專利名稱：新的子宮內(nèi)膜異位相關(guān)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及侵襲過程例如子宮內(nèi)膜異位相關(guān)的基因、其編碼的多肽、抗該肽的抗體和該核酸、多肽和抗體的藥學(xué)應(yīng)用。
子宮內(nèi)膜異位是女性第二大常見疾病，定義為在子宮外出現(xiàn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞。子宮內(nèi)膜異位影響約五分之一的生殖期女性和二分之一具有生育問題的的女性。
在正常情況下，子宮內(nèi)膜僅在子宮內(nèi)出現(xiàn)。在子宮內(nèi)膜異位時，在子宮外例如在子宮外表面上、腸上甚至在胰腺或肺中出現(xiàn)組織學(xué)表型類似子宮內(nèi)膜的組織。盡管這些子宮內(nèi)膜異位病灶位于子宮外，但在月經(jīng)過程中也會出血，因此它們受女性周期激素的影響。因為在該周期中類似子宮內(nèi)膜的子宮內(nèi)膜異位病灶經(jīng)歷體積變化，所以根據(jù)部位不同這些變化可引起疼痛。而且肌體對子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，這也引起疼痛。而且，炎癥在卵巢和輸卵管區(qū)導(dǎo)致粘附，結(jié)果引起染病女性所謂的機械不孕。然而，很明顯，即使沒有出現(xiàn)粘附，在子宮內(nèi)膜異位中也會釋放可降低染病女性生育力的信息。
考慮到它們的病理學(xué)特性，子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞可歸為正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的類型一方面它們不顯示贅生行為，然而另一方面，象轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞一樣，它們能通過生物體內(nèi)器官的邊界并長入其它器官，也就是說它們顯示侵襲行為。因此，文獻中子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞定義為“良性腫瘤細(xì)胞”，盡管至今這種類型細(xì)胞中仍未發(fā)現(xiàn)原癌基因的腫瘤特異突變。
因為子宮內(nèi)膜異位的發(fā)病機理仍不完全清楚，所以對子宮內(nèi)膜異位相關(guān)疾病的治療和預(yù)防仍沒有有效的選擇。
本發(fā)明的目的是鑒定在侵襲過程中起作用并可能與子宮內(nèi)膜異位的病理生理學(xué)表型相關(guān)的新基因。
根據(jù)本發(fā)明，該目標(biāo)通過鑒定、克隆和表征編碼多肽的稱為子宮內(nèi)膜異位相關(guān)基因的基因來實現(xiàn)。該基因序列是通過差異顯示RT-PCT(Liang和Pardee，科學(xué)(Science)257(1992)，967-971)發(fā)現(xiàn)的。為此，在子宮內(nèi)膜細(xì)胞系的侵襲性和非侵襲性變體之間進行相互比較。在該過程中，發(fā)現(xiàn)一個子宮內(nèi)膜細(xì)胞侵襲性變體特異的cDNA序列。發(fā)現(xiàn)長度為4kb的相關(guān)RNA。從cDNA噬菌體庫分離的相應(yīng)cDNA具有一個302氨基酸的開放閱讀框(ORF)。
本發(fā)明涉及一種核酸，其包含(a)SEQ ID NO.1、3或/和5所示的核苷酸序列、其組合或編碼蛋白的片段，(b)在遺傳密碼簡并性的范圍內(nèi)相應(yīng)于(a)的核苷酸序列或(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)和/或(b)中的序列雜交的核苷酸序列。
該核酸優(yōu)選編碼與侵襲過程相關(guān)的多肽或其片段。
下列核苷酸序列已存在EMBL EST數(shù)據(jù)庫中，其登錄號為Z98886、Ac003017、AL023586、Aa52993、Aa452856。這些序列并不代表根據(jù)本發(fā)明的核酸。這些序列的前兩個是分離自人腦的DNA，顯示分別與SEQ IDNO.1從第970到約2000位和從第760到約1450位核苷酸的片段，或與SEQ ID NO.3(在5’端額外有84個堿基)從第1054到2084位和從第844到約1534位核苷酸的片段，有大于90％的一致堿基。AL023586也是人的序列，其與Z98885非常相似并與SEQ ID NO.1第970到約2000位的區(qū)域有同源性。
