專(zhuān)利名稱(chēng)：提高生育力的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二聚體形式的溶菌酶在提高動(dòng)物或人生殖細(xì)胞、例如卵母細(xì)胞和精母細(xì)胞的生育力方面的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及對(duì)動(dòng)物或人的生育力或生殖疾病的預(yù)防性干預(yù)和治療。本發(fā)明也涉及溶菌酶二聚體在制備適于這類(lèi)應(yīng)用的藥物組合物中的用途，以及改良的保存人或動(dòng)物細(xì)胞的方法和延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間的方法。
背景八十年代后期，當(dāng)發(fā)現(xiàn)了既保留了已知單聚體形式的所有有益性能、同時(shí)用于醫(yī)療時(shí)又顯示沒(méi)有消極副作用的分離的二聚體形式的酶以后，溶菌酶和其他治療活性酶在實(shí)際應(yīng)用中的限制才得以克服。WO89/11294中已描述了包含作為活性成分的溶菌酶二聚體或其他二聚體酶的抗病毒和抗細(xì)菌組合物，該文的整個(gè)內(nèi)容引用在此作為參考。
稍后，如WO 94/01127中所述，又發(fā)現(xiàn)了溶菌酶二聚體的其他引人注意的特性，并且開(kāi)發(fā)出該藥物的其他治療用途，特別是用于治療細(xì)菌和病毒感染，該篇專(zhuān)利的整個(gè)內(nèi)容也將結(jié)合在此作為參考。發(fā)明人觀察到了二聚體溶菌酶的某些免疫調(diào)制作用，特別是有關(guān)調(diào)制細(xì)胞因子水平的免疫調(diào)制作用，這些作用得到了各種體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。溶菌酶二聚體除了別的以外還能調(diào)制TNFα、IL-2、IL-6和INFα的合成，能激活吞噬作用和與其相關(guān)的免疫機(jī)理。溶菌酶二聚體特別可用于治療和預(yù)防與過(guò)度高水平的TNFα有關(guān)的疾病。
溶菌酶二聚體組合物在抑制或者甚至是全面預(yù)防體內(nèi)白血病細(xì)胞增殖方面顯示出卓越的效能，特別是對(duì)于病毒誘導(dǎo)的淋巴白血病更是如此，這一點(diǎn)也可成功地得到證明。其他研究涉及制備包含溶菌酶二聚體作為活性組分的藥物組合物，這些組合物適用于毛發(fā)生長(zhǎng)疾病，特別是以免疫功能失?；蚬δ苷系K為基礎(chǔ)的毛發(fā)生長(zhǎng)疾病，或者適用于預(yù)防或治療與受抑制的免疫系統(tǒng)有關(guān)的疾病。溶菌酶二聚體的這些顯著效用已公開(kāi)在WO 96/21463中，該文的整個(gè)內(nèi)容引用在此作為參考。
發(fā)明概述進(jìn)一步研究令人驚奇地顯示，溶菌酶二聚體還能確信無(wú)疑地影響動(dòng)物精液的保藏，特別是冷凍保藏。適當(dāng)?shù)乇２貏?dòng)物和人的精液樣本，從而維持精子的活動(dòng)性和生育力，并使發(fā)生形態(tài)變化(既病理改變)的精子的數(shù)目盡可能低，這是非常重要的，包括在商業(yè)利益方面。
使用不同的添加劑和助劑與精液混合來(lái)促進(jìn)冷凍保藏和在融化過(guò)程中保護(hù)這些細(xì)胞，這是本領(lǐng)域中眾所周知的。例如，俄羅斯專(zhuān)利申請(qǐng)SU-604556-A教導(dǎo)了一種用于稀釋和冷凍農(nóng)業(yè)動(dòng)物精液的合成含水介質(zhì)的制備，該介質(zhì)包含阿拉伯膠、甘油、乳糖和10-20％重量的雞蛋黃。
通過(guò)對(duì)保藏和儲(chǔ)存的生物材料(特別是在將冷凍樣本融化后)的最相關(guān)的生物活性或生存能力參數(shù)的評(píng)估分析，證實(shí)了溶菌酶二聚體及其對(duì)動(dòng)物或人類(lèi)細(xì)胞(包括組織細(xì)胞、血液細(xì)胞和精子)在不同溫度下的保藏效果改善的貢獻(xiàn)的輔助作用，盡管多數(shù)常涉及至少一個(gè)冷凍步驟。對(duì)于動(dòng)物或人的精子，測(cè)定了融化后具有正?；顒?dòng)性、精子形態(tài)、生化和生物活性的精子百分?jǐn)?shù)的改善情況。
動(dòng)物或人的細(xì)胞懸液在儲(chǔ)藏前用溶菌酶二聚體處理并且將這些細(xì)胞與溶菌酶二聚體一起儲(chǔ)藏是特別優(yōu)選的，不論儲(chǔ)藏溫度例如是在凝固點(diǎn)溫度之上還是之下。除了溶菌酶二聚體的輔助作用以外—所得結(jié)果表明，即使在非常低的溫度下，溶菌酶二聚體也能附著到精子和其它真核細(xì)胞的細(xì)胞膜上并使這些細(xì)胞膜穩(wěn)定—它的抗菌活性以及對(duì)在整個(gè)保藏期間加入的潛在的病毒滲入的抑制作用也有可能提高效能，特別是在液態(tài)儲(chǔ)藏的過(guò)程中。當(dāng)在低于凝固點(diǎn)的溫度下儲(chǔ)藏時(shí)，優(yōu)選在冷凍步驟之前將溶菌酶二聚體加入細(xì)胞懸液中。
