專利名稱：新型VLA－4抑制劑:oMePUPA－V的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制、變更或預(yù)防細(xì)胞粘著和細(xì)胞粘著介導(dǎo)致病狀的新化合物。本發(fā)明還涉及含有這些化合物的藥物制劑，以及使用它們抑制和預(yù)防細(xì)胞粘著和細(xì)胞粘著介導(dǎo)致病的方法。可以將本發(fā)明的這些化合物和藥物組合物用作治療和預(yù)防藥物。它們特別適宜治療許多炎性和自身免疫性疾病。
細(xì)胞粘著為細(xì)胞彼此結(jié)合、向特定靶子移動(dòng)或定位在胞外基質(zhì)中的過程。細(xì)胞粘著本身構(gòu)成許多生物現(xiàn)象的基本機(jī)制之一。例如，細(xì)胞粘著引起造血細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上，接著這些造血細(xì)胞移到血管外并移到損傷部位。細(xì)胞粘著本身在如哺乳動(dòng)物的炎癥和免疫反應(yīng)的許多病狀中起作用。
對(duì)細(xì)胞粘著的分子基礎(chǔ)研究顯示，不同細(xì)胞表面的大分子-共同稱之為粘著分子或受體-介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。例如，所謂“整聯(lián)蛋白”的超家族蛋白質(zhì)是造血細(xì)胞和其微環(huán)境之間粘附相互作用的關(guān)鍵介導(dǎo)體(M.E.Hemler，″整聯(lián)蛋白家族中的VLA蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和其對(duì)白細(xì)胞的作用″Ann.Rev.Immunol.，8，第365頁(1990))。整聯(lián)蛋白為非共價(jià)雜二聚體絡(luò)合物，由兩個(gè)所謂的α和β亞單元組成。有至少17個(gè)不同的α亞單元(α1-α10、α-L、α-M、α-D、α-X、α-IIB、α-V和α-E)和至少9個(gè)不同的β(β1-β9)亞單元，到目前為止它們都已被識(shí)別?；谄洇梁挺聛唵卧M分的類型，可以將每個(gè)整聯(lián)蛋白歸類到亞家族中。
整聯(lián)蛋白α4β1，最近也稱之為抗原-4(“VLA-4”)或CD49d/CD29，為參與廣泛的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)粘附相互作用的白細(xì)胞細(xì)胞表面受體(M.E.Hemler，Ann.Rev.Immunol.，8，第365頁(1990))。它被充當(dāng)白細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的受體，血管細(xì)胞粘著分子-1(“VCAM-1”)，以及胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)纖連蛋白(“FN”)的受體(Ruegg等人，J.Cell Biol.，177，第179頁(1991))；Wayner等人，J.Cell Biol.，105，第1873頁(1987)；Kramer等人，J.Biol.Chem.，264，第4684頁(1989)；Gehlsen等人，Science，24，第1228頁(1988))?？?VLA-4單克隆抗體(″mAb′s″)已顯示出在體外和體內(nèi)都抑制VLA-4-依賴性粘著相互作用(Ferguson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，88，第8072頁(1991)；Ferguson等人，J.Immunol.150，第1172頁(1993)).體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果暗示，抑制VLA-4-依賴性細(xì)胞粘著可以預(yù)防、抑制或改變幾種炎性和自體免疫病狀。(R.L.Lobb等人，″The Pathophysiologic Role of α4整聯(lián)蛋白在體內(nèi)的病理生理作用，94，第1722-28頁(1994))。
為了鑒定結(jié)合VLA-4所必需的最小活性氨基酸序列，Komoriya等人合成了許多以特種纖連蛋白的CS-1區(qū)域(VLA-4結(jié)合域)的氨基酸序列為基礎(chǔ)的重疊肽。(″在纖連蛋白的選擇性剪接型III連接片段域中主細(xì)胞型特異性粘著位點(diǎn)的最小必需序列(CS1)為亮氨酸-天冬氨酸-纈氨酸″J.Biol.Chem.，266(23).第15075-79頁(1991))。它們鑒定了一8-氨基酸肽，Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr，以及兩個(gè)較小的重疊五肽，Glu-Ile-Leu-Asp-Val和Leu-Asp-Val-Pro-Ser，它們具有抗FN-依賴性細(xì)胞粘著的抑制活性。這些結(jié)果暗示，三肽Leu-Asp-Val是細(xì)胞粘著活性的最小序列。后來證實(shí)，Leu-Asp-Val僅結(jié)合表達(dá)VLA-4活性形式的淋巴細(xì)胞，因此使人們不相信能在體內(nèi)能利用這種肽(E.A.Wayner等人，“在纖連蛋白的V區(qū)域中LDV序列的造血細(xì)胞的激活依賴性識(shí)別”，J.Cell.Biol.，116(2)，第489-497頁(1992))。但是，含有LDV序列的某些較大肽后來顯示出在體內(nèi)有活性(T.A.Ferguson等人，“兩個(gè)整聯(lián)蛋白結(jié)合肽使體內(nèi)的T-細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)無效”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，第8072-76頁(1991)；和S.M.Wahl等人，″合成纖連蛋白肽通過中斷白細(xì)胞粘著和募集來抑制大鼠關(guān)節(jié)炎″，J.Clin.Invest.，94，第655-62頁(1994))。還描述了能夠抑制VLA-4和VLA-5粘著到FN上的環(huán)五肽。(參見例如，D.M.Nowlin等人″新型環(huán)五肽抑制a4β1和α5β1整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘著″，J.Biol.Chem.，268(27)，第20352-59頁(1993)；以及PCT申請(qǐng)PCT/US91/04862)。該五肽以來自已知為幾種胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的識(shí)別位點(diǎn)中的常規(guī)主題的FN的三肽序列Arg-GIy-Asp為基礎(chǔ)。
例如在懸而待決的美國(guó)專利申請(qǐng)08/376372(本文特別引入作為參考)中已報(bào)道了VLA-4抑制劑的其它例子。USSN 376372描述了具有細(xì)胞粘著抑制活性的含β-氨基酸的線性肽基化合物。國(guó)際專利申請(qǐng)94/15958和WO92/00995(特別引入作為參考)描述了具有細(xì)胞粘著調(diào)節(jié)活性的環(huán)狀肽和肽模擬化合物。國(guó)際專利申請(qǐng)WO93/08823和WO92/08464(本文特別引入作為參考)含有胍基、脲基和硫脲基的細(xì)胞粘著調(diào)節(jié)化合物。美國(guó)專利US5260277描述了胍基細(xì)胞粘著調(diào)節(jié)化合物，將其特別引入本文。
盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，但是還需要具有提高的藥動(dòng)學(xué)和藥效性如口服生物可利用率和有效作用時(shí)間的低分子量VLA-4依賴性細(xì)胞粘著特異性抑制劑。這些化合物將提供對(duì)治療、改變、預(yù)防或抑制通過細(xì)胞粘著和VLA-4結(jié)合所介導(dǎo)的各種病狀有用的藥物。
本發(fā)明的化合物為VLA-4整聯(lián)蛋白抑制劑，因此阻斷VLA-4結(jié)合到其各種配體上，如VCAM-1和纖連蛋白區(qū)域。因此這些化合物在抑制包括細(xì)胞激活、移動(dòng)、繁殖和分化的細(xì)胞粘著過程中是有用的。這些化合物對(duì)抑制、預(yù)防和減少VLA-4介導(dǎo)的細(xì)胞粘著和與該粘著有關(guān)的病狀如炎癥和免疫反應(yīng)，包括例如多發(fā)性硬化、哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、炎性肺病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、器官移植、再狹窄、自體骨髓移植、病毒感染的炎性后遺癥、心肌炎、包括潰瘍性結(jié)膜炎和克羅恩氏病的炎性腸病、某些類型的毒性和免疫基腎炎、接觸性皮膚過敏癥、牛皮癬、瘤轉(zhuǎn)移、多發(fā)性骨髓瘤和動(dòng)脈粥樣硬化是有用的。本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)使用也可以與抑制、變更、預(yù)防或減少細(xì)胞粘著的其它治療或預(yù)防性試劑混合使用。本發(fā)明還提供了含這些VLA-4-介導(dǎo)的細(xì)胞粘著抑制劑的藥物制劑和使用本發(fā)明的化合物和組合物抑制細(xì)胞粘著的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1報(bào)道了綿羊用oMePUPA-V處理后的呼吸道反應(yīng)性。綿羊，天然對(duì)豬蛔蟲過敏，在以指定劑量給藥oMePUPA-V氣溶膠或等量載體之后2小時(shí)用豬蛔蟲過敏原氣溶膠攻擊。在指定時(shí)間測(cè)定肺力學(xué)并被報(bào)道為基于研究前基線值(左方格)的特異性呼吸道阻力的變化。在開始研究之前和過敏原攻擊24小時(shí)之后(右方格)測(cè)定吸入的氨甲酰膽堿的呼吸道阻力。以攻擊前和攻擊后的PC400(阻力增加400％所需的氨甲酰膽堿的量)值的比報(bào)道呼吸道反應(yīng)性。
圖2綿羊，天性對(duì)豬蛔蟲過敏，以指定劑量給藥oMePUPA-V氣溶膠或豬蛔蟲氣溶膠攻擊。測(cè)定氣溶膠攻擊之后的呼吸道阻力的變化并將攻擊后峰特異性肺阻力(cm H2O/sec)與基線值比較。與對(duì)照組重復(fù)比較的Dunnett試驗(yàn)之后，與PBS對(duì)照比較，方差單向分析，*＝p＜0.05。統(tǒng)計(jì)顯示，與PBS對(duì)照組比較的峰特異性肺阻力大大增加。
圖3綿羊，天性對(duì)豬蛔蟲過敏，在給藥oMePUPA-V氣溶膠(0.03mg)或等量載體(乙醇∶生理鹽水，1∶2，上方格；Tris∶生理鹽水，1∶499，下方格)第4天之后用豬蛔蟲過敏原氣溶膠攻擊24小時(shí)。在指定時(shí)間測(cè)定肺力學(xué)并被報(bào)道為基于研究前基線值(左方格)的特異性呼吸道阻力的變化。在開始研究之前和過敏原攻擊24小時(shí)之后(右方格)測(cè)定吸入的氨甲酰膽堿的呼吸道阻力。以攻擊前和攻擊后的PC400(阻力增加400％所需的氨甲酰膽堿的量)值的比報(bào)道呼吸道反應(yīng)性。
圖4Balb/c小鼠，先前對(duì)DNFB過敏，通過對(duì)左耳背面施用DNFB并向右耳背面施用載體攻擊。24小時(shí)后用微米計(jì)測(cè)定耳朵的厚度。在用DNFB攻擊之后以給定劑量給藥oMePUPA-V4小時(shí)。以最大有效腸道劑量供給陽性對(duì)照(+CTRL)化合物。值為8只動(dòng)物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。上方格顯示了耳朵的絕對(duì)膨脹。下方格顯示了與載體(VEH)對(duì)照相比耳朵膨脹抑制的百分比。
圖5在不同激活條件下OMePUPA-V和已知抑制劑之間的競(jìng)爭(zhēng)性分析。將TBS+2mM Mn2+、1mM Ca2++1mM Mg2+、1mM Ca2++10mM Mg2+、10mM Mg2+或10mM Mg2++10μg/ml TS2/16中的Jurkat細(xì)胞(1.5×106/ml)在室溫下單獨(dú)用5nM3H-已知抑制劑或用5nM3H-已知抑制劑+10nM BIO1591處理30分鐘。然后通過離心作用將這些細(xì)胞造粒，再懸浮于100μl的TBS+Mn2+中，并通過閃鑠計(jì)數(shù)分析。結(jié)合在這些條件下的計(jì)數(shù)測(cè)定未被試驗(yàn)化合物占領(lǐng)并因此沒有結(jié)合3H-已知抑制劑的整聯(lián)蛋白。