序列Aa452993和Aa452856來源于小鼠胚胎，顯示分別與SEQ IDNO.1第約1060到約1450位以及從第約24到440位的核苷酸(nt)，或SEQ ID NO.3核苷酸位置的第1144到約1534位以及從第約108到約524位核苷酸的堿基一致性。直到目前任何這4個序列均未有指出閱讀框或功能。
SEQ ID NO.1中描述的核苷酸序列含有長302個氨基酸的多肽相應(yīng)的開放閱讀框。該多肽顯示在SEQ ID NO.2所描述的氨基酸序列中。SEQID NO.3顯示一個相應(yīng)于SEQ ID NO.1中的核苷酸序列，但其在5’端具有另外84個核苷酸。結(jié)果，在兩個核酸序列中，彼此相應(yīng)的核苷酸的位置移動了84個核苷酸。因此，SEQ ID NO.3編碼的多肽在N端具有另外28個氨基酸，并且描述于具有330個氨基酸的SEQ ID NO.4中。SEQID NO.2和4描述了天然多肽的C-末端片段。
為了說明，請參考

圖1，該圖顯示了根據(jù)本發(fā)明的子宮內(nèi)膜異位相關(guān)基因的cDNA圖示說明。顯示了五個外顯子E1至E5，和用作DDRT-PCR探針的片段1(394 nt)的位置。還顯示了用作RT-PCR的PCR引物(見實施例4，表1)的位置。
圖1未顯示在SEQ ID NO.5中描述了其核苷酸序列的另一個外顯子4a。該4a外顯子可能存在。如果存在，應(yīng)處于外顯子4和外顯子5之間。這相應(yīng)于SEQ ID NO.3中nt1054和nt1055之間的位置。因此，SEQ IDNO.1/3與SEQ ID NO.5的組合產(chǎn)生例如一個在所述位置含有外顯子4a序列的序列。
除了顯示于SEQ ID NO.1、3和5的核苷酸序列和其組合例如在nt1054和1055間具有SEQ ID NO.5序列的SEQ ID NO.3，以及在遺傳密碼的簡并性范圍內(nèi)相應(yīng)于這些序列之一的核苷酸序列，本發(fā)明還包括與前述序列之一雜交的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“雜交”的使用見Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbor LabortaryPress(1989)，1.101-1.104)。優(yōu)選地，如果在50℃，優(yōu)選55℃，尤其優(yōu)選62℃，最優(yōu)選68℃，用1×SSC和0.1％SDS洗滌1小時，特別優(yōu)選在55℃，優(yōu)選55℃，尤其優(yōu)選62℃，最優(yōu)選68℃，用0.2×SSC和0.1％SDS洗滌1小時后，仍可觀察到陽性雜交信號，則將雜交稱為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)摹Ｔ谶@些洗滌條件下與SEQ ID NO.1、3和5描述的一或多個核苷酸序列，或在遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)相應(yīng)于這些序列的核酸序列雜交的核苷酸序列是根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列優(yōu)選為DNA。然而，也可包括例如RNA或核酸類似物如肽核酸。尤其優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的核酸包括SEQ IDNO.1、3和/或5所示核苷酸序列編碼蛋白的片段，或與SEQ ID NO.1、3或5所示核苷酸序列有大于80％，優(yōu)選大于90％，尤其優(yōu)選大于95％同源性的序列，或它們的優(yōu)選至少20個核苷酸(nt)，尤其優(yōu)選至少50nt的片段。如上所述，同樣的原則也適用于除了SEQ ID NO.1或3的序列外還含有SEQ ID NO.5的序列的核酸。當(dāng)兩個核酸(或肽鏈)相比時，同源性以一致性位置的百分比給出，其中100％同源性意味著相比較的兩分子完全一致(HerderLexilon der Biochemie und Molekularbiologie[生物化學(xué)和分子生物學(xué)字典]，Spektrum Akademischer Verlag 1995)。
根據(jù)本發(fā)明的核酸優(yōu)選可從哺乳動物，尤其是人獲得。它們可根據(jù)已知技術(shù)通過使用SEQ ID NO.1、3或/和5所示核苷酸序列的短片段作為雜交探針和/或作為擴增引物來分離。而且，根據(jù)本發(fā)明的核酸還可由化學(xué)合成制備，可使用修飾的核苷酸構(gòu)件，例如適當(dāng)時用2’-O-烷基化核苷酸構(gòu)件，而非傳統(tǒng)核苷酸構(gòu)件。
