專利名稱：鯊魚軟骨的低分子量成分、其制備方法及其治療應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由鯊魚軟骨提取的低分子量成分及其制備方法。本發(fā)明還涉及在多種條件下分離和純化該軟骨提取物的方法。上述低分子量成分表現(xiàn)出至少一種的抗基質(zhì)金屬蛋白酶(抗MMP)、抗血管生成和抗腫瘤活性。
國際專利申請公開WO95/32722、WO96/23512和WO97/16197中公開了制備鯊魚軟骨提取物的方法以及這些提取物本身。在多種實驗中測試了鯊魚軟骨的液體提取物的抗血管生成、抗溶膠原、直接抗腫瘤增殖和抗炎作用。
WO95/32722公開了一種獲得具有抗血管生成、體外直接抗腫瘤增殖和體內(nèi)抗腫瘤活性的鯊魚軟骨提取物的方法。該方法包括將鯊魚軟骨組織混合并且將其在水中的粒度減小至約500μm；將活性成分提取到水中；并且分餾由此得到的提取物回收分子量小于約500kDa的分子(0-500餾分)。在公稱孔隙率約為1kDa的膜上濃縮該液體軟骨提取物，生成含有分子量低于約500kDa的分子的濃縮液體提取物。該提取物富集了分子量在約1-500kDa之間的分子。將0-500餾分進一步分餾生成多種含有分子量在約1-120kDa內(nèi)的抗腫瘤增殖分子的提取物。但專利申請公開WO95/32722沒有描述對分子量低于約1kDa的成分的具體回收。也未公開一種在含有機溶劑的溶液中獲得軟骨提取物或餾分本身的方法。
國際專利申請公開WO96/23512公開了一種用于在水溶液中由任何來源的軟骨提取生物活性成分的方法。此外，該專利申請公開了與液體鯊魚軟骨有關(guān)的其他生物活性，也就是抗溶膠原和抗炎活性。專利申請公開WO96/23512既沒有公開分子量小于約1kDa成分的回收方法，也沒有公開任何應(yīng)用含有機溶劑溶液的方法。
國際專利申請公開WO97/16197公開了一種回收水提取物的方法，所述水提取物中富集分子量在約0.1至500kDa內(nèi)的分子。盡管該方法可以回收分子量小于約1kDa的成分。但它未提供任何有關(guān)特定低分子量成分的回收方法。也沒有公開已分離或純凈形式的成分。
現(xiàn)有技術(shù)普遍公認，基質(zhì)金屬蛋白酶參與新血管形成的過程，促進原發(fā)性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的形成。因此，具有抗血管生成和/或抗基質(zhì)金屬蛋白酶的化合物或藥物適用于至少一種的抑制新血管形成、抑制腫瘤生長、抑制細胞的轉(zhuǎn)移侵染、抑制轉(zhuǎn)移的形成并且治療血管生成相關(guān)性疾病。
得自鯊魚軟骨的成分令人感興趣，需要改進其制備方法以及用于分離和純化其他具有生物活性的未知成分的方法。
本發(fā)明提供一種用于制備由鯊魚軟骨獲得的提取物的改進方法。
在一個方面中，本發(fā)明提供了一種方法，其中采用多種條件制備軟骨提取物及其含有生物活性成分的餾分。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于制備含有至少具備抗MMP的活性成分的鯊魚軟骨提取物的方法。
另一方面中，本發(fā)明提供一種方法，通過該方法衍生自軟骨液體提取物的生物活性成分的0-500分子量餾分被分離為兩個單獨餾分，其中第一餾分含有分子量小于1kDa(0-1餾分)的成分，并且第二餾分含有分子量在1-500kDa(1-500餾分)內(nèi)的成分。
為了將組分聚集物的形成減至最小，為提高溶解和維持穩(wěn)定可溶的形式，蔗糖或一種或多種其他適當穩(wěn)定劑如葡聚糖、FocollTM(蔗糖和表氯醇共聚物)、果糖、明膠、葡萄糖、甘氨酸、肌醇、乳糖、甘露糖醇和山梨糖醇可以以充分穩(wěn)定的量加入任何0-500、0-1和1-500餾分中，或可應(yīng)用在制備過程的任何步驟中。在此有關(guān)餾分、溶液或提取物所用的術(shù)語“含有1％w/v蔗糖”是指含有約1％w/v蔗糖的各個餾分、溶液或提取物。0-1和1-500餾分中的生物活性成分具有抗MMP、抗血管生成和抗腫瘤活性。
另一方面，本發(fā)明提供一種分子量約為244amu(原子質(zhì)量單位)的鯊魚軟骨衍生成分，在此稱作I-E-986，該成分具有至少一種的抗MMP和抗腫瘤活性。用于純化I-E-986的方法和材料揭示出后者的一些物理化學特征，這些特征能夠使這種成分在不同的溶劑相和色譜體系中被區(qū)分出來。本發(fā)明還提供一種用于分離和純化I-E-986成分或由任何來源軟骨獲得的等效成分的方法。
本發(fā)明的另一方面提供衍生自任意來源的軟骨的純生物活性化合物，其相應(yīng)于由鯊魚軟骨分離的分子量約為244amu且具有抗MMP和抗腫瘤活性的化合物。
本發(fā)明的再一方面提供一種抑制MMP酶的方法，該方法包括將由被所述酶裂解的底物與有效量的一種或多種本發(fā)明的軟骨提取物或其衍生餾分或I-E-986成分相接觸的步驟。
本發(fā)明的又一方面提供一種抑制新血管形成和轉(zhuǎn)移形成的方法，所述方法包括使靶向組織與有效量的所述軟骨衍生提取物，溶液，勻漿，混懸液，餾分如0-500餾分、0-1餾分、1-500餾分或含有1％W.v蔗糖的相同餾分，或成分如成分I-E-986相接觸的步驟。


圖1a和1b描繪了在HPLCC18體系上利用甲酸銨緩沖液(pH7)和等度洗脫由測定I-E-986獲得的總離子色譜圖和單離子色譜圖(245M+1)。
圖2a和2b描繪了在HPLCC18體系上利用甲酸銨緩沖液(pH3)和梯度洗脫由測定I-E-986獲得的總離子色譜圖和單離子色譜圖(245M+1)。
圖3a和3b描繪了在HPLCC18體系上利用甲酸銨緩沖液(pH3)和等度洗脫由I-E-986分析獲得的總離子色譜圖和單離子色譜圖(245)。
圖4a和4b描繪在HPLCNH2體系上利用甲酸銨緩沖液(pH3)和梯度洗脫由I-E-986分析獲得的總離子色譜圖和單離子色譜圖(245)。
圖5描繪了I-E-986的MS/MS光譜，它表示損失相當于失去一個水分子的失去18amu(主峰m/e227.1)的光譜。
圖6描繪了離子227(245 M+1減去水分子)的特定碎片的MS/MS光譜。
利用至少一個下列分析試驗測定鯊魚軟骨提取物、其衍生餾分及其成分I-E-986的生物性質(zhì)·明膠酶抑制試驗(GIA)一種用于評價抗MMP活性的試驗；·胚胎血管形成試驗(EVT)一種評估抗血管生成活性的試驗；和·Lewis肺癌轉(zhuǎn)移小鼠模型(LLC)一種評估抗腫瘤活性的試驗。GIA采用市售試劑盒(Boehringer Mannheim)進行GIA。利用GIA測定所述軟骨衍生提取物中的成分、或其餾分或成分I-E-986抑制明膠酶，即一種酶(MMP-2)的能力。簡單而言，GIA按照以下方式進行。將生物素標記明膠底物與明膠酶A在液體軟骨提取物或其衍生物不存在或存在的條件下溫育。隨后，將反應(yīng)混合物加樣到鏈霉抗生物素涂層的微量滴定平板上。該生物素標記明膠通過其游離生物素殘基鍵合在鏈霉抗生物素涂層的微量滴定平板上。如果底物、明膠沒有被剪接，鏈霉抗生物素-過氧化物酶(POD)偶聯(lián)物可鍵合在明膠酶-生物素復合物上。隨后POD使加入的ABTS底物轉(zhuǎn)化為綠色終產(chǎn)物，其在405nm下測定。然而，如果生物素標記明膠被明膠酶剪接，則只有少量明膠片段形成。在附著在微量滴定平板上后，這些片段不具有與鏈霉抗生物素-POD偶聯(lián)物結(jié)合的能力；因此，不發(fā)生著色反應(yīng)。
所以，高明膠酶活性產(chǎn)生低信號，低明膠酶活性反而(例如通過加入抑制劑)引起高信號。在軟骨衍生提取物中的成分或其衍生餾分中尋找到的活性可以是明膠酶的抑制活性或是競爭明膠酶與其明膠底物之間的反應(yīng)的拮抗活性(例如拮抗成分結(jié)合明膠)。EVT
