào)，99:157-98(1998)；M.Raffray和G.Cohen，藥理治療學(xué).75:153-77(1997)；J.Lemasters，美國(guó)生理學(xué)雜志276:G1-6(1999))。細(xì)胞凋亡包括一系列完全獨(dú)特、完全相繼的酶活化步驟(caspase酶級(jí)聯(lián))，通常導(dǎo)致特殊類型的DNA降解(核小體間的DNA序列梯)和細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)上的特征是將核染色體和細(xì)胞核片段壓縮成細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡體而不喪失膜的完整性，及通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的亞G0/G1期DNA內(nèi)含物的增加。壞死是一種生物化學(xué)上不甚明確的情況，其特征是細(xì)胞膜完整性的大范圍破壞，并涉及細(xì)胞內(nèi)ATP水平的降低(C.Renvoize等，細(xì)胞生物毒物學(xué)14:111-20(1998))。壞死的形態(tài)學(xué)上的特征是細(xì)胞膜完整性的喪失(通過碘化丙錠(propidiuM iodide)染色證實(shí))以及細(xì)胞變圓和細(xì)胞分離。這兩個(gè)過程在其生化機(jī)制中可以部分重疊，但一般認(rèn)為是分開的或至少在機(jī)制的進(jìn)行中有不同的終點(diǎn)。如下所示，HPR和HPR+沙芬戈均通過細(xì)胞凋亡和壞死的結(jié)合引起細(xì)胞死亡。這些觀察是有意義的，因?yàn)榫哂惺軗p的細(xì)胞凋亡機(jī)制的腫瘤細(xì)胞可以通過壞死而將其殺死。因此，此處所述的藥物組合比其他主要依賴于一個(gè)完整的細(xì)胞凋亡機(jī)制或依賴于增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的抗瘤殺死方法具有顯著的優(yōu)勢(shì)。
方法為測(cè)定在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中4-HPR或HPR+沙芬戈導(dǎo)致細(xì)胞死亡的方式，評(píng)定了在有或無一種特定的細(xì)胞凋亡抑制劑、神經(jīng)細(xì)胞滲透劑、pan-caspase酶抑制劑、BOC-d-fmk的情況下，在CHLA-90細(xì)胞中細(xì)胞凋亡和/或壞死的形態(tài)學(xué)跡象(酶系統(tǒng)產(chǎn)品，Livermore,CA)。BOC-d-fmk通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的caspase酶特定地抑制并阻止死亡。CHLA-90細(xì)胞以一個(gè)重復(fù)置于Lab Tek載玻片的小室中(Nunc,Naperville,IL)，吸附24小時(shí)，然后在有或無BOC-d-fmk(40μM)的情況下處理1小時(shí)，再用HPR(10μM)處理。用0.1％乙醇(4-HPR)和/或0.2％DMSO(BOC-d-fmk)載體溶劑處理對(duì)照細(xì)胞。用體外活體的DNA著色劑Hoechst 33342(10ug/ml在37℃進(jìn)行30分鐘)在+24或+48小時(shí)的未分離的細(xì)胞中產(chǎn)生藍(lán)核熒光，對(duì)此進(jìn)行目測(cè)，觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征(DNA凝聚和/或細(xì)胞凋亡體)，此時(shí)用碘化丙錠(propidiuM iodide)(0.5μM/ml)的紅色熒光著色分辨出壞死的細(xì)胞和已產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡細(xì)胞。有凝聚的核殘余物的紅色熒光著色細(xì)胞作為細(xì)胞凋亡細(xì)胞。為在+48小時(shí)測(cè)定細(xì)胞，在+24小時(shí)時(shí)加入另外的BOC-d-fmk(40μM)或適當(dāng)?shù)膶?duì)照載體。在Olympusvanox表熒光顯微鏡上使用一系列適于各種染料的濾光片觀察細(xì)胞。對(duì)多個(gè)隨機(jī)的區(qū)域內(nèi)(每個(gè)區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)為100-500)的細(xì)胞計(jì)數(shù)并對(duì)活細(xì)胞、細(xì)胞凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞照相。為進(jìn)一步考察用HPR處理的細(xì)胞，測(cè)定CHLA-90細(xì)胞的細(xì)胞毒性，預(yù)先用或不用40μMBOC-d-fmk處理此細(xì)胞1小時(shí)，然后加入4-HPR(3-10μM)，并在+24小時(shí)用DIMSCAN測(cè)定法測(cè)定對(duì)生活力的caspase抑制效果。用載體溶劑0.1％乙醇(4-HPR)和/或0.2％DMSO(BOC-d-fmk)處理對(duì)照細(xì)胞。使用在低滲的裂解緩沖液(A.Krishan等，細(xì)胞生物學(xué)雜志66:188-193(1975))中的碘化丙錠用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡(Z.Darnzynkiewicz等，血細(xì)胞計(jì)數(shù)13:795-808(1992))，用亞G0/G1期DNA含量標(biāo)示細(xì)胞。如上處理細(xì)胞并在+24小時(shí)測(cè)定。用有488nm氬激光和定位在610nm的20nm譜帶濾過器的Coulter Epics ELITE流式細(xì)胞儀分析著色的核。誤差范圍(error bars)為95％置信限。用未配對(duì)的、雙邊(two-sided)Student’st-檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。全部P值均為雙邊的。