因此，根據(jù)本發(fā)明的核酸或其片段可用于制備優(yōu)選含有標(biāo)志或標(biāo)記基團的引物和探針。還優(yōu)選特別適合鑒定不同mRNA種類的跨內(nèi)含子的寡核苷酸引物。
本發(fā)明還涉及如上定義的核酸編碼的多肽。這些多肽優(yōu)選含有(a)SEQ ID NO.2或4中所描述的氨基酸序列，或(b)與(a)的氨基酸序列有大于70％，優(yōu)選大于80％，尤其優(yōu)選大于90％同源性的氨基酸序列。
除了SEQ ID NO.2或4中所描述的多肽，本發(fā)明還涉及突變蛋白、變體和其片段。由于單個氨基酸或短氨基酸片段的替換、缺失和/或插入，這些序列與SEQ ID NO.2或4中所描述的氨基酸序列不同。
術(shù)語“變體”包括子宮內(nèi)膜異位蛋白天然存在的等位基因變體或拼接變體，以及重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的蛋白(尤其是由化學(xué)合成寡核苷酸介導(dǎo)的體外誘變)，這些蛋白就其生物和/或免疫活性而言，實質(zhì)上相應(yīng)于SEQID NO.2或4中所述的蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括化學(xué)修飾的多肽。在肽末端和/或反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈基團中?；缫阴；蝓０坊亩嚯膶儆诖祟悺４鞸EQ ID NO.2或4所示氨基酸序列的至少10個氨基酸的片段的多肽片段(肽)也屬于根據(jù)本發(fā)明的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及含有至少一個拷貝本發(fā)明的核酸的載體。該載體可以是任何攜帶根據(jù)本發(fā)明的DNA序列的原核或真核載體，其中DNA序列優(yōu)選連接表達信號如啟動子、操作子、增強子等。原核載體的例子是染色體載體例如噬菌體和染色體外載體如質(zhì)粒，尤其優(yōu)選環(huán)狀質(zhì)粒載體。適合的原核載體的描述見例如Sambrook等(見上)，第1-4章。尤其優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的載體為真核載體，例如酵母載體，或適于高等細(xì)胞的載體例如質(zhì)粒載體、病毒載體或植物載體。該類型的載體是分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，所以無需在此作進一步說明。具體地，該方面請參考Sambrook等，見上，第16章。
本發(fā)明還涉及含有SEQ ID NO.1、3或/和5所示序列或其組合至少21個核苷酸長的片段的載體。優(yōu)選該片段的核苷酸序列來自于所述序列的蛋白編碼區(qū)或該蛋白或多肽表達必需的區(qū)域。這些核酸尤其適合于制備治療上可用的優(yōu)選長達50個核苷酸的反義核酸。
本發(fā)明進一步涉及轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的載體的細(xì)胞。該細(xì)胞可是真核也可以是原核細(xì)胞。核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法是一般的現(xiàn)有技術(shù)，因此無需進一步說明。細(xì)胞優(yōu)選例如真核細(xì)胞，尤其是動物細(xì)胞，尤其優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。
本發(fā)明進一步涉及抗該子宮內(nèi)膜異位基因編碼的多肽或其變體的抗體或該抗體的片段。該類抗體尤其優(yōu)選針對所述基因編碼的完整多肽或SEQID NO.4所述氨基酸序列的第1-330位氨基酸相應(yīng)的肽序列。
根據(jù)本發(fā)明，特異地與侵襲過程相關(guān)特別是與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)的基因的鑒定、分離和表達提供了基于上述病癥的疾病的診斷、治療和預(yù)防的必要條件。
利用本發(fā)明的多肽或該多肽的片段作為免疫原可制備抗這些多肽的抗體?？贵w的制備可按常規(guī)方法進行，即通過用該完整多肽或其片段免疫實驗動物，之后獲得產(chǎn)生的多克隆抗血清。根據(jù)Khler和Milstein的方法和其發(fā)展的方法，可從實驗動物的抗體生產(chǎn)細(xì)胞按已知方式利用細(xì)胞融合獲得單克隆抗體。同樣，可按已知方法生產(chǎn)人單克隆抗體。然后該類抗體可用于尤其是子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞組織的診斷檢測或治療。