本發(fā)明還涉及對(duì)卵母細(xì)胞生育力的改善，更具體地說(shuō)是涉及改善卵母細(xì)胞的成熟以及隨后受精卵細(xì)胞和早期胚胎的發(fā)育。用牛精子進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)顯示，在牛卵母細(xì)胞受精時(shí)的成熟培養(yǎng)基中加入溶菌酶二聚體，對(duì)受精率和所得到的胚胎的質(zhì)量具有有益作用。還發(fā)現(xiàn)，向卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)基中加入一部分多形核細(xì)胞(PMN)或淋巴細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物(在溶菌酶二聚體與促分裂原如LPS、PHA或ConA的混合物的存在下生長(zhǎng))的上清液，對(duì)受精率和胚胎發(fā)育具有類(lèi)似的有益作用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在體內(nèi)改善動(dòng)物或人的精液質(zhì)量，以及預(yù)防性干預(yù)或治療任何已知或未知病因的生育力或生殖疾病，特別是具有免疫、激素或代謝起因的男性生育力疾病。在首選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及動(dòng)物或人的精子減少癥的預(yù)防或治療，是通過(guò)對(duì)可能患或已患有這樣一種生育力疾病的動(dòng)物或人個(gè)體給藥有效劑量的溶菌酶二聚體來(lái)避免或減輕這種病情。
精子減少癥的特征是精子的濃度病理性下降，形態(tài)改變的精子的比例異常升高。除了別的原因以外，這可能是由影響精子形成(即精子的產(chǎn)生和/或破裂)的激素、免疫或代謝機(jī)能障礙引起的。現(xiàn)已在體內(nèi)成功地證明，對(duì)各種雄性家養(yǎng)動(dòng)物肌內(nèi)注射了包含溶菌酶二聚體作為活性成分的藥物組合物后，它們的精液質(zhì)量大大改善了，包括但不限于精子濃度顯著增加和形態(tài)改變的精子的數(shù)量明顯下降。我們相信，溶菌酶二聚體的廣泛的免疫調(diào)制作用非常有助于所觀察到的有益效果。
本文中所用的與溶菌酶二聚體對(duì)動(dòng)物或人免疫系統(tǒng)的作用有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“調(diào)制的”和“調(diào)制”將表示這種作用的雙功能的免疫系統(tǒng)平衡特性。當(dāng)個(gè)體例如因傳染病、化療、壓力、污染物等等原因而處于免疫抑制狀態(tài)時(shí)，溶菌酶二聚體就會(huì)增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的作用并通常修復(fù)到免疫防御能力的正常生理水平，或者至少通過(guò)包括特別是增加某些細(xì)胞因子(包括干擾素和一些白介素)的血液或血清濃度，和/或增強(qiáng)各種吞噬類(lèi)免疫系統(tǒng)細(xì)胞(諸如象單核細(xì)胞、多形核細(xì)胞(PMN)和巨噬細(xì)胞)的吞噬活性的作用顯著促進(jìn)這種修復(fù)。另一方面，如果免疫系統(tǒng)受到毒性試劑或者破壞性試劑的過(guò)度刺激，或其自身產(chǎn)生了病理性增強(qiáng)的免疫應(yīng)答，則給藥溶菌酶二聚體可通過(guò)包括例如降低危險(xiǎn)的高腫瘤壞死因子(TNF)水平、使高熱降低至正常體溫、和/或降低生物體系中存在的各種已知形式的游離氧化基(包括氧、羥基和氧化氮基)的血液或血清濃度的作用平息壓倒性的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療患有生育力失調(diào)疾病的雌性個(gè)體的方法，所述生育力失調(diào)可能是例如由產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎癥引起的，這經(jīng)常發(fā)生在家養(yǎng)動(dòng)物特別是母牛身上。在體內(nèi)研究中可以證明，子宮內(nèi)滴注溶菌酶二聚體組合物降低了內(nèi)源性前列腺素的活性。并且，與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，在用溶菌酶二聚體處理過(guò)的母牛身上觀察到了卵巢濾泡的更快成熟、更快的黃體化和與雌二醇水平升高同時(shí)發(fā)生的P-4孕酮水平的更快下降。這些動(dòng)態(tài)變化與前列腺素F2生成的迅速降解一起發(fā)生效用，溶菌酶二聚體處理過(guò)的母牛能比對(duì)照組的母牛早大約11±3天恢復(fù)動(dòng)情周期。
本發(fā)明還涉及溶菌酶二聚體在制備將用于前述目的的藥物組合物中的用途。溶菌酶二聚體優(yōu)選以約0.005-5mg/kg的單劑或多劑對(duì)人或動(dòng)物個(gè)體給藥，更好是約0.01-1mg/kg體重，分別相當(dāng)于約0.07-70或0.14-14μg溶菌酶二聚體每毫升人個(gè)體血液(以70公斤的人有5升血液為基礎(chǔ)計(jì)算)。有利的是，該藥物以含有0.01-10mg/ml、優(yōu)選0.1-0.5mg/ml(溶液)濃度的溶菌酶二聚體的注射溶液形式給藥。
更優(yōu)選所應(yīng)用的溶菌酶二聚體是通過(guò)溶菌酶單體的蛋白交聯(lián)得到的二聚產(chǎn)物，它含有大約10重量％或更少的不需要的副產(chǎn)物，特別是單體和寡聚形式的溶菌酶。溶菌酶單體優(yōu)選從雞蛋中提取，不過(guò)也可能從其他天然來(lái)源包括人、動(dòng)物、植物和微生物中獲得，或者可以利用化學(xué)合成或基因工程方法生產(chǎn)。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“Lydium-KLP”是指一種液體組合物，優(yōu)選為注射溶液，它包含適宜的溶劑、適宜的防腐劑、以及作為活性藥物的溶菌酶二聚體，該溶菌酶二聚體是經(jīng)雞蛋白溶菌酶的化學(xué)交聯(lián)得到的，其在該組合物中的濃度為0.01-10mg/ml，優(yōu)選為0.1-0.5mg/ml(溶液)。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1顯示了在不同濃度的溶聚酶二聚體的存在下受精的卵母細(xì)胞的發(fā)育情況(如下文實(shí)施例6中所述)。
