專(zhuān)利名稱(chēng)：室管膜神經(jīng)干細(xì)胞及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離未被鑒定未從哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離過(guò)的室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及包含這些新細(xì)胞本身的制品、含有這些制品的藥物組合物和其各種醫(yī)學(xué)用途以及使用這些細(xì)胞的測(cè)定方法。
背景基于在成年哺乳動(dòng)物腦中不能產(chǎn)生新神經(jīng)元的假設(shè)，直到最近幾年，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中神經(jīng)細(xì)胞命運(yùn)“靜止”的觀點(diǎn)仍普遍流行。然而，已報(bào)道了在成年CNS的某些區(qū)域，例如嗅覺(jué)器官神經(jīng)元的信號(hào)到達(dá)大腦的部位嗅球(Kaplan等，科學(xué)(Science)1971092)和海馬的齒狀回(Bayer等，科學(xué)216890)中神經(jīng)元的更新。因?yàn)樯窠?jīng)元不能分裂，新神經(jīng)元的增加提示存在可產(chǎn)生神經(jīng)元的未成熟細(xì)胞，即祖細(xì)胞或干細(xì)胞。幾年前提出了支持成年哺乳動(dòng)物CNS中存在多能神經(jīng)干細(xì)胞的證據(jù)(Reynolds等，科學(xué)2551707)。然而，與其它幾種器官中一樣，意識(shí)到干細(xì)胞的存在早于其鑒定和定位。有趣的是，在嚙齒類(lèi)動(dòng)物的整個(gè)成年期均存在成年腦的神經(jīng)發(fā)生(Kuhn PG，神經(jīng)科學(xué)雜志(J.Neurosci.)1620)，而且這似乎是存在于各種哺乳動(dòng)物中的一種進(jìn)化上相當(dāng)保守的現(xiàn)象(Gould等，神經(jīng)科學(xué)雜志172492，Gould等，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)953168)。盡管成年人腦組織培養(yǎng)(Kirschenbaum等Cereb.Cortex 6576)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示在成年人CNS中也可能存在持續(xù)的神經(jīng)發(fā)生，但問(wèn)題是難于證實(shí)。
成年哺乳動(dòng)物CNS中神經(jīng)干細(xì)胞的存在首先是通過(guò)培養(yǎng)成年鼠腦和脊髓的細(xì)胞來(lái)證實(shí)的。在一定培養(yǎng)條件下，從分離的成年大鼠腦和脊髓可增殖多能神經(jīng)干細(xì)胞群體(Reynolds等，科學(xué)2551707，發(fā)育生物學(xué)1751，Weiss等，神經(jīng)科學(xué)雜志.167599)。培養(yǎng)基必需包含促細(xì)胞分裂因子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，而且必需排除血清。與干細(xì)胞相比，大多數(shù)其它CNS細(xì)胞類(lèi)型在這些培養(yǎng)基中不能存活。
在這些條件下，單個(gè)細(xì)胞可體外增殖，后代形成聚集細(xì)胞團(tuán)(Reynolds等，科學(xué)2551707，發(fā)育生物學(xué)1751)。體外培養(yǎng)幾天后，這些細(xì)胞克隆與培養(yǎng)皿脫離。這些細(xì)胞繼續(xù)增殖形成細(xì)胞緊密聚集的特征性球狀細(xì)胞聚集體，稱(chēng)為神經(jīng)球(neurosphere)，所有這些細(xì)胞均來(lái)自一個(gè)單一細(xì)胞。在神經(jīng)球中大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)nestin(Lendahl等.細(xì)胞(Cell)，60585)，但并沒(méi)有分化細(xì)胞的典型標(biāo)志。如果接種在附著基質(zhì)上或向培養(yǎng)基添加血清，這些未分化細(xì)胞迅速分化。重要的是，來(lái)自單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞克隆可產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，提示至少初始細(xì)胞是多能的(Reynolds等.科學(xué)2551707，ibid.發(fā)育生物學(xué)1751)。而且，如果細(xì)胞克隆被解離，許多細(xì)胞將形成新的未分化多能細(xì)胞團(tuán)(Reynolds等，發(fā)育生物學(xué)1751)，因此滿足作為干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。
因此，上述方法存在嚴(yán)重缺陷，即所用細(xì)胞群體具有復(fù)雜的混合組成。即使可以增強(qiáng)某些類(lèi)型細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)所獲細(xì)胞的原始定位不可能得出任何結(jié)論。
因此，提出了其它方法來(lái)確定成年CNS干細(xì)胞的定位，其中仔細(xì)分離和培養(yǎng)成年嚙齒類(lèi)動(dòng)物前腦的不同部分以測(cè)定神經(jīng)發(fā)生的能力。這些研究證實(shí)干細(xì)胞在側(cè)腦室壁和海馬中最為豐富(Lois等，美國(guó)科學(xué)院院刊，902074，Morsehead等，神經(jīng)元(Neuron)131071，Palmer等，分子細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)(Mol.Cell.Neurosci.)6474，ibid，8389)。而且，可從第三和第四腦室以及成年脊髓中分離干細(xì)胞，提示整個(gè)腦脊髓的室系統(tǒng)附近存在干細(xì)胞(Weiss等，神經(jīng)科學(xué)雜志167599)。
然而，神經(jīng)干細(xì)胞的確切定位和本質(zhì)仍然是個(gè)迷。側(cè)腦室壁一直是深入形態(tài)學(xué)研究的對(duì)象(Doetsch等，神經(jīng)科學(xué)雜志175046)。腦室系統(tǒng)覆蓋了單層室管膜細(xì)胞。哺乳動(dòng)物室管膜細(xì)胞傳統(tǒng)上被認(rèn)為是高度特化的細(xì)胞，其主要功能是在神經(jīng)組織和腦脊液之間形成屏障(Del Bigio，Glia141)，這對(duì)這些細(xì)胞是未分化干細(xì)胞的看法提出強(qiáng)烈質(zhì)疑。室管膜層之下是室管膜下層，即腦室下區(qū)(subventricular zone)。該區(qū)域含有星形膠質(zhì)細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞和祖細(xì)胞(Doetsch等，神經(jīng)科學(xué)雜志175046)。室管膜下層祖細(xì)胞具有很高的增殖速率(Morsehead等，神經(jīng)科學(xué)雜志12249)。一般地，干細(xì)胞增殖非常緩慢，而且當(dāng)選擇性殺死快速增殖的室管膜下層細(xì)胞時(shí)，干細(xì)胞群體并不減少，這對(duì)這些細(xì)胞是未分化干細(xì)胞的看法提出質(zhì)疑(Morsehead等，神經(jīng)元131071)。
WO 97/44442(Johe)公開(kāi)了從哺乳動(dòng)物CNS，更具體地從覆蓋側(cè)腦室的紋狀體室管膜下區(qū)分離干細(xì)胞的方法。然而，僅采用了室管膜下細(xì)胞，因此對(duì)于哺乳動(dòng)物室管膜細(xì)胞的本質(zhì)和作用沒(méi)有進(jìn)一步的改變傳統(tǒng)觀點(diǎn)的看法。
WO 95/13364(Weiss等)涉及增殖位于哺乳動(dòng)物CNS腦室附近的CNS前體細(xì)胞的方法。然而，僅公開(kāi)了前體細(xì)胞，沒(méi)有關(guān)于其它細(xì)胞階段如干細(xì)胞的內(nèi)容。