例如，樣品如體液，尤其是人體液(例如血、淋巴液或CSF)可使用ELISA技術(shù)一方面檢測子宮內(nèi)膜異位基因編碼的多肽的存在，另一方面檢測抗該多肽的自身抗體的存在。然后可使用特異抗體例如本發(fā)明的抗體在這些樣品中檢測子宮內(nèi)膜異位基因編碼的多肽或其片段。為檢測自身抗體，優(yōu)選可使用含有子宮內(nèi)膜基因編碼多肽的部分、域或甚至完整多肽、并與利于檢測的蛋白域例如麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)相融合的重組融合蛋白。
診斷檢測還可采用特異核酸探針在核酸水平上檢測，例如在基因或轉(zhuǎn)錄本水平上進行。
本發(fā)明的核苷酸、氨基酸序列和抗體的提供進一步促進了該多肽/蛋白效應(yīng)物的定向?qū)ふ摇Ｐ?yīng)物是以抑制或激活方式作用于本發(fā)明的多肽并可選擇性影響該多肽控制的細(xì)胞功能的試劑。然后這些試劑可用于適當(dāng)病癥例如基于侵襲過程的病癥的治療。因此本發(fā)明還涉及用于鑒定子宮內(nèi)膜異位蛋白效應(yīng)物的方法，其中將表達該蛋白的細(xì)胞與各種潛在效應(yīng)物物質(zhì)(如低分子量試劑)接觸，然后分析細(xì)胞的改變，例如細(xì)胞激活、細(xì)胞抑制、細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞遺傳的改變。用該方法，還可鑒定子宮內(nèi)膜異位蛋白的結(jié)合靶標(biāo)。
由于許多腫瘤疾病伴有侵襲過程，根據(jù)本發(fā)明的基因的發(fā)現(xiàn)還提供了癌癥診斷、預(yù)防和治療的可能性。
參與負(fù)責(zé)侵襲過程的基因的發(fā)現(xiàn)不僅開拓了治療基于這種細(xì)胞改變的疾病的可能性，而且為使該過程有效，也可使用根據(jù)本發(fā)明的序列。這對于例如胚胎的植入可能是重要的。
因此本發(fā)明還涉及包含作為活性成分的如前所述的核酸、載體、細(xì)胞、多肽、肽和/或抗體的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可含有藥物學(xué)常規(guī)載體、賦形劑和/或添加劑，而且，如果合適可含有其它的活性成分。該藥物組合物可用于特別是侵襲過程相關(guān)的疾病的診斷、治療或預(yù)防。而且本發(fā)明的組合物還可用于診斷這些疾病的易感性，特別是診斷子宮內(nèi)膜異位危險。
本發(fā)明通過下列附圖、序列和實施例來更詳細(xì)說明。
在本實施例中，首先采用幾個不同dT11VX引物(下游引物，錨定引物)將細(xì)胞polyA+RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后使用Genhunter，Nashville(1994)RNA MapTM試劑盒的4種下游引物和20種上游引物并加入放射性標(biāo)記的核苷酸對獲得的cDNA群體進行PCR擴增。擴增后將反應(yīng)混合物真空濃縮，獲得的cDNA片段在6％天然PAA(聚丙烯酰胺)凝膠中分級分離。用放射線自顯影法進行DNA的檢測。將待研究的兩個細(xì)胞變體的條帶模式顯示顯著不同的PCR混合物重復(fù)兩次以檢測重現(xiàn)性。如果前面發(fā)現(xiàn)的不同得到證實，則根據(jù)已知方法從凝膠中洗脫條帶、再擴增、克隆和測序。
通過該方法發(fā)現(xiàn)一個侵襲細(xì)胞變體特異的394 bp片段(片段1，SEQID NO.1所示核苷酸序列的第1235-1628位核苷酸，也見圖1)。該片段用作Northern雜交分析(見下)的探針。實施例3 在人Northern雜交中分析片段1的表達圖譜為了檢測DDRT-PCR片段1的表達模式，進行Northern雜交。為此，將20ug總RNA或4ug polyA+RNA在1％變性瓊脂糖凝膠中分級分離，并過夜轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。用UV光照射將RNA固定在膜上。在含甲醛的雜交液中用32P標(biāo)記探針(用Amersham的RPL試劑盒標(biāo)記)42℃雜交過夜。然后在遞增嚴(yán)格的條件下洗膜直到斑點發(fā)射的放射性達到可測量強度。雜交模式通過放置在X光片(NEF-NEN，DuPont)上暴光數(shù)天來顯現(xiàn)。