本發(fā)明提供了能夠通過抑制配體結(jié)合到受體上抑制VLA-4介導(dǎo)的細(xì)胞粘著的化合物。優(yōu)選的化合物是(R)-N-[[4-[[(2-甲基苯基氨基)羰基]氨基]苯基]乙?；鵠-L-脯氨?；?3-甲基)-β-丙氨酸，本文稱之為“oMePUPA-V”，如下式I所示 oMePUPA-V并且本文稱之為“oMePUPA-V”。本發(fā)明還包含oMePUPA-V的藥物上可接受的衍生物、鹽和酯。
式I的化合物含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心因此可以外消旋混合物、簡(jiǎn)單的對(duì)映體、非對(duì)映體混合物和單個(gè)非對(duì)映體形式存在。本發(fā)明包括式I化合物的所有這些異構(gòu)形式。
本發(fā)明還包含藥物上可接受的式I鹽。術(shù)語“藥物上可接受的鹽”是指由藥物上可接受的非毒性堿或酸包括無機(jī)或有機(jī)堿和無機(jī)或有機(jī)酸制備的鹽。由無機(jī)堿獲得的鹽包括鋁、銨、鈣、銅、鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳鹽、亞錳、鉀、鈉、鋅等。特別優(yōu)選銨、鈣、鎂、鉀和鈉鹽。由藥物上可接受的有機(jī)非毒性堿獲得的鹽包括伯、仲和叔胺鹽，取代胺包括天然存在的取代胺、環(huán)胺和堿性離子交換樹脂，如精氨酸、甜菜堿、咖啡因、膽堿、N，N′-二芐基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-嗎啉、N-乙基哌啶、還原葡糖胺、葡糖胺、組氨酸、羥基胺、異丙胺、賴氨酸、甲葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、聚胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可堿、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。
當(dāng)本發(fā)明的化合物為堿性時(shí)，鹽可以由包括無機(jī)和有機(jī)酸的藥物上可接受的非毒性酸制備。這些酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、檸檬酸、乙磺酸、富馬酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氫溴酸、鹽酸、羥乙磺酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、杏仁酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、撲酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、對(duì)甲苯磺酸等。特別優(yōu)選檸檬酸、氫溴酸、馬來酸、磷酸、硫酸和酒石酸。
此外，本發(fā)明包含藥物前體，特別是酯前體藥物，其中將(R)-N-[[4-[[(2-甲基苯基氨基)羰基]氨基]苯基]乙酰基]-L-脯氨?；?3-甲基)-β-丙氨酸的羧基用任意醇酯化。優(yōu)選的醇為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、或直鏈或支鏈C1-10烷基醇。
式I化合物對(duì)抗VLA-4作用的能力使它們可以用于預(yù)防、治療或逆轉(zhuǎn)由VLA-4結(jié)合到其配體上誘導(dǎo)的癥狀、紊亂或疾病。因此這些對(duì)抗劑將抑制包括細(xì)胞激活、移動(dòng)、繁殖和分化的細(xì)胞粘著過程。因此，本發(fā)明的另一方面提供了治療、預(yù)防、減輕或抑制VLA-4路徑所介導(dǎo)的疾病或紊亂。這些疾病和紊亂包括例如哮喘、多發(fā)性硬化、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、炎性肺病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性骨髓瘤、膿毒性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、器官移植排斥、炎性腸病和其它。
可以使用任意常規(guī)技術(shù)合成本發(fā)明的化合物，在本發(fā)明中列舉了幾種這些技術(shù)。優(yōu)選地，由可容易獲得的原料如α-氨基酸及其功能性等價(jià)物化學(xué)合成這些化合物。合成這些化合物的模塊和匯集法也是優(yōu)選的。在匯集法中，例如在合成的最后階段，大段最終產(chǎn)物匯聚在一起，而不是通過將小片段增量加成到成長(zhǎng)的分子鏈上。
本發(fā)明的化合物還可以通過附加增強(qiáng)選擇性生物性能的適宜功能團(tuán)修飾。這些修飾法在本領(lǐng)域中是已知的并包括增加進(jìn)入給定生物體系(例如血液、淋巴系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng))的生物穿透性、增加口服利用度、增加通過注射給藥的溶解性、改變新陳代謝和改變排泄速度的那些。這些修飾的例子包括，但不限于，用聚乙二醇的酯化、用新戊酸酯或脂肪酸取代物衍生、轉(zhuǎn)化成氨基甲酸酯、芳環(huán)羥基化和芳環(huán)中雜原子取代。
本申請(qǐng)全文中所用的術(shù)語“患者”是指哺乳動(dòng)物，包括人。并且術(shù)語“細(xì)胞”是指任意細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人細(xì)胞。
一旦合成，可以使用體外和體內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定本發(fā)明化合物的活性和VLA-4特異性。
例如，這些化合物的細(xì)胞粘著抑制活性可以通過測(cè)定阻斷VLA-4-表達(dá)細(xì)胞結(jié)合到纖連蛋白-或CS1-涂布平板上所需的抑制劑的濃度來測(cè)定。在這種測(cè)定中，微量滴定孔用纖連蛋白(含有CS-1序列)或者用CS-1涂布。如果使用CS-1，它必須共軛到載體蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白上，以便結(jié)合到這些孔上。一旦將這些孔涂布，然后將不同濃度的試驗(yàn)化合物與適宜標(biāo)記的VLA-4-表達(dá)細(xì)胞一起添加?；蛘?，可以首先添加試驗(yàn)化合物，用所涂布的孔培養(yǎng)，然后加入細(xì)胞。使這些細(xì)胞在這些孔中培養(yǎng)至少30分鐘。培養(yǎng)之后，將這些孔倒空并沖洗。通過定量每種不同濃度的試驗(yàn)化合物和不含試驗(yàn)化合物的對(duì)照附著在平板上的熒光性或放射性測(cè)定結(jié)合抑制。
可以用于本實(shí)驗(yàn)的VLA-4-表達(dá)細(xì)胞包括Ramos細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞、A375黑瘤細(xì)胞和人周圍血液淋巴細(xì)胞(PBL)?？梢匀我膺m宜方式，例如熒光或放射性標(biāo)記，標(biāo)記本測(cè)定中所用的細(xì)胞。
還可以使用直接結(jié)合測(cè)定定量本發(fā)明化合物的抑制活性。在該測(cè)定中，將含有附著在IgG1分子(“VCAM 2D-IgG”)的鉸鏈區(qū)上的首先的兩個(gè)免疫球蛋白域的VCAM-IgG融合蛋白共軛到標(biāo)志酶如堿性磷酸酯酶(“AP”)上。該VCAM-IgG融合的合成描述在PCT申請(qǐng)WO90/13300中，將其加入本文作為參考。該熔融與標(biāo)志酶的共軛是通過本領(lǐng)域中眾所周知的交聯(lián)法完成的。
然后將該VCAM-IgG酶共軛物放入多孔過濾板的孔中，例如在微孔多級(jí)篩分測(cè)定體系(Millipore Corp.，Bedford，MA)中所含的。然后向這些孔中加入不同濃度的試驗(yàn)抑制化合物，之后加入VLA-4-表達(dá)細(xì)胞。將這些細(xì)胞、化合物和VCAM-IgG酶共軛物混合在一起并在室溫下培養(yǎng)。
培養(yǎng)之后，將這些孔抽空，留下細(xì)胞和任意附著的VCAM。通過加入與VCAM-IgG共軛的酶的適宜比色底物并測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的量來確定附著的VCAM的量。反應(yīng)產(chǎn)物降低說明結(jié)合抑制活性增加。下面描述了一些測(cè)定方案為了評(píng)價(jià)本發(fā)明化合物的VLA-4抑制特異性，測(cè)定整聯(lián)蛋白即β2和β3以及其它β1整聯(lián)蛋白如VLA-5、VLA-6和α4β7的其它主要基團(tuán)。這些測(cè)定可以與上述的粘著抑制和直接結(jié)合測(cè)定相似，取代適宜的整聯(lián)蛋白表達(dá)細(xì)胞和相應(yīng)配體。例如，多形核細(xì)胞(PMN)在其表面上表達(dá)β2整聯(lián)蛋白并結(jié)合到ICAM上。β3整聯(lián)蛋白涉及血小板聚集作用并且可以在標(biāo)準(zhǔn)血小板聚集測(cè)定中測(cè)定抑制性。VLA-5特異性地結(jié)合到Arg-Gly-Asp序列上，而VLA-6結(jié)合到昆布氨酸上。最近發(fā)現(xiàn)α4β7為VLA-4同系物，它也結(jié)合纖連蛋白和VCAM。在利用上述VCAM-IgG-酶標(biāo)志共軛物和表達(dá)α4β7的細(xì)胞系，但不是VLA-4，如RPMI-8866或JY細(xì)胞的結(jié)合測(cè)定中測(cè)定α4β7的特異性。
一旦鑒定VLA-4特異性抑制劑，還可以進(jìn)一步將它們?cè)隗w內(nèi)測(cè)定中鑒定。一種這樣的測(cè)定試驗(yàn)在動(dòng)物中的接觸過敏性抑制，例如P.L.Chisholm等人描述的“整聯(lián)蛋白α-4亞單元的單克隆抗體抑制鼠科接觸過敏性反應(yīng)”Eur.J.Immunol.，23，第682-688頁(1993)以及“免疫學(xué)中的目前方案”中，J.E.Coligan等人編輯，John Wiley & Sons，NewYork，1，第4.2.1-4.2.5頁(1991)，將它們加入本文作為參考。在該測(cè)定中，將動(dòng)物的皮膚與刺激物如二硝基氟苯接觸，然后通過輕微的物理刺激如用尖端輕輕擦涂皮膚使其過敏?；謴?fù)一段時(shí)間之后，用相同步驟將動(dòng)物再致敏。過敏幾天后，講動(dòng)物的一只耳朵與該化學(xué)刺激物接觸，同時(shí)另一只耳朵用沒有刺激物的對(duì)照溶液處理。將這些耳朵處理之后不久，通過皮下注射給予這些動(dòng)物不同劑量的VLA-4抑制劑。通過測(cè)定處理和未處理的耳朵中動(dòng)物的耳朵膨脹反應(yīng)評(píng)價(jià)與細(xì)胞粘著相關(guān)的炎癥的體內(nèi)抑制。使用測(cè)徑規(guī)或其它適宜儀器測(cè)定耳朵厚度來測(cè)定膨脹。以這種方式，人們可以鑒定最適宜抑制炎癥的本發(fā)明的抑制劑。
用來檢測(cè)本發(fā)明抑制劑的另一體內(nèi)測(cè)定是綿羊哮喘測(cè)定?；旧先鏦.M.Abraham等人在“α4-整聯(lián)蛋白介導(dǎo)綿羊中抗原誘導(dǎo)的Late Bronchial反應(yīng)和延長(zhǎng)的呼吸道過反應(yīng)性”J.Clin.Invest.，93，第776-87頁(1994)中所述的進(jìn)行該測(cè)定，將其加入本文作為參考。該測(cè)定測(cè)定了過敏綿羊中蛔蟲屬抗原誘導(dǎo)的后期呼吸道反應(yīng)和呼吸道過敏反應(yīng)性的抑制。還可以在血小板聚集測(cè)定中檢驗(yàn)本發(fā)明化合物。
本發(fā)明VLA-4抑制劑出人意料地顯示出有益的活性和選擇性。通常，這些化合物對(duì)VLA-4(＞1000倍的α4β7和α5β1)具有選擇性，在常規(guī)PanLabs和非GLP Ames測(cè)定中為陰性，在標(biāo)準(zhǔn)輔助藥理試驗(yàn)中潔凈并在按照人一天一次預(yù)定使用量1mg/天或更少在綿羊模型中有效。