在本文中，令人感興趣的是注意到除了嗅球和海馬之外，關(guān)于整個(gè)成年期哺乳動(dòng)物腦其它區(qū)域中持續(xù)神經(jīng)發(fā)生的資料很少。作為神經(jīng)發(fā)生可能是一種更為普遍現(xiàn)象的例子，已從紋狀體和隔膜分離了能體外產(chǎn)生神經(jīng)元的少數(shù)細(xì)胞(Palmer等，分子細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)6474)，盡管未測(cè)定過(guò)這些細(xì)胞是否具有干細(xì)胞性質(zhì)或是否它們是神經(jīng)元祖細(xì)胞。
越來(lái)越多的證據(jù)說(shuō)明神經(jīng)系統(tǒng)損傷可影響成年CNS中的干細(xì)胞。在脊髓和腦損傷之后，nestin表達(dá)在覆蓋中央管的細(xì)胞和腦室下區(qū)中均增加(Frisén等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)131453，Holmin等，歐洲神經(jīng)科學(xué)雜志(Eur.J.Neurosic.)965)。提示這些細(xì)胞來(lái)源于干細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，可觀察到來(lái)源于中央管和側(cè)腦室的nestin表達(dá)細(xì)胞日益增多，而且這些細(xì)胞表達(dá)星形細(xì)胞標(biāo)志(Frisén等，細(xì)胞生物學(xué)雜志131453，Holmin等，歐洲神經(jīng)科學(xué)雜志965)。這些數(shù)據(jù)提示腦室系統(tǒng)附近的干細(xì)胞或祖細(xì)胞被誘導(dǎo)增殖，向損傷部位遷移并分化成星形細(xì)胞。而且，海馬損傷促進(jìn)海馬祖細(xì)胞的增殖并增加海馬顆粒神經(jīng)元的數(shù)目(Gould等，神經(jīng)科學(xué)(Neurosci.)80427)。然而，由于干細(xì)胞一直未獲得鑒定或確切定位，所以干細(xì)胞是否在損傷過(guò)程起作用仍不清楚。
Doetsch等(細(xì)胞(Cell)97703)最近試圖分析成年腦側(cè)腦室壁中的神經(jīng)干細(xì)胞的性質(zhì)。他們提供了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)。GFAP在許多星形細(xì)胞中表達(dá)，Doetsch等得出他們所述的干細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞。然而，他們和其它研究組的大量實(shí)驗(yàn)明確地說(shuō)明GFAP在若干其它細(xì)胞類(lèi)型中也表達(dá)，如某些肝細(xì)胞、無(wú)髓神經(jīng)膜細(xì)胞、伸長(zhǎng)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞。這使得不可能根據(jù)GFAP的表達(dá)得出他們描述的干細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)論。Doetsch等或任何其它研究組均未證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異標(biāo)志。
WO 99/16863公開(kāi)了從哺乳動(dòng)物多能神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生造血細(xì)胞。因此，可給白血病、淋巴瘤或免疫缺陷患者施用神經(jīng)干細(xì)胞，而無(wú)需骨髓移植。然而，該文獻(xiàn)完全未涉及其它器官的再生。
因此，在哺乳動(dòng)物成年CNS中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的存在是重要的，而且使得可開(kāi)發(fā)刺激產(chǎn)生新神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的策略。然而，幾個(gè)重要的問(wèn)題尚未回答，而且需要培養(yǎng)這些細(xì)胞和體內(nèi)定量研究這些細(xì)胞的更好方法。最重要的是，在成年CNS中鑒定和定位于細(xì)胞是絕對(duì)關(guān)鍵的，以便能進(jìn)一步研究干細(xì)胞和從這些細(xì)胞刺激產(chǎn)生新神經(jīng)元。
而且，目前沒(méi)有在組織培養(yǎng)早期階段純化干細(xì)胞的方法。盡管已有一些在其它組織中純化細(xì)胞群體的一般方法，但是沒(méi)有對(duì)干細(xì)胞真正本質(zhì)的了解，不可能利用這些方法或開(kāi)發(fā)新方法。為了篩選藥物化合物需要進(jìn)一步研究更好地闡明的細(xì)胞群體。而且，需要開(kāi)發(fā)體內(nèi)標(biāo)記和跟蹤干細(xì)胞和其后代的定量方法，以便詳細(xì)研究例如產(chǎn)生新神經(jīng)元的調(diào)節(jié)，以分析不同化合物的作用或?qū)@些干細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作。盡管本領(lǐng)域已有可用于體內(nèi)跟蹤其它細(xì)胞類(lèi)型的方法，但是不可能利用這些方法或開(kāi)發(fā)新方法跟蹤干細(xì)胞，因?yàn)楦杉?xì)胞的本質(zhì)仍不清楚。在神經(jīng)變性疾病和CNS損傷動(dòng)物模型中跟蹤干細(xì)胞及其后代的定量方法的開(kāi)發(fā)將開(kāi)辟在人疾病中篩選新的治療策略的可能性，目前這些疾病僅可減輕一些癥狀而不是神經(jīng)元損傷本身。
因此，本領(lǐng)域的一個(gè)問(wèn)題是即使已知神經(jīng)干細(xì)胞存在，其定位和本質(zhì)仍然未知。如果回答了該問(wèn)題，旨在達(dá)到上述目標(biāo)的研究將會(huì)獲得巨大的進(jìn)步。
定義在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指從動(dòng)物或人分離并純化至至少約10％，優(yōu)選至少約30％，更優(yōu)選至少約50％，最優(yōu)選至少約60％如約80％的細(xì)胞部分。在本發(fā)明這方面的一個(gè)具體實(shí)施方案中，分離細(xì)胞的純度是接近100％，如約90％。在純度約90％的這種細(xì)胞群體中，也許僅約4％的干細(xì)胞清楚地作為“活躍”干細(xì)胞，而其余干細(xì)胞是靜止的，盡管它們可能具有轉(zhuǎn)化成這種“活躍”干細(xì)胞的能力?！盎钴S”干細(xì)胞定義為可自我更新的多能細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)干細(xì)胞”涉及在適當(dāng)條件下如在含有適當(dāng)促細(xì)胞分裂劑的培養(yǎng)基中能產(chǎn)生未分化細(xì)胞的聚集體即所謂的神經(jīng)球的細(xì)胞?！笆夜苣ぜ?xì)胞”是指部分或完全存在于CNS腦室系統(tǒng)的室管膜層中的任何細(xì)胞或位于別處的相同類(lèi)型細(xì)胞。本文中“室管膜細(xì)胞”定義為包括任何具有從出生后CNS組織室管膜細(xì)胞層分離的室管膜細(xì)胞特征的任何細(xì)胞。在本文中應(yīng)理解，表征本發(fā)明干細(xì)胞的特征是產(chǎn)生新干細(xì)胞、前體細(xì)胞或祖細(xì)胞以及新神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力。室管膜神經(jīng)干細(xì)胞也表達(dá)一些能用于分離和鑒定目的的細(xì)胞表面標(biāo)志，如Notch 1(跨膜受體)、Notch 2、Notch 3、CAR(結(jié)合腺病毒的跨膜蛋白，Tomko等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，943352)和CFTR(囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白，Kunzelmann Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.1371)。室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞還包括至少一個(gè)纖毛。本文術(shù)語(yǔ)“成年”用于區(qū)分已在胚胎中鑒定的神經(jīng)干細(xì)胞和來(lái)自出生后哺乳動(dòng)物的本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞。因此，成年干細(xì)胞本質(zhì)上是非胚胎干細(xì)胞。