為確定DDRT-PCR片段1的表達模式，用下列細(xì)胞或組織的RNA進行Northern印跡分析-上皮子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞系EEC145T+的侵襲細(xì)胞(傳代17次)-上皮子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞系EEC145T+的非侵襲細(xì)胞(傳代33次)-腹膜細(xì)胞系EEC143T+的細(xì)胞-子宮內(nèi)膜組織-侵襲性人膀胱癌細(xì)胞系EJ28的細(xì)胞-非侵襲性人膀胱癌細(xì)胞系RT112的細(xì)胞用DDRT-PCR片段1的探針雜交后檢測到一個約4kb的mRNA，而且它僅可在子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞系EEC145T+細(xì)胞的侵襲性變體中檢測到。
還檢測了其它人組織。在脾臟中發(fā)現(xiàn)明顯與片段1雜交的4kbmRNA，在腦中分別發(fā)現(xiàn)長4kb和＞9kb的mRNA片段。
使用兩個Clontech的人多組織Northern(multiple tissue Northern，MTN)按照廠家說明進行Northern印跡分析。在下列組織中檢測表達結(jié)腸、小腸、心臟、腦、睪丸、肝、肺、脾、腎、卵巢、胰臟、外周血白細(xì)胞、胎盤、前列腺、骨骼肌、胸腺。用放射線標(biāo)記3′探針“DDRT-PCR片段1”獲得的表達模式表示如下4kb mRNA(期望大小)腦、脾、胰臟9.5kb mRNA腦在其它組織中沒有檢測到特異雜交。原位雜交為了闡述細(xì)胞表達模式，對不同組織的10um石蠟切片進行mRNA原位雜交。為此，以“DDRT-PCR片段1”作為地高新配基標(biāo)記的RNA探針。檢測反應(yīng)采用與堿性磷酸酶(A)偶聯(lián)的地高新配基特異抗體進行。BM紫作為AP的底物，在去磷酸化之后它形成藍色沉淀。結(jié)果列在下表中，顯示主要在侵襲/遷移細(xì)胞中表達。
實施例4 RT-PCRRT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)提供了一種測試表達模式的敏感方法。
為此，用400U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco-BRL)在30ul總體積中將1ug適當(dāng)polyA+RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取1ul該反應(yīng)物用于隨后用不同引物組合進行的PCR。
所用PCR引物P1至P7見表1(也見圖1)。表1
RT-PCR實驗用不同細(xì)胞系和組織的polyA+RNA和不同引物組合來進行。結(jié)果見表2。表2
PC＝引物組合P17＝子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞系EEC145T，傳代17次，侵襲P33＝子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞系EEC145T，傳代33次，非侵襲Per＝腹膜細(xì)胞系Perl43TEM＝子宮內(nèi)膜組織EJ28＝侵襲性膀胱癌細(xì)胞系RT112＝非侵襲性膀胱癌細(xì)胞系E＝子宮內(nèi)膜組織EE＝子宮內(nèi)膜異位患者的子宮內(nèi)膜組織PEE＝腹膜子宮內(nèi)膜異位活檢n.d.＝未測定RT-PCR結(jié)果證明在子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞系EEC145T+的早期傳代物(17代，20代)中有片段1特異的表達。與Northern印跡分析不同，在子宮內(nèi)膜中顯示可能也有弱表達。用跨越內(nèi)含子的引物進行RT-PCR分析為了檢測可能的其它外顯子，用跨越內(nèi)含子的引物進行RT-PCR實驗?？赡茉谒鰉RNA之外還存在至少一種mRNA，它在第4和第5外顯子之間含有一個長218bp的外顯子(4a)。該外顯子位于3′-UTR(非翻譯區(qū))，也就是說編碼區(qū)之后。4a外顯子的序列如下。gcggttgtcc ggaatgccag tggctcctgg gcagatgtgc accccagattcagcctttgt gatagattcc aacacgttct ggcctcagac cacctttgtggtggggccag actgctctgg gcaaagtgaa gctggccttt atgctccaaggaagggggcc tcgagagcag gcctgcattg gctctcggac taattcgcgatcatctttca tacagcag可選擇的外顯子4a的核苷酸序列實施例5 cDNA噬菌體文庫EEC14的制備按照Short，J.M.等(1988)核酸研究(Nucleic Acids Res.)167583-7600的方法制備cDNA噬菌體文庫EEC14。