與結(jié)構(gòu)上相關(guān)的VLA-4抑制劑相比，本發(fā)明的化合物具有出人意料優(yōu)良的效能。例如，蛔蟲屬過敏的綿羊用霧化藥劑以0.1mg/kg一天一次處理4天，然后用抗原攻擊24小時(shí)，最后劑量之后，預(yù)先試驗(yàn)的化合物基本上使早期反應(yīng)減弱并阻止了后期支氣管縮小和非特異性過敏反應(yīng)性的發(fā)展。假設(shè)在人中生物等值，那么在70kg人中將需要總劑量7mg。而且，通過氣管內(nèi)管以估計(jì)為人口服吸入器裝置典型達(dá)到的2倍的沉積速度向綿羊給藥。此外，可以將賦形劑加入最后固體制劑中，以使裝置填充和藥物釋放最佳。這些因素建議，在人體中超過技術(shù)限制1-5mg的14mg或更多的可能劑量需要可以通過干粉吸入器(DPI)裝置準(zhǔn)確釋放。然而所需劑量可以通過該DPI的多次使用釋放，這在哮喘市場(chǎng)上將呈現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性缺陷，通常吸入的類固醇計(jì)量為0.2-1.0mg。
在抗原攻擊之前當(dāng)以0.003mg/kg的最小劑量以單霧化劑量給藥2小時(shí)時(shí)，oMePUPA-V使早期反應(yīng)減弱，阻止了后期支氣管縮小并使過反應(yīng)性正?；?。而且，以每天劑量0.001mg/kg用抗原攻擊4天，最后劑量24小時(shí)之后，得到最大反應(yīng)。因此，與市場(chǎng)上最好的吸入類固醇的劑量水平相比，oMePUPA-V比以前的化合物的效能高出30-100倍。oMePUPA-V及其次末段合成中間物為高度結(jié)晶。(參見圖1，表1)此外，與已知VLA-4抑制劑化合物相比，oMePUPA-V具有改善的新陳代謝輪廓。例如，給藥氣溶膠之后，本發(fā)明的化合物很快轉(zhuǎn)變成低活性代謝產(chǎn)物，它是從支氣管肺泡流體(BALF)中回收的主要產(chǎn)物，并且也是體循環(huán)中觀察到的主要產(chǎn)物，在體循環(huán)中它比母化合物呈現(xiàn)出更長(zhǎng)的血液半衰期。然而向低活性化合物的快速代謝轉(zhuǎn)化是實(shí)現(xiàn)減少全身接觸的有用的策略，代謝成幾乎沒有或本質(zhì)上沒有活性的副產(chǎn)物的化合物在進(jìn)展上呈現(xiàn)出更少的復(fù)雜性，并且從后面角度來看是優(yōu)選的。
由于oMePUPA-V的潛在蛋白水解產(chǎn)物在VLA-4結(jié)合測(cè)定中無活性，因此蛋白水解將產(chǎn)生無活性產(chǎn)物。盡管如此，體外代謝研究和大鼠、狗和綿羊中的體內(nèi)PK研究顯示出oMePUPA-V在蛋白水解上是穩(wěn)定的。
表1與以前已知的抑制劑相比的oMePUPA-V的性能性能 以前的化合物 oMePUPA-V抗VLA-4-VCAM-Ig結(jié)合的IC50 1.5nM 2.7nM抗α4β7-VCAM-Ig結(jié)合的IC502.7μM ＞100μM抗α5β1-FN粘著的IC50 ＞100μM ＞100μM綿羊模型中最小有效劑量-單劑量 0.1mg/kg 0.003mg/kg-重復(fù)劑量 0.03-0.1mg/kg 0.001mg/kg結(jié)晶性無 有體外藥物篩分85試驗(yàn)1周擊中干凈ACE活性 ACE底物 干凈葡萄糖醛酸化 低水平 預(yù)定的Ames試驗(yàn)(誘變性) 干凈 干凈輔助藥理學(xué)(副作用) 干凈全身接觸，10mg氣溶膠劑量(綿羊) 40ng/ml×hr 完成代謝輪廓 活性新陳代謝產(chǎn)物口服利用度 ＜1％＜1％整體穩(wěn)定性(40℃，75％RH)“不穩(wěn)定” 穩(wěn)定＞4周配制穩(wěn)定性(40℃) 0.2％降解/天 穩(wěn)定＞4周可以將本發(fā)明的化合物配制成可以經(jīng)口、非腸道、吸入法噴射、局部、直腸、鼻、口腔、陰道、或通過植入的儲(chǔ)器給藥的藥物組合物。本文中所用的術(shù)語“非腸道”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
本發(fā)明的藥物組合物含有本發(fā)明任意的化合物或其藥物上可接受的衍生物和任意藥物上可接受的載體。本文中所用的術(shù)語“載體”包括可接受的佐劑和載體?？梢杂糜诒景l(fā)明藥物組合物的藥物上可接受的載體包括，但不限于，離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白如人血清蛋白、緩沖物如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態(tài)的二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙稀基吡咯烷酮、纖維素基物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物可以為可無菌注射制劑的形式，例如可無菌注射的含水或含油懸浮液形式?？梢允褂眠m宜的分散或潤(rùn)濕劑和懸浮劑根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)配制該懸浮液?？蔁o菌注射的該制劑還可以為非毒性非腸道可接受的稀釋劑或溶劑中的可無菌注射的溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液?？梢越邮艿妮d體和可以使用的溶劑為水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌固定油常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，可以使用包括合成的單或二甘油酯的任意混合不揮發(fā)油。脂肪酸，例如油酸和其甘油酯衍生物以及作為天然藥物上可接受的油，如橄欖油或蓖麻子油，特別是它們的聚氧乙基化變體在制備可注射物中是有用的。這些油溶液或懸浮液還可以含有長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以任意口服可接受的劑量形式口服給藥，這些形式包括，但不限于，膠囊、片劑、含水懸浮液或溶液。在為口服用的片劑時(shí)，常用的載體包括乳糖和玉米淀粉。典型地還加入如硬脂酸鎂的潤(rùn)滑劑。對(duì)于以膠囊形式口服而言，有用的稀釋劑包括乳糖和干玉米淀粉。當(dāng)口服用需要含水懸浮液時(shí)，將該活性組分與乳化和懸浮試劑混合，如果需要的話，還可以添加某些甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。
另外，本發(fā)明的藥物組合物可以直腸投藥的栓劑形式給藥?？梢酝ㄟ^將該試劑與適宜的在室溫下為固體但在直腸溫度下為液體并因此熔于直腸中釋放該藥物的無刺激賦形劑混合來制備它們。這些物質(zhì)包括可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。
還可以經(jīng)局部給藥本發(fā)明的藥物組合物，特別是當(dāng)所處理的靶子包括通過局部涂敷可以容易地達(dá)到的區(qū)域或器官，包括例如眼、皮膚或下面腸道的疾病。對(duì)于每種這些區(qū)域或器官，能夠容易地制備適宜的局部制劑。
可以直腸栓劑(參見上面的)或適宜的灌腸劑實(shí)現(xiàn)下面腸道的局部施加。還可以使用局部透皮貼劑。
為了局部施加，可以將藥物組合物配制成含懸浮或溶解于一種或多種載體中的活性組分的適宜軟膏。局部給藥本發(fā)明組合物的載體包括，但不限于，礦物油、液體凡士林、白色凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化石蠟和水?；蛘撸梢詫⒃撍幬锝M合物配制成含有懸浮或溶于一種或多種藥物上可接受的載體中的該活性組分的適宜洗液或乳膏。適宜的載體包括，但不限于，礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、吐溫60、鯨蠟基酯石蠟、鯨蠟醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
對(duì)眼用而言，可以將該藥物組合物配制成在等滲、pH經(jīng)過調(diào)整的無菌生理鹽水中的微?；瘧腋∫海蛘邇?yōu)選在有或沒有例如氯化苯甲羥胺的等滲、pH經(jīng)過調(diào)整的無菌生理鹽水中的溶液。或者，對(duì)眼用而言，可以將該藥物組合物配制在例如凡士林的軟膏中。
還可以通過鼻氣溶膠或通過使用霧化器、干粉吸入器或計(jì)量吸入器吸入給藥本發(fā)明的藥物組合物。根據(jù)藥物制劑領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)制備這些組合物并可使用苯甲醇或其它適宜的防腐劑、提高生物利用度的吸收促進(jìn)劑和/或其它傳統(tǒng)增溶或分散劑將它們制成生理鹽水的溶液。此外，本發(fā)明的組合物可以包括任意藥物上可接受的載體，例如用于干粉制劑的乳糖。
可以與載體材料混合生產(chǎn)單劑量形式的活性組分的量隨所處理的宿主和給藥的具體方式而變化。但是，應(yīng)理解為，任意特定患者的具體劑量和處理機(jī)制將取決于很多因素，包括具體所用化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時(shí)間、排泄速度、藥物組成和處理醫(yī)師的判斷和所處理的特定疾病的嚴(yán)重性?；钚越M分的量還可能取決于治療或預(yù)防試劑，如果有的話，將其與該組分共同給藥。
對(duì)預(yù)防、減輕或抑制細(xì)胞粘著有效的本發(fā)明組合物的劑量和給藥速度將取決于很多因素，如抑制劑的性質(zhì)、患者大小、處理的目標(biāo)、待處理的病狀的性質(zhì)、所用的特定藥物組合物和處理醫(yī)師的判斷。每天每kg體重約0.001-約100mg、優(yōu)選約0.01-約50mg并且更優(yōu)選約10mg的該活性組分化合物的劑量水平是有用的。
就使用靜脈內(nèi)給藥的組合物而言，適宜劑量范圍為約0.001mg-約25mg/kg、更優(yōu)選約0.01mg-約1mg/kg。
根據(jù)另一實(shí)施方式，含有本發(fā)明化合物的組合物還可以含有其它試劑，它們選自皮質(zhì)類固醇、支氣管擴(kuò)張藥、平喘藥、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑、消炎藥、抗風(fēng)濕劑、免疫抑制劑、抗代謝物、免疫調(diào)制劑、治牛皮癬藥和治療糖尿病藥。每種這些類的特定化合物可以選自下面適宜組標(biāo)題所列的任意那些“綜合性藥用化學(xué)品”英國(guó)牛津Pergamon出版社，第970-986頁(1990)，將其內(nèi)容引入本文作為參考。在該組中還包括了如下化合物茶葉堿、柳氮磺胺吡啶、對(duì)氨基水楊酸鹽(消炎藥)；環(huán)孢菌素、FK-506和雷帕霉素(免疫抑制劑)；環(huán)磷酰胺和甲氨蝶呤(抗代謝物)；類固醇(吸入、口服或局部)和干擾素(免疫調(diào)制劑)。而且，可以將本發(fā)明的化合物與其它細(xì)胞粘著抑制劑一起給藥。當(dāng)與所述VLA-4抑制劑一起給藥一種或多種其它試劑時(shí)，可以將這些活性組分配在一起，或者可以結(jié)合給藥?；旧峡梢酝瑫r(shí)或依次給藥與本發(fā)明的VLA-4抑制劑結(jié)合的一種或多種活性試劑。根據(jù)所給予的試劑、所需結(jié)果和處理的患者及其條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測(cè)定最適宜的給藥。
根據(jù)其它實(shí)施方式，本發(fā)明提供了預(yù)防、抑制或減輕患者中與細(xì)胞粘著相關(guān)的炎癥和與細(xì)胞粘著相關(guān)的免疫或自體免疫反應(yīng)的方法。與VLA-4-相關(guān)的細(xì)胞粘著在許多炎癥、免疫和自體免疫疾病中起核心作用。因此，可以將通過本發(fā)明化合物的細(xì)胞粘著抑制劑用于治療或預(yù)防炎癥、免疫和自體免疫疾病的方法中。優(yōu)選用本發(fā)明方法治療的疾病選自哮喘、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、移植排斥、多發(fā)性硬化、糖尿病和炎性腸病。
這些方法可以在單療法中使用本發(fā)明的化合物或者與消炎藥或免疫抑制劑結(jié)合使用。這些結(jié)合療法包括以單劑量形式給藥試劑或以復(fù)合劑量形式同時(shí)或不同時(shí)間給藥。