對(duì)于本發(fā)明，室管膜組織的離解可優(yōu)選使用選自膠原酶、胰蛋白酶和透明質(zhì)酸酶的酶以及犬尿酸進(jìn)行。室管膜組織也可單獨(dú)通過(guò)機(jī)械分離或聯(lián)合一或多個(gè)上述酶進(jìn)行分離。本發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明涉及成年神經(jīng)CNS干細(xì)胞室管膜干細(xì)胞，換句話說(shuō)是位于室管膜層的神經(jīng)干細(xì)胞。因此本發(fā)明提供神經(jīng)干細(xì)胞，其特征是具有室管膜細(xì)胞的特征。更具體地，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)表面蛋白Notch 1和至少一種選自Notch 2、Notch 3、CAR(結(jié)合腺病毒的跨膜蛋白)和CFTR(囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白)的表面蛋白，而且該細(xì)胞還包含至少一個(gè)纖毛。
在第二方面，本發(fā)明涉及從成年或出生后CNS組織分離室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞的方法，該方法優(yōu)選包括解離室管膜組織和從中回收所述室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞。所述解離可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員容易選擇的任何適當(dāng)方法進(jìn)行。細(xì)胞通過(guò)采用適當(dāng)技術(shù)與存在的任何不需要的物質(zhì)分離來(lái)回收，所述不需要的物質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量根據(jù)獲得組織所用程序和條件不同而有不同。
因此，本發(fā)明的這一方面依賴(lài)于從出生后CNS組織分離特定類(lèi)型細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，這可通過(guò)各種方式實(shí)現(xiàn)。因此，例如如上所述，室管膜細(xì)胞層可從神經(jīng)組織解剖下來(lái)，然后處理以從中分離室管膜細(xì)胞。因此，室管膜組織可選擇性地解離，并從中分離或回收室管膜干細(xì)胞。
此外，室管膜干細(xì)胞可從可能含有不同組織類(lèi)型的CNS組織制品中選擇性分離。因此，例如，可解剖含有室管膜細(xì)胞層以外組織的較大區(qū)域腦組織，并通過(guò)例如僅回收具有室管膜細(xì)胞特征的細(xì)胞從中選擇性地分離室管膜細(xì)胞。如下文所詳述，這可通過(guò)例如使用親和分離技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中親和分離技術(shù)使用對(duì)室管膜細(xì)胞特異細(xì)胞表面標(biāo)志具有特異性的親和試劑。
因此，室管膜干細(xì)胞優(yōu)選解離成單個(gè)細(xì)胞，然后分離。這通過(guò)從所述方法獲得的細(xì)胞中篩選顯示室管膜神經(jīng)干細(xì)胞至少一個(gè)特征或特性的細(xì)胞來(lái)提供?，F(xiàn)有技術(shù)中已描述了成年的神經(jīng)干細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)主要條件決定最佳篩選方法。
在本方法的一個(gè)有利實(shí)施方案中，組織是從所述人或動(dòng)物腦或脊髓的室系統(tǒng)壁的室管膜層收集的。通過(guò)任何適當(dāng)傳統(tǒng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地進(jìn)行組織的這種解剖和回收。解離步驟可使用任何適當(dāng)方法進(jìn)行，如酶和/或機(jī)械處理，而且只要結(jié)果獲得期望的單個(gè)細(xì)胞，解離步驟不受任何限制。這些方法的例子是例如研磨、胰蛋白酶處理、膠原酶處理和透明質(zhì)酸酶處理。最優(yōu)選地，解離通過(guò)用胰蛋白酶處理進(jìn)行。組織解離也可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮主要條件容易選擇的任何其它方法來(lái)進(jìn)行。
如上所述，所獲細(xì)胞如單個(gè)細(xì)胞的篩選可根據(jù)所用室管膜細(xì)胞的特征、特性或性質(zhì)按任何適合的方法進(jìn)行。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，篩選使用了特異細(xì)胞表面標(biāo)記例如蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種表面蛋白質(zhì)的表達(dá)可以是例如以前曾在文獻(xiàn)中公開(kāi)過(guò)但是在其它背景下公開(kāi)的Notch1、Notch2和/或Notch3受體的表達(dá)。在該方法的最優(yōu)選實(shí)施方案中，篩選表達(dá)Notch1受體的單個(gè)細(xì)胞。在本發(fā)明該方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)細(xì)胞的篩選使用了先已標(biāo)記的室管膜細(xì)胞。這種標(biāo)記可是染料和有利的熒光標(biāo)記例如實(shí)施例1所述的Dil。Dil曾在其它背景中公開(kāi)過(guò)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。細(xì)胞的標(biāo)記在研究及診斷方法中均有廣泛的使用，因此技術(shù)人員將容易選擇合適的技術(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案，可使用病毒，例如腺病毒或慢病毒。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞的制品。這種制品可通過(guò)本文中公開(kāi)的任何分離方法獲得。該制品包括神經(jīng)干細(xì)胞，其含量至少約10％，如10-50％，如約35％，或在優(yōu)選實(shí)施方案中高達(dá)90％，或最優(yōu)選基本純的培養(yǎng)物。優(yōu)選地，至少約4％的這些細(xì)胞是完全活躍干細(xì)胞。自然，根據(jù)所選擇的篩選方法可獲得高得多的濃度。以前，在現(xiàn)有技術(shù)操作中，分離腦的各部分并加入特定的生長(zhǎng)因子以誘導(dǎo)特定細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)。這些操作可能最終產(chǎn)生相對(duì)高濃度的細(xì)胞，然而需要幾天的生長(zhǎng)。最重要的是，這些操作從未力圖在培養(yǎng)過(guò)程的早期階段獲得純的干細(xì)胞群體，因?yàn)樵诒景l(fā)明之前干細(xì)胞的本質(zhì)和特征(例如特異的細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá))是未知的。因此，事實(shí)上，本方法產(chǎn)生了所需濃度的以前未曾鑒定和/或定位的細(xì)胞類(lèi)型，即本文所公開(kāi)的室管膜干細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該產(chǎn)物含有約90-95％的室管膜神經(jīng)干細(xì)胞。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，該方法的產(chǎn)物是幾乎完全由(即約100％的)室管膜神經(jīng)干細(xì)胞組成的細(xì)胞部分。因此，本方面還涉及通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的分離的神經(jīng)干細(xì)胞以及分離的神經(jīng)干細(xì)胞的任何部分。