為了能更全面地理解本文所描述的發(fā)明，現(xiàn)給出下列實(shí)施例。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的而不在任何方面限制本發(fā)明。
實(shí)施例1溶菌酶二聚體對(duì)精液保藏的作用有關(guān)溶菌酶二聚體作用的研究利用在低溫下保存的公豬精液來(lái)進(jìn)行。試驗(yàn)在臨床條件下用六只不同種的公豬進(jìn)行一只“Duron”豬，三只“Hampshire”豬，一只“Pietrain”豬和一只“WBP”豬。將這些動(dòng)物用于人工授精，每星期一次。
新鮮的精液采集后立即用溶菌酶二聚體處理，劑量為1、2和4μg每1ml精液。對(duì)所有試驗(yàn)階段中的精液進(jìn)行充分測(cè)試，即，在向精液中加入溶菌酶二聚體之前和之后，在精液冷凍之前和融化后，都要進(jìn)行測(cè)試。分析測(cè)定下列因子精子濃度、具有正?；顒?dòng)性的精子的比例、精子的形態(tài)(包括頂體)、以及在各種稀釋劑和各種溫度下的存活率。生化測(cè)定包括GOT(谷草轉(zhuǎn)氨酶)、頂體蛋白、透明質(zhì)酸酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶。使用以下冷凍保藏方法a)球體法，b)在5ml塑料圓管中冷凍，和在7ml平管中冷凍。表1、2和3中顯示了初步結(jié)果。
表1顯示，與對(duì)照組不同，當(dāng)4μg溶菌酶二聚體加入到1ml新鮮精液中時(shí)，在5℃下平衡后，具有正?；顒?dòng)性的精子的比例平均升高了10％；精液融化后，平均升高了15％。
表2顯示了溶菌酶二聚體(4μg每1毫升精液)對(duì)帶有在保藏過(guò)程中被破壞的頂體的精子比例的影響。在實(shí)驗(yàn)樣品中，精子中被破壞的頂體的比例明顯低于對(duì)照樣品(未加溶菌酶二聚體)。
表3顯示了在各個(gè)試驗(yàn)階段的GOT活性測(cè)定結(jié)果。我們注意到，溶菌酶二聚體減少了精液融化后酶從精子的釋放(平均429U每109個(gè)精子)，由此表明精子細(xì)胞發(fā)生破壞的情況少了。表1在不同的低溫保藏公豬精液的方法中，溶菌酶二聚體(4μg/ml精液)對(duì)具有正?；顒?dòng)性的精子比例的影響
表2在不同的低溫保藏公豬精液的方法中，溶菌酶二聚體(4μg/ml精液)對(duì)帶有破壞的頂體的精子比例的影響
表3在不同的低溫保藏公豬精液的方法中，溶菌酶二聚體(4μg/ml精液)對(duì)GOT活性(U/109精子)的影響
上述研究的有利結(jié)果表明，溶菌酶二聚體可以成功地用于保藏動(dòng)物或人的精液。
實(shí)施例2溶菌酶二聚體(KLP-602)對(duì)動(dòng)物精子保藏的作用研究利用不同雄性家養(yǎng)動(dòng)物(6只公豬，5只狗，5只公羊和4只雄鹿)的精液進(jìn)行。在采集了新鮮的精液后并在保存前，直接向其中加入溶菌酶二聚體制劑，劑量如下1、2、4、5、10、15和20μg/ml精液。在所有試驗(yàn)階段(向精液中加入溶菌酶二聚體之前和之后，就在精液冷凍之前和融化之后)對(duì)精液進(jìn)行詳細(xì)檢驗(yàn)，包括測(cè)定精子濃度、適當(dāng)運(yùn)動(dòng)的精子比例、精子(包括頂體)的形態(tài)、在不同稀釋劑和溫度下的存活率。生化研究包括測(cè)定GOT、透明質(zhì)酸酶以及酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性。精液的冷凍采用不同的超低溫保護(hù)法進(jìn)行，諸如在顆粒、吸管(0.25ml)、5ml圓管和1.7ml平管中冷凍。對(duì)于所有動(dòng)物來(lái)說(shuō)，向1ml新鮮精液中加入4-10μg溶菌酶二聚體，使得精液融化后具有前進(jìn)活動(dòng)性的精子實(shí)際增加了，而受破壞的頂體數(shù)降低了，GOT從保藏的精子中的釋放也減少了。所得結(jié)果表明，在不同雄性動(dòng)物的新鮮精液中加入溶菌酶二聚體可以穩(wěn)定在低溫下保藏時(shí)精子的細(xì)胞膜。
實(shí)施例3溶菌酶二聚體在公豬精子減少癥的治療中的效能該試驗(yàn)用一只六歲的公豬進(jìn)行，這只公豬已持續(xù)1.5個(gè)月出現(xiàn)精子減少癥狀，并且因右睪丸萎縮導(dǎo)致形態(tài)改變的精子比例很高。給這只公豬肌內(nèi)注射10ml含有作為活性成分的2mg溶菌酶二聚體的Lydium-KLP，相當(dāng)于每公斤動(dòng)物體重大約0.020mg劑量。
治療前，每單位體積精液中的精子濃度從145.000/mm3逐漸下降到65.000/mm3，形態(tài)改變的精子從25％增至50％(平均為40％)。注射Lydium-KLP 51天后，精子濃度從100.000/mm3升高至150.000/mm3，形態(tài)改變的精子在18％至21％的范圍內(nèi)(平均為19.5％)。由此可以得出結(jié)論Lydium-KLP看來(lái)在動(dòng)物或人精子減少癥的治療中是一種有效的藥劑。
實(shí)施例4溶菌酶二聚體對(duì)精子存活的影響該實(shí)施例描述了溶菌酶二聚體對(duì)公豬和公牛精子的生存和生物活性的影響。該研究包括進(jìn)行下列測(cè)定—測(cè)定將溶菌酶二聚體加入未經(jīng)保存的公豬和公牛的新鮮精液中產(chǎn)生的影響；—測(cè)定溶菌酶二聚體對(duì)這些雄性動(dòng)物精液的低溫保藏過(guò)程的影響；以及—溶菌酶二聚體藥物組合物(Lydium-KLP)給藥對(duì)精液質(zhì)量差的公牛和公豬的受精能力的影響。
該研究用75只公豬和65頭公牛以及它們的精液進(jìn)行。