首先，進行上皮子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞系EEC145T+侵襲性細(xì)胞(17代)的polyA+RNA的逆轉(zhuǎn)錄。所用引物包括XhoI切割位點和18個核苷酸長的poly(dT)。將一含有EcoRI切割位點的接頭與產(chǎn)生的cDNA片段連接。兩個限制性位點允許cDNA片段直接插入ZAP ExpressTM載體。插入片段可以以抗卡那霉素的pBK CMV噬菌粒的形式從噬菌體中切割下來。實施例6 篩選噬菌體文庫按照廠家手冊(Stratagene)，以DDRT-PCR片段1(394bp)作為探針以篩選106pfu(噬菌體形成單位)的cDNA噬菌體文庫EEC14。探針借助PCR用地高新配基(Boehringer Mannheim)標(biāo)記。將感染細(xì)菌菌株XL lblue MRF′后形成的噬菌斑轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，并用上述探針在其上雜交。雜交的地高新配基標(biāo)記探針按Boehringer Mannheim的化學(xué)發(fā)光手冊進行檢測。
選擇陽性噬菌斑再次篩選。再次篩選的陽性克隆用于切割。通過ExAssist輔助噬菌體從噬菌體上切割載體部分獲得了卡那霉素抗性的pBK CMV噬菌粒，該噬菌粒經(jīng)過在細(xì)菌菌株XLOLRTM中擴增后可分離和測序。分離的噬菌?？寺2A含有2.3kb大小的最長的插入片段，其序列已被測定并顯示于SEQ ID NO.1。DDRT-PCR片段1的序列是SEQ ID NO.1第1235-1628位核苷酸。實施例7 Southern印跡分析用各種限制性內(nèi)切酶切割10ug男女受檢者的基因組DNA。將片段在瓊脂糖凝膠上分級分離并轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。用地高新配基標(biāo)記的DDRT-PCR片段1對該膜雜交。
根據(jù)Boehringer手冊用化學(xué)發(fā)光法檢測雜交情況。在女性和男性DNA樣品中使用各種限制酶均只檢測到一個條帶。該結(jié)果提示片段1所在基因是單一的非性別特異的基因。此后，用DDRT-PCR片段1分離了兩個基因組克隆PAC J1472和PAC N1977。實施例8 熒光原位雜交(FISH)通過熒光原位雜交已將實施例7中獲得的基因組克隆定位于1號染色體上(1p36)(Lichter等(1990)，科學(xué)24764-69)。實施例9 特異抗體的產(chǎn)生通過適當(dāng)限制性切割位點將上述cDNA序列的第584-909位核苷酸克隆至表達載體pMAL cRI中。為了表達該序列，將該結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。翻譯的蛋白質(zhì)片段從SDS聚丙烯酰胺凝膠切割下來用于免疫兔。實施例10 RACE(cDNA末端快速擴增)因為cDNA克隆Q2A(見實施例6)的長度與檢測到的mRNA長度(約4kb)不同，所以進行RACE實驗以獲得更多的序列信息。借助該方法有可能從mRNA模板的已知內(nèi)部序列和5’或3’末端的未知序列之間獲得cDNA序列?？寺2A的3’端可通過從第5個外顯子開始的3′RACE實驗證實。
對于5’RACE，用與第1個外顯子雜交的基因特異引物合成cDNA第一鏈，然后用末端轉(zhuǎn)移酶添加均聚核苷酸尾。添加的序列允許擴增位于基因特異引物和均聚核苷酸尾之間的序列區(qū)域。這使得可獲得下列位于Q2A序列5’端并屬于第1個外顯子的下列附加序列cc cgg ccg ccc cga gtg gag cgg atc cac ggg cagatgcagatgcct47Arg Pro Pro Arg Val Glu Arg Ile His Gly Gln Met Gln Met Pro1 5 10 15cga gcc aga cgg gcc cac agg ccc cgg gac cag gcg gcc gcc ctc gtg... 95Arg Ala Arg Arg Ala His Arg Pro Arg Asp Gln Ala Ala Ala Leu Val ...