在另一方面，本方法制備的室管膜神經(jīng)干細(xì)胞可以被遺傳修飾。可進(jìn)行操作以修飾細(xì)胞的各種性狀，例如使其更適應(yīng)或抵抗特定的環(huán)境條件、誘導(dǎo)其產(chǎn)生一或多種特定物質(zhì)，例如可改善細(xì)胞的生存能力或可用作藥物的物質(zhì)。關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的這些被操作細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)和可能性的進(jìn)一步細(xì)節(jié)將在以下的“討論”部分給出。為了使細(xì)胞更適合用于移植，例如避免受體對(duì)它的排斥可進(jìn)行一些這樣的遺傳改變(關(guān)于基因治療操作的論述參見(jiàn)，如Anderson，科學(xué)256808；Nabel和Felgner TIBTECH 11211；Mitani和Caskey TIBTECH 11162；Mulligan Science 926；DillonTIBTECH 11167；Miller自然(Nature)357455；Van Brunt生物技術(shù)(Biotechnology)6(10)1149；Vigne Restorative Neurology andNeuroscience 835；Kremer和Perricaudet英國(guó)醫(yī)學(xué)通報(bào)(BritishMedical Bulletin)51(1)31；Haddada等，微生物和學(xué)和免疫學(xué)最新主題(Current Topics in Microbiology and Immunology)，Doerfler和Bhm(編)Springer-Verlag，德國(guó)Heidelberg；和Yu等，基因治療(GeneTherapy)113)。因此，本發(fā)明還包括基因治療方法，其中使用神經(jīng)干細(xì)胞以及欲在這些方法中使用的含有根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的制品。這些基因治療方法可用于治療和/或預(yù)防CNS神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞受損傷或缺陷的任何疾病。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有用于治療的神經(jīng)干細(xì)胞的組合物，例如作為藥物。此外，本發(fā)明還涉及神經(jīng)干細(xì)胞在制備治療制劑如藥物中的應(yīng)用，以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)如腦的神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)膠質(zhì)發(fā)生。該調(diào)節(jié)可是誘導(dǎo)性的或抑制性的，治療可針對(duì)帕金森癥、Alzheimer病、中風(fēng)、腦外傷等。對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，該藥物可用于治療多發(fā)性硬化癥和其它神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)病癥。這些組合物還可用于產(chǎn)生其它組織，例如含有心臟心房和心室壁的心肌膜、背主動(dòng)脈、和生殖嵴原基和中腎小管。其它可產(chǎn)生的器官例子有眼睛的視柄、視網(wǎng)膜層和晶狀體，內(nèi)耳，肝，胰臟和其它內(nèi)分泌器官。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的這些方面使用由上述方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞，甚至為了本目的本發(fā)明還包括任何神經(jīng)干細(xì)胞的使用，例如遺傳修飾的神經(jīng)干細(xì)胞。
因此，本發(fā)明涉及含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的室管膜神經(jīng)干細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑。根據(jù)本發(fā)明的這些制劑可適于注射至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的適合部位。這種藥物制劑包括任何適當(dāng)?shù)妮d體，例如水性載體如緩沖鹽等。該制劑的活性組分一般是無(wú)菌的而且沒(méi)有任何不需要的物質(zhì)。此外，該制劑可包含為接近生理狀態(tài)所需要的藥物學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑等。該制劑中本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞的濃度將根據(jù)應(yīng)用目的而不同，因此其劑量由病人的醫(yī)師來(lái)決定。所用神經(jīng)干細(xì)胞可通過(guò)本方法和任何其它適當(dāng)方法分離或以任何其它方式獲得。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明干細(xì)胞可被遺傳操作，以特別適用于其目標(biāo)用途。
在另一方面，本發(fā)明的細(xì)胞可施用給病人，其中這種施用是治療上有用的。另外，通過(guò)施用本發(fā)明的細(xì)胞，本發(fā)明的細(xì)胞可用于替換或補(bǔ)充患者的相應(yīng)細(xì)胞類(lèi)型。本發(fā)明的細(xì)胞可用于包被植入物，從而充當(dāng)植入物和患者之間的屏障。本發(fā)明細(xì)胞的施用可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。
在另一方面，本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的室管膜神經(jīng)干細(xì)胞的動(dòng)物如小鼠。這些動(dòng)物可用作例如研究或測(cè)試新藥物的模型。
在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明干細(xì)胞用作“藥物靶標(biāo)”，優(yōu)選用于體外實(shí)驗(yàn)，以刺激干細(xì)胞產(chǎn)生特定神經(jīng)元表型或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞亞型。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及所述細(xì)胞在新神經(jīng)元體外培養(yǎng)中的應(yīng)用。該應(yīng)用可涉及例如培養(yǎng)分離的神經(jīng)干細(xì)胞，見(jiàn)如下“討論”部分詳述。本發(fā)明還涉及通過(guò)上述應(yīng)用獲得的物質(zhì)。
在另一方面，本發(fā)明涉及優(yōu)選在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中用于評(píng)價(jià)腦的各個(gè)區(qū)域的神經(jīng)元發(fā)生和干細(xì)胞后代的遷移流的無(wú)偏定量或定性方法，優(yōu)選定量方法，以及用于分析遷移至各腦區(qū)的干細(xì)胞和其后代總數(shù)的技術(shù)。這可用于開(kāi)發(fā)新的篩選方法，這些方法正如所附權(quán)利要求中定義的一樣屬于本發(fā)明的范疇。如果適合正電子掃描斷層攝影技術(shù)(PET)或其它能以足夠分辨率顯現(xiàn)活體大腦的成像系統(tǒng)的室管膜細(xì)胞標(biāo)記的開(kāi)發(fā)允許診斷人CNS中干細(xì)胞后代的缺陷遷移和/或分化，這可以用于診斷患神經(jīng)變性疾病的患者。因此，本發(fā)明還涉及實(shí)施這些方法的試劑盒和分析方法，以及由本發(fā)明方法獲得的物質(zhì)。
在最后一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療患神經(jīng)變性疾病的人或動(dòng)物的方法，該方法包括給所述人或動(dòng)物施用藥物學(xué)上有效劑量的室管膜神經(jīng)干細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，該方法是基于施用具有完整功能并能根據(jù)人CNS疾病產(chǎn)生神經(jīng)元或其它細(xì)胞類(lèi)型的本發(fā)明的室管膜神經(jīng)干細(xì)胞?；蛘?，可將體外干細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞施用于CNS。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療和/或防止人或動(dòng)物患者的神經(jīng)變性病癥的方法，其中現(xiàn)有缺陷神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生新神經(jīng)元并遷移至合適目的地的能力被修復(fù)。該方法是基于施用可刺激和誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞自身性質(zhì)和產(chǎn)生神經(jīng)元能力的物質(zhì)。或者，該方法可基于施用確實(shí)抑制神經(jīng)元變性過(guò)程的物質(zhì)。