a)體外研究研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，加入新鮮精液中的溶菌酶二聚體的最有效劑量是5μg每1ml精液。較低的劑量，例如1μg/ml和3μg/ml(精液)，具有降低的生物活性或沒(méi)有生物活性。與此類(lèi)似，高于5μg/ml(精液)的劑量也未產(chǎn)生明確的、可重復(fù)的生物效應(yīng)。因此，在該研究中，向每1ml新鮮精液中加入5μg溶菌酶二聚體。
在新鮮精液(沒(méi)有讓該精液經(jīng)受隨后的冷凍步驟)中加入溶菌酶二聚體，使得公豬精子的存活時(shí)間與對(duì)照樣品相比平均延長(zhǎng)了約6.8±1.5小時(shí)，公牛的平均延長(zhǎng)了約3±1.2小時(shí)。
類(lèi)似地，向進(jìn)行了低溫保藏并在液氮(-196℃)中儲(chǔ)存了30天然后解凍的精液中加入5μg溶菌酶二聚體，對(duì)精子存活時(shí)間的延長(zhǎng)產(chǎn)生了有利影響，與類(lèi)似的對(duì)照樣品相比，所檢驗(yàn)的精液中精子存活時(shí)間延長(zhǎng)了6-14小時(shí)。
此外，在用溶菌酶二聚體處理過(guò)的精液、特別是在公豬的精液中觀察到，具有正常活動(dòng)性的精子的比例比未經(jīng)處理的對(duì)照樣品中高大約10-15％。并且，具有主要缺損的精子的數(shù)目與未加入溶菌酶二聚體的類(lèi)似試驗(yàn)相比低大約20-25％。
另外，在用溶聚酶二聚體處理過(guò)的組中觀察到的、頂體被破壞的精子濃度的降低是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(P＜0.01)。此作用在公豬的精液中表現(xiàn)得尤其明顯在對(duì)照樣品中，頂體被破壞的精子的比例在35％至60％之間，而在實(shí)驗(yàn)樣品中此比例不超過(guò)28％。
而且，向經(jīng)過(guò)低溫保藏并融化的精液中加入溶菌酶二聚體使得精子的破壞統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少(P＜0.05)，這是利用釋放的轉(zhuǎn)氨酶(AspAT)測(cè)量的。與對(duì)照樣品相比，公豬精液中被破壞的細(xì)胞減少約65±8％，公牛精液中減少約48±11％。
體內(nèi)研究將精液質(zhì)量差(精液中精子濃度低，具有主要缺損和破壞頂體的細(xì)胞比例高，具有正常形態(tài)的的精子比例低)并因此而使生殖能力大大降低的20只公豬和15頭公牛用溶菌酶二聚體進(jìn)行處理以0.02mg溶菌酶二聚體每kg體重的劑量給動(dòng)物肌內(nèi)注射溶菌酶二聚體藥物組合物(Lydium-KLP)。該制劑以10天的間隔應(yīng)用三次。在從第一次給藥直到最后一次給藥后的第95天這段時(shí)間內(nèi)，每周檢驗(yàn)一次精液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lydium-KLP第一次給藥后40±5天(平均)，發(fā)育的公豬精液的鏡檢形態(tài)有了好的變化，公牛精液在50±4天后有好的變化，公豬的維持了最多48±6天，而公牛的維持了最多65±7天。這些變化表現(xiàn)在精子的濃度與0時(shí)的初始濃度相比升高了約25-40％，具有正?；顒?dòng)性的精子比例與0時(shí)的情況相比增加了10-26％。
也觀察到了有關(guān)帶有主要缺損的精子數(shù)目的顯著變化。在實(shí)驗(yàn)組中，它們的數(shù)目與對(duì)照組相比下降了大約20-30％。
c)生育力測(cè)試試驗(yàn)期間，用局部試驗(yàn)對(duì)用溶菌酶二聚體保護(hù)的公豬和公牛精液或者是從接受了Lydium-KLP治療的公豬和公牛得到的精液進(jìn)行生物學(xué)評(píng)估。研究用80只母牛和100只母豬進(jìn)行。結(jié)果顯示，利用加入了溶菌酶二聚體加以保護(hù)的精液授精的母牛的非重復(fù)因子(NR)為87.5±8％。在對(duì)照組母牛中該值為70±9％。在用溶菌酶二聚體保護(hù)的精液授精的母豬中該值為86±5％，而對(duì)照組的母豬該值為74±6％。
母豬使用如上所述已接受Lydisum-KLP治療的的公豬的精液授精后產(chǎn)生了非常好的生物作用。在這種免疫刺激之前，母豬用這些公豬的精液授精的效力從未超過(guò)35-40％；公豬利用前述溶菌酶二聚體治療進(jìn)行了免疫刺激之后，在實(shí)驗(yàn)期間授精效力升高至78-85％。
實(shí)施例5溶菌酶二聚體在動(dòng)物生育力受損的治療中的用途該實(shí)施例所描述的試驗(yàn)是為了證明和解釋溶菌酶二聚體對(duì)母牛子宮內(nèi)膜炎的治療活性和有關(guān)作用方式。
該研究利用120只患有產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎癥(產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎)的母牛進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組包括隨機(jī)選擇的60只母牛。對(duì)照組包括相同數(shù)目的母牛。使用一根導(dǎo)管對(duì)實(shí)驗(yàn)組的母牛子宮內(nèi)給藥存在于40-50ml 5％葡萄糖溶液中的2mg溶菌酶二聚體，對(duì)照組的母牛則滴注抗生素(Amoksiklav)。婦科學(xué)檢查考慮以下因素子宮和子宮頸的狀態(tài)，退化過(guò)程和結(jié)束期，子宮腔的充填—排放的量、特征和氣味，卵巢活性的測(cè)定。用來(lái)自各組(∑＝40只雌性)的20只母牛進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室檢查包括測(cè)定細(xì)胞免疫的各個(gè)因子，這使用胚芽轉(zhuǎn)化試驗(yàn)在LF-7的影響下進(jìn)行，按照Wrignt法進(jìn)行吞噬作用試驗(yàn)，硝基四唑藍(lán)(NBT)、酯酶藍(lán)的減少，測(cè)定體液免疫的免疫因子—總蛋白及其成分，白細(xì)胞型，測(cè)定卵巢周期的激素水平—孕酮(P-4)和雌二醇—以及PGF2α(PGFM)代謝物的活性。所采用的治療方法的效力在下列數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行估定從免疫因子檢驗(yàn)中得到的數(shù)值，PGF2α的動(dòng)力學(xué)變化，卵巢周期的孕酮水平，以及計(jì)算出的生育力指數(shù)，諸如從下仔到首次發(fā)情的周期長(zhǎng)度、妊娠指數(shù)、授精指數(shù)和受孕間期的長(zhǎng)度。