理化特性匯總化學(xué)名稱(R)-N-[[4-[[(2-甲基苯基氨基)羰基]氨基]苯基]乙?；鵠-L-脯氨?；?3-甲基)-β-丙氨酸分子式 C25H30N4O5分子量 466.53外觀 潔凈白色粉末熔點(diǎn) 153.6-154.4℃方案1由MPUPA-OH(1)制備MPUPA-OSu(2) 方案2由Boc-(L)-Pro-OSu(3)和苯甲基-(R)-3-氨基丁酸半硫酸酯(鹽)(4)合成oMePUPA-V(8) 用于制備oMePUPA-V的合成化學(xué)描述在方案1和2中。由商業(yè)源和合同廠商獲得這些原料由Ricerca，Inc.，Painesville，OH大量制備(1)；從Bachem Bioscience，Inc.，King of Prussia，PA獲得(3)并從CelgeneCorp.，Warren，NJ獲得(4)。
oMePUPA-V的制備常規(guī)化學(xué)方法(1H NMR，13C NMR.MS，IR & HPLC)在Bruker AC 300或Varian 500或Varian 600儀器上進(jìn)行1H NMR測(cè)定，或者在DMSO-d6中并參照DMSO-d6(d 2.49 ppm)或者在CDCl3中并參照殘余CHCl3(d 7.24 ppm)測(cè)定樣品。
在Varian 500或Varian 600儀器上進(jìn)行13C NMR測(cè)定，或者在DMSO-d6中并參照DMSO-d6(d 40.5 ppm)或者在CDCl3中并參照CDCl3(d 77.0 ppm)測(cè)定樣品。
在帶有HP 1500型自動(dòng)取樣器的Fisons VG Platform LC-MS-DS質(zhì)譜儀體系上進(jìn)行質(zhì)譜分析，并使用Fisons VG MassLynx質(zhì)譜儀工作站處理數(shù)據(jù)。在VG Analytical ZAB 2SE高場(chǎng)質(zhì)譜儀上使用快速原子轟擊以M型掃描(PA)進(jìn)行該HRMS工作，參照SOP# MS-002，MS-006，MS-012和MS-023。使用銫離子槍產(chǎn)生所需質(zhì)譜的離子，它是使用PDP-11-250J數(shù)據(jù)體系記錄的。
在Perkin Elmer 1600系列FTIR上進(jìn)行IR譜測(cè)定。
分析HPLC色譜法按如下進(jìn)行1.使用帶PB Nelson 3020積分儀的Perkin Elmer 785A UV檢測(cè)器(固定在214nm)和應(yīng)用生物體系783A UV檢測(cè)器(固定在254nm)的PerkinElmer 200系列HPLC自動(dòng)取樣器體系獲得使用程序1(Equilibrate@20％B，注射樣品，20％ B(1分鐘)，20％-70％ B(24分鐘)，70％-100％ B(17分鐘))的色譜圖。僅報(bào)道了面積百分比值。
2.使用帶783A波長(zhǎng)UV檢測(cè)器的應(yīng)用生物體系400溶劑釋放體系和Waters717自動(dòng)取樣器獲得使用程序8(Equilibrate @ 15％ B，注射樣品，15％ B(1分鐘)，15％-40％ B(25分鐘)，40％ B(10分鐘))的色譜圖。使用HP 3396系列II積分儀處理該數(shù)據(jù)。用以下參數(shù)調(diào)整積分儀衰減＝8，閾值＝5，注射面積＝10000，峰寬＝0.04，記錄紙速＝0.2。
使用Vydac C-18柱(5m孔徑，4.5mm×25cm，測(cè)試# 218TP54)進(jìn)行所有HPLC工作。
溶劑A(水+0.1％ TFA)溶劑B(乙腈+0.1％ TFA)流速＝1mL/分鐘梯度程序如下程序1Equilibrate @ 20％B，注射樣品，20％ B(2分鐘)，20％-70％B(25分鐘)，100％ B(5分鐘)。羰基]氨基]苯基]乙酸的理化數(shù)據(jù)(1，MPUPA-OH；由Ricerca Inc.生產(chǎn)的材料)mp 210-215℃(分解)；IR(KBr)3295(寬帶)，3034(寬帶)，1107，1637，1603，1551，1516，1457，1414.1302，1241，1189，1118cm-1；1H NMR(600MHz，DMSO-d6)d 12.28(bs，1H)，9.0(s.1H)，7.91(s，1H)，7.88(d.J＝7.8Hz，1H)，7.43(d，J＝8.4Hz，2H)，7.19(d，J＝8.4Hz，2H)，7.16(m.2H)，6.94(dd，J＝7.8，8.4Hz，1H)，3.51(s，2H)，2.25(s，3H)；13C NMR(150MHz.DMSO-d6)d 173.0(C)，152.7(C)，138.5(C)，137.5(C)，130.2(CH)，129.8(CH)，128.3(CH)，127.5(CH)，126.2(CH).122.7(CH)，121.0(CH)，118.1(CH)，40.1(CH2)，179(CH3)；MS(EI)m/z 285(M+1)+，193，152，134，132，109，108，106，93，91，57；C16H16N2O3的元素分析，理論值C，67.59；H，5.67；N，9.85；實(shí)測(cè)值C，67.60；H，5.70；N，10.01。
琥珀酰亞氨基[4-[[[(2-甲基苯基)氨基]羰基]氨基]苯基]乙酸酯的制備(2，MPUPA-OSu)在10分鐘內(nèi)邊劇烈攪拌邊向在乙腈(600rnL)中的o-甲基苯脲苯乙酸(1，MPUPA-OH；150g，0.501mol；來自Ricerca，Inc.)回流懸浮液中加入亞硫酰氯(41mL，0.558mol)。離析出大量HCl。繼續(xù)攪拌1.5小時(shí)并將反應(yīng)混合物冷卻到室溫。該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)變成粉紅色漿液，向其中加入一部分固體N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu；75.5g，0.636mol)。在30分鐘內(nèi)向該混合物中滴加三乙胺(174rnL)，同時(shí)用水浴將反應(yīng)混合物的溫度保持在60℃以下。繼續(xù)攪拌2小時(shí)，然后向該反應(yīng)混合物中加入蒸餾水(500mL)。過濾出固體并用2L蒸餾水和乙腈(2×200mL)沖洗，空氣干燥，在真空(-0.1mmHg)下在P2O5中進(jìn)一步干燥，得到淡棕色粉末粗產(chǎn)物(175g，97％產(chǎn)率)。粗產(chǎn)物(174g)從乙腈(3.5L)中重結(jié)晶并用活性炭(10g)脫色，得到129g白色MPUPA-OSu粉末(2；68％產(chǎn)率)(純度＞99％)。
mp 211.2-211.8℃；IR(KBr)3905-3203(寬帶)，1816，1783，1654，1368，1304，1244，1116，1021cm-1；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)d 9.04(s.1H).7.92(s.1H)，7.82(d，1H)，7.44(d，J＝8.5Hz，2H)，7.24(d，J＝8.5Hz，2H)，7.15(m，2H)，6.93(dd，J＝7.4，7.3Hz，1H)，4.02(s，2H)，2.80(s，4H).2.23(s，3H)；MS(EI.ES+)rn/z 382[(M+1)+]，239，108，106。
琥珀酰亞氨基Boc-(L)-脯氨酸(Boc-Pro-OSu，3；從BachemBioscience獲得的材料)的理化數(shù)據(jù)mp 132-136℃；IR(KBr)3456，2940，1731，1619，1561，1541，1497，1454，1395，1337，1259，1202，1118，1060cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)d 4.51(dd，J＝3.8，8.7Hz，1H)，3.56(m，1H)，3.44(m，1H)，2.80(s.4H)，2.32(m，1H)，2.27(rn，1H)，1.94(m.2H)，1.43(s，9H)；MS(EI)m/z 335(M+N2)+，279，213，138，114，86；HPLC 97.1％。
苯甲基-(R)-3-氨基丁酸半硫酸酯(4；從Celgene Corp.獲得的材料)的理化數(shù)據(jù)mp 249.4-249.8℃；IR(KBr)3515，3383，2989，2945，2880，1821，1788，1744，1701，1476，1454，1421，I394，1368，1260，1241，1202，1159，1077crn-1，1H NMR(300MHz，CDCl3)d 7.85(bs，2H)，7.26(s，5H)，5.06(ABq，J＝12.3Hz.2H)，4.35(m，2H)，3.73(m.1H)，2.92(dd，J＝6.4，17.1Hz，1H)，2.66(dd，J＝6.4，17.0Hz，1H)，1.35(d，J＝6.5Hz，3H)；MS(EI)m/z 195(M+3)+，194(M+2)+，106，92，91；HPLC 99.0％.
N-(叔丁氧羰基)-L-脯氨酰-3-甲基-(R)-β-丙氨酸苯甲基酯(5)的制備向CH2Cl2(200mL)中的苯甲基-R-3-氨基丁酸半硫酸酯(鹽)(4；66.7g，213mmol)的充分?jǐn)嚢钁腋∫褐屑尤隑oc-(L)-Pro-OSu(3；53.9g，222mmol)和Et3N(95mL，681mmol)。在室溫下將該反應(yīng)混合物攪拌2小時(shí)。將該反應(yīng)混合物在EtOAc(1.5L)和H2O(250mL)之間分開，有機(jī)層用10％檸檬酸(3×250mL)、H2O(250mL)、飽和碳酸氫鈉(250mL)、H2O(250mL)和生理鹽水(3×250mL)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(40℃；-80mmHg)上經(jīng)第一次濃縮，然后在高真空(室溫，16小時(shí)；0.2mmHg)下濃縮，得到粘性油中間體5(88.1g)，它含殘余EtOAc和CH2Cl2(通過NMR)且其純度＞98％(HPLC)。該材料不用進(jìn)一步提純下就可用于下面反應(yīng)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)d 7.30(m，5H)，6.44(bs，1H)，5.10(dd，J＝12.3，14.1Hz，2H)，4.32(m，1H)，4.13(m，1H)，3.34(bs，2H)，2.48(d，J＝5.1Hz，2H)，2.1(m，2H)，1.75(bs，2H)，1.40(s.9H)，1.17(d，J＝6.0Hz，3H)；MS(EI)m/z 413[M+Na]+，313，291，191，194，165，91。
L-脯氨?；?3-甲基-(R)-β-丙氨酸苯甲基酯鹽酸鹽(6)的制備向來自上面反應(yīng)的中間體5中慢慢加入在二噁烷(240mL)中的4N HCl溶液。保證快速放出氣體(小心放熱)。將該反應(yīng)混合物攪拌2小時(shí)，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(45℃；-80mmHg)上經(jīng)第一次濃縮，然后在高真空(室溫，14小時(shí)；-0.2mmHg)下濃縮一夜，得到極粘材料，將其從CH2Cl2/Et2O(600mL/700mL)中結(jié)晶，得到64.0g(92％兩步的總產(chǎn)率)白色固體HCl鹽6(HPLC純度99.6％)。
mp 119.8-120.5℃；IR(KBr)3217，3072，2904，2756，1736，1681，1560，1446，1387，1352，1295，1244，1178，1096crn-1；1H NMR(500MHz1CDCl3)d 10.21(bs.1H)，8.71(d，J＝8.0Hz，1H)，7.77(bs，1H)，7.24(m.5H).5.00(s.2H)，4.52(bs.1H)，4.22(表觀t，J＝6.5Hz.1H)，3.33(bs，2H)，2.67(dd，J＝5.5，15.5Hz，1H)，2.44(m，2H)，1.89(m，3H)，1.15(d，J＝6.5Hz，3H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)d 171.03(C＝O)，167.67(C＝O).135.58(C)，128.43(CH)，128.13(CH)，128.06(CH)，66.34(CH2)，59.71(CH)，46.55(CR2)，43.34(CH)，40.42(CH2)，30.50(CH2)，24.23(CH2)，19.92(CH3)；MS(EI)m/z 291[M-Cl]+，199，194，160，139，92，91；C16H23N2O3Cl的元素分析、計(jì)算C，58.80；H，7.094；N，8.57；實(shí)測(cè)C，58.95；H，6.99；N，8.46.