因此，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的適于移植位點(diǎn)的任何方法將本發(fā)明的細(xì)胞移植給患者，以治療疾病或損傷。
本發(fā)明細(xì)胞的施用方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、和硬膜外途徑。本發(fā)明的細(xì)胞可通過(guò)任何方便的途徑例如輸注或大團(tuán)注射、通過(guò)上皮或皮膚粘膜表層(如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)的吸收來(lái)施用，也可聯(lián)合其它生物活性試劑一起施用。施用可是系統(tǒng)的或局部的。此外，可能希望使用任何合適的途徑，包括腦室內(nèi)和鞘內(nèi)注射，將本發(fā)明細(xì)胞導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；腦室內(nèi)注射可使用例如與儲(chǔ)液器例如Ornmaya儲(chǔ)液器相連的腦室內(nèi)導(dǎo)管來(lái)進(jìn)行。
可能希望給需要治療的位置局部施用本發(fā)明的細(xì)胞；這可通過(guò)例如但不限于手術(shù)中的局部注入、局部涂藥例如聯(lián)合手術(shù)后的傷口敷料、注射、通過(guò)導(dǎo)管或植入物來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述植入物是多孔、非多孔或凝膠狀物質(zhì)，包括膜如sialastic膜，或纖維。
以下描述示例性方法，其可被修飾用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的移植分離和移植人胚胎組織的操作已有報(bào)道，而且進(jìn)行了涉及這些研究的臨床實(shí)驗(yàn)。例如，Lindvall，科學(xué)247574，曾描述過(guò)關(guān)于移植物和胚胎多巴胺神經(jīng)元在移植入大腦后的存活的結(jié)果。如需要，可通過(guò)對(duì)Lindvall，Arch.Neurol.46615中所述方法的改換進(jìn)行前體細(xì)胞的洗滌和部分解離。
作為例子，細(xì)胞植入大腦可按如下方法進(jìn)行。使用立體定向技術(shù)在左殼(豆?fàn)詈?三個(gè)位置進(jìn)行植入(Lindvall，Arch.Neurol.46615)。對(duì)于每一位置，吸取20l的分離細(xì)胞加至裝置中(外直徑，1.0mm)。細(xì)胞分別沿10、12和14mm線形道按每15-20秒2.5l的量注射。每次注射之間有2分鐘間隔，然后將管子后撤1.5-1.7mm。最后一次注射后，管子在原位保持8分鐘，然后緩慢將其撤出大腦。手術(shù)后，細(xì)胞的存活能力按Brundin，Brain.Res.331251所述方法評(píng)價(jià)。
另一例子見(jiàn)Caplan等，1993，美國(guó)專(zhuān)利5,226,914。簡(jiǎn)要地說(shuō)，從骨髓栓和髓間質(zhì)收獲骨髓細(xì)胞后，通過(guò)離心分離干細(xì)胞。干細(xì)胞通過(guò)選擇性粘附于組織培養(yǎng)皿的塑料或玻璃表面來(lái)進(jìn)一步分離。干細(xì)胞被允許增殖，但不分化。在輕微真空下將由60％的羥基磷灰石和40％的磷酸三鈣構(gòu)成的多孔陶質(zhì)立方體加入細(xì)胞中。在沿裸鼠背部的切口中植入粘有細(xì)胞的立方體。間質(zhì)干細(xì)胞分化成骨。
在治療特定疾病或癥狀中有效的移植細(xì)胞滴度將依據(jù)疾病或癥狀的性質(zhì)決定，并可由標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。此外，可任選地使用體外分析來(lái)幫助確定最佳劑量范圍。在制劑中使用的精確劑量還依賴(lài)于給藥途徑和疾病或病癥的嚴(yán)重性，應(yīng)根據(jù)醫(yī)師的判斷和每個(gè)病人的環(huán)境來(lái)決定。
本發(fā)明還提供含有一或多個(gè)容器的藥物包或盒，這些容器中裝有一或多種本發(fā)明藥物組合物的成分和/或制備本發(fā)明藥物組合物的試劑。按照管理藥物或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式，可任選性地將這些容器與說(shuō)明放在一起，該說(shuō)明反映生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售管理機(jī)構(gòu)對(duì)人體施用的許可。
本發(fā)明的細(xì)胞還可在培養(yǎng)基中維持以用于研究包括醫(yī)學(xué)研究。例如，細(xì)胞可用于篩選具有已知功能的測(cè)試化合物是否具有將本發(fā)明細(xì)胞分化為不同細(xì)胞類(lèi)型的能力。附圖詳細(xì)說(shuō)明

圖1室管膜細(xì)胞的特異標(biāo)記圖示成年前腦和側(cè)腦室壁結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)元遷移(A)。腦室(V)被室管膜細(xì)胞(E)包被。在室管膜層和紋狀體(S)間是腦室下區(qū)域(SVZ)，前體細(xì)胞(淺藍(lán)色)在此分裂產(chǎn)生未成熟神經(jīng)元(深藍(lán)色)。神經(jīng)元遷移至嗅球(藍(lán)箭頭)。(B)室管膜細(xì)胞的標(biāo)記。將Dil立體定位注射至側(cè)腦室，導(dǎo)致整個(gè)腦室系統(tǒng)的室管膜細(xì)胞的標(biāo)記。在一些動(dòng)物中，切口(脊髓橫截面圖中的灰色區(qū)域)位于脊髓的背索中。注射后6小時(shí)Dil標(biāo)記了包被側(cè)腦室(C，D)和脊髓中央管(E)的室管膜層。脈絡(luò)叢(CP)在(C)中被標(biāo)記。圖2嗅球神經(jīng)元和神經(jīng)球的產(chǎn)生在Dil(A，C)或表達(dá)LacZ的復(fù)制缺陷型腺病毒(B，D)注射入對(duì)側(cè)側(cè)腦室后10天，在腦室下區(qū)域(A，B)和嗅球(C，D)中可見(jiàn)標(biāo)記的細(xì)胞。(C)中的插圖顯示βIII-微管蛋白-免疫反應(yīng)性神經(jīng)元中的Dil。亮視野(E)和熒光(F)顯微照相顯示來(lái)自接受腦室內(nèi)Dil注射的動(dòng)物腦的神經(jīng)球。箭頭指示兩個(gè)非常微弱標(biāo)記或未被標(biāo)記的神經(jīng)球。圖3具有室管膜細(xì)胞特異標(biāo)志的神經(jīng)干細(xì)胞的富集側(cè)腦室壁(A)和脊髓(B)中的Notch 1免疫熒光定位。Notch 1免疫反應(yīng)性局限于包被側(cè)腦室和中央管的室管膜細(xì)胞。Notch 1對(duì)室管膜細(xì)胞的選擇性定位使得可以從急性分離的腦和脊髓組織中富集室管膜細(xì)胞。在抗Notch 1的抗血清中孵育分離的細(xì)胞，之后細(xì)胞和連有二抗的磁珠一起孵育，然后磁性分離標(biāo)記的(Notch 1部分)和未標(biāo)記的(洗脫部分)細(xì)胞。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，省掉了最初的抗血清。計(jì)算每一部分的細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)數(shù)不同培養(yǎng)物中產(chǎn)生的神經(jīng)球的數(shù)目(C)。圖4室管膜細(xì)胞的增殖持續(xù)2周施用BrdU后(A，B)或施用兩周BrdU然后停用一周之后(C，D)在側(cè)腦室壁中免疫組化檢測(cè)BrdU。(B)和(D)分別顯示(A)和(C)的細(xì)節(jié)。(B)和(D)中箭頭指示標(biāo)記的室管膜細(xì)胞。