胚胎血管形成試驗(EVT)用來測定鯊魚軟骨液體提取物中的成分或其衍生餾分抑制新血管形成的能力(抗血管生成活性)。
雞胚胎的正常發(fā)育包括位于卵黃膜內(nèi)外部血管系統(tǒng)形成，卵黃膜由卵黃(蛋黃)運送營養(yǎng)物以發(fā)育胚胎。當置于卵黃膜上時，抗血管生成物質(zhì)可以抑制在卵黃膜內(nèi)發(fā)生的血管形成。
將含有不同量的得自鯊魚軟骨衍生液體提取物的成分，或其衍生餾分或適當對照物的甲基纖維素圓盤(惰性固體和透明基質(zhì))置于卵黃膜血管周邊的外緣上，在此發(fā)生血管生成過程。陽性對照是由含有1.5mg/ml2-甲氧基雌二醇的甲基纖維素圓盤構(gòu)成。將對照和含樣品圓盤置于3天齡胚胎的卵黃膜上。在這一點，只有主血管開始侵襲卵黃。同時將含有陰性對照或一定量的得自鯊魚軟骨衍生液體提取物的成分或其衍生物餾分的甲基纖維素圓盤始終置于同一胚胎的卵黃膜上。兩個圓盤以相對于胚胎頭尾軸對稱的方式放置，以便在對比所述成分和陰性對照的功效時減小個體之間的差異。在圓盤沉積后24小時評估血管形成，結(jié)果表示為其中血管形成受到影響的胚胎的百分比。當與陰性對照對比其生長途徑出現(xiàn)偏離或減弱或當在圓盤下觀察不到其生長時可以認為血管形成受到影響。LLC模型利用Lewis肺癌小鼠模型(LLC)測定鯊魚軟骨液體提取物的成分，或其衍生餾分或I-E-986抑制轉(zhuǎn)移在肺內(nèi)形成的能力。
細胞培養(yǎng)通過P.Brodt博士(Brodt.P，《癌癥研究》(Cancer Res.)，46:2442,1986)建立對肺具有高轉(zhuǎn)移潛能的Lewis肺癌結(jié)腸M27。這種模型易于建立并且公認它可預(yù)測體外和體內(nèi)活性之間的相關(guān)性。將細胞維持在RPMI-1640培養(yǎng)基中和5％CO2下，該培養(yǎng)基中補充有10％胎牛血清和1％青霉素-鏈霉素，并且每周傳代2次。生成細胞原液，將其作為早代保藏。所有試驗采用相同的傳代。為誘導腫瘤，M27細胞以70％融合率在完全培養(yǎng)基中生長，隨后用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶，存在于HBSS中的0.53mM EDTA-4Na，無Ca++或Mg++)收集。隨后將細胞離心，洗滌并且重新懸浮(1×106LLC細胞/200μl的PBS，無Ca++和Mg++)。通過臺盼(trypan)藍染色檢測成活力，并且只取其中存活率高于95％的燒瓶用于接種。
腫瘤的誘導采用C57B/10雌性小鼠(15至20g)(Charles river Inc.)誘導Lewis肺癌腫瘤。培育1周后，在第0天將LLC細胞皮下轉(zhuǎn)移(5×105活細胞/100μl)到右脅腹的腋區(qū)。所有動物在相同位置接種。用卡鉗每天監(jiān)測腫瘤的生長。利用下式計算相對腫瘤體積長度(cm)×[寬度(cm)]2/2，其中長度相當于腫瘤的縱軸且寬度相當于腫瘤的垂直最短軸。當原發(fā)性腫瘤的大小達到0.5-1.0cm3(接種10天后)，將具有大致相同尺寸的原發(fā)性腫瘤的小鼠隨機分成單獨試驗組，每組15只動物，用耳部穿孔法標記上編號。手術(shù)在滅菌條件下進行。在完成皮膚小切口(0.5-1cm)后，小心地將腫瘤與周圍健康組織分開。LLC細胞(處于生長的早期階段)可以形成良好的局部腫瘤，而且易于分離獲得，同時對正常組織無明顯損害。實體鏡試驗顯示，在腫瘤接種位置不存在任何可目測到的殘余腫瘤，并且在我們的條件下觀察不到腫瘤的再生長。取出后，將腫瘤稱重并且用手術(shù)不銹鋼夾閉合傷口，用吡咯烷酮(providone)-碘消毒。
效能研究試驗設(shè)計在取出腫瘤后當天(接種后11天)開始用不同的試驗樣品(衍生自試驗軟骨液體提取物的成分，其衍生餾分或I-E-986)處理。軟骨衍生產(chǎn)物的鹽水通過口飼管每天給藥2周?？陲暪?0.5ml)采用22G彎針進行。如上述試驗表明，在原發(fā)性腫瘤取出后約2周期間足以在肺表面獲得平均30-50個結(jié)節(jié)，2周后在CO2室內(nèi)處死動物。尸體解剖后，取出兩側(cè)的肺，稱重并且在10％布安氏固定劑中固定。用立體顯微鏡(4X)計數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移物。
體重的測量每2或3天監(jiān)測體重直至處死為止。制備軟骨提取物的方法用含有機溶劑的溶液由鯊魚軟骨提取活性成分本發(fā)明提供一種制備軟骨提取物和獲得、分離或純化其中生物活性成分的方法。其中至少一部分的生物活性成分不是蛋白性質(zhì)。然而，本發(fā)明的方法中可采用有效提取含蛋白成分的離液劑。
在此所用術(shù)語“含有機溶劑溶液”是指含有至少部分有機溶劑的溶液或混合物。該含有機溶劑溶液可以含有一種或多種有機溶劑并且可以含有水。在此所用的有機溶劑或有機溶劑的混合物優(yōu)選為極性。在一個實施方案中，甲醇和乙醇中的至少一種可以用來制備鯊魚軟骨液體提取物。其他有機溶劑如乙腈、丙醇、異丙醇和丙酮是可應(yīng)用的適當極性溶劑。所述有機溶劑可以包括一種或多種鹵代、醚、質(zhì)子、非質(zhì)子、極性、非極性、堿性、酸性、疏水性和親水性溶劑。
適用的鹵代溶劑包括氯仿、二溴甲烷、氯丁烷、二氯甲烷。
適用的醚溶劑包括二甲氧基甲烷、四氫呋喃、乙醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二甘醇二乙醚、三甘醇二甲醚、叔丁基乙基醚，或叔丁基甲基醚。
適用的質(zhì)子溶劑可以包括，例如但不限于甲醇、乙醇、2-硝基乙醇、2-氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、乙二醇、1-丙醇、2-丙醇、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、2-乙氧基乙醇、二甘醇、1-、2-或3-戊醇、新戊醇、叔戊醇、二甘醇一甲醚、二甘醇一乙醚、環(huán)己烷、苯甲醚、芐醇、苯酚或甘油。
適用的非質(zhì)子溶劑可以包括，例如但不限于二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺、N-甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亞砜、丙腈、甲酸乙酯、醋酸甲酯、丙酮、乙基甲基酮、乙酸乙酯、環(huán)丁砜、N,N-二甲基丙酰胺、四甲基脲、硝基甲烷、硝基苯，或六甲基磷酰胺。
適用的堿性溶劑包括2-、3-或4-甲基吡啶、吡咯、吡咯烷、嗎啉、吡啶或哌啶。
適用的酸性溶劑包括三氟乙酸、乙酸、丙酸或甲酸。
適用的烴類溶劑包括苯、環(huán)己烷、戊烷、己烷、甲苯、環(huán)庚烷、甲基環(huán)己烷、庚烷、乙基苯、辛烷、2,3-二氫化茚，壬烷，或萘。
含有機溶劑溶液可以含有有機溶劑的混合物和/或有機溶劑和水的混合物。適當?shù)馁|(zhì)子溶劑和水的混合物包括，例如但不限于水-甲醇、水-丙醇、水-異丙醇、水-丁醇。適當?shù)暮锌捎锌蔁o水的非質(zhì)子溶劑混合物可以包括，例如但不限于水-乙腈、水-二甲基亞砜、甲醇-乙腈、甲醇-二甲基亞砜、乙醇-乙腈，和乙醇-二甲基亞砜。
有機溶劑在本發(fā)明中的含量可以根據(jù)由軟骨提取的成分的本質(zhì)或物理性質(zhì)變化。通常，含有機溶劑溶液應(yīng)含有以總?cè)芤后w積計約1-100％v/v，約40-80％v/v，至少1％v/v，至少10％v/v，至少25％v/v，至少50％v/v，至少90％v/v或至少99％v/v的有機溶劑。