N-[[4-[[(2-甲基苯氨基)羰基]氨基]苯基]乙酰基]-L-脯氨酰基-3-甲基)-(R)-β-丙氨酸苯甲基酯(7)的制備向DMF(125mL)中的HCl鹽6(61.77g，189mmol)溶液中加入MPUFA-OSu(2；69.39g，181.9mmol)，然后加入Et3N(90mL；pH-10)。將該反應(yīng)混合物攪拌3.5小時(shí)，然后用EtOAc(1L)稀釋并用H2O(3×250mL)提取。這時(shí)產(chǎn)物開始沉淀。將10％檸檬酸溶液(250mL)添加到有機(jī)層中(小心放熱！)，搖動(dòng)，形成很多沉淀。在多孔玻璃漏斗(2L，M)上過濾該固體。將該固體用檸檬酸(10％，2×250rnL)、H2O(250mL)、飽和碳酸氫鈉(2×250mL)，H2O(250mL)和生理鹽水(3×250mL)洗滌，在該漏斗上通過抽吸(-80mmHg)將其干燥1夜(-14小時(shí))，得到黃白色固體，將其從THF/Et2O(1L/4L)中重結(jié)晶，得到83.3g白色固體化合物7(HPLC純度99.6％)。
將濾液進(jìn)一步用檸檬酸(10％，3×250ml)、H2O(250mL)、飽和碳酸氫鈉(2×250mL)、H2O(250mL)和生理鹽水(3×250rnL)洗滌。伴隨每次含水洗滌，其他化合物沉淀出來；但是繼續(xù)洗滌，小心別使沉淀物損失。過濾，得到4.02g白色固體產(chǎn)物。最后將該濾液用Et2O(1L)稀釋，過濾，固體用Et2O(3×100mL)洗滌，得到1.67g主白色固體的另一收獲物。該反應(yīng)的總產(chǎn)率為88％。
mp 153-153.5℃；IR(KBr)3342，3307，3119，2966，1737，1702，1643，1590，1543，1514，1455，1414，1308，1238，1179crn-1；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)a3∶2旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物，(主構(gòu)象峰)d 9.00(bs，1H)，7.91(bs，1H)，7.84(d，J＝8.3Hz，1H)，7.68(d，J＝8.3Hz，1H)，7.40-7.28(m，7H)，7.13(3H)，7.06(d，J＝8.8Hz，1H)，6.92(t，J＝7.3Hz.1H)，5.06(ABq，J＝12.2Hz，Dn＝8.9Hz，2H)，4.18(dd，J＝3.4，8.8Hz.1H)，4.10(四重峰，J＝6.8Hz，1H).3.57(m，2H)，3.50-3.22(m，3H).2.62-2.37(m，2H)，2.23(s，3H)，2.18-1.68(rn，3H)，1.05(d，J＝6.8Hz，3H)和(次構(gòu)象峰)d 9.00(bs.1H)，7.91(bs，IH)，7.84(d，J＝8.3Hz，1H)，8.15(d，J＝8.3Hz，1H)，7.40-7.28(m，7H)，7.13(3H)，7.06(d，J＝8.8Hz，1H)，6.92(t，J＝7.3Hz，1H)，5.01(ABq，J＝12.2Hz，Dn＝19.0Hz.2H)，4.32(dd.J＝2.4，8.8Hz，1H)，4.22(四重峰，J＝6.8Hz，1H).3.57 Cm，2H)，3.50-3.22(m，3H)，2.62-2.37(m，2H)，2.23(s，3H)，2.18-1.68(m，3H)，1.10(d，J＝6.8Hz，3H)；13C NMR(125MHz，DMSO-d6)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物，(主構(gòu)象峰)d170.80(C＝O)，170.52(C＝O)，169.18(C＝O)，152.61(C＝O)，138.10(C)，137.38(C)，136.04(C)，130.05(CR)，129.63(CH)，129.47(CH)，128.5S(C)，128.28(CH)，127.89(CH)，127.85(C)，126.02(CH)，122.50(CH)，117.90(CH)，117.81(CH)，65.44(CH2)，59.61(CH)，47.04(CR2)，41.75(CH)，40.41(CH2)，40.00(CH2)，29.29(CH2)，24.13(CH2)，19.88(CH3)，17.78(CH3)和(次構(gòu)象峰)d 170.94(C＝O)，170.52(C＝O)，169.31(C＝O)，152.61(C＝O)，138.10(C)，137.38(C)，136.04(C)，130.05(CH)，129.63(CH)，129.47(CH)，128.65(C)，128.28(CH)，127.89(CH)，127.85(C)，126.02(CH)，120.940(CH)，117.90(CH)，117.81(CH)，65.44(CH2)，59.91(CH)，46.51(CH2)，42.01(CH)，40.13(CH2)，39.84(CH2)，31.75(CH2).22.11(CH2)，20.05(CH3)，17.78(CH3)；MS(EI)m/z 579[M+Na]+，557，454，426，357，336，293，267，201；C32H36N4O5的元素分析、計(jì)算C，69.05；H，6.52；N，10.07；實(shí)測(cè)C，68.87；H.6.52；N，9.93.
N-[[4-[[(2-甲基苯基氨基)羰基]氨基]苯基]乙?；鵠-L-脯氨?；?3-甲基)-(R)-β-丙氨酸(8oMePUPA-V)的制備在有Pd/C(10％；2.44g)的情況下在-55psi下將THF/H2O(9∶1；800rnL)中的OMePUPA-V-OBn(7；80.18g)溶液氫化。25小時(shí)后，將反應(yīng)混合物通過多孔玻璃漏斗上的Solka Floc(144g；Fiber Sales & DevelopmentCorp.)過濾。然后將濾液通過另一塊Solka Floc(115g)再過濾，濃縮至約250mL，慢慢倒入劇烈攪拌的甲苯(3L)中。將懸浮液攪拌0.5小時(shí)，過濾(2L多孔玻璃漏斗)，將所得白色粉末首先在漏斗上通過抽吸(約80mmHg；0.5小時(shí))然后在真空爐(14小時(shí)；45℃，用N2流將壓力調(diào)整到25inHg真空度)干燥。將該白色節(jié)塊粉碎(研缽和研棒)成細(xì)粉，得到58.3g(產(chǎn)率87％)的oMePUPA-V白色固體。將該產(chǎn)物從丙酮/H2O(320mL/75mL)中重結(jié)晶。將晶體收集并首先在多孔玻璃漏斗上通過抽吸(1小時(shí)，80mmHg)然后在真空爐(25小時(shí)；45℃；通過N2流將壓力調(diào)整到25inHg真空度)中干燥，得到47.0g(84％，通過重結(jié)晶回收)oMePUPA-V白色固體(HPLC純度99.1％)mp 153.6-154.4℃；IR(KBr)3354，3307，1719，1643，1590，1543，1514，1449，1414，1308，1237cm-1；1H NMR(600MHz，DMSO-d6)3∶2旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物(主構(gòu)象峰)δ12.21(bs，1H)，8.99(s，1H)，7.91(s，1H)，7.87(d，J＝8.2Hz，1H)，7.68(d，J＝7.9Hz，1H)，7.40(d，J＝8.6Hz，2H)，7.17(d，J＝5.9Hz，2H)，7.15(d，J＝7.7Hz，1H)，7.12(dd，J＝7.9，8.2Hz.1H)，6.94(dd.J＝7.3，7.3Hz，1H)，4.22(dd，J＝3.3，8.8Hz，1H)，4.06(m，J＝6.6Hz，1H).3.47(dd，1H)，3.44(d，J＝15.0Hz，1H)，3.37(dd，1H)，3.29(d，J＝15.4Hz，1H)，2.46(dd，1H)，2.27(m.1H)，2.25(s，3H)，1.99(rn，1H)，1.80m(rn，1H)，1.78(m，1H)，1.76(m，1H)，1.07(d，J＝6.6Hz，3H)和(次構(gòu)象峰)δ12.21(bs，1H).8.99(s，1H).7.90(s，1H)，7.87(d，J＝8.2Hz，1H)，8.12(d，J＝8.2Hz，1H)，7.40(d，J＝8.6Hz.2H)，7.16(d，J＝5.9Hz.2H)，7.15(d，J＝7.6Hz，1H)，7.12(dd，J＝7.9，8.2Hz，1H)，6.94(dd，J＝7.3，7.3Hz，1H)，4.34(dd，J＝1.8，8.4Hz，1H)，4.18(m，J＝6.6Hz，1H)，3.60(m，2H)，3.59(m，1H)，3.48(m.1H).2.47(dd，J＝6.6，15.4Hz，1H)，2.40(dd，J＝6.6，15.4Hz.1H)，2.25(s.3H)，2.15(m.1H)，1.83(rn，1H)，1.91Cm.1H)，1.77(m，1H)，1.12(d，J＝6.6Hz，3H)；13C NMR(150MHz.DMSO-d6)(主構(gòu)象峰)δ172.4(C＝O)，170.9(C＝O)，169.3(C＝O)，152.6(C＝O)，138.2(C)，137.5(C)，130.2(CH)，129.8(CH)，129.6(CH)，128.7(C)，127.4(C)，126.1(CH)，122.6(CH)，120.9(CH)，118.0(CH)，117.9(CH)，59.7(CH)，46.6(CH2)，41.7(CH2)，40.6(CH2)，40.2(CH2)，29.4(CH2)，22.2(CR2)，19.9(CH3)，17.9(CH3)和(次構(gòu)象峰)δ172.5(C＝O)，171.0(C＝O)，160.5(C＝O)，152.7(C＝O)，138.19(C)，137.5(C)，130.2(CH)，129.8(CH)，129.6(CH)，128.8(C)，127.4(C)，126.1(CH)，122.6(CH)，120.9(CH)，118.0(CH)，117.9(CH)，59.9(CH)，47.1(CH2)，42.0(CH2)，39.8(CH2)，40.3(CH2)，31.8(CH2)，24.2(CH2)，20.2(CH3)，17.9(CH3)；MS(EI)rn/z 468[M+H]+，336，267，137；C25H30N4O5的元素分析、計(jì)算C，64.36；H，6.48；N，12.61；實(shí)測(cè)C，64.07；H，6.40；N，11.85。
實(shí)施例2.在過敏性肺炎的綿羊模型中的活性使用重量在27-50kg之間的過敏性綿羊。所有綿羊已提前顯示出對(duì)吸入的霧化豬蛔蟲過敏原產(chǎn)生早期和晚期的支氣管反應(yīng)。這些綿羊是清醒的并將它們以伏臥位綁在經(jīng)過改裝的運(yùn)貨馬車中使它們的頭不能移動(dòng)。通過2％利多卡因?qū)⑵浔潜砻媛樽?，首先將球形?dǎo)管通過鼻孔進(jìn)入下食道。使用柔性光學(xué)纖維支氣管鏡作為導(dǎo)向裝置通過另一鼻孔將成套氣管內(nèi)管插入這些動(dòng)物內(nèi)。本研究中所用的所有方案都是得到Mount SinaiMedical Center Animal Research Committee許可的，它對(duì)保證試驗(yàn)動(dòng)物的人道護(hù)理和使用負(fù)責(zé)。使用食管的球狀導(dǎo)管(填充有1mL空氣)評(píng)價(jià)胸膜壓力，該導(dǎo)管位于離胃食管接合處5-10cm。在該位置，末端呼氣胸膜壓范圍為-2至-5cmH2O。一旦放置該氣球，就保證了它在實(shí)驗(yàn)過程中保持在相同位置。用通過并位于氣管內(nèi)管頂端遠(yuǎn)端的側(cè)孔導(dǎo)管(內(nèi)徑，2.5mm)測(cè)定氣管內(nèi)的側(cè)壓。
將氣管和胸膜壓力導(dǎo)管連接到不同壓力傳感器(MP45，Validyne，Northridge，CA)，用于測(cè)定定義為氣管和胸膜之間壓差的跨肺壓。通過將氣管內(nèi)管的鄰近端與呼吸速度描記器(Fleisch，Dyna Sciences，Inc.，Blue Bell，PA)相連測(cè)定氣流。在與80-386 DOC個(gè)人計(jì)算機(jī)相連的多波道生理記錄器上記錄跨肺壓和流動(dòng)信號(hào)，以聯(lián)機(jī)計(jì)算跨肺壓的變化除以中潮體積流動(dòng)的變化(通過數(shù)位積分獲得)的平均肺流阻(RL)。將至少5次沒有人為吞咽現(xiàn)象的呼吸的平均值用于獲得RL(以cmH2O/L/sec計(jì))。測(cè)定RL之后即刻在恒定體積殼體體積描記器中測(cè)定胸的氣體體積(Vtg)，從而獲得特異性肺阻力(specific lung resistance)(SRL＝RL×Vtg)(以L×cmH2O/L/sec計(jì))。