圖5損傷誘導(dǎo)室管膜細(xì)胞的增殖施用BrdU 8小時(shí)(A，D-F)或兩周(B，C)后在脊髓中免疫組織化學(xué)檢測(cè)BrdU。(G)為吸收處死前最后8小時(shí)中所施用BrdU的脊髓室管膜細(xì)胞的比例(BrdU標(biāo)記的核/碘丙錠顯示的室管膜細(xì)胞核總數(shù)，在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上n＝3-5只大鼠，誤差線顯示SEM)。圖6脊髓損傷后從室管膜細(xì)胞產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞Dil、nestin和GFAP免疫反應(yīng)性在脊髓中的分布。(D-F)中動(dòng)物在分析前4周接受一次背索損傷。損傷前所有動(dòng)物接受一次腦室內(nèi)Dil注射。(A-F)中Dil和nestin的免疫反應(yīng)性顯示在相同的區(qū)域，GFAP的免疫反應(yīng)性位于臨近區(qū)域。(D)中用虛線顯示了損傷區(qū)域的大概輪廓。(G)顯示了損傷后2周背索中的Dil(紅色)和GFAP(綠色)的免疫反應(yīng)性。黃色信號(hào)顯示了Dil和GFAP免疫反應(yīng)性的共定位。(H)共聚焦激光掃描顯微鏡觀察損傷后2周瘢痕組織中Dil和GFAP的免疫反應(yīng)性。楔形符號(hào)顯示兩個(gè)GFPA免疫反應(yīng)性的Dil標(biāo)記細(xì)胞，箭頭顯示不出現(xiàn)任何可檢測(cè)GFAP信號(hào)的Dil標(biāo)記細(xì)胞。圖7神經(jīng)干細(xì)胞的移植來(lái)自表達(dá)LacZ的轉(zhuǎn)基因小鼠的純化干細(xì)胞移植至成年大鼠的紋狀體。箭頭指示移植細(xì)胞群。(B)顯示(A)的細(xì)節(jié)。圖8成年大鼠中室管膜層干細(xì)胞在黑質(zhì)中產(chǎn)生神經(jīng)元。4個(gè)月前將熒光染料施用給成年動(dòng)物后，嚙齒類(lèi)動(dòng)物中黑質(zhì)致密部的黑質(zhì)酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元(綠色)的顯微照片也標(biāo)記了Dil(紅色)。箭頭指示含有標(biāo)記室管膜神經(jīng)干細(xì)胞的熒光標(biāo)記的兩個(gè)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元。圖9小鼠中腦中室管膜層來(lái)源的干細(xì)胞或其后代的遷移流。箭頭指示Dil標(biāo)記室管膜細(xì)胞的腹側(cè)正中遷移流(紅色細(xì)胞)，到達(dá)中腦黑質(zhì)致密部(*)。SNR＝黑質(zhì)網(wǎng)狀部，IP＝腳間核。箭頭顯示側(cè)位(l)和腹位(v)。分別鑒定了到達(dá)黑質(zhì)致密部的吻部、尾部、中部和側(cè)部的幾個(gè)路徑。除了描述的腹側(cè)正中流，還鑒定了背側(cè)和中線流。圖10定位于室管膜層的干細(xì)胞在小鼠海馬中產(chǎn)生神經(jīng)元。顯微照片說(shuō)明Dil標(biāo)記的室管膜細(xì)胞或其后代遷移至海馬齒狀回的粒細(xì)胞層。箭頭顯示側(cè)位(l)和腹位(v)。圖11(A)中顯示了一個(gè)野生型胚齡11天的胚胎(左)和一個(gè)嵌合胚胎(右)，該嵌合胚胎由成年Rosa26小鼠來(lái)源的腦神經(jīng)干細(xì)胞注射的胚泡產(chǎn)生。在野生型胚胎中有一些與聽(tīng)泡相關(guān)的內(nèi)源性X-gal標(biāo)記。在注射過(guò)的胚胎的幾種組織中，包括例如心臟和CNS，成年神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞的貢獻(xiàn)是明顯的。在(B)中，來(lái)源于羊膜(A)、頭區(qū)(H)、胸區(qū)(Th)或尾區(qū)(C)的lacZ cDNA通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增。說(shuō)明嵌合性的lacZ mRNA的表達(dá)在3個(gè)注射過(guò)的胚胎中被觀察到，而在對(duì)照中則設(shè)有。針對(duì)L19的引物用作內(nèi)對(duì)照。圖12在經(jīng)過(guò)11天胚齡胚胎胸腔的切片中β-半乳糖苷酶(A，B)結(jié)蛋白(C，D)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。(E)和(F)中β-半乳糖苷酶(綠色)和結(jié)蛋白免疫標(biāo)記(紅色)顯示在一起，說(shuō)明在心臟中的共定位。圖13在經(jīng)過(guò)11天胚齡胚胎上腹腔的切片中β-半乳糖苷酶(A)和結(jié)蛋白(B)的免疫標(biāo)記。肝臟顯示強(qiáng)β-半乳糖苷酶表達(dá)(A)。(C)中β-半乳糖苷酶和結(jié)蛋白免疫染色顯示在一起，說(shuō)明在腸中的共定位。(D)顯示腸中β-半乳糖苷酶的免疫標(biāo)記。
之后迅速地將解離的組織通過(guò)一個(gè)70um的尼龍細(xì)胞過(guò)濾器(Falconno.2350)。該混合物在15ml的圓錐形試管中1500rpm離心5分鐘，去掉上清液，在10ml蔗糖-HBSS溶液中重懸沉淀。重懸的沉淀以2000rpm離心10分鐘，去掉上清液，沉淀重懸于2ml 1×EBSS中。在一個(gè)新的15ml的圓錐形試管中裝入12ml BSA-EBSS-HEPES溶液。將2ml細(xì)胞懸浮液小心地加在這12ml溶液的頂部，將所獲混合物以1500rpm離心7分鐘，去掉上清液，細(xì)胞重懸于神經(jīng)球培養(yǎng)基中并在10cm培養(yǎng)皿中鋪板。
上述程序?qū)τ诩顾枋抢硐氲?，因?yàn)樵摲椒ㄈコ舜蠖鄶?shù)髓磷脂。然而，對(duì)于從腦室壁分離的細(xì)胞和小量組織，懸浮于蔗糖中后使用Eppendorf管更適合，而且將獲得更多的細(xì)胞。典型地，沉淀重懸在4ml蔗糖-HBSS溶液中，然后這個(gè)量分裝在4個(gè)1.5ml管中。由此下調(diào)BSA-EBSS-HEPES溶液的體積。5.神經(jīng)球的傳代胰蛋白酶(Life Technologies#45300027)在37℃孵育24小時(shí)。然后用PBS(磷酸鹽緩沖液)稀釋至可在5分鐘內(nèi)神經(jīng)球完全解離的水平(對(duì)每500ml處理物經(jīng)驗(yàn)確定)。
從10cm平板中收集神經(jīng)球，并將其溫和地置于15ml圓錐形管中。一旦球體聚集到管底尖端，去除上清液。然后將神經(jīng)球重懸于1×PBS中，轉(zhuǎn)移至1ml eppendorf管中，待其沉淀。去除上清液，向球體加入500ul胰蛋白酶(37℃)。37℃孵育2分鐘后，用200ul移液管吸頭溫和地抽吸研碎球體，然后靜置另一個(gè)3分鐘。再次研碎球體，使任何剩余的塊狀物或球體沉淀大約30秒。將上部400-500ul胰蛋白酶消化的細(xì)胞移出，置于一個(gè)新的含有等量體積BSA-EBSS-HEPES溶液的eppendorf管中。然后以1500rpm離心細(xì)胞1分鐘，細(xì)胞沉淀重懸于1×PBS中，之后再次以1500rpm離心1分鐘。然后去除上清液，細(xì)胞沉淀重懸于50∶50的神經(jīng)球培養(yǎng)基條件培養(yǎng)基中(條件培養(yǎng)基收集自已在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少1周的神經(jīng)球培養(yǎng)物。通過(guò)0.2um濾膜過(guò)濾，從培養(yǎng)物中移出培養(yǎng)基，然后與等體積的新鮮制備的神經(jīng)球培養(yǎng)基混合)。然后將細(xì)胞鋪在含有相同培養(yǎng)基的細(xì)菌平板上(非組織培養(yǎng)處理的平板)，否則大部分細(xì)胞最初將附著在平板底部，從而抑制新的球體形成。如果需要，24小時(shí)后，可將細(xì)胞重新置于組織培養(yǎng)板上。6.單個(gè)室管膜神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)室管膜細(xì)胞形成神經(jīng)球能力的直接檢測(cè)方法是體外培養(yǎng)單個(gè)室管膜細(xì)胞(Johansson等細(xì)胞9625)。為此，我們通過(guò)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)從解離的側(cè)腦室壁組織分離室管膜細(xì)胞。