所以，本發(fā)明提供一種制備鯊魚軟骨的提取物的方法，該方法包括步驟a)用一定量的含有機溶劑溶液處理鯊魚軟骨原料，生成含有鯊魚軟骨的可溶成分的第一混合物；b)分離該第一混合物，生成含有該可溶成分的第一液體提取物和第一固體物；和c)由所述第一液體提取物除去有機溶劑。
所述方法可以進一步包括的步驟是d)由第一液體提取物除去足夠量的液體，生成基本上干燥的第二固體物；e)向該第二固體物加入水，生成第二混合物；和f)分離所述第二混合物，生成第一最終液體提取物和第三固體物。
用含有機溶劑溶液，或用水代替含有機溶劑的溶液，按照a)-c)所述步驟另外提取一次或多次含有鯊魚軟骨原料的第一固體物，生成含有至少剩余量的鯊魚軟骨可溶成分的第二和第三或進一步的最終液體提取物。
在步驟b)中，固體和液體的分離可以按照任何那些所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種方法進行，其中包括，例如但不限于離心、過濾、滲濾、超濾、微量過濾，和沉降固體并且除去上清液。
如步驟c)所述，有機溶劑的除去可以按照任何那些所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種方法進行，其中包括，例如但不限于蒸發(fā)、冷凍干燥、蒸餾、干燥、加入有機溶劑吸收劑、液/液提取和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。
本發(fā)明所用鯊魚原料應(yīng)是固體并且可以是，例如粉末、顆粒、棒狀或微粒。在步驟a)之前，可以將鯊魚原料均化。在此所用術(shù)語“均化”“勻漿”和“攪勻”是指一種提高由軟骨原料提取所需成分的功效的方法，可以通過a)增加軟骨原料的總表面或比表面，或b)促使軟骨原料釋放所需成分。均化可以通過一種或多種化學方法、物理方法及其組合來進行。
用于均化軟骨原料的化學方法包括一種或多種可溶脹軟骨、破裂或溶解軟骨原料內(nèi)的細胞或細胞外基質(zhì)，和/或提高軟骨原料的孔隙率的化學試劑。所述化學試劑的非限定實例包括洗滌劑、表面活性劑、離子性試劑、非離子試劑、還原劑、螯合劑、糖基化試劑、離液劑、脲、胍、磷脂、糖脂、二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉、三硝基甲苯溶液和其他所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的此類試劑，或由Judith Neugebauer公開在“洗滌劑在生物學和生物活性中的性質(zhì)和應(yīng)用指南”(Calbiochem-Novabiochem公司，1988)，該文獻在此引入作為參考。
用于均化軟骨原料的物理方法一般是使鯊魚原料的平均粒度減小，由此增加其比表面積。粒度的減小可以通過一種或多種以下例舉的方法來進行，其中包括粉碎、微粉化、碾磨、磨碎、截斷、高速下混合和其他所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于減小粒度的方法。
提取溶液可以含有提取增強劑，其可以增強由軟骨提取所述成分的提取作用。這些提取增強劑可包括無機或有機酸、無機或有機堿、聚合物、緩沖劑、鹽和其他所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類似試劑。
按照一個實施方案，由軟骨提取低分子量原料可以通過以下步驟進行a)用甲醇(1kg)處理均化的鯊魚軟骨原料(1kg)，生成含有鯊魚軟骨的可溶成分的第一混合物；b)將該第一混合物離心，生成含有所述可溶成分的第一液體提取物和第一固體物；c)蒸發(fā)該第一液體提取物中的甲醇；d)由該第一液體提取物蒸發(fā)足夠量的液體，生成基本上干燥的第二固體物；e)向該第二固體物中加入水(1kg)生成第二混合物；和f)將所述第二混合物離心生成第一最終液體提取物和第三固體物。上述步驟c)和d)可以任選地組合以使第一液體提取物直接生成第二固體物。
所有由上述步驟對鯊魚軟骨的提取和再提取獲得的液體提取物用來分析它們的干重內(nèi)容物和蛋白濃度(按照標準Bradford蛋白分析法測定)，作為回收的可溶成分的一個指示。另外評價其抗MMP活性。結(jié)果概括在表1中表1
如表1中所用，“CTRL”(對照樣本)是指當用純水作為提取溶劑時所得的最終液體提取物。術(shù)語“SU-MET”是指用甲醇作為含有機溶劑溶液所獲得的最終液體提取物。術(shù)語“SU-ETH”是指用乙醇作為含有機溶劑溶液所獲得的最終液體提取物?！癝1”、“S2”和“S3”分別是指用指定溶劑作為含有機溶劑溶液或用純水所獲得的第一最終液體提取物，第二最終液體提取物，和第三最終液體提取物。
結(jié)果證明，含水和非水的含有機溶劑溶液都可以用來回收鯊魚軟骨中至少具有抗MMP作用的生物活性成分。此外，通過連續(xù)-反復提取鯊魚軟骨的固體顆?？梢蕴崛〕銎溆嗷钚浴Ｍㄟ^干重試驗和蛋白質(zhì)回收率的測定，抗MMP活性和被分離原料的用量之間沒有明顯的直接相關(guān)性。軟骨和純水的比例對液體提取物制備的影響按照本發(fā)明的第一種實施方案，用水制備粗品液體提取物，其中軟骨(C)和純水(E)的比例分別約為1kg:1L?；厥粘煞值姆椒òú襟Ea)在水溶液中均化鯊魚軟骨直至軟骨粒度減小到平均粒度小于500μ，生成勻漿；b)令該勻漿平衡以使生物活性成分被萃取至該含水溶液中生成第一混合物，第一混合物包括第一固體物和含所述生物活性成分的第一液體提取物(LE)；c)由該第一固體物分離出第一液體提取物；d)對該第一液體提取物進行分離處理，生成含有分子量小于約500kDa的軟骨分子的第二液體提取物(LE-0-500)；e)經(jīng)孔隙率為0.22微米的微量過濾膜過濾該第二液體提取物，生成最終液體提取物(P-C1-E1，其基本上等效于0-500餾分)；本發(fā)明方法也采用了如下所示的不同軟骨和水的比例進行
*P是指在分離步驟中形成的滲透物分析所有按照上述方法制備的第一液體提取物的干重內(nèi)容物、蛋白質(zhì)濃度及其抗MMP活性。結(jié)果概括在表2中。表2
*GIA以30μl等份試樣的20X濃縮樣品進行這些結(jié)果表明，每1千克的鯊魚軟骨起始原料可以回收得到約20g的可溶成分。在特定條件下可溶成分的最大回收率是19.8(9.9×2)和18.9(6.3×3)g的可溶成分/千克鯊魚軟骨(P-C1-E2和P-C1-E3)。
這些結(jié)果還表明，利用不同的軟骨和純水比例可以有效回收干重內(nèi)容物、蛋白內(nèi)容物以及具有抗MMP活性的成分。
由P-C1-E1提取回收的第一固體物用相同的軟骨和純水比例再提取2次可以回收其中所含剩余量的成分。第一固體物的再提取方法包括以下步驟f)將由步驟c)回收的第一固體物用純水處理，生成第二混合物，將該混合物分離成為第二液體提取物(P-C1-E1-2)和第二固體物，其中可以按照步驟d)和e)處理該第二液體提取物；和，任選地g)對該第二固體物重復步驟f)，生成第三液體提取物(P-C1-E1-3)和第三固體物，其中可以按照步驟d)和e)處理該第三液體提取物。
表3概括了上述步驟a)至g)所用水和鯊魚軟骨的量。表3
分析所有由上述方法獲得的液體提取物的干重內(nèi)容物、蛋白質(zhì)濃度和抗MMP活性。結(jié)果概括在表4中。表4
*GIA以30μl等份試樣的20X濃縮樣品進行這些結(jié)果表明，按照上述步驟a)至c)一次或多次提取鯊魚軟骨可以獲得高回收率的鯊魚軟骨的可溶成分。此外，在將同一固體顆粒第二次和第3次提取后仍然可以提取到剩余量的具有抗MMP活性的成分。