實(shí)驗(yàn)室研究顯示了靜脈注射Lydium-KLP對(duì)所分析的細(xì)胞免疫因子的數(shù)值的有益的免疫調(diào)制影響。在實(shí)驗(yàn)組的母牛中觀察到，滴注了Lydium-KLP之后的第3天和第5天之間，吞噬指數(shù)升高大約15-21％，吞噬活性和轉(zhuǎn)化能力平均升高約10-18％，丙種球蛋白成分顯著增加。在接受抗生素的對(duì)照組母牛中檢測(cè)到了免疫活性的變化，所檢驗(yàn)的各因子的數(shù)值表明了產(chǎn)后免疫小境(niche)的出現(xiàn)，其它研究中的母牛也觀察到了這一現(xiàn)象。
子宮內(nèi)滴注Lydium-KLP降低了作為PGFM測(cè)定的內(nèi)源性前列腺素的活性。在溶菌酶二聚體應(yīng)用后的2-5小時(shí)之間看到了該參數(shù)的動(dòng)力學(xué)顯著變化。其活性與滴注Lydium-KLP之前觀測(cè)到的數(shù)值相比下降了約70-85％。
在靜脈注射了Lydium-KLP的母牛中，與對(duì)照組的母牛的類(lèi)似變數(shù)相比，卵巢濾泡更早成熟，更早黃體化，P-4水平下降更快。在P-4水平變化的同時(shí)觀察到了血液中雌二醇的動(dòng)力學(xué)改變。它們的增加與P-4的消失動(dòng)力學(xué)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)組母牛的這些變化以及他們更快的速率產(chǎn)生的作用是，實(shí)驗(yàn)組母牛比對(duì)照組母牛早大約11±3天進(jìn)入動(dòng)情周期。
所觀察到的前列腺素F2生成的動(dòng)力學(xué)變化，特別是它的迅速消失，看來(lái)是Lydium-KLP在母牛子宮內(nèi)膜炎治療中的有益的活性作用的結(jié)果。血液中孕酮和雌二醇水平的動(dòng)力學(xué)變化將證實(shí)這些評(píng)論。
實(shí)施例6溶菌酶二聚體(KLP-602)對(duì)牛卵細(xì)胞(卵母細(xì)胞)成熟和體外受精的作用進(jìn)行以下試驗(yàn)A.測(cè)定不同的溶菌酶二聚體濃度對(duì)牛卵細(xì)胞(卵母細(xì)胞)的成熟和體外受精的作用。
B.評(píng)估溶菌酶二聚體對(duì)多形核細(xì)胞(PMN)或淋巴細(xì)胞與卵母細(xì)胞成熟以及早期胚胎發(fā)育之間相互關(guān)系的影響。
C.測(cè)定在卵母細(xì)胞的體外受精過(guò)程中存在不同濃度的溶菌酶二聚體對(duì)隨后的胚胎發(fā)育的影響。
結(jié)果Ad A.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分別在0.1-100μg溶菌酶二聚體每毫升細(xì)胞或組織培養(yǎng)物懸液范圍內(nèi)的所有測(cè)試的溶菌酶二聚體濃度都削弱了卵丘膨脹(粘液化)，而卵母細(xì)胞成熟速率的下降僅在更高的物質(zhì)濃度，即高于10μg溶菌酶二聚體/ml的濃度下才觀察到。雖然在不超過(guò)10μg/ml的溶菌酶二聚體濃度下也觀察到了對(duì)卵丘粘液化的削弱作用，但其對(duì)卵母細(xì)胞的成熟具有非常有益的影響。有關(guān)在不同溶菌酶二聚體濃度下成熟卵母細(xì)胞的體外受精和胚胎發(fā)育的結(jié)果顯示，當(dāng)使用10μg/ml濃度的溶菌酶二聚體時(shí)，培養(yǎng)36小時(shí)后，受精率和達(dá)到中期第II階段的卵母細(xì)胞數(shù)有最大增加。并且，當(dāng)在0.1-10μg溶菌酶二聚體/ml的存在下發(fā)生受精時(shí)，達(dá)到桑椹胚和胚泡階段的受精卵細(xì)胞的比例明顯更高。
Ad.B.PMN在RPMI-1640培養(yǎng)基(或者加入了LPS和溶菌酶二聚體，或者沒(méi)有加入這些物質(zhì))中培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)基(上清液)并在-80℃下冷凍直至使用。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，淋巴細(xì)胞在加入了ConA、PHA和溶菌酶二聚體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后如上所述收集培養(yǎng)基并儲(chǔ)存。進(jìn)行各種試驗(yàn)，評(píng)估以下內(nèi)容
B.I.來(lái)自PMN培養(yǎng)物的不同濃度的上清液對(duì)卵母細(xì)胞成熟的作用。結(jié)果顯示，來(lái)自在溶菌酶二聚體的存在下培養(yǎng)的LPS刺激的PMN的上清液顯著提高了卵母細(xì)胞成熟速率。
B.II.105個(gè)LPS刺激的或未刺激的PMN在溶菌酶二聚體的存在下的協(xié)同培養(yǎng)對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在所使用的實(shí)驗(yàn)條件下，向LPS活化的PMN中加入溶菌酶二聚體對(duì)牛卵母細(xì)胞的體外成熟具有消極作用。該作用似乎表明由PMN細(xì)胞產(chǎn)生的某些影響卵母細(xì)胞成熟的因子增加了。