第一，細(xì)胞必須具有纖毛，室管膜細(xì)胞的一個(gè)顯著形態(tài)學(xué)特征，腦室下區(qū)域來(lái)源的細(xì)胞并不具有該特征。第二，從處死前6小時(shí)接受Dil注射的動(dòng)物中取樣，并僅收集Dil標(biāo)記細(xì)胞。挑出滿足這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至微孔板。在神經(jīng)球條件培養(yǎng)基中每孔培養(yǎng)一個(gè)細(xì)胞。在這些培養(yǎng)物中，58％(192細(xì)胞中的111個(gè))室管膜細(xì)胞經(jīng)歷了細(xì)胞分裂。大多數(shù)這些孔(99孔)中，細(xì)胞在幾天內(nèi)死亡或形成非常小的細(xì)胞群。然而，最初細(xì)胞的6.2％(192個(gè)中的12個(gè))形成了大的神經(jīng)球。向這些神經(jīng)球的培養(yǎng)基中加入血清后，鑒定出表達(dá)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)志的細(xì)胞。這顯示了單個(gè)室管膜細(xì)胞能夠形成可產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)球，即它們是真正的神經(jīng)干細(xì)胞。7.Dil標(biāo)記方法的證實(shí)因?yàn)橐恍┙Y(jié)果決定性地依賴(lài)于室管膜細(xì)胞的Dil特異標(biāo)記，而腦室下區(qū)域的細(xì)胞不標(biāo)記，所以必須排除Dil轉(zhuǎn)移至腦室下區(qū)域的可能性。為了排除室管膜細(xì)胞的Dil的直接細(xì)胞至細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，我們將Dil標(biāo)記的室管膜細(xì)胞與遺傳標(biāo)記的ROSA 26小鼠來(lái)源的細(xì)胞一起共培養(yǎng)。未能觀察到Dil向ROSA 26細(xì)胞的可檢測(cè)轉(zhuǎn)移。為了排除隨時(shí)間發(fā)生的Dil從腦脊髓液向腦室下細(xì)胞的被動(dòng)擴(kuò)散，我們從前一天接受Dil腦室內(nèi)注射的動(dòng)物的側(cè)腦室中吸取腦脊髓液，并將其添加給培養(yǎng)細(xì)胞。我們僅發(fā)現(xiàn)了微弱的標(biāo)記，說(shuō)明Dil的濃度非常低。而且，將該腦脊髓液注射入另一動(dòng)物的側(cè)腦室中，并未導(dǎo)致包被腦室的細(xì)胞的任何標(biāo)記。這些數(shù)據(jù)暗示了腦室內(nèi)注射后側(cè)腦室中的Dil濃度的快速降低，而且腦室下區(qū)細(xì)胞的緩慢被動(dòng)標(biāo)記是非常不可能的。8.通過(guò)細(xì)胞分選純化神經(jīng)干細(xì)胞我們發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育過(guò)程中在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的細(xì)胞表面受體Notch 1蛋白(Kopan等，Trends Genet.13465)在成年大鼠腦和脊髓的室管膜細(xì)胞中選擇性表達(dá)，而不在腦室下區(qū)細(xì)胞中表達(dá)(圖3)。通過(guò)用Notch 1抗血清磁性分選，我們利用Notch 1的該選擇性表達(dá)從急性分離的側(cè)腦室壁和脊髓組織分離室管膜細(xì)胞。對(duì)于磁性分選，按如上收集細(xì)胞，重懸在100ul上面定義組成的細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入1ul抗Notch 1的兔抗血清，并在4℃孵育20分鐘。然后，用6ml DMEM/12洗滌細(xì)胞，細(xì)胞團(tuán)重懸在100ul培養(yǎng)基中，加入30ul(用0.5％BSA的PBS)預(yù)洗滌的磁性珠結(jié)合的抗兔抗血清(1.8-2.1×107個(gè)珠，Dynal)，間歇搖動(dòng)于4℃孵育20分鐘。孵育后，加入2ml培養(yǎng)基，將懸液轉(zhuǎn)移至2ml Eppendorf管中，置于Dynal磁性分離器中2分鐘。將上清收集在35mm未包被的Nunc培養(yǎng)皿中(“洗脫”部分)，然后從分離器取出磁鐵，加入2ml(上述定義的)培養(yǎng)基重懸珠-細(xì)胞懸液，重復(fù)磁性分離步驟。上清又轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板中。取出磁鐵后，加入2ml培養(yǎng)基，重懸剩余的細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至35mm未包被Nunc培養(yǎng)皿中。在整個(gè)過(guò)程中，所有溶液和細(xì)胞懸液均保持冰冷。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5％CO2的潮濕空氣中進(jìn)行。每3-4天更換培養(yǎng)基(組成如上所述)。然后培養(yǎng)吸附(分選的)或未吸附(洗脫部分)磁珠的細(xì)胞，并分析干細(xì)胞的存在。在分離后約4-5天開(kāi)始出現(xiàn)神經(jīng)球。在用Notch1抗血清分選細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)球體在分選部分中形成，但在無(wú)Notch1抗血清的實(shí)驗(yàn)中則沒(méi)有(圖3)。當(dāng)在Notch 1分選部分中形成的球體解離時(shí)它們形成多能的二次球體，證明室管膜細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。
在其它實(shí)驗(yàn)中，用Dil體內(nèi)標(biāo)記室管膜細(xì)胞(見(jiàn)上)之后進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或手工挑選熒光細(xì)胞，獲得室管膜細(xì)胞的高度富集培養(yǎng)物。9.室管膜細(xì)胞具有緩慢的增殖速率并產(chǎn)生過(guò)渡性擴(kuò)增性前體細(xì)胞群基于單次或少數(shù)幾次注射后缺乏標(biāo)記核苷酸的整合，前人的研究指出室管膜細(xì)胞在成年哺乳動(dòng)物中不增殖。干細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特特性是它們?cè)鲋尘徛驇缀醪辉鲋?，人們已采用長(zhǎng)時(shí)期施用標(biāo)記的核苷酸以鑒定其它組織中緩慢循環(huán)的干細(xì)胞。因此，如果通過(guò)單次或少數(shù)幾次注射標(biāo)記的核苷酸來(lái)分析，室管膜細(xì)胞的緩慢增殖速率(如果它們是干細(xì)胞的話將是如此)將有可能被遺漏。為了表征室管膜細(xì)胞的增殖，我們?cè)陂L(zhǎng)時(shí)期內(nèi)持續(xù)提供胸苷類(lèi)似物5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU，Sigma)。我們沒(méi)有采用重復(fù)注射，而是在分析前通過(guò)飲水給成年小鼠施用BrdU 2-6周以上的時(shí)間。為了實(shí)現(xiàn)小鼠腦的長(zhǎng)期標(biāo)記，我們向小鼠的飲水中加入了1mg/ml的BrdU。一周更換兩次水，并用鋁箔避光。BrdU通過(guò)腸道有效攝取，導(dǎo)致側(cè)腦室外側(cè)壁上覆蓋的室管膜細(xì)胞被標(biāo)記。側(cè)腦室頂部和內(nèi)側(cè)壁上覆蓋的室管膜細(xì)胞幾乎不標(biāo)記，說(shuō)明外側(cè)壁是最活躍的神經(jīng)發(fā)生區(qū)。BrdU標(biāo)記細(xì)胞的很大部分存在于腦室下區(qū)(圖4)。腦室下區(qū)中標(biāo)記的細(xì)胞常常緊密成群形成細(xì)胞聚集體，給人的印象是細(xì)胞克隆(圖4)。引人注意的是，在許多情況下，這種細(xì)胞聚集體靠近標(biāo)記的室管膜細(xì)胞(圖4)。在腦室下區(qū)中增殖前體細(xì)胞緊密一起遷移至側(cè)腦室的前側(cè)端，它們?cè)诖诉M(jìn)入吻部遷移流。在大多數(shù)情況下，標(biāo)記室管膜細(xì)胞和腦室下區(qū)細(xì)胞聚集體之間的空間關(guān)系使得室管膜下細(xì)胞向標(biāo)記的室管膜細(xì)胞相關(guān)的吻部遷移流轉(zhuǎn)移(圖4)。