對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員很顯然的是，改進提取參數(shù)，例如溫度、提取次數(shù)或提取溶劑，可以使回收固體、蛋白質(zhì)和生物活性成分的量最佳化。用于制備不同分子量部分的衍生自軟骨的成分的方法0-500餾分0-500餾分是含有分子量小于約500kDa的成分的鯊魚軟骨液體提取物。制備0-500餾分的方法概括在國際專利號WO95/32722、WO96/23512和WO97/16197，其相關(guān)公開內(nèi)容在此引入作為參考。這些現(xiàn)有技術(shù)的方法包括步驟a)在與保持軟骨中存在的生物活性成分的完整性相容的條件下將鯊魚軟骨在水溶液中均化直至該軟骨減小為粒度小于約500μm的固體顆粒；b)將該生物活性成分提取到該含水溶液中，得到固體微粒和含生物活性成分的粗品液體提取物(LE)的混合物；c)分離該液體提取物和固體微粒；d)進一步分離粗品液體提取物由此獲得含有分子量小于約500kDa的分子的最終液體提取物(0-500)；和e)在微量過濾膜(0.22微米)上過濾該LE-0-500并且冷凍得到最終液體提取物(0-500餾分)。
0-1和1-500餾分0-1餾分是含有分子量小于約1kDa的成分的鯊魚軟骨液體提取物。1-500餾分是含有分子量約為1-500kDa的成分的鯊魚軟骨液體提取物。鯊魚軟骨提取物的0-1和1-500餾分是采用超濾體系、利用分子量截止約為1kDa的膜制備。利用這種體系，經(jīng)過一個純化循環(huán)(一個純化循環(huán)的定義是該純化步驟在回收50％的滲透物時停止)后得到這兩種軟骨餾分。當用終體積等于提純所用軟骨提取物的起始體積的純水重組時，含保留物(R)的1-500餾分含有1X濃度的分子量約1-500kDa的成分和0.5X濃度的分子量小于1kDa成分，以純化所用的初始提取物計。0-1餾分含有僅由分子量小于約1kDa且為1X濃度的成分組成的滲透物(P)。利用該超濾體系，通過另外的純化循環(huán)可以進一步提純1-500餾分，如表5證實。表5
按照上述方法制備多個批次的0-1和1-500餾分。為了減少聚集物的形成和提高溶解作用并且維持穩(wěn)定、可溶形式，用1％w/v蔗糖水溶液作為提取的穩(wěn)定劑。
通過首先按照現(xiàn)有技術(shù)所述方法制備一批LE-0-500餾分，并且其次增加下列新的步驟來獲得0-1和1-500餾分e)任選地用含有終濃度約為1％(w/v)蔗糖的溶液制備LE-0-500提取物，生成含有1％蔗糖的LE-0-500餾分；f)用具有公稱分子量截止約為1kDa的膜過濾LE-0-500或含有1％蔗糖的LE-0-500，生成含有分子量小于1kDa的軟骨分子的液體提取物(分別是Pn-0-1和含有1％蔗糖的Pn-0-1餾分，其中“n”是指表5的純化循環(huán))，并且生成含有分子量高于約1kDa的軟骨分子的鯊魚軟骨液體提取物(分別是Rn-0-1和含有1％蔗糖的Rn-0-1餾分，其中“n”是指表5的純化循環(huán))；和；g)通過孔隙率約0.22微米的微量過濾膜微量過濾保留物和滲透物液體提取物。
上述過程可以不包括步驟e)從而制備無蔗糖的提取物。滲余物液體提取物可以超濾一個或多個，優(yōu)選4個或多個純化循環(huán)以生成另外的含有分子量小于約1kDa軟骨成分的濾液提取物(P1-0-1至P6-0-1)并且生成含有分子量在1至約500kDa軟骨成分的保留物提取物(R-6-1-500和含有1％蔗糖的R6-1-500)?？梢詫⑸鲜鲆后w提取物任選地冷凍保藏。
所以，上述方法可用來制備以下液體提取物。1)由LE0-500制備的0-500餾分2)由含有1％蔗糖的LE-0-500制備含有1％蔗糖的0-500餾分3)由P1-0-1制備0-1餾分4)由含有1％蔗糖的P1-0-1制備含有1％蔗糖的0-1餾分5)由R6-1-500制備1-500餾分6)由含1％蔗糖的R6-1-500制備含1％蔗糖的1-500餾分可以用水反復提取第二固體物以回收額外量的鯊魚軟骨的可溶餾分，所述第二固體物是通過分離在用水處理第一固體物過程中生成的第二混合物而獲得。
分析所有按照上述方法制備的液體提取物的干重和蛋白質(zhì)含量。此外，還測定各個餾分的抗MMP活性、抗血管生成和抗腫瘤活性。結(jié)果概括在表6中。表6
*GIA以30μl等份試樣的20X濃縮樣品進行分析結(jié)果證實，0-1餾分和含有1％蔗糖的相同餾分，在含有約90％的回收干重內(nèi)容物的同時，含有極低量，幾乎無法檢測量的蛋白質(zhì)。
然而，在0-1餾分和1-500餾分中觀察到的抗MMP活性顯示1)至少一種非蛋白成分產(chǎn)生抗MMP活性，和2)不止一種成分可能具有抗MMP活性?；钚猿煞挚梢允腔蚩梢圆皇堑鞍谆螂念惐举|(zhì)。
此外，根據(jù)EVT的測定，僅在0-1餾分中觀察到抗血管生成活性。我們注意到蔗糖的存在可以在含有1％蔗糖的1-500餾分中引起抗血管生成活性的輕度恢復。
針對用M27腫瘤細胞(LLC)接種的動物的治療可以明顯減少肺表面上顯微觀察到的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量。0-1和0-500餾分均可以明顯減少轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量(約30％)。然而，1-500餾分的活性小于0-1或0-500餾分，這表明0-1餾分中的活性成分至少部分導致抗腫瘤作用。這些結(jié)果還揭示出在1-500餾分中存在另一種抗腫瘤成分。將一些另外組的動物用含有1％w/v蔗糖的相同分子量的餾分處理。雖然本發(fā)明人未觀察到組之間有任何顯著性差異，但是，蔗糖存在下的趨勢是高分子量的餾分活性較高(上表)。本發(fā)明人觀察到動物體重無任何降低，這表明軟骨提取物在LLC模型中沒有毒性。抗MMP成分的分離和定性色譜分離和純化由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有有效生物活性的多種成分存在于0-500餾分中，特別是存在于0-1餾分中，下一步是從其中分離出這些活性成分。
我們開發(fā)出4種不同的方法用于由0-500餾分中分離和純化出具有抗MMP活性的成分。
方法1步驟1將通過上述詳細過程獲得的0-500餾分冷凍干燥并且在純水中重組(成為以初始體積計20倍的濃度)。將重組原料超聲15分鐘使生物活性成分的溶解最佳化。分離步驟后，例如4℃在2200g下離心10分鐘后，保留上清液用于進一步純化。
步驟2利用固相萃取柱(中性SPE-C18)進行吸附色譜。
裝有500mg C18吸附劑(Supelco號5-7012，尺寸3cc)的SPE柱在2ml甲醇(100％)中預(yù)處理2次并用2ml純水預(yù)處理3次。將1ml2X重組軟骨提取物加樣到該柱上。用1.5ml純水沖洗吸附劑珠，用兩個2.5ml份的純水洗脫出具有抗MMP活性的成分，將兩份洗脫液合并得到第一洗脫液。
在第一洗脫液中回收約50％的初始抗MMP活性。剩余50％在柱加樣和洗脫步驟中損失。因此中性條件可能產(chǎn)生了對具有抗MMP活性成分的弱保留。當采用這種色譜介質(zhì)時，成分的弱保留是極性或離子成分的一個指標。
步驟3對20X重組軟骨提取物的多種樣品重復多次上述處理后，分別將第一洗脫液合并且在Speed Vac離心機上蒸發(fā)。由此獲得的固體在純水中重組為200倍濃度，以所用0-500餾分的起始體積計。在超聲和離心之后，保留上清液用于下步純化。
步驟4在中性條件中用低分辨半制備HPLC分離上清液中存在的生物活性成分。采用Novapack C18HR(7.6×300mm；水)柱。所用流動相是硫酸鈉(0.01M pH7)/甲醇(92:8)。流量和溫度分別維持在2mg/分鐘和30℃。將上述200X重組餾分(100μl)注射到柱上并且利用等度洗脫條件和UV檢測(205nm)收集2ml餾分。運行時間為30分鐘。發(fā)現(xiàn)洗脫餾分中具有抗MMP活性的成分相應(yīng)于那些保留時間在11至13分鐘內(nèi)的餾分。