B.III.來(lái)自PMN培養(yǎng)物的上清液(與B.I.中公開(kāi)的類(lèi)似)對(duì)體外卵母細(xì)胞成熟、受精和隨后的胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成熟培養(yǎng)基中以2.5％ v/v的濃度加入在溶菌酶二聚體的存在下生長(zhǎng)的LPS刺激的PMN細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，對(duì)卵母細(xì)胞的受精和胚胎的發(fā)育具有有益作用。
B.IV.從在ConA、PHA和溶菌酶二聚體的存在下生長(zhǎng)的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)物得到的上清液對(duì)卵母細(xì)胞成熟、受精和隨后的胚胎發(fā)育的作用。結(jié)果顯示，在成熟培養(yǎng)基中加入濃度為10％ v/v的上清液對(duì)卵母細(xì)胞的受精和隨后的胚胎發(fā)育具有有益作用。在加入了溶菌酶二聚體培養(yǎng)的用ConA或PHA刺激的淋巴細(xì)胞中該作用較低。
Ad.C.在卵母細(xì)胞發(fā)生受精的培養(yǎng)基中加入濃度為10μg/ml的溶菌酶二聚體對(duì)在體外得到的胚胎質(zhì)量具有有益影響。尚待澄清的是此作用是該物質(zhì)影響與受精過(guò)程有關(guān)的卵母細(xì)胞的結(jié)果還是影響精子的結(jié)果。
總的來(lái)說(shuō)，我們發(fā)現(xiàn)，按照不同的實(shí)驗(yàn)方案，當(dāng)以低濃度使用溶菌酶二聚體時(shí)，對(duì)體外牛卵母細(xì)胞的成熟、它們的受精和隨后的胚胎發(fā)育顯示出了有益作用。
實(shí)施例7溶菌酶二聚體(KLP-602)對(duì)真核細(xì)胞生存的影響該研究針對(duì)原代雞胚成纖維細(xì)胞以及傳代細(xì)胞系CC81(他養(yǎng)貓細(xì)胞系)、TBTR(牛氣管細(xì)胞)和MDBK(牛腎細(xì)胞)進(jìn)行。該研究的主要目的是對(duì)比各細(xì)胞系在加入了或沒(méi)有加入溶菌酶二聚體的無(wú)血清的Parker培養(yǎng)基中的存活時(shí)間。
原代雞胚成纖維細(xì)胞和傳代細(xì)胞系按照病毒學(xué)中使用的常規(guī)方法進(jìn)行繁殖。簡(jiǎn)單地說(shuō)是
a)原代雞胚成纖維細(xì)胞將9-10天大的胚胎切成小片，通過(guò)用pH7.5的在鹽水溶液中的稀釋胰蛋白酶(0.25％)處理并攪拌而使其分離成單個(gè)細(xì)胞的懸液。拋棄第一次提取物而保留后來(lái)的提取物。通過(guò)離心和洗滌除下細(xì)胞，然后將它們?cè)谘?xì)胞計(jì)數(shù)器室中計(jì)數(shù)，并用生長(zhǎng)培養(yǎng)基(組成見(jiàn)下文)稀釋至濃度約為2.5×105細(xì)胞/ml。將該細(xì)胞懸液分配到適宜的培養(yǎng)管(Roux扁瓶和/或試管)中并保持在37℃下。通常在24小時(shí)后，當(dāng)獲得了單層培養(yǎng)物時(shí)，去掉生長(zhǎng)培養(yǎng)基，該單層培養(yǎng)物用犬瘟病毒接種，洗滌并覆蓋上包含溶菌酶二聚體的維持培養(yǎng)基(組成見(jiàn)下文)。
b)傳代細(xì)胞系瓶子上的單層培養(yǎng)物利用胰蛋白酶消化而傳代培養(yǎng)(胰蛋白酶Difco 0.5％，維爾烯鈉0.02％)。將這些細(xì)胞懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，一旦獲得了單層培養(yǎng)物，就立即用維持培養(yǎng)基替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。進(jìn)行了病毒接種后，將該細(xì)胞懸液分配到玻璃管中。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基Eagle極限必需培養(yǎng)基，其中添加了沒(méi)有碳酸氫納的Hanks鹽和L-谷酰胺(Sigma)；4-8％wt.的(根據(jù)所使用的細(xì)胞培養(yǎng)物而定)胎牛血清(Sigma；在58℃下滅活30分鐘)；抗生素(100U/ml的青霉素，100μg/ml的硫酸二氫鏈霉素，2.5μg/ml的兩性霉素B，100×泰樂(lè)菌素)。
維持培養(yǎng)基Parker 199培養(yǎng)基(Biofactory of Sera and Vaccines，Lublin，Poland)；抗生素(與生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的相同)。
藥物毒性在細(xì)菌學(xué)試管(每種藥物溶液6管)和塑料平板(每種溶液用8個(gè)孔)中評(píng)估溶菌酶二聚體(KLP 602)和己酮可可豆堿對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的毒性。這些加有培養(yǎng)物的平板在一個(gè)有二氧化碳的濕潤(rùn)房間中保持在37℃下。在光學(xué)顯微鏡(一種單筒顯微鏡或反向顯微鏡)下檢查藥物對(duì)細(xì)胞的作用。
細(xì)胞活力的評(píng)定融合的單層培養(yǎng)物通過(guò)胰蛋白酶消化而分離，將其離心，該細(xì)胞懸液用中性紅染色。在Burker室中計(jì)算細(xì)胞的數(shù)目。