20 25 30加下劃線的序列代表Q2A序列的頭幾個核苷酸，它之前的序列是通過5′RACE獲得的新序列。開放閱讀框與已從片段推出的閱讀框相符，并含有兩個推定的起始密碼子(加下劃線)。
前面獲得序列的核苷酸序列見SEQ ID NO.1，其5’端額外的84個核苷酸見SEQ ID NO.3。
序列表<110>Starzinski-Powitz，Anna教授<120>新的子宮內(nèi)膜異位相關(guān)基因<130>18505PWO子宮內(nèi)膜異位基因<140><141><150>DE 198 24 230.1<151>1998-05-29<160>5<170>PatentIn 2.1版<210>1<211>2204<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(3)..(911)cc gcc ctc gtg ccc aag gca gga ctg gcc aag ccc cca gct gct gcc 47Ala Leu Val Pro Lys Ala Gly Leu Ala Lys Pro Pro Ala Ala Ala1 5 10 15aaa tcc agc cct tcc ctc gcc tct tcg tcc tcg tcc tcg tcc tcc gcg95Lys Ser Ser Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala20 25 30gtg gcc ggt ggg gcc ccg gag cag cag gcc ctc ctg agg agg ggc aag143Val Ala Gly Gly Ala Pro Glu Gln Gln Ala Leu Leu Arg Arg Gly Lys35 40 45agg cac ctg cag ggg gac ggt ctc agc agc ttc gac tcc aga ggc agc191Arg His Leu Gln Gly Asp Gly Leu Ser Ser Phe Asp Ser Arg Gly Ser50 55 60cgg ccc acc aca gag act gag ttc atc gcc tgg ggg ccc acg ggg gac239Arg Pro Thr Thr Glu Thr Glu Phe Ile Ala Trp Gly Pro Thr Gly Asp65 70 75gag gag gcc ctg gag tcc aac aca ttt ccg ggc gtt tac ggc ccc acc287Glu Glu Ala Leu Glu Ser Asn Thr 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<400>330 cc cgg ccg ccc cga gtg gag cgg atc cac ggg cag atg cag atg cct 47Arg Pro Pro Arg Val Glu Arg Ile His Gly Gln Met Gln Met Pro1 5 10 15cga gcc aga cgg gcc cac agg ccc cgg gac cag gcg gcc gcc ctc gtg9535 Arg Ala Arg Arg Ala His Arg Pro Arg Asp Gln Ala Ala Ala Leu Val20 25 30ccc aag gca gga ctg gcc aag ccc cca gct gct gcc aaa tcc agc cct143Pro Lys Ala Gly Leu Ala Lys Pro Pro Ala Ala Ala Lys Ser Ser Pro40 35 40 45tcc ctc gcc tct tcg tcc tcg tcc tcg tcc tcc gcg gtg gcc ggt ggg191Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Ala Gly Gly50 55 6045gcc ccg gag cag cag gcc ctc ctg agg agg ggc aag agg cac ctg cag239Ala Pro Glu Gln Gln Ala Leu Leu Arg Arg Gly Lys Arg His Leu Gln65 70 7550 ggg gac ggt ctc agc agc ttc gac tcc aga ggc agc cgg ccc acc aca287Gly Asp Gly Leu Ser Ser Phe Asp Ser Arg Gly Ser Arg Pro Thr Thr80 85 90 95gag act gag ttc atc gcc tgg ggg ccc acg ggg gac gag gag gcc ctg33555 Glu Thr Glu Phe Ile Ala Trp Gly Pro Thr Gly Asp Glu Glu Ala Leu100 105 110gag tcc aac aca 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權(quán)利要求
1.一種核酸，其特征在于它含有(a)SEQ ID NO.1、3和/或5所示核苷酸序列、其組合或其編碼蛋白質(zhì)的片段，(b)遺傳密碼簡并性范圍內(nèi)與(a)中序列相應(yīng)的核苷酸序列，(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)和/或(b)中的序列雜交的核苷酸序列，條件是該核苷酸序列與EMBL EST數(shù)據(jù)庫中登錄號為Z98886、Ac003017、Aa453993、AL023586和Aa452856的序列不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其特征在于它含有SEQ ID NO.1、3和/或5所示核苷酸序列的編碼蛋白質(zhì)的片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸，其特征在于它與SEQ ID NO.1、3和/或5所示核苷酸序列或其片段具有80％同源性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項的核酸，其特征在于它編碼與侵襲過程有關(guān)的多肽或其片段。