步驟5用不同的100μl等份試樣的200X重組餾分重復步驟4并且合并相應(yīng)的所需洗脫液餾分，蒸發(fā)，重組在純水中，濃度為500X，以所用0-500餾分的初始體積計。超聲并離心。保留上清液用于下一步純化。步驟6高分辨半制備HPLC在中性條件下對步驟5獲得的上清液進行層析。該高分辨半制備HPLC的方法與步驟4的相同，但用磷酸鹽緩沖液(0.01M,pH7)/甲醇(97:3)作為流動相。發(fā)現(xiàn)洗脫餾分中具有抗MMP活性的成分相應(yīng)于那些保留時間在23至27分鐘內(nèi)的餾分。
步驟7重復步驟6后，合并相應(yīng)的含有活性成分的預(yù)期洗脫餾分，蒸發(fā)溶劑，生成基本上固體的殘余物，將殘余物在純水中重組為500-2000X的濃度，以所用0-500餾分的初始體積計，超聲和離心，進一步進行分子量分析并且測定其抗MMP活性。將該生物活性成分稱作“I-E-986”。
方法2在C18相色譜介質(zhì)中在pH3下觀察I-E-986通常其可更好地保留。因此，改進SPE方法(上述步驟2)和半制備色譜體系(上述步驟4和6)。下列條件允許在獲得純凈最終提取物的SPE過程中和在省略一個半制備純化步驟(方法1的步驟4)中采用強洗脫劑溶液。例如，重復方法1的步驟1至3。步驟4被以下步驟代替步驟4采用和上述步驟2中相同的SPEC-18柱，但色譜介質(zhì)用2ml甲酸銨(0.01M,pH3)預(yù)處理3次。將由步驟3獲得的1ml200X重組提取物(在樣品加樣之前用甲酸調(diào)至pH3)加樣到柱上。用2ml甲酸銨/甲醇(90:10,pH3)沖洗3次吸附床。用1ml甲醇(100％)進行I-E-986洗脫。對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員很顯然，由甲醇洗脫色譜柱獲得的餾分將含有水。所以，這步中的洗脫溶劑可以是另一種有機溶劑，優(yōu)選極性和/或水可混溶有機溶劑，并且洗脫溶劑可以含有水。
步驟5重復方法1的步驟5，但重組抗MMP餾分的濃度為4000X。
步驟6此步與方法1的步驟6相同，除了流動相是甲酸銨/甲醇(75:25pH3)以外。
步驟7步驟7與方法1的步驟7相同，但保持與上步6相同濃度的4000X。
方法3該方法基本上與方法2相同，除了在步驟6中將甲酸鹽的pH由酸性(pH3)改變?yōu)橹行詶l件(約pH7)。
方法4
在此純化方法中，自酸性流動相開始。
步驟1原0-500餾分(1X濃度)的pH用甲酸調(diào)至3，隨后在2200g下離心10分鐘。步驟2中使用上清液。
步驟2將上清液加樣至在酸性條件下預(yù)處理的SPE C-18柱(Supelco#5.-7136；體積60cc，裝有10g固相載體)上。該柱用120ml甲醇(100％)和120ml甲酸(0.01M,pH3)預(yù)處理。將500ml的1X酸化軟骨提取物加樣在該柱上并用6個體積的100ml甲酸(0.01M(pH3)/甲醇90:10)洗脫。在洗脫餾分3、4和5中獲得生物活性成分。
步驟3合并步驟2的洗脫液餾分3、4和5，將溶劑蒸至近干燥。隨后將餾分稀釋至初始的4000X，生成含I-E-986的溶液。
步驟4在制備HPLC柱上在甲酸緩沖液pH 3中純化I-E-986。將該色譜柱(Prodigy OSD-prep,10u,250×50mm，得自Phenomenex)預(yù)處理并且室溫下運行。流動相的組成是甲酸(0.01M,pH3)/甲醇(70:30)且流量為4ml/分鐘。將4ml的SPEC-18餾分以4000X濃度注射在柱上并且以等度方式洗脫柱子并用UV(205nm)檢測。60分鐘內(nèi)每隔1分鐘收集餾分。在33至36分鐘之間洗脫出抗MMP活性的I-E-986。
步驟5合并具有抗MMP活性的餾分并且蒸發(fā)得到10000X濃度餾分。
步驟6該步驟與方法2的步驟6相同，但流動相是甲酸(0.01M,pH3)/甲醇(75:25)。將500μl等份試樣的10000X濃縮餾分加樣在柱上。在21至23分鐘之間洗脫出含有抗MMP活性的成分。
步驟7步驟7與方法1的步驟7相同。保持與前面步驟6相同的濃度4000X。
按照方法1制備的半純化餾分本發(fā)明人首次指出，HPLC純化的餾分(由上述方法1獲得的餾分)含有具有抗MMP活性的成分。由此純化的成分也表現(xiàn)出如在上述體內(nèi)模型LLC中證實的抗腫瘤活性。通過用3個不同濃度的HPLC純化餾分處理動物可以測定出抗腫瘤活性。可觀察到鐘形劑量反應(yīng)曲線，在2.5X濃度(該濃度基于純化步驟中100％的回收率并且以軟骨提取物的初始體積計)劑量時最大效能約為50％(p＜0.005)。
由于抗血管生成和基質(zhì)金屬蛋白酶活性與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移進程密切相關(guān)，含有抗MMP成分的HPLC純化餾分可產(chǎn)生抗腫瘤作用。因此，具有這些活性的成分在癌癥治療中是有效治療劑(Yolnay,E等人，《癌癥研究和臨床腫瘤學雜質(zhì)》(J.Cancer Res Clin.Oncol.)123”652-658,1997;Skobe,M.,等人《天然藥物》3:1222-1227,1997)。
按照方法4制備的半純化餾分在這部分中餾分是按照上述方法4制備，除了步驟2)和3)如下進行步驟2上清液加樣在已用酸性條件預(yù)處理的SPE C-18柱(Supelco#5.-7012；體積3cc，裝有500g固相載體)上。該色譜柱用4ml甲醇(100％)和6ml甲酸(0.01M,pH3)預(yù)處理。將10ml的1X酸化軟骨提取物加樣到色譜柱上，用1.0ml體積的甲酸(0.01M(pH3)/甲醇90:1)沖洗3次，用1.0ml甲醇洗脫出生物活性成分。
步驟3將步驟2的含有生物活性成分的洗脫餾分蒸發(fā)至干。隨后將餾分稀釋至起始濃度的40X或20X，生成含I-E-986的溶液。
測定所有由這種方法獲得的液體提取物的抗MMP活性。結(jié)果概括在表7中。表7
*GIA在80μl等份試樣的20X濃縮樣品上進行**GIA在80μl等份試樣的40X濃縮樣品上進行因此，本發(fā)明的方法提供了用于制備具有抗MMP活性的特定鯊魚軟骨餾分的方法，另外，含水和含有機溶劑溶液可以用來制備具有至少抗MMP活性的軟骨提取物。雖然0-500和1-500餾分都具有抗MMP活性，但通過本發(fā)明方法純化的抗MMP組分主要含在0-1kDa部分中。類似的結(jié)果可在含有1％w/v蔗糖的等效餾分中觀察到。最后，抗MMP活性可以利用不同的軟骨與純水的比例有效回收。通過LC/MS測定抗MMP組分的分子量開發(fā)出5種多維色譜體系通過液體色譜/質(zhì)譜(LC/MS)來測定鯊魚軟骨餾分的分子量。5個體系的每一種如表8-12所述。
試驗包括MS掃描的裂分(7:1)色譜柱洗脫以及由LC收集餾分，用于運轉(zhuǎn)后的抗MMP活性試驗。MS和抗MMP生物活性之間的關(guān)系具體決定于洗脫餾分和所用各色譜體系的所述化合物的保留時間。
對于MS陰離子檢測，在向MS離子源引入之前向柱洗脫劑中加入氫氧化銨溶液(0.75％v/v0.15ml/分鐘)的溶液?；旌衔锏膒H是8-10，由此改進MS陰離子的形成和檢測。表8．色譜體系等度C18中性條件(甲酸銨)
評價所收集餾分的抗MMP活性表9．色譜體系梯度C18酸性條件(甲酸銨)
評價所收集餾分的抗MMP活性表10．色譜體系等度C18酸性條件(甲酸銨)
評價所收集餾分的抗MMP活性表11．色譜體系梯度NH2酸性條件(甲酸銨)