結(jié)果如圖16所示，pan-caspase酶、細(xì)胞凋亡抑制劑、BOC-d-fmk(40μM)能顯著降低所有濃度的HPR的細(xì)胞毒性(P＜0.01)，但在BOC-d-fmk存在時(shí)，HPR還導(dǎo)致顯著的細(xì)胞毒性(在3μMHPR,P=0.02,在＞3μMHPR,P＜0.01)。這些結(jié)果顯示HPR通過細(xì)胞凋亡和非細(xì)胞凋亡(壞死)兩種機(jī)制殺死細(xì)胞。
圖17在暴露于HPR之前用BOC-d-fmk預(yù)處理CHLA-90細(xì)胞顯著降低(P=0.001)其標(biāo)示細(xì)胞凋亡的核的形態(tài)學(xué)變化(進(jìn)入未喪失膜的活性的細(xì)胞凋亡體內(nèi)的凝聚的、強(qiáng)著色的核染色體和核片段)。然而，HPR引起的(由碘化丙錠著色和細(xì)胞周期證實(shí)的膜的完整性的喪失)壞死的顯著的形態(tài)學(xué)的跡象(P=0.002)受BOC-d-fmk的微弱影響，但與對(duì)照物相比仍顯著(P=.016).HPR單獨(dú)導(dǎo)致顯著的細(xì)胞凋亡(P=.006)，在用HPR+BOC-d-fmk處理的細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡與對(duì)照物沒有顯著的差異(P=.48)。這些結(jié)果提示HPR導(dǎo)致的細(xì)胞死亡是由混合的細(xì)胞凋亡和壞死引起的，即使細(xì)胞凋亡引起的死亡受到抑制，此過程可由壞死機(jī)制進(jìn)行。
圖18在+24小時(shí)，BOC-d-fmk(40μM)排除流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的HPR(10μM)在CHLA-90中引起的亞G0/G1期DNA片段化，它是細(xì)胞凋亡的特征。由于大部分的CHLA-90細(xì)胞在+24小時(shí)已死亡或?yàn)l臨死亡，此數(shù)據(jù)提供了HPR可以通過非細(xì)胞凋亡(壞死)機(jī)制殺死細(xì)胞的證據(jù)。
最近也報(bào)道在淋巴母細(xì)胞瘤樣(lymphoblastoid)細(xì)胞系內(nèi)(L.Spreinger和B.Stewart，癌癥快報(bào)128:189-196(1998))和胚胎癌細(xì)胞系中(J.Clifford等，癌癥研究59:14-18(1999))由HPR(10-20μM)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡由壞死引發(fā)。
圖19在暴露于HPR或HPR+沙芬戈(10∶3微摩爾比例)之前用BOC-d-fmk預(yù)處理CHLA-90細(xì)胞，降低在+48小時(shí)表示細(xì)胞凋亡的核的形態(tài)學(xué)變化。然而，在48小時(shí)由HPR+沙芬戈藥物組合引起的壞死的顯著的形態(tài)學(xué)的跡象受BOC-d-fmk的微弱影響，但與對(duì)照物相比仍顯著(P＜.001)。這些結(jié)果提示藥物組合物HPR+沙芬戈(本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案)可以導(dǎo)致由混合的細(xì)胞凋亡和壞死引起的細(xì)胞死亡，即使細(xì)胞凋亡引起的細(xì)胞死亡受到抑制，此過程可由壞死機(jī)制引發(fā)。
例14
在多數(shù)的腫瘤細(xì)胞系內(nèi)沙芬戈協(xié)同4-HPR的細(xì)胞毒性如上所述，我們已通過抑制多種與神經(jīng)酰胺相關(guān)的途徑成功地增進(jìn)了4-HPR的細(xì)胞毒性。多數(shù)抑制劑僅在體外進(jìn)行了研究。然而沙芬戈，一種具有對(duì)抗神經(jīng)酰胺活化的PKC-ξ的活性的PKC抑制劑，近期收到部分Ⅰ期評(píng)價(jià)(G.Schwartz等，臨床腫瘤研究3,537-543(1997))。此試驗(yàn)由于缺少藥物過早地終止。然而，Ⅰ期結(jié)果顯示沙芬戈在120mg/m2濃度下溫育1小時(shí)，在溫育中達(dá)到3μM血清水平，而沒有報(bào)道的毒性。因此，從這些結(jié)果和動(dòng)物模型數(shù)據(jù)，我們對(duì)4-HPR+沙芬戈的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，HPR沙芬戈為固定的3∶1摩爾比，其濃度為預(yù)期會(huì)在人體中達(dá)到的濃度(G.Kelloff等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志，增刊(suppl.)20,176-196(1994))。首先在包括許多高度抗烷基化劑(alkylator-resistant)細(xì)胞系的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的代表模型中測(cè)試4-HPR+沙芬戈的活性。