使用一次性藥用空氣噴射霧化器(Raindrop，Puritan Bennett，Lenexa，KS)產(chǎn)生所有液體劑量氣溶膠，該霧化器賦予氣溶膠3.2μm的質(zhì)量平均空氣動(dòng)力直徑(由Andersen階式碰撞取樣器測(cè)定)。該霧化器與放射劑量計(jì)體系相連，該體系由電磁閥和壓縮氣源(20psi)組成。將霧化器出口導(dǎo)入塑料T接頭，該接頭一端與活塞呼吸罩(Harvard Apparatus，S.Natick，MA)的吸氣端口相連。在開始呼吸罩吸氣循環(huán)時(shí)將該電磁閥打開一半。以500mL的潮流氣量和20次/分鐘的呼吸速度輸送氣溶膠。為了評(píng)價(jià)支氣管反應(yīng)性，通過吸入緩沖劑后即刻和每次連續(xù)給藥10次呼吸遞增濃度的卡巴膽堿(以0.25、0.5、1.0、2.0和4.0％w/v于緩沖生理鹽水中)之后測(cè)定SRL來完成卡巴膽堿的累積濃度反應(yīng)曲線。當(dāng)SRL增加超過給予生理鹽水后的值400％或在給予最高卡巴膽堿濃度之后停止該激發(fā)試驗(yàn)。通過測(cè)定SRL增加到由劑量反應(yīng)曲線內(nèi)推的給予生理鹽水后的值的400％(PC400)的累積卡巴膽堿濃度(以呼吸單位計(jì))評(píng)價(jià)支氣管反應(yīng)性。1呼吸單位(BU)定義為一次呼吸1％w/v卡巴膽堿霧化溶液。
將oMePUPA-V劑量溶于1∶2乙醇∶生理鹽水、1∶5乙醇∶200mM磷酸鈉或Tris緩沖劑中。當(dāng)使用Tris時(shí)，使用生理鹽水進(jìn)行任意所需稀釋。以總體積3-5mL制備劑量。
在所有研究中，在開始研究之前3-4天測(cè)定基線呼吸道反應(yīng)性(即PC400)。在單劑量預(yù)處理研究中，測(cè)定SRL并用該化合物或載體處理動(dòng)物。在處理后2小時(shí)(就在攻擊之前)再測(cè)定SRL，然后用過敏原攻擊動(dòng)物。在多劑量研究中，在過敏原攻擊之前頭4天，一天一次對(duì)動(dòng)物處理4天并在最后劑量之后24小時(shí)用過敏原攻擊。在化合物最后劑量或載體處理之前或之后測(cè)定SRL。在所有研究中，在過敏原攻擊之后即刻、攻擊后1-6小時(shí)每小時(shí)、過敏原攻擊后6.5-8小時(shí)中每半小時(shí)再測(cè)定SRL。在過敏原攻擊后24小時(shí)進(jìn)行呼吸道反應(yīng)性的后攻擊測(cè)定(PC400)。
值以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差來表示。以與攻擊前的基線SRL的差計(jì)算每只綿羊的SRL的變化。攻擊后SRL的變化以早期呼吸道反應(yīng)(EAR)來表征，該反應(yīng)約進(jìn)行0-4小時(shí)。接著進(jìn)行后期呼吸道反應(yīng)(LAR)，該反應(yīng)在過敏原攻擊之后約4-8小時(shí)進(jìn)行。使用梯形規(guī)則計(jì)算每個(gè)動(dòng)物的EAR和LAR曲線的面積。與安慰劑對(duì)照相比該EAR或LAR曲線面積的大大降低顯示出對(duì)過敏原誘導(dǎo)的SRL變化的治療效果。在過敏原攻擊之前和攻擊之后24小時(shí)時(shí)評(píng)價(jià)的卡巴膽堿的呼吸道反應(yīng)性(PC400)是以每只綿羊的PC400比(攻擊前/攻擊后的PC400值)表示的。與安慰劑對(duì)照相比，該P(yáng)C400比大大增加，說明有治療效果。使用遵循與對(duì)照的多重對(duì)比的Dunnett試驗(yàn)的單向方差分析(單尾)進(jìn)行與安慰劑對(duì)照的對(duì)比。產(chǎn)生p＜0.05的比較呈現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有效的。
圖1顯示了給藥2小時(shí)后在對(duì)豬蛔蟲過敏的綿羊中氣溶膠化oMePUPA-V的抑制劑量反應(yīng)。左方格顯示了特異性肺阻力SRL(以cm H2O/sec計(jì))的變化。右方格顯示了攻擊后24小時(shí)測(cè)定對(duì)吸入的卡巴膽堿的呼吸道反應(yīng)性(PC400比，攻擊前/攻擊后)。oMePUPA-V以劑量0.01-0.03mg不能抑制早期或后期呼吸道反應(yīng)或改變過敏原攻擊后24小時(shí)對(duì)卡巴膽堿的過反應(yīng)性。劑量0.1、1和3抑制早期呼吸道反應(yīng)并最大地抑制后期呼吸道反應(yīng)。這些劑量還抑制過敏原攻擊后24小時(shí)對(duì)卡巴膽堿的過反應(yīng)性。將這些數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析示于表2中。
表2
綿羊，天性對(duì)豬蛔蟲過敏，在以指定劑量給予oMePUPA-V氣溶膠或等量載體之后2小時(shí)或者重復(fù)每天給藥閾下劑量oMePUPA-V或等量BPS 4天后24小時(shí)用豬蛔蟲過敏原氣溶膠攻擊。肺力學(xué)，基于研究前基線值的特異性呼吸道阻力的變化報(bào)道，在過敏原攻擊后測(cè)定了8個(gè)小時(shí)。早期呼吸道反應(yīng)(0-4小時(shí)，EAR)和后期呼吸道反應(yīng)(4-8小時(shí)，LAR)以Δ特異性肺阻力曲線x時(shí)間的平均面積±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。在研究開始之前和過敏原攻擊后24小時(shí)測(cè)定對(duì)吸入的卡巴膽堿的呼吸道阻力。呼吸道反應(yīng)性以攻擊前和攻擊后的PC400值(阻力增加到400％所需的卡巴膽堿的量)之比報(bào)道。
根據(jù)與對(duì)照組的多重比較的Dunnett試驗(yàn)，與PBS對(duì)照相比，單向方差分析*＝p＜0.05。這顯示經(jīng)統(tǒng)計(jì)EAR或LAR大大降低，或者與PBS對(duì)照組相比PC400比大大增加。
單劑量刺激在用豬蛔蟲過敏原攻擊之后，通過與基線阻力相比的呼吸道阻力沒有變化反映出，上面研究中所用的oMePUPA-V劑量沒有一種具有刺激效果。這顯示在圖2中。
重復(fù)劑量研究圖3描述了當(dāng)以單劑量用于急性預(yù)處理時(shí)顯示無效的0.03mg劑量的oMePUPA-V，如果一天一次給藥4天，當(dāng)在最后劑量后24小時(shí)給以抗原攻擊時(shí)，卻有保護(hù)性。上下左手方格顯示出，使用兩種不同配方可以看出這種效果。由圖3的上下右手方格可以看出，在另外24小時(shí)后對(duì)卡巴膽堿的過敏反應(yīng)性還被最大抑制。oMePUPA-V抗EAR和LAR及抗對(duì)卡巴膽堿的過反應(yīng)性的這種保護(hù)性效果很大，這種定量分析顯示在表3中。
該研究的結(jié)果說明，通過氣溶膠用小分子抑制劑VLA-4、oMePUPA-V的單個(gè)預(yù)處理能夠預(yù)防過敏綿羊模型中過敏原誘導(dǎo)的早期和后期呼吸道反應(yīng)和后過敏原誘導(dǎo)的AHR。以單個(gè)預(yù)處理，用任意劑量oMePUPA-V看不出呼吸道的刺激效果。結(jié)果還顯示出，用多次處理可以降低oMePUPA-V的有效劑量。這些數(shù)據(jù)共同地提供了VLA-4粘著途徑在過敏原刺激之后從過敏綿羊的呼吸道開始的長(zhǎng)時(shí)間炎癥事件的病理生理指示劑(LAR和AHR)中起關(guān)鍵作用的有力證據(jù)。
表3
綿羊，天性對(duì)豬蛔蟲過敏，在重復(fù)每天給藥閾下劑量oMePUPA-V或等量BPS 4天后24小時(shí)用豬蛔蟲過敏原氣溶膠攻擊。肺力學(xué)，基于研究前基線值的特異性呼吸道阻力的變化報(bào)道，在過敏原攻擊后測(cè)定了8個(gè)小時(shí)。早期呼吸道反應(yīng)(0-4小時(shí)，EAR)和后期呼吸道反應(yīng)(4-8小時(shí)，LAR)以特異性肺阻力曲線x時(shí)間的平均面積±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。在研究開始之前和過敏原攻擊后24小時(shí)測(cè)定對(duì)吸入的卡巴膽堿的呼吸道阻力。呼吸道反應(yīng)性以攻擊前和攻擊后的PC400值(阻力增加到400％所需的卡巴膽堿的量)之比報(bào)道。
根據(jù)與對(duì)照組的多重比較的Dunnett試驗(yàn)，與PBS對(duì)照相比，單向方差分析*＝p＜0.05。這顯示經(jīng)統(tǒng)計(jì)EAR或LAR大大降低，或者與PBS對(duì)照組相比PC400比大大增加。
實(shí)施例3在延遲型高過敏性模型中的活性綿羊紅細(xì)胞研究將來自Jackson實(shí)驗(yàn)室的8-19周齡的特定無病原體的雌性Balb/c小鼠用于所有試驗(yàn)。隨意給這些動(dòng)物喂食和水。每周從Charles River Pharm.Services(Southbridge，MA)獲得來自相同綿羊的在Alsever溶液中的綿羊紅細(xì)胞(sRBC)。在4℃下將該sRBC在1000g下離心造粒，除去任意可見血沉棕黃層。然后將這些細(xì)胞在生理鹽水中沖洗。將這些細(xì)胞粒再懸浮于生理鹽水中并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將這些細(xì)胞稀釋于磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)至2×108sRBC/mL。在第0天，通過皮下注射在100μLPBS中的2×107sRBC使小鼠致敏。在第5天，如上制備sRBC，但稀釋在PBS中至最終濃度4×109sRBC/mL。在該制備中，將25μL皮下注射到右背足板中。
為了腸內(nèi)給藥化合物，將oMePUPA-V(Lot#2770-029)配制到在0.02MTRIS中的60％ PEG 400的載體中至原料濃度為5mg/mL。在PEG/TRIS載體中制備適宜稀釋液并通過腸道給藥100μL。將抗-VLA-4抗體(PS/2)以濃度4.3mg/kg稀釋到生理鹽水中并通過腹膜內(nèi)給藥100μL。在用sRBC攻擊之后立即給予所有處理。
在足背攻擊20小時(shí)后使用來自Mitutoyo(Model # 304-196，Dyer，Lancaster，PA)的張力測(cè)徑規(guī)測(cè)定未被攻擊的對(duì)照(左)和經(jīng)過攻擊的(右)背足板的膨脹。數(shù)據(jù)以足背厚度的變化表示，它是通過左后爪厚度減去右后爪厚度得到的。使用雙尾Student’st-實(shí)驗(yàn)比較足背厚度的變化。
抗-VLA-4抗體PS/2以4.3mg/kg劑量腹膜內(nèi)抑制膨脹約30％，而以20mg/kg劑量的腸內(nèi)給藥的oMePUPA-V在該模型中沒有影響(未顯示數(shù)據(jù))。通過腸內(nèi)途徑以20mg/kg劑量給藥oMePUPA-V到小鼠中sRBC誘導(dǎo)的DTH模型中的功效經(jīng)研究，沒有觀察到功效。
實(shí)施例4延遲型過敏性模型中的活性接觸過敏性模型將四個(gè)一籠放入Biogen無病毒動(dòng)物家族中的微隔離器籠中并隨意收到鼠食和自來水的20g雌性無病毒Balb/c小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)用于所有研究中。將這些小鼠用氯胺酮∶賽拉嗪(90∶10mg/kg，腹膜內(nèi))麻醉。通過緊緊地刮屑皮毛暴露出一塊3cm2的腹部皮膚、劍狀恥骨，將該皮膚用70％乙醇沖洗干凈。將體積為25μL在4∶1v/v丙酮∶橄欖油載體中的0.5％DNFB均勻地涂覆到該裸露的腹部皮膚上。用涂敷移液管尖輕輕抓破該皮膚以使其輕微發(fā)炎。將小鼠仰臥躺在其籠中，讓其從麻醉中蘇醒。開始致敏后24小時(shí)，再用25μL在載體中的0.5％DNFB在相同腹部皮膚位置致敏，然后再用移液管尖輕輕抓破。在束縛未被麻醉的小鼠的同時(shí)進(jìn)行第二次致敏。在第5天(開始致敏后約120小時(shí))，使用低于刺激劑量的致敏物(在4∶1v/v丙酮∶橄欖油載體中的0.2％ DNFB)攻擊該免疫反應(yīng)。用90∶10mg/kg氯胺酮∶賽拉嗪腹膜內(nèi)注射將小鼠麻醉，將10μL 0.2％ DNFB涂覆到左耳背面。右耳接受4∶1v/v丙酮∶橄欖油載體的相似涂覆。在接下來的24小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行二相性耳膨脹反應(yīng)，如圖4所示。攻擊后24小時(shí)，再用氯胺酮∶賽拉嗪將小鼠麻醉，用工程測(cè)微計(jì)測(cè)定兩耳的厚度并精確到10-4英寸。
在第5天攻擊該免疫反應(yīng)之后4小時(shí)通過管飼法經(jīng)口服給予化合物(100μL)或適宜載體(在等滲磷酸鹽緩沖鹽水[PBS]中的二甲亞砜[DMSO]，100μL)。將每組8只小鼠的組用于每種試驗(yàn)處理。通過添加pH為8.8的0.5％磷酸鈉緩沖液和3％ DMSO將oMePUPA-V(Batch Number 2044-076)溶于蒸餾水中。以攻擊后24小時(shí)其載體攻擊的耳厚度和DNFB-攻擊的耳厚度之差計(jì)算每只小鼠的耳膨脹反應(yīng)。典型地DNFB誘導(dǎo)的耳膨脹為65-75×10-4英寸。通過將處理組與其載體對(duì)照組對(duì)比測(cè)定耳朵膨脹反應(yīng)的抑制。使用遵循用于與對(duì)照組(Systat，SPSS Inc.)的多次對(duì)比的Dunnett試驗(yàn)的單向方差分析使用p＜0.05評(píng)價(jià)處理組之間差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。值以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示。