評價所收集餾分的抗MMP活性表12．色譜體系等度C18酸性條件(甲酸銨)
評價所收集餾分的抗MMP活性通過注射100μl的500至1000X純化磷酸鹽最終餾分(得自純化方法1的步驟7)進行多維色譜試驗。在此濃度下，在MS掃描方式(全部離子)中檢測不到強和清晰的I-E-986信號。通過在感興趣的區(qū)域內(nèi)運行后測定所有各個離子信號(100-1000amu)來發(fā)現(xiàn)感興趣的峰。
注射的濃度至多2000X的純餾分在總離子色譜及基底峰色譜中顯示出與I-E-986相應(yīng)的小峰。
在陽離子檢測方式(表13)中在感興趣的區(qū)域(I-E-986)內(nèi)僅能清晰檢測到離子245M+1和227。在LCQMS中的每個設(shè)計和操作中，對于含有醇官能團的分析物通常并多次觀測到相應(yīng)于損失水分子的離子和分子離子(M+1)。離子245M+1和227的共同洗脫曲線以及相應(yīng)于損失的水分子(H2O)的18amu，有力地表明了存在令人感興趣的單一成分，其分子量為244,245在陽離子方式中等于M+1形式。
由在不同色譜體系上注射半純化I-E-986獲得的總離子色譜(TIC)和單離子色譜(245M+1m/e)表示在圖1至4中。展開后分析的那些色譜表明，在由不同色譜體系收集的各個餾分中存在離子245(M+1)，其中含有具有抗MMP活性的成分。
由分析在HPLCC18體系(甲酸銨，中性pH ，等度)上分離的I-E-986獲得的全離子色譜和單離子色譜(245M+1)表示在圖1中。在13.5至15.0分鐘之間收集的餾分中檢測I-E-986相應(yīng)于洗脫保留時間14.4分鐘的m/e245M+1峰。
由分析在HPLC C18體系(甲酸銨，酸性pH3，梯度)上分離的I-E-986獲得的全離子色譜和單離子色譜(245M+1)表示在圖2中。在16.5至17.0分鐘之間收集的餾分中檢測I-E-986相應(yīng)于洗脫保留時間16.62分鐘的m/e245M+1峰。
由分析在HPLCC18體系(甲酸銨，酸性pH3，等度)上分離的I-E-986獲得的全離子色譜和單離子色譜(245M+1)表示在圖3中。在16至18分鐘之間收集的餾分中檢測I-E-986相應(yīng)于洗脫保留時間16.79分鐘的m/e245M+4峰。
由分析在HPLCNH2體系(甲酸銨，酸性pH3，梯度)上分離的I-E-986獲得的全離子色譜和單離子色譜(245)表示在圖4中。在14至16分鐘之間收集的餾分中檢測I-E-986相應(yīng)于洗脫保留時間14.28分鐘的m/e245M+1峰。
在陰離子方式(表14)中，在所有被評估色譜體系中在感興趣的區(qū)域(I-E-986)內(nèi)僅檢測到離子243和289。再進行這兩種離子的共同洗脫表明在離子243上形成甲酸鹽加合物。當用甲酸銨作為流動相中的緩沖劑時，在陰離子中常觀測到這種現(xiàn)象。這可以通過在相同pH下用醋酸銨緩沖劑代替甲酸銨緩沖劑來證實。醋酸銨流動相是在MS檢測之前用氫氧化銨溶液柱后堿化。兩種體系顯示出清晰的離子243信號，但離子289僅能在甲酸鹽體系中檢測到，在第二中色譜體系中檢測到與醋酸鹽聚合物相應(yīng)的新離子(303)。所以，可以肯定I-E-986成分具有約244amu的分子量(在陰離子方式中243等價于M-1形式)。表13陽離子檢測
表14陰離子檢測
I-E-986的經(jīng)驗式和部分結(jié)構(gòu)解釋LC-MS經(jīng)驗式的測定采用質(zhì)譜獲得有關(guān)I-E-986的結(jié)構(gòu)信息。表15公開了在I-E-986的LC-MS分析試驗中所用的條件。表15.LC-MS部分經(jīng)驗式測定的色譜條件
對247、246、245的同位素比例的測定是以變焦掃描方式進行從而提高記錄那些離子峰信號的精密度。在下表中給出了由離子246/245(A+1型)和247/245(A+2型)獲得的同位素比例。
m/e峰高的5.9％的比例(A+2同位素比例)有力地表明分子上存在硫和氧原子。
A+1單元(m/e246/245峰高)的11.8％的比例可以解釋為在分子上有至多10個碳原子或碳、氮和硫(1)的混合物。
對于244amu的分子量，只能有偶數(shù)(0、2、4)個氮存在于該分子上。LC/MSn結(jié)構(gòu)解釋利用串聯(lián)質(zhì)譜實驗對I-E-986的結(jié)構(gòu)進行部分解釋。表16．Msn實驗所用的色譜條件如下所述
針對分子離子245m/e(M+1)的陽離子進行的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MP)實驗顯示出18amu(m/e227.1)和36amu(m/e209)的損失。這些損失相應(yīng)于失去一個和兩個水分子(分別-H2O和-2H2O)，表明在I-E-986中存在醇，和/或多元醇部分。準確的MS/MS光譜在圖5中給出。
針對m/e227進行的MS/MS實驗得到一個復雜光譜，其具有許多I-E-986結(jié)構(gòu)的特征碎片。該光譜中出現(xiàn)的碎片應(yīng)是得自一個或兩個m/e227離子的裂解或此光譜中其它強離子(即m/e166得自209離子的裂解)裂解獲得的碎片。所以，針對m/e227離子的選定碎片進一步進行MS/MS實驗。圖6中繪出所得的MS/MS光譜。
針對209m/e離子(M+1-2H2O)的MS/MS實驗由于失去60amu產(chǎn)生m/e149，其特征是失去羧酸(-CH3COOH)部分。
隨后離子149m/e(M+1-2H2O-CH3COOH)再進行MS/MS分析并且獲得下列碎片m/e105,115,116和134。149失去15生成134最可能是因失去CH3。33和34的損失是失去SH和H2S的特征，由此有力揭示了I-E-986中存在含硫基團(硫醇或硫醚)。由m/e149失去44生成105可能是因為失去若干個不同的基團。化學衍生結(jié)構(gòu)的解釋令I(lǐng)-E-986處于下列常用于羧酸酯化的詳細條件下。
甲基化(HCl/甲醇)為了純餾分甲基化，本發(fā)明人蒸發(fā)15μlI-E-986的純餾分(4000X)并且加入100μl裝在密封瓶內(nèi)的HCl(12N):MeOH/(1:99)的混合物。將該混合物在45℃下保溫60-90分鐘，隨后蒸發(fā)至干，將其溶解在100μl水中。根據(jù)用于LC/MS結(jié)構(gòu)解釋的色譜條件注射此溶液。
甲基化(BF3/甲醇)為了純餾分的甲基化，本發(fā)明人蒸發(fā)15μlI-E-986的純餾分(4000X)并且加入100μl裝在密封瓶內(nèi)的BF3/甲醇溶液。將該混合物在45℃下保溫60-90分鐘，隨后蒸發(fā)至干，將其溶解在100μl水中。根據(jù)LC/MS結(jié)構(gòu)鑒定所用的色譜條件注射此溶液。
純化餾分的稀釋(4000X)為了檢驗衍生作用的回收率，本發(fā)明人用85μl水稀釋15μlI-E-986的純餾分(4000X)。按照LC/MS鑒定所用的色譜條件分析該稀釋溶液。
結(jié)果根據(jù)在預(yù)期的I-E-986保留時間測定的信號強度，用BF3/甲醇或H+/甲醇在45℃下將I-E-986衍生1小時導致其色譜信號95％以上消失。這兩個反應(yīng)已知是將羧酸轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)甲酯。甲基化作用引起I-E-986分子量的增高及其在色譜體系上保留時間的增加。由此生成的I-E-986衍生物的濃度無法檢測到該衍生產(chǎn)物。物理化學性質(zhì)當甲酸鹽緩沖液的pH由7降低至3時，通過其在HPLCC18柱上保留時間的增加可以證實在I-E-986分子上存在弱酸性官能團，例如羧酸。這有力地說明I-E-986中存在pKa約4或更高的部分。