然后在由其他腫瘤類型衍生的細(xì)胞系中測(cè)試4-HPR+沙芬戈的活性。結(jié)果歸納于表Ⅰ，它也顯示由用于計(jì)算藥物協(xié)同作用的Chou分析法計(jì)算得出的聯(lián)合指數(shù)(CI)(CI是描述兩種藥物聯(lián)合的藥理學(xué)效果的術(shù)語(yǔ)。CI＜1表示協(xié)同效果，具有小數(shù)量的增加的協(xié)同；CI=1表示增加的效果；CI＞1表示藥物的聯(lián)合是拮抗的)。值得注意的是在p53零位(null)或突變體細(xì)胞系中，和在高度抗烷基化試劑的細(xì)胞系中達(dá)到了多-log細(xì)胞毒性。我們的結(jié)果證實(shí)沙芬戈顯著促進(jìn)并甚而協(xié)同4-HPR的對(duì)抗具有多種p53-非依賴方式的腫瘤類型的腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。
表Ⅰ對(duì)于0-12μM的HPR,HPR+沙芬戈(3∶1)的聯(lián)合指數(shù)聯(lián)合指數(shù) 細(xì)胞殺死的對(duì)數(shù)Index(CI) HPR(3∶1)細(xì)胞類型 ED99 9μM12μM神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-RA ＜0.11.9 3SMS-LHN Pd-IND ＜0.13.5CHLA-90 Pd-BMT ＜0.13.1 4CHLA-171 ＜0.12.9 4CHLA-79 Pd-BMT ＜0.13.5 4肺NCl-H146SCLC ＞c-myc ＜0.13.2 4NCl-H157 鱗狀的 ＜0.12.9 4NCl-H1792＜0.12.1 4A549 p53wt 0.21 2黑素瘤A375 p53wt ＜0.12.6 4A2058 0.20.9 2.7前列腺LNCaP.FGCp53wt ＜0.12.8 4PC-3 p53null 1.01.4 1.9結(jié)腸LoVop53wt 0.10.5 1.8HT-29 p53mut0.31.3 2.4乳腺M(fèi)CF7p53wt 0.51.1 1.5DoxR MCF7 0.10.9 1.5MDA-MB-231 p53mut0.30.9 3胰腺PANC-1上皮的p53mut0.20.3 1.7Hs766T1.72.9 2.5聯(lián)合指數(shù)(CI) 說明＜0.1 非常強(qiáng)的協(xié)同0.1-0.3 強(qiáng)的協(xié)同0.3-0.7協(xié)同0.7-0.85 中等的協(xié)同0.85-0.9 輕微的協(xié)同0.9-1.10 接近于累積1.1-1.20 輕微的拮抗上述是對(duì)本發(fā)明的說明，但不局限于此。用以下權(quán)利要求書對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行限定，此處包括權(quán)利要求書的等同物。
權(quán)利要求
1．一種對(duì)需要治療的受治療者施行的治療過度增殖疾病的方法，包括以聯(lián)合方式使受治療者服用有效治療量的(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素，或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)神經(jīng)酰胺降解抑制劑，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的神經(jīng)酰胺降解抑制劑選自葡糖基神經(jīng)酰胺合酶抑制劑，鞘氨醇-1-磷酸合酶抑制劑，蛋白激酶C抑制劑，和其藥學(xué)上可接受的鹽。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的過度增殖疾病包括噁性、癌前和非噁性的過度增殖疾病。
4．一種對(duì)需要治療的受治療者施行的治療過度增殖疾病的方法，包括以聯(lián)合方式使受治療者服用有效治療量的(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素，或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素是芬維A胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。
6．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑是葡糖基神經(jīng)酰胺合酶抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
7．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑是1-苯基-2-棕櫚酰氨基-3-嗎啉代-1-丙醇或其藥學(xué)上可接受的鹽。
8．一種對(duì)需要治療的受治療者施行的治療過度增殖疾病的方法，包括以聯(lián)合方式使受治療者服用有效治療量的(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素，或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素是芬維A胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。
10．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑是鞘氨醇激酶抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