病毒1、狗細(xì)小病毒的減毒株BMD(Lublin，Poland)2、犬瘟病毒的BP1和BP2毒株(Pulawy，Poland)血細(xì)胞凝集用懸浮于加有0.1％牛白蛋白的Sorensen緩沖劑(pH5.8)中的豬的紅細(xì)胞進(jìn)行。在該研究中使用1-1000μg/ml范圍內(nèi)的不同濃度的溶菌酶二聚體(表4，4a，4b，4c)。
我們從實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶菌酶二聚體以1-25μg每毫升細(xì)胞培養(yǎng)物懸液之間的濃度使用時(shí)，不僅對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，而且顯著延長(zhǎng)了細(xì)胞的存活時(shí)間這些細(xì)胞維持未改變的單層培養(yǎng)物形式的時(shí)間比未經(jīng)處理的對(duì)照品長(zhǎng)了2-8天(表4)。當(dāng)以更高的濃度使用溶菌酶二聚體時(shí)，它似乎對(duì)真核細(xì)胞有輕微毒性(從死細(xì)胞數(shù)的增加和經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化得出該結(jié)論)，但在所測(cè)試的溶菌酶二聚體的整個(gè)濃度范圍(即1-1000μg每毫升細(xì)胞培養(yǎng)物懸液)內(nèi)，它仍保持了其較高的細(xì)胞生命延長(zhǎng)活性(表4a，4b)。
在接觸了不同濃度的溶菌酶二聚體和固定濃度的己酮可可豆堿的病毒感染的動(dòng)物細(xì)胞中也觀察到了這種真核細(xì)胞生命延長(zhǎng)作用(表4c)。有趣的是，在該細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)中，在所用溶菌酶二聚體的最高劑量(即1000μg每毫升細(xì)胞培養(yǎng)物)下觀察到了對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的極強(qiáng)的作用。在這些實(shí)驗(yàn)中達(dá)到的細(xì)胞生命延長(zhǎng)系數(shù)至少為1.3(＝與對(duì)照相比細(xì)胞生存時(shí)間延長(zhǎng)了30％)，最多不超過(guò)1.67(＝延長(zhǎng)了67％)。表4溶菌酶二聚體(KLP-602)對(duì)真核細(xì)胞系在無(wú)血清的Parker 199培養(yǎng)基中的存活的影響
*＝未確定的；**＝出現(xiàn)毒性作用表4a溶菌酶二聚體(KLP-602)對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞在無(wú)血清的Parker199培養(yǎng)基中的存活的影響
+ 微小的毒性改變++ 有毒性改變的灶+++ 明顯的毒性改變BZ 細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有改變表4b溶菌酶二聚體(KLP-602)對(duì)CC81細(xì)胞系在無(wú)血清的Parker 199培養(yǎng)基中的存活的影響
表4c不同劑量的溶菌酶二聚體(KLP-602)結(jié)合10μg/ml的己酮可可豆堿對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞和CC81細(xì)胞的病毒感染的培養(yǎng)物在無(wú)血清的Parker 199培養(yǎng)基中的存活的影響
T＝藥物的毒性作用；NB＝未確定的感染用犬瘟病毒和狗細(xì)小病毒進(jìn)行；對(duì)照(CCID50/ml)的病毒效價(jià)為103.25(犬瘟病毒)/105.0(狗細(xì)小病毒)在相當(dāng)?shù)臈l件下用其它細(xì)胞進(jìn)行研究，特別是用萊迪希氏細(xì)胞和類(lèi)似的巨噬細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)了前述結(jié)論。它們還顯示用溶菌酶二聚體處理后，細(xì)胞的DNA含量和蛋白質(zhì)合成增加了。不過(guò)，尚未完全弄清楚溶菌酶二聚體是怎樣與真核細(xì)胞、特別是與哺乳動(dòng)物的免疫活性細(xì)胞相互作用來(lái)干涉細(xì)胞程序死亡(即遺傳預(yù)定的“編程性”細(xì)胞死亡)的。雖然如此，但迄今為止所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在所觀察到的溶菌酶二聚體對(duì)真核細(xì)胞的抗老化作用方面仍然是非常令人興奮的，這些結(jié)果對(duì)實(shí)踐的暗示可能還未完全預(yù)測(cè)出來(lái)。
權(quán)利要求
1.溶菌酶二聚體在制備用于預(yù)防性干預(yù)或治療動(dòng)物或人的生育力損害的藥物組合物中的用途。
2.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述預(yù)防性干預(yù)或治療包括改善下列的至少一種生育力參數(shù)精液的質(zhì)量，卵細(xì)胞的成熟，胚胎的發(fā)育。
3.按照權(quán)利要求1或2的用途，其中所述預(yù)防性干預(yù)或治療包括改善下列的至少一種精液質(zhì)量因子精子活力的持續(xù)時(shí)間，精子的活動(dòng)性，精子的膜穩(wěn)定性，頂體的保護(hù)，形態(tài)正常的精子的濃度，精液中精子的總數(shù)。
4.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述損害受到下列至少一種疾病的影響或由其引起免疫疾病、激素紊亂、代謝疾病，而其中的免疫疾病可選地包括一種子宮炎癥。
5.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述生育力損害是由精子減少導(dǎo)致的。