如果硫醇或硫醚官能團存在于I-E-986中，如MS/MS數(shù)據(jù)所提示的，它將影響I-E-986由0-500餾分和軟骨的回收。這似乎是只有I-E-986的游離硫醇部分可以按照本發(fā)明的方法提取，因為硫醇與溶液中其它含硫分子(例如蛋白質(zhì)、肽、氨基酸)形成二硫(S=S)鍵。二硫加合物的形成一般可改變含硫醇基團分子的物理化學性質(zhì)及其提取的回收率。這可能是因為I-E-986的二硫鍵無法通過直接提取0-500餾分(20X)分離。通過在提取之前在pH7和室溫下用三丁基磷酰胺處理15分鐘含有它的溶液可以減少I-E-986二硫鍵的形成，尤其是在pH3(SPEC18pH3)下的那些。其它二硫鍵斷裂試劑，例如二硫蘇糖醇和巰基乙醇，可用來將I-E-986二硫加合物的形成降至最小。
上述用于由鯊魚軟骨回收和分離生物活性的方法可適用于任何來源的軟骨(1)提取具有預(yù)期生物活性的餾分，和(2)提取具有那些生物活性的特定成分。
由于本發(fā)明教導了可以由軟骨在不同的親水性溶劑中提取生物活性成分，上述方法可適用于由不同物質(zhì)的軟骨提取生物活性成分。分離自軟骨原料，優(yōu)選鯊魚軟骨并且1)具有與I-E-986類似或相同的生物活性性能；和/或2)具有244amu質(zhì)量的成分被認為屬于本本發(fā)明在上文中參考具體實施方案作了詳細說明。所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知在不脫離上述教導下可以進行改進。這些改進屬于本發(fā)明在所附權(quán)利要求書中定義的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種由軟骨獲得可溶成分的方法，該方法包括的步驟是a)用一定量的含有機溶劑溶液處理軟骨原料，生成含有軟骨的可溶成分的第一混合物；b)分離該第一混合物，生成含有該可溶成分的第一液體提取物和第一固體物，其中所示可溶成分具有一種或多種抗基質(zhì)金屬蛋白酶、抗腫瘤和抗血管生成活性。
2．權(quán)利要求1的方法，該方法進一步包括步驟a)由所述第一液體提取物除去足夠量的液體生成基本上干燥的第二固體物；b)用水處理該第二固體物生成第二混合物；和c)分離所述第二混合物生成最終液體提取物和第三固體物，其中該最終液體提取物包括該可溶成分。
3．權(quán)利要求1的方法，該方法進一步包括步驟由該第一液體提取物除去基本上所有的有機溶劑。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述含有機溶劑的溶液包括一種或多種鹵代、醚、質(zhì)子、非質(zhì)子、堿性、酸性、極性、非極性、親水性和疏水性有機溶劑。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述含有機溶劑的溶液包括一種或多種選自下面的有機溶劑氯仿、二溴甲烷、氯丁烷、二氯甲烷、二甲氧基甲烷、四氫呋喃、乙醚、乙二醇、甲醚、乙二醇二乙醚、二甘醇二乙醚、三甘醇二甲醚、叔丁基乙基醚、叔丁基甲基醚、甲醇、乙醇、2-硝基乙醇、2-氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、乙二醇、1-丙醇、2-丙醇、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、2-乙氧基乙醇、二甘醇、1-、2-或3-戊醇、新戊醇、叔戊醇、二甘醇一甲醚、二甘醇一乙醚、環(huán)己烷、苯甲醚、芐醇、苯酚、甘油、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺和N-甲基甲酰胺。
6．權(quán)利要求1的方法，其中所述含有機溶劑的溶液含有一種或多種選自甲醇、乙醇、乙腈、丙醇、異丙醇、丙酮和二甲基亞砜的有機溶劑。
7．權(quán)利要求6的方法，其中所述含有機溶劑的溶液含有選自下列的有機溶劑混合物甲醇和乙腈，甲醇和二甲基亞砜，乙醇和乙腈，以及乙醇和二甲基亞砜。
8．權(quán)利要求1的方法，其中所述含有機溶劑的溶液含有水和選自甲醇、丙醇、異丙醇、乙醇、乙腈和二甲基亞砜的有機溶劑的混合物。
9．權(quán)利要求1的方法，其中所述含有機溶劑的溶液含有以溶液總體積計約1-1000％v/v量的有機溶劑。
10．權(quán)利要求9的方法，其中所述有機溶劑是以溶液總體積計約40-80％v/v的量存在。
11．權(quán)利要求9的方法，其中所述有機溶劑是以溶液總體積計約至少10％v/v的量存在。
12．權(quán)利要求1的方法，其中所述第一混合物是通過一種或多種的離心、過濾、滲析和靜置固體后除去上清液來分離。
13．權(quán)利要求2的方法，其中所述液體的除去是通過一種或多種的蒸發(fā)、冷凍干燥、蒸餾、共沸蒸餾、干燥、液/液提取、加入有機溶劑吸收劑和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來進行。
14．權(quán)利要求1的方法，其中所述軟骨原料是鯊魚軟骨。
15．權(quán)利要求1的方法，該方法進一步包括步驟在用含有機溶劑溶液處理該軟骨原料之前、期間和之后將該軟骨原料均化。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所述均化是通過一種或多種物理和化學方式進行。
17．權(quán)利要求1的方法，該方法進一步包括步驟a)用一定量的含有機溶劑溶液處理該第一固體物生成含軟骨可溶成分的第二混合物；和b)分離該第二混合物生成含該可溶成分的第二液體提取物和第二固體物。
18．權(quán)利要求17的方法，該方法進一步包括步驟a)用一定量的含有機溶劑溶液處理該第二固體物生成含軟骨可溶成分的第三混合物；和b)分離該第三混合物生成含該可溶成分的第三液體提取物和第三固體物。
19．權(quán)利要求18的方法，該方法進一步包括步驟將所述第一、第二和第三液體提取物混合生成總液體提取物。
20．權(quán)利要求1的方法，其中所述可溶成分分離自所述第一液體提取物。
21．由軟骨獲得生物活性成分的方法，其中該方法包括步驟a)將軟骨在水溶液中均化直至軟骨的平均粒度減小到約500微米生成勻漿；b)平衡該勻漿以將所述生物活性成分提取到含水溶液中并且生成第一混合物，該第一混合物包括第一固體物和含該生物活性成分的第一液體提取物；c)由第一固體物分離出第一液體提取物；和d)對第一液體提取物進行分離生成含有生物活性成分的第二液體提取物，所述生物活性成分具有的各自分子量小于約500kDa；改進包括e)用分子量截止為1kDa的膜過濾該第二液體提取物生成含有具有小于約1kDa的分子量的第一生物活性成分的濾液和含有具有分子量約1至約500kDa的第二生物活性成分的保留物；其中所述第一和第二生物活性成分至少具有抗基質(zhì)金屬蛋白酶活性。
22．權(quán)利要求21的方法，其中步驟c),d)和e)的任何兩個或多個可以合并成一個步驟。
23．權(quán)利要求21的方法，其中步驟d)和e)的任何兩個或多個可以合并成一個步驟。
24．權(quán)利要求21的方法，其中所述均化是通過一個或多個的粉碎、微粉化、碾磨、磨碎、截斷、混合、溶脹、破裂細胞外基質(zhì)、溶解細胞和提高軟骨原料的孔隙率來進行。
25．權(quán)利要求21的方法，其中所述第一生物活性成分分離自所述濾液。
26．權(quán)利要求21的方法，其中所述第一生物活性成分還具有抗血管生成和抗腫瘤活性。
27．權(quán)利要求21的方法，其中所述第一固體物進行一次或多次步驟b)和c)，生成一種或多種另外的第一液體提取物。