11．根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑是D-赤-N,N-二甲基鞘氨醇或其藥學(xué)上可接受的鹽。
12．一種對(duì)需要治療的受治療者施行的治療過度增殖疾病的方法，包括以聯(lián)合方式使受治療者服用有效治療量的(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素，或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)蛋白激酶C抑制劑，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素是芬維A胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。
14．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的蛋白激酶C抑制劑是L-蘇-二氫鞘氨醇或其藥學(xué)上可接受的鹽。
15．一種對(duì)需要治療的受治療者施行的治療過度增殖疾病的方法，包括以聯(lián)合方式使受治療者服用有效治療量的(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素，或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)選自包括以下的至少兩種化合物(ⅰ)葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽，(ⅱ)鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽，和(ⅲ)蛋白激酶C抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素是芬維A胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。
17．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的至少兩種化合物包括(ⅰ)葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，(ⅱ)鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑、蛋白激酶C抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
18．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的至少兩種化合物包括葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，和鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
19．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的至少兩種化合物包括葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，和蛋白激酶C抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
20．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的至少兩種化合物包括鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，和蛋白激酶C抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
21．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的至少兩種化合物包括葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，鞘氨醇-1-磷酸合成抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽，和蛋白激酶C抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
22．一種篩選增加產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素對(duì)過度增殖細(xì)胞的細(xì)胞毒性的化合物的方法，包括(a)將第一對(duì)照過度增殖細(xì)胞與一定量的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素接觸；(b)將第二對(duì)照過度增殖細(xì)胞與一定量的測(cè)試化合物接觸；并(c)將實(shí)驗(yàn)過度增殖細(xì)胞與步驟(a)所述數(shù)量的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素和步驟(b)所述數(shù)量的測(cè)試化合物接觸；并(d)測(cè)定以上步驟(a)、(b)、(c)的過度增殖細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，然后(e)將對(duì)步驟(c)中實(shí)驗(yàn)過度增殖細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制與對(duì)步驟(a)和(b)中的過度增殖細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制進(jìn)行比較，在步驟(c)的實(shí)驗(yàn)過度增殖細(xì)胞中，測(cè)得比步驟(b)和(c)的對(duì)照過度增殖細(xì)胞的聯(lián)合生長(zhǎng)抑制更大程度的抑制作用，表示測(cè)試化合物促進(jìn)了產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素的活性。