6.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述預(yù)防性干預(yù)或治療包括調(diào)制下列至少一種參數(shù)細(xì)胞免疫，吞噬活性，細(xì)胞因子水平，激素水平。
7.按照權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物組合物包含適量的溶菌酶二聚體，其量適于將所述溶菌酶二聚體以約0.005-5、優(yōu)選約0.01-1mg溶菌酶二聚體每kg體重的單劑或多劑、或者以約0.07-70、優(yōu)選0.14-14μg溶菌酶二聚體每ml血液的單劑或多劑對(duì)人或動(dòng)物個(gè)體給藥。
8.按照權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的用途，其中所述組合物為含有濃度為0.01-10mg/ml、優(yōu)選0.1-0.5mg/ml溶液的溶菌酶二聚體的液態(tài)溶液形式。
9.按照權(quán)利要求1或2的用途，用于改善卵細(xì)胞的成熟和/或胚胎發(fā)育，其中所述預(yù)防性干預(yù)或治療包含在卵細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中添加有效量的溶菌酶二聚體，優(yōu)選為約1-10μg溶菌酶二聚體每ml成熟培養(yǎng)基。
10.溶菌酶二聚體用于改善真核細(xì)胞、特別是動(dòng)物或人的生殖細(xì)胞的保藏的用途，和/或用于延長(zhǎng)真核細(xì)胞生命的用途，是通過(guò)將真核細(xì)胞在溶菌酶二聚體的存在下、優(yōu)選在0.1-50μg溶菌酶二聚體每ml含有所述細(xì)胞的懸液的存在下培養(yǎng)或儲(chǔ)存而實(shí)現(xiàn)的。
11.按照權(quán)利要求10的用途，用于延長(zhǎng)細(xì)胞生命，使延長(zhǎng)系數(shù)至少不超過(guò)1.3，優(yōu)選系數(shù)不超過(guò)1.67。
12.按照上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的用途，其中所述溶菌酶二聚體是溶菌酶單體的交聯(lián)二聚產(chǎn)物，它含有約10重量％或更少的不期望的副產(chǎn)物，特別是單體和寡聚物形式的溶菌酶。
13.一種用于改善真核細(xì)胞、特別是動(dòng)物或人的生殖細(xì)胞的保藏的方法，和/或用于延長(zhǎng)真核細(xì)胞生命的方法，其中該方法包括在溶菌酶二聚體的存在下、優(yōu)選在0.1-50μg溶菌酶二聚體每ml含有所述細(xì)胞的懸液的存在下儲(chǔ)存或培養(yǎng)所述細(xì)胞。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其中所述保藏包括一個(gè)冷凍步驟，且其中溶菌酶二聚體加入到真核細(xì)胞中，優(yōu)選在細(xì)胞經(jīng)歷冷凍步驟之前加入，加入量為0.1-20μg，優(yōu)選為約1-4μg每1ml含有所述細(xì)胞的懸液。
15.一種用于改善卵細(xì)胞成熟和/或胚胎發(fā)育的方法，其特征在于它包含在卵細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中添加有效量的溶菌酶二聚體，優(yōu)選為約1-10μg溶菌酶二聚體每ml成熟培養(yǎng)基。
16.按照權(quán)利要求13-15任一項(xiàng)所述的方法，其中所述溶菌酶二聚體是溶菌酶單體的交聯(lián)二聚產(chǎn)物，它含有約10重量％或更少的不期望的副產(chǎn)物，特別是單體和寡聚物形式的溶菌酶。
17.一種用于預(yù)防或治療動(dòng)物或人的生育力損害的組合物，其特征在于該組合物包含足以以約0.005-5mg溶菌酶二聚體每kg體重的劑量、或者是0.07-70μg溶菌酶二聚體每ml血液的劑量對(duì)受治療的人或動(dòng)物給藥的適量溶菌酶二聚體。
18.按照權(quán)利要求17的組合物，它為含有濃度為0.01-10mg/ml、優(yōu)選0.1-0.5mg/ml溶液的溶菌酶二聚體的液態(tài)溶液形式。
19.一種用于保藏真核細(xì)胞、特別是動(dòng)物或人的生殖細(xì)胞的組合物，和/或用于延長(zhǎng)真核細(xì)胞生命的組合物，其特征在于它包含足以在0.1-50μg溶菌酶二聚體每1ml含有所述細(xì)胞的懸液的存在下培養(yǎng)或儲(chǔ)存所述細(xì)胞的適量的溶菌酶二聚體。
20.按照權(quán)利要求17-19任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于所述溶菌酶二聚體是溶菌酶單體的二聚產(chǎn)物，它含有約10重量％或更少的不期望的副產(chǎn)物，特別是單體和寡聚物形式的溶菌酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及二聚體形式的溶菌酶在提高受傷害動(dòng)物或人的生育力方面的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及動(dòng)物或人的生殖疾病的預(yù)防或治療以及溶菌酶二聚體在制備適于這類(lèi)應(yīng)用的藥物組合物中的用途。本發(fā)明也涉及改良的保存人或動(dòng)物細(xì)胞、特別是生殖細(xì)胞的方法和延長(zhǎng)真核細(xì)胞壽命的方法。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1307480SQ99807938
公開(kāi)日2001年8月8日 申請(qǐng)日期1999年4月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月27日
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