28．權(quán)利要求21的方法，其中步驟c)中的分離是通過一個或多個的過濾、滲濾、滲析、超濾、微量過濾、深度過濾、離心，和靜置固體后回收上清液來進行。
29．權(quán)利要求21的方法，其中所述軟骨原料是鯊魚軟骨。
30．權(quán)利要求21的方法，其中所述第二液體提取物是通過一或多種滲析、滲濾和超濾來過濾。
31．權(quán)利要求1的方法，其中所述第一液體提取物進一步含有穩(wěn)定劑。
32．權(quán)利要求2的方法，其中所述最終液體提取物進一步含有穩(wěn)定劑。
33．權(quán)利要求21的方法，其中至少一個所述第一液體提取物、第二液體提取物和濾液進一步含有穩(wěn)定劑。
34．按照權(quán)利要求21、22、23、24、25、26、27、28、29、30和33任一項所述方法制備的第一或第二生物活性成分。
35．按照權(quán)利要求21、22、23、24、25、26、27、28、29、30和33任一項所述方法制備的第一生物活性成分，其中該成分進一步具有抗腫瘤活性。
36．按照權(quán)利要求25所述制備的第一生物活性成分，其中所述軟骨原料是鯊魚軟骨并且所述第一生物活性成分的分子量約為244。
37．權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、31和32任一項所述方法制備的可溶成分。
38．按照權(quán)利要求37所述的可溶成分，其中所述軟骨原料是鯊魚軟骨。
39．按照權(quán)利要求37所述的可溶成分，其中所述可溶成分具有至少抗基質(zhì)金屬蛋白酶活性。
40．按照權(quán)利要求39所述的可溶成分，其中所述可溶成分進一步具有至少一種的抗血管生成和抗腫瘤活性。
41．按照權(quán)利要求40所述的可溶成分，其中所述成分的分子量約244。
42．具有下列性質(zhì)的生物活性成分分子量小于約1kDa；和抗基質(zhì)金屬蛋白酶活性；其中，該生物活性成分可以得自軟骨原料。
43．權(quán)利要求42的生物活性成分，其中該組合物已由鯊魚軟骨獲得。
44．權(quán)利要求42的生物活性成分，其中該組合具有與分離自軟骨原料的成分具有類型的生物活性性能。
45．權(quán)利要求42的生物活性成分，其進一步具有至少一種以下性質(zhì)弱酸性官能團；可以被甲基化的官能團；至少0、2或4個氮原子；至少0、1或2個硫原子；水溶液溶解性；和含有機溶劑溶液溶解性。
46．權(quán)利要求43的生物活性成分，其中該成分的分子量約244。
47．權(quán)利要求42的生物活性成分，其進一步具有至少一種以下生物性質(zhì)抗腫瘤活性；抑制新血管形成的能力；和抑制轉(zhuǎn)移形成的能力。
48．一種抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的方法，該方法包括步驟令該酶與有效量的按照權(quán)利要求1的方法制備的可溶成分接觸足夠長的時間以抑制該酶。
49．一種抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的方法，其中包括步驟令該酶與有效量的至少一種按照權(quán)利要求21的方法制備的所述第一和第二生物活性成分接觸足夠長的時間以抑制該酶。
50．一種抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的方法，其中包括步驟令該酶與有效量的按照權(quán)利要求42的方法制備的所述生物活性成分接觸足夠長的時間以抑制該酶。
51．一種抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的方法，其中包括步驟令該酶與有效量的按照權(quán)利要求46的方法制備的所述生物活性成分接觸足夠長的時間以抑制該酶。
52．一種在生物組織內(nèi)至少抑制一種新血管形成和抑制轉(zhuǎn)移形成的方法，該方法包括步驟令該組織與有效量的按照權(quán)利要求1的方法制備的可溶成分接觸足夠長的時間以抑制該組織內(nèi)新血管形成和轉(zhuǎn)移形成中的至少一種。
53．一種在生物組織內(nèi)至少抑制一種新血管形成和抑制轉(zhuǎn)移形成的方法，該方法包括步驟令該組織與有效量的按照權(quán)利要求26的方法制備的可溶成分接觸足夠長的時間以抑制該組織內(nèi)新血管形成和轉(zhuǎn)移形成中的至少一種。
54．一種在生物組織內(nèi)至少抑制一種新血管形成和抑制轉(zhuǎn)移形成的方法，該方法包括步驟令該組織與有效量的按照權(quán)利要求47的方法制備的可溶成分接觸足夠長的時間以抑制該組織內(nèi)新血管形成和轉(zhuǎn)移形成中的至少一種。
55．一種用于治療哺乳動物中至少一種血管生成相關(guān)性疾病、腫瘤相關(guān)性疾病和基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)性疾病的方法，該方法包括步驟該哺乳動物在足以提供治療效果的時期施用治療有效量的按照權(quán)利要求1制備的可溶成分。
56．一種用于治療哺乳動物中至少一種血管生成相關(guān)性疾病、腫瘤相關(guān)性疾病和基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)性疾病的方法，該方法包括步驟該該哺乳動物在足以提供治療效果的時期施用治療有效量的按照權(quán)利要求26制備的可溶成分。
57．一種用于治療哺乳動物中至少一種血管生成相關(guān)性疾病、腫瘤相關(guān)性疾病和基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)性疾病的方法，該方法包括步驟該該哺乳動物在足以提供治療效果的時期施用治療有效量的至少一種按照權(quán)利要求40制備的第一和第二生物活性成分。
58．一種用于治療哺乳動物中至少一種血管生成相關(guān)性疾病、腫瘤相關(guān)性疾病和基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)性疾病的方法，該方法包括步驟該該哺乳動物在足以提供治療效果的時期施用治療有效量的按照權(quán)利要求47制備的生物活性成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用含機溶劑溶液代替純水制備軟骨提取物及其餾分的方法。試驗用不同的有機溶劑制備含有至少具有抗基質(zhì)金屬蛋白酶(抗MMP)活性的生物活性成分的提取物。本發(fā)明還涉及一種方法,通過該方法由分子量小于約500kDa的分子組成的鯊魚軟骨的全液體提取物(0－500餾分)被純化為兩種分別由分子量小于約1kDa的分子組成(0－1餾分)和分子量約1—500kDa的分子組成(1－500kDa)的完全獨立餾分。為了防止聚集物的形成,為提高活性成分的溶解度和穩(wěn)定性,可以加入蔗糖或其它穩(wěn)定劑。0—500餾分、0－1餾分和1－500餾分以及它們的含有1%w/v蔗糖的等效物具有抗MMP和抗腫瘤活性。本發(fā)明還提供一種至少具有抗MMP和抗腫瘤活性且質(zhì)量為244amu(原子量單位)的成分。還描述了上述提取物、其衍生餾分或成分在抑制MMP酶、新血管形成和/或轉(zhuǎn)移形成中的應(yīng)用。
文檔編號A61K35/60GK1314816SQ99807876
公開日2001年9月26日 申請日期1999年7月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月23日
發(fā)明者E·杜邦, Y·拉昌斯, D·萊薩德, S·奧格 申請人:萊斯實驗室阿特納公司