圖4比較了在接受載體(DMSO，PBS)、正對(duì)照化合物(給以0.03μg/kg)或0.03或0.3mg/kg oMePUPA-V(DNFB攻擊后4小時(shí)腸內(nèi)給藥(上方格))的小鼠中DNFB攻擊后24小時(shí)測(cè)定的耳朵膨脹反應(yīng)。在下方格中顯示了處理誘導(dǎo)的抑制百分比。兩種劑量的oMePUPA-V都顯著地將耳朵膨脹反應(yīng)抑制到通過正對(duì)照化合物顯示的相似程度。
在DNFB攻擊后4小時(shí)給的腸內(nèi)0.03或0.3mg/kg單劑量的oMePUPA-V顯著地抑制了小鼠接觸過敏性模型中的耳朵膨脹反應(yīng)。
實(shí)施例5生物化學(xué)5.1在VCAM-Ig直接結(jié)合測(cè)定(DBA)中使用VCAM-Ig堿性磷酸酶共軛物測(cè)定oMePUPA-V的受體親和性。
如所公開的構(gòu)建并提純VCAM-Ig(Jakubowski，A.等人，《細(xì)胞粘著和傳染》3131-142，1995)。為了裂解產(chǎn)色底物，如所公開的共軛到小牛腸內(nèi)堿性磷酸酶上(Lobb，R.R.等人，《細(xì)胞粘著和傳染》3385-397，1995)。在人T細(xì)胞系Jurkat(α4β1)上評(píng)價(jià)VLA-4的結(jié)合。在有1mM Mn+2的情況下在這些細(xì)胞的表面上VCAM-Ig-AP和oMePUPA-V競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到α4β1上。
在VCAM-Ig直接結(jié)合測(cè)定中，在有1mM MnCl2的情況下oMePUPA-V與VCAM-Ig-AP濃度依賴性地以8±1nM(n＝9)的IC50競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到Jurkat細(xì)胞上。
5.2在純化VLA-4蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)測(cè)定中使用VCAM-Ig堿性磷酸酶共軛物測(cè)定oMePUPA-V的受體親和性。
從α4-轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞的高表達(dá)亞克隆的洗滌劑提取物中通過抗體親和性色譜法提純VLA-4并將其固定在微量滴定孔上建立蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。在沒有或有oMePUPA-V(Lot #2)和1mM MnCl2的情況下將VCAM-Ig-AP結(jié)合到提純的VLA-4-涂布板上。在405nm下讀板并使用SoftMax v.2.32軟件分析該數(shù)據(jù)。
VCAM-Ig共軛物與提純VLA-4的結(jié)合完全被特異性中和抗-α4單克隆抗體(HP1/2)阻斷。在VLA-4蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)測(cè)定中由oMePUPA-V獲得的兩個(gè)IC50值列于表4中，它是由VCAM-Ig-AP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定和CS1細(xì)胞粘著測(cè)定在Jurkat細(xì)胞上獲得的IC50′s。
5.3在CS1細(xì)胞粘著測(cè)定中評(píng)價(jià)oMePUPA-V的受體親和性a.Jurkat細(xì)胞粘著在CS1/BSA共軛物上合成肽NH2-半胱氨酸-酪氨酸-CS-1并以CS1/BSA比為10∶1將其偶合到BSA-SMCC(SMCC是與BSA和合成肽的單獨(dú)半胱氨酸上的游離氨基反應(yīng)的異型雙功能交聯(lián)劑)上。用稀釋至最終濃度為1μg/ml的100μL共軛物將孔涂布一夜。第二天用PBS中的BSA將這些孔阻塞1小時(shí)，然后將其沖洗3次。
將人T細(xì)胞系Jurkat用2μM BCECF-AM標(biāo)記，該BCECF-AM為一種熒光染料(2′，7′，二-(2-羧乙基)-5和-6)羧基熒光黃乙酰氧基甲酯(Molecular Probes Inc.，Eugene，Oregon；catalog #B-1150)，其經(jīng)內(nèi)在化和去酯化將該染料捕獲在肝細(xì)胞中。將含1mM Mn+2的緩沖劑中的Jurkat細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)加入含有三倍系列抑制劑稀釋液的涂布板中。一式兩份測(cè)定每一濃度。室溫下30分鐘后，將這些板顛倒并沖洗3次或者直到?jīng)]有細(xì)胞粘著在僅用BSA涂布的對(duì)照孔中。在Cytofluor熒光板讀數(shù)儀中使用485nm的興奮波長(zhǎng)和530nm的發(fā)射波長(zhǎng)將CS-1粘著細(xì)胞定量。
在沒有化合物的情況下粘著在CS1/BSA的細(xì)胞用作0％抑制對(duì)照，同時(shí)將僅粘著在BSA上的細(xì)胞用作100％抑制對(duì)照。使用Deltagraph軟件第5版計(jì)算IC50′s。
在有Mn+2的情況下標(biāo)記Jurkat細(xì)胞的粘著被EDTA和中和抗-α4β1mAb，HP1/2，完全阻斷，這說明結(jié)合是特異性的。表4給出了oMePUPA-V在CS1/BSA粘著測(cè)定中的活性以及結(jié)合測(cè)定結(jié)果。
oMePUPA-V是含Mn+2的緩沖劑中VLA-4的有效拮抗物。當(dāng)在有Mn+2的情況下將其在分離VLA-4上測(cè)定時(shí)比在結(jié)合測(cè)定中在Jurkat細(xì)胞上測(cè)定的有效性高出80倍。通過其劑量依賴性地并完全阻斷Jurkat粘著在CS1上的能力證實(shí)，oMePUPA-V為功能性拮抗物。在粘著測(cè)定中的絕對(duì)值大于在結(jié)合測(cè)定中觀察到的。這可能是由于粘著的多價(jià)性能。在所有測(cè)定形式中，EDTA和HP1/2的結(jié)合抑制證明特異性地結(jié)合到VLA-4上。
表4在有1mM MnCl2的情況下在VCAM-Ig競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定、CS1細(xì)胞粘著測(cè)定和提純VLA-4蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)測(cè)定中測(cè)定的oMePUPA-V的受體親和性
6.4oMePUPA-V抑制的特異性a.使用JY細(xì)胞在VCAM-Ig直接結(jié)合和CS1粘著測(cè)定中評(píng)價(jià)oMePUPA-V的特異性在有Mn+2的情況下在JY細(xì)胞上測(cè)定與α4β1的結(jié)合。在結(jié)合測(cè)定中，在JY細(xì)胞上VCAM-Ig和oMePUPA-V競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到α4β1上(參見測(cè)定方案的段4.1.1)。在該細(xì)胞粘著測(cè)定中，試驗(yàn)oMePUPA-V阻斷JY(α4β1)細(xì)胞結(jié)合到CS1/BSA共軛物上的能力。
oMePUPA-V不阻斷α4β1結(jié)合到VCAM-Ig或CS1/BSA上?？?β7Mab、Fib27(Pharmingen)完全抑制這些相互作用，這說明結(jié)合上α4β1特異性的。因此oMePUPA-V為VLA-4特異性抑制劑。結(jié)果列于表5中。
b.使用K562細(xì)胞粘著到涂布有Fn-120的孔上評(píng)價(jià)oMePUPA-V的特異性將未處理的96孔聚苯乙烯平底板用5μg/ml Fn-120在4℃下涂布一夜。將這些板用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗2次，并在室溫下用1％牛血清白蛋白(BSA)堵塞1小時(shí)。將這些板用含1mM MnCl2的TBS緩沖液(測(cè)定緩沖液)沖洗2次。K562細(xì)胞用2μM熒光染料BCECF-AM標(biāo)記(參見段4.1.3)，并將其在室溫下經(jīng)過30分鐘結(jié)合到板上。將這些板顛倒并沖洗3次，在Cytofluor熒光板讀數(shù)儀中使用485nm的興奮波長(zhǎng)和530nm的發(fā)射波長(zhǎng)將粘著細(xì)胞定量。
K562與Fn-120的粘著完全被中和抗-α5抗體IIA1(Pheamingen)阻斷，這說明通過VLA-5的特異性結(jié)合。oMePUPA-V的劑量高至100μM也沒有抑制K562細(xì)胞結(jié)合到Fn120K上。參見下表5。
c.進(jìn)行聚集測(cè)定評(píng)價(jià)oMePUPA-A的特異性方法使用富含血小板的血漿通過標(biāo)準(zhǔn)血小板聚集評(píng)價(jià)抗gpIIbIIIa的活性。使用ADP在血漿中開始聚集，其中Ca+2和Mg+2為主要二價(jià)陽離子。將GRGDSP @ 100μg/mL用作正對(duì)照。
結(jié)果以三個(gè)劑量1、10和100μM測(cè)定oMePUPA-A。在選擇劑量下通過ADP誘導(dǎo)沒有抑制血小板聚集。結(jié)果列于表5中。oMePUPA-A對(duì)VLA-4高度特異性(＞10000倍)。它沒有抗相關(guān)整聯(lián)蛋白α4β7和VLA-5或抗β3整聯(lián)蛋白gpIIbIIIa的可測(cè)量活性(＞100μM)。
表5在α4β7 VCAM-Ig競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定、α4β7和VLA-5粘著測(cè)定、以及血小板聚集研究中測(cè)定的oMePUPA-V的抑制活性
實(shí)施例6LIBS誘導(dǎo)的oMePUPA-V測(cè)定6.1使用LIBS抗體9EG7在Jurkat上測(cè)定a.在體外通過FACS分析測(cè)定α4β1拮抗物的LIBS誘導(dǎo)。在37℃下用僅含2mM MgCl2(Mg+2-TBS)的TRIS緩沖鹽水或試驗(yàn)化合物的系列稀釋液將Jurkat細(xì)胞(2×105/孔)預(yù)培養(yǎng)20分鐘。將這些樣品轉(zhuǎn)移到冰浴中并以10μg/ml的最終濃度補(bǔ)充LIBS抗體9EG7。將這些細(xì)胞用Mg+2-TBS沖洗2次并將其再懸浮于在Mg+2-TBS中的1∶200稀釋的FITC共軛羊抗大鼠IgG中并在4℃下培養(yǎng)30分鐘。將這些細(xì)胞沖洗2次并再懸浮于Mg+2-TBS中。通過FACS分析(Becton Dickinson FACScan)測(cè)定平均熒光強(qiáng)度(MFI)。結(jié)果以MFI表達(dá)。通過Microsoft Excel 5.0版和Deltagraph 4.0版軟件分析數(shù)據(jù)。
圖5顯示了與2mM Mg+2緩沖液(方格B)相比的oMePUPA-V誘導(dǎo)的LIBS表位的暴露。該誘導(dǎo)為濃度依賴型并與用1mM Mg+2(方格A)觀察到的誘導(dǎo)非常相似。省略LIBS抗體和檢測(cè)抗體，或者僅省略抗體消除了貼標(biāo)簽(方格B)。該反應(yīng)的ED50為-20nM。
結(jié)論這些數(shù)據(jù)說明，oMePUPA-A誘導(dǎo)VLA-4中與用天然配體觀察的相同構(gòu)象改變。LIBS值一般落入oMePUPA-V結(jié)合和粘著測(cè)定所定義的范圍(分別為8nM和22nM)內(nèi)。
6.2多種類受體篩選a.在VCAM-Ig直接結(jié)合測(cè)定中使用VCAM-Ig堿性磷酸酶共軛物和來自不同種的周圍血液淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞測(cè)定oMePUPA-V的受體親和性。
PBL，使用綿羊PBL(Abraham，W.M.等人J.Clin.Invest.93776-787，1994)中所述的方法從人、綿羊和狗的外周血液中分離出來。使用VCAM-Ig-AP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定比較oMePUPA-V在這些不同細(xì)胞類型上的結(jié)合。
由oMePUPA-V在有Mn+2的情況下在來自不同種的外周血液淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞上獲得的IC50′s示于表6中。在有Mn+2的情況下，具有相似IC50的oMePUPA-V抑制VCAM-Ig結(jié)合到從人、大鼠、狗、綿羊和小鼠中獲得的淋巴細(xì)胞上。沒有證據(jù)表明種特異性。這與在種中觀察到的VLA-4和其天然配體、CS-1和VCAM的序列保守高度一致。