23．根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的比較步驟通過計(jì)算聯(lián)合指數(shù)進(jìn)行。
24．根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的過度增殖細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
25．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺、黑素瘤、前列腺、結(jié)腸、乳腺、白血病和胰腺的腫瘤細(xì)胞。
26．根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素是芬維A胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。
27．根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的測(cè)試化合物是神經(jīng)酰胺降解抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽。
28．根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的測(cè)定生長(zhǎng)抑制的步驟通過測(cè)定壞死、細(xì)胞凋亡或二者進(jìn)行。
29．一種由權(quán)利要求22的方法產(chǎn)生的，增加產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素在過度增殖細(xì)胞中的細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒活性的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
30．一種藥物制劑，含有在一種藥學(xué)可接受的載體中的、由權(quán)利要求22的方法產(chǎn)生的，治療有效量的，能增加產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素在過度增殖細(xì)胞中的細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒活性的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
31．根據(jù)權(quán)利要求31所述的藥物制劑，進(jìn)一步含有治療有效量的產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素或其藥學(xué)上可接受的鹽。
32．一種對(duì)需要治療的受治療者施行的治療過度增殖疾病的方法，包括以聯(lián)合方式使受治療者服用有效治療量的(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素，或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)一種由權(quán)利要求22產(chǎn)生的增加產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素在過度增殖細(xì)胞中的細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒活性的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
33．根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的過度增殖疾病包括噁性、癌前和非癌性的過度增殖疾病。
全文摘要
一種對(duì)需要治療的受治療者施行的治療過度增殖疾病的方法,包括以聯(lián)合方式使受治療者服用有效治療量的:(a)產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的類視色素,如芬維A胺或其藥學(xué)上可接受的鹽;和(b)至少一種(在某些實(shí)施方案中為至少兩種)神經(jīng)酰胺降解抑制劑,如選自(ⅰ)葡糖基神經(jīng)酰胺合成抑制劑(ⅱ)鞘氨醇－1－磷酸合成抑制劑和(ⅲ)蛋白激酶C抑制劑的化合物。一種優(yōu)選的神經(jīng)酰胺合成抑制劑是1－苯基－2－棕櫚酰氨基－3－嗎啉代－1－丙醇。一種優(yōu)選的鞘氨醇－1－磷酸合成抑制劑是D－赤－N,N－二甲基鞘氨醇。一種優(yōu)選的蛋白激酶C抑制劑是L－蘇－二氫鞘氨醇。
文檔編號(hào)A61K31/535GK1308538SQ99808142
公開日2001年8月15日 申請(qǐng)日期1999年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月29日
發(fā)明者B·J·毛雷爾, C·P·雷諾, M·卡波特 申請(qǐng)人:洛杉磯兒童醫(yī)院