5.包含根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項的核苷酸序列的修飾核酸或核酸類似物。
6.多肽，其特征在于它是由根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項的核酸編碼的，其中不考慮權(quán)利要求1的條件。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的多肽，其特征在于它(a)含有SEQ ID NO.2或4所示氨基酸序列或(b)與根據(jù)(a)的氨基酸序列具有70％以上的同源性。
8.包含根據(jù)權(quán)利要求6或7的氨基酸序列的修飾多肽。
9.肽，其特征在于它是SEQ ID NO.2或4所示氨基酸序列的至少10個氨基酸的片段。
10.載體，其特征在于它包含至少一個拷貝的根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項的核酸或其片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的載體，其特征在于它便于在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達核酸。
12.細(xì)胞，其特征在于它已被根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項的核酸或根據(jù)權(quán)利要求10或11的載體轉(zhuǎn)化。
13.抗權(quán)利要求6-8之任一項的多肽或抗根據(jù)權(quán)利要求9的肽的抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的抗體，其特征在于它是抗所述完整多肽或抗其選自SEQ ID NO.4第1-330位氨基酸片段的片段。
15.藥物組合物，其特征在于它包含作為活性成分的(a)根據(jù)權(quán)利要求1-5的核酸，其中不考慮權(quán)利要求1的條件，(b)根據(jù)權(quán)利要求10或11的載體，(c)根據(jù)權(quán)利要求12的細(xì)胞，(d)根據(jù)權(quán)利要求6-8之任一項的多肽，(e)根據(jù)權(quán)利要求9的肽和/或(f)根據(jù)權(quán)利要求13或14的抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其特征在于它還含有藥學(xué)上的傳統(tǒng)載體、賦形劑和/或添加物。
17.根據(jù)權(quán)利要求6-8之任一項的多肽或該多肽的片段作為免疫原在產(chǎn)生抗體中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物在侵襲過程相關(guān)疾病的診斷中的應(yīng)用。
19.根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物在侵襲過程相關(guān)疾病的易感性的診斷中的應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物在侵襲過程相關(guān)疾病的治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
21.根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物在子宮內(nèi)膜異位癥的診斷、治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
22.根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物在腫瘤性疾病的診斷、治療或預(yù)防中的應(yīng)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物作為基因治療劑的應(yīng)用。
24.根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物作為反義抑制劑的應(yīng)用。
25.根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物在胚胎植入中的應(yīng)用。
26.根據(jù)權(quán)利要求15或16的組合物在鑒定權(quán)利要求6-8之任一項的多肽的抑制劑和/或能結(jié)合該多肽的分子的抑制劑中的應(yīng)用。
27.根據(jù)權(quán)利要求6-8之任一項的多肽或該多肽的片段在檢測樣品中抗子宮內(nèi)膜異位相關(guān)蛋白或其片段的抗體中的應(yīng)用。
28.根據(jù)權(quán)利要求13或14的抗體或該抗體的片段在檢測子宮內(nèi)膜異位相關(guān)蛋白或其片段中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及侵襲性疾病如子宮內(nèi)膜異位相關(guān)基因、所述基因編碼的多肽、抗該多肽的抗體和該核酸、多肽和抗體的藥物學(xué)應(yīng)用。
文檔編號A61K31/70GK1307636SQ99807965
公開日2001年8月8日 申請日期1999年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月29日
發(fā)明者安娜·斯塔津斯基－波伊茲, 西爾維亞·科特奇安, 海克·漢德羅－梅特茲瑪徹 申請人:安娜·斯塔津斯基－波伊茲