表6在使用VCAM-Ig堿性磷酸酶共軛物和來自不同種的處周血液淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞在VCAM-Ig競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中測(cè)定的oMePUPA-V的受體親和性
實(shí)施例7oMePUPA-V的受體動(dòng)力學(xué)7.1使用3H-已知的抑制劑作探針的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定在組織培養(yǎng)保溫箱中在37℃下將Jurkat保持在PRMI-1640培養(yǎng)基+10％胎牛血清中。為了結(jié)合研究，通過離心將這些細(xì)胞造粒，用TBS(50mMTris HCl，150mM NaCl，0.1％牛血清白蛋白，2mM葡萄糖，10mM HEPESpH7.4)沖洗2次，以約2×106個(gè)細(xì)胞/ml懸浮于TBS中，并使用Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。在指定緩沖液中將這些細(xì)胞進(jìn)一步稀釋至1.5×106/ml，并經(jīng)受每個(gè)試驗(yàn)所定義的特定處理。然后通過離心將這些細(xì)胞造粒，將其再懸浮于100μl試驗(yàn)緩沖液中，并轉(zhuǎn)移到含2.9mlScintiVerse II(Fisher Scientific)的閃爍小瓶中。通過閃爍計(jì)數(shù)計(jì)量細(xì)胞相關(guān)的放射性。在這些條件下結(jié)合的計(jì)數(shù)測(cè)定未被試驗(yàn)化合物占領(lǐng)并因此沒有結(jié)合到該3H-已知的抑制劑的整聯(lián)蛋白。在硅化處理的1.5ml微量離心管中用標(biāo)準(zhǔn)1ml樣品進(jìn)行所有研究。3H-已知的抑制劑在細(xì)胞(本底物)上的非特異性結(jié)合通過測(cè)定在沒有金屬離子的情況下結(jié)合的抑制劑來定義。通過結(jié)合總計(jì)數(shù)減去非特異性計(jì)數(shù)計(jì)算結(jié)合的特異性計(jì)數(shù)。
進(jìn)行一系列競(jìng)爭(zhēng)性研究以驗(yàn)證oMePUPA-V和已知抑制劑對(duì)VLA-4上的相同位置的競(jìng)爭(zhēng)。首先，將3H-已知的抑制劑與等摩爾量的oMePUPA-V、10倍量和100倍量混合，用Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)并評(píng)價(jià)冷抑制劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合已知抑制劑的能力。oMePUPA-V處理產(chǎn)生3H-已知的抑制劑結(jié)合的劑量依賴性抑制。競(jìng)爭(zhēng)3H-已知的抑制劑結(jié)合所需的oMePUPA-V的濃度比將冷卻用作競(jìng)爭(zhēng)劑時(shí)的大10倍，與Mn+2-激活的VLA-4的較低親和性一致。其次，Mn+2-激活的Jurkat細(xì)胞用3H-已知的抑制劑處理，以便首先占領(lǐng)帶有放射性探針的VLA-4，然后加入過量冷oMePUPA-V。接下來用過量冷oMePUPA-V或已知抑制劑的處理不能辨別出其替換放射性探針的能力。第三，Mn+2-激活的Jurkat細(xì)胞用飽和量的oMePUPA-V處理，并且測(cè)定該oMePUPA-V分離的速度，與用于Mn+2-激活的VLA-4的已知抑制劑的延長(zhǎng)半衰期不同，oMePUPA-V以不到10分鐘的t1/2很快從oMePUPA-V-VLA-4釋放。oMePUPA-V和已知抑制劑的t1/2的很大差異暗示，oMePUPA-V對(duì)VLA-4的較低親和性結(jié)果導(dǎo)致其更快的分離速度。
分離數(shù)據(jù)證實(shí)，oMePUPA-V與VLA-4的結(jié)合特別依賴于VLA-4的活化狀態(tài)，并且它呈現(xiàn)用已知抑制劑看到的相同的活化選擇性。至于Mn+2-激活的VLA-4，oMePUPA-V從Mn+2-激活的VLA-4分離的t1/2比在競(jìng)爭(zhēng)形式中能夠測(cè)定的最短時(shí)間點(diǎn)少10分鐘。另一方面，在有Mn+2和活化抗體TS2/16的情況下，t1/2延長(zhǎng)(20分鐘)。還沒有詳細(xì)評(píng)價(jià)所有可能的活化狀態(tài)，然而可以設(shè)計(jì)快速高亮度差別的簡(jiǎn)單篩選。在該試驗(yàn)中，將固定濃度的oMePUPA-V(10nM)與5nM3H-已知的抑制劑混合，并在這些條件下以不同活化狀態(tài)進(jìn)行結(jié)合。如果oMePUPA-V對(duì)VLA-4具有異常高或低的親和力，那么人們將通過3H-已知的抑制劑的量的區(qū)別檢測(cè)它。在不同活化條件下結(jié)合的3H-已知的抑制劑的百分比的差異近似地可以該抑制劑的已知性能為基礎(chǔ)預(yù)測(cè)。
結(jié)合研究證實(shí)oMePUPA-V以與其親和性一致的濃度與已知抑制劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到VLA-4上，并證實(shí)這兩種化合物競(jìng)爭(zhēng)整聯(lián)蛋白的相同位置。在不同VLA-4活化狀態(tài)下oMePUPA-V和已知抑制劑結(jié)合的相似性暗示結(jié)合機(jī)理相似。
7.2在Panlabs和Cerep篩選中測(cè)定oMePUPA-V在Panlabs輪廓篩、發(fā)現(xiàn)篩和放射性配體、酶和功能性測(cè)定的免疫篩板中以及Cerep膜受體板中試驗(yàn)oMePUPA-V。在包括NK1受體測(cè)定的所有測(cè)定中10μM的oMePUPA-V觀察不到顯著活性，相反已知抑制劑顯示一些活性。Cerep還報(bào)道oMePUPA-V沒有顯示出抑制人ACE蛋白酶活性。ACE蛋白酶源為人內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。3H-HGG，將其添加到HUVEC中，被ACE轉(zhuǎn)變成3H-馬尿酸和雙甘氨肽?？ㄍ衅绽?，一種有效的ACE抑制劑，以990pM的IC50阻斷該轉(zhuǎn)化，然而10μM的oMePUPA-V不能。
藥物性質(zhì)oMePUPA-V為白色至黃白色結(jié)晶粉末。溶于DMSO并具有0.120mg/mL的水溶性。通過DSC、TGA和熱階段顯微鏡檢查研究的oMePUPA-V熱行為顯示，該物質(zhì)在約160℃下熔化。在約136℃，DSC和TGA分析暗示，oMePUPA-V失去可能與水合物脫水一致的揮發(fā)性雜質(zhì)。
制劑霧化制劑100mL 5mg/mL的oMePUPA-V霧化制劑的生產(chǎn)說明如下。
如下制備200mL緩沖原液1、稱重0.286g USP級(jí)氨丁三醇，加入適宜容器中。
2、稱重1.676g USP級(jí)氯化鈉，加入相同容器中。
3、加入200mL USP級(jí)注射用水。
混合直到均勻。
1、稱重0.500g oMePUPA-V并加入適宜容器。
2、加入步驟1中制備的100mL緩沖液。
3、混合直到均勻。
4、無菌過濾到適宜容器中。
5、用適宜封口措施密封。
典型制劑性質(zhì)pH7.4，滲重量摩爾濃度290mOsm實(shí)施例9穩(wěn)定性指示HPLC步驟柱Zorbax SB-C18，3μm顆粒，4.6×150mm保護(hù)柱Zorbax SB-C18，5μm顆粒，4.6×12.5mm流速1mL/分鐘柱溫40℃流動(dòng)相A0.1％(w/v)水中的三氟乙酸(TFA)B0.1％(w/v)在90％(v/v)乙腈、10％(v/v)水中的TFA組分時(shí)間(分鐘)％B0-3 153-18 15-10018-2110021-2815注射10μL在Tris/NaCl/水(散裝中間體)中或在0.1％TFA/45％乙腈(最終產(chǎn)物)中的0.2mg/mL溶液。
檢測(cè)UV 254nm(開始)和215nm對(duì)照oMePUPA-V，在沸水中加熱20分鐘。
完成開始方法的定量。
藥物穩(wěn)定性在以下貯藏條件下貯藏2周后在散裝中間體中沒有觀察到降解在密封小瓶中40℃；在密封小瓶中50℃；在25℃、RH60％下；和在40℃、RH75％下。在4周后，在40℃或50℃下可以檢測(cè)出一個(gè)或者兩個(gè)降解峰，但是每個(gè)雜質(zhì)峰的水平仍然低于0.02％。
水溶性a)霧化制劑，在Tris/NaCl中5mg/mL，在室溫下貯藏2個(gè)月，早期顯示出總水平1％(254nm)和2-3％(215nm)的洗脫降解峰。
b)在沸水中將霧化制劑加熱20分鐘，在254nm純度由99.9％降到98.7％，在215nm純度由100％降到93.6％。
c)在Tris/NaCl/水中的0.2mg/mL溶液在中性pH下在2-8℃下至少穩(wěn)定1周。
顯而易見，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨或范圍的情況下可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改進(jìn)和變化。因此，本發(fā)明覆蓋了附加權(quán)利要求書及其等價(jià)范圍內(nèi)的本發(fā)明提供的這些改進(jìn)和變化。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞粘著抑制化合物 oMePUPA-V及其藥物上可接受的衍生物、前藥、鹽或異構(gòu)體。
2.藥物組合物，其含有權(quán)利要求1的化合物和藥物上可接受的載體。
3.如權(quán)利要求2的藥物組合物，還含有選自皮質(zhì)類固醇、支氣管擴(kuò)張藥、平喘藥、消炎藥、抗風(fēng)濕劑、免疫抑制劑、抗代謝物、免疫調(diào)制劑、治牛皮癬藥和治療糖尿病藥的第二種試劑。
4.藥物組合物，其含有權(quán)利要求1的抑制化合物和和一種或多種細(xì)胞粘著抑制劑化合物。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述一種或多種細(xì)胞粘著抑制劑化合物為VLA-4抑制劑。
6.預(yù)防、抑制或減少哺乳動(dòng)物中細(xì)胞粘著的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給予有效量的權(quán)利要求2的藥物組合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中將所述方法用于預(yù)防、抑制或減少炎癥。
8.治療哺乳動(dòng)物中哮喘、過敏性鼻炎、多發(fā)性硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、炎性腸病或多發(fā)性骨髓瘤的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給予治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
9.治療哺乳動(dòng)物中多發(fā)性硬化的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給予治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
10.治療哺乳動(dòng)物中炎性腸病的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物給予治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
11.含有權(quán)利要求1的化合物的酯前藥的藥物組合物。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述酯選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和直鏈或支鏈烷基C1-C10醇的酯。
13.治療、預(yù)防或改善哮喘癥狀的方法，包括向患有哮喘的患者給予治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)胞粘著抑制劑oMePUPA－V,(R)－N－[[4－[[(2－甲基苯基氨基)羰基]氨基]苯基]乙?；鵠－L－脯氨?；?－甲基)－β－丙氨酸,藥物組合物,和治療細(xì)胞粘著介導(dǎo)的病狀的方法。
文檔編號(hào)A61K31/40GK1307561SQ99808002
公開日2001年8月8日 申請(qǐng)日期1999年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月28日
發(fā)明者W-C·李, A·吉爾 申請(qǐng)人:拜奧根有限公司