干細(xì)胞增殖速率緩慢的事實(shí)已被用于在其它組織中定位干細(xì)胞。當(dāng)標(biāo)記的核苷酸在長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)施用時(shí)，迅速和緩慢增殖的細(xì)胞均會(huì)被標(biāo)記。通過(guò)在施用標(biāo)記核苷酸之后讓動(dòng)物存活一段時(shí)間，快速增殖的細(xì)胞將有時(shí)間通過(guò)持續(xù)分裂或遷移至別處稀釋標(biāo)記。因此，隨著時(shí)間的推移，只有緩慢增殖的細(xì)胞會(huì)保持標(biāo)記。我們分析了持續(xù)2-6周以上接受BrdU然后2周不接受BrdU的動(dòng)物。在這些動(dòng)物中，在腦室下區(qū)看到的標(biāo)記細(xì)胞非常少，表明大多數(shù)細(xì)胞已通過(guò)重復(fù)分裂或遷移至別處稀釋了標(biāo)記(圖4)。然而，絕大多數(shù)室管膜細(xì)胞仍被標(biāo)記(圖4)。
然后我們研究了脊髓室管膜細(xì)胞的增殖。在通過(guò)飲水長(zhǎng)期使用BrdU后絕大多數(shù)覆蓋中央管的室管膜細(xì)胞被標(biāo)記(圖5)。與側(cè)腦室腦室下區(qū)相比，靠近中央管室管膜緊外邊見(jiàn)到少數(shù)標(biāo)記細(xì)胞(圖5)。然而，靠近中央管的少數(shù)標(biāo)記細(xì)胞常常緊靠標(biāo)記的室管膜細(xì)胞附近，提示該細(xì)胞可能來(lái)自室管膜(圖5)。10.從成年人腦培養(yǎng)室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞從手術(shù)除去癲癇病灶過(guò)程中的兩個(gè)成年患者取出側(cè)腦室壁組織。象用于嚙齒類(lèi)組織的詳述方法一樣，將該組織用酶法解離，以相同方式處理和培養(yǎng)。約1周之后，在培養(yǎng)皿中出現(xiàn)典型的神經(jīng)球。當(dāng)通過(guò)將神經(jīng)球接種在聚-L-鳥(niǎo)氨酸上或加入血清誘導(dǎo)分化時(shí)，可從單個(gè)神經(jīng)球分化出神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞(象嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)一樣，用相同細(xì)胞特異標(biāo)志研究)。11.在確定的腦區(qū)如中腦黑質(zhì)致密部中體內(nèi)分析神經(jīng)發(fā)生的定量方法本發(fā)明人的一些未發(fā)表數(shù)據(jù)使它們假定帕金森病中多巴胺神經(jīng)元壞死的腦區(qū)即黑質(zhì)(Date，Brain Res.Bull.401)代表了存在神經(jīng)元持續(xù)更新的新區(qū)。已采用和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)最新原位立體定位細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)(Gundersen等，APMIS 96857；Janson等，神經(jīng)科學(xué)57931)，并分析了幼年和老年小鼠中黑質(zhì)神經(jīng)元的總數(shù)和相同區(qū)域凋亡神經(jīng)元的總數(shù)。簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明人的未發(fā)表結(jié)果(Janson等)表明幼年和老年小鼠具有相同數(shù)量的黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元，盡管少數(shù)通過(guò)凋亡自然死亡。同時(shí)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如上所述的神經(jīng)元祖細(xì)胞的標(biāo)志nestin存在于黑質(zhì)神經(jīng)元一個(gè)亞群中(未發(fā)表數(shù)據(jù)，Janson等)。這些數(shù)據(jù)綜合起來(lái)表明持續(xù)神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)凋亡之間可能存在平衡，即神經(jīng)元更新(見(jiàn)下文)。定量方法允許體內(nèi)篩選增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生和/或神經(jīng)元遷移的物質(zhì)。
如上述實(shí)施例所述，通過(guò)腦室內(nèi)注射給成年大鼠和小鼠施用Dil。在注射后不同時(shí)間間隔(數(shù)小時(shí)至數(shù)月)，給動(dòng)物穿心灌注15ml 0.9％生理鹽水，然后在5分鐘內(nèi)灌注50ml+4℃含4％(w/v)多聚甲醛和0.4％(v/v)苦味酸的0.1M pH 6.9的磷酸緩沖鹽水。取腦后，將組織在相同固定液中再固定90分鐘，并在緩沖蔗糖中+4℃防凍處理(10％24小時(shí)，30％ 2天)。采用系統(tǒng)均勻隨機(jī)抽樣設(shè)計(jì)，用恒冷切片機(jī)對(duì)整個(gè)中腦切片，其中將40um厚的額切片分成6個(gè)平行吻尾系列。一個(gè)系列切片保持在0.1MPBS中，使用前人描述過(guò)的修改程序(Singleton等，Neurosci.Meth.6447)將熒光信號(hào)迅速轉(zhuǎn)換成持久的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)信號(hào)。這樣，取樣的新切的自由漂浮切片浸泡在含1％H2O2的0.1M Tris(pH8.2)中10分鐘，然后在不含H2O2的緩沖液中洗滌。然后將組織在黑暗中與過(guò)濾的DAB(溶解于pH8.2的Tris緩沖液，濃度1.5mg/ml)于4℃孵育60分鐘，在Tris緩沖液中洗滌，之后放置在玻璃載片上，用新鮮DAB溶液覆蓋，在光轉(zhuǎn)換過(guò)程中該溶液每30分鐘用新鮮溶液替換。在每個(gè)取樣載片上鑒定黑質(zhì)，在表面熒光顯微鏡(Nikon)下使用10×物鏡和若丹明濾光片用紫外光照射切片。仔細(xì)評(píng)價(jià)光轉(zhuǎn)換過(guò)程，當(dāng)用褐色DAB產(chǎn)物顯現(xiàn)了黑質(zhì)中所有信號(hào)時(shí)，采用抗生物素蛋白-生物素-免疫過(guò)氧化酶系統(tǒng)(Vector)(Janson等，神經(jīng)科學(xué)57931)用多巴胺神經(jīng)元標(biāo)志(酪氨酸羥化酶)(Vector SG，Vector)對(duì)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記。相反，5個(gè)平行系列切片貯存在含30％蔗糖的0.1M PBS中，保存于-20℃，直到它們用免疫組織化學(xué)方法處理和用數(shù)個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元(和適當(dāng)對(duì)照)標(biāo)志在共聚焦激光掃描顯微鏡中分析以測(cè)定黑質(zhì)致密部Dil標(biāo)記的細(xì)胞的神經(jīng)元表型(圖8)。在雙側(cè)SNc中對(duì)用間甲酚紫反染的TH免疫反應(yīng)細(xì)胞體(TH/CV+神經(jīng)元)和含有Dil標(biāo)記的TH免疫反應(yīng)細(xì)胞體的總數(shù)進(jìn)行定性估計(jì)。神經(jīng)元計(jì)數(shù)通過(guò)編碼切片和立體化邏輯技術(shù)、光學(xué)分離器(Janson等，神經(jīng)科學(xué)57931)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，吻尾部的無(wú)偏取樣切片用CAST-Grid系統(tǒng)(Computer Assisted Stereological Toolbox，Olympus，Albertslun d，Denmark)進(jìn)行分析，它在帶有一個(gè)機(jī)動(dòng)標(biāo)本臺(tái)的Olympus BH2顯微鏡上包括一個(gè)攝影機(jī)和一個(gè)指針測(cè)微計(jì)以監(jiān)測(cè)z-軸上的運(yùn)動(dòng)(Heidenhain，Traunreut，德國(guó))；二者均與帶有GRID軟件和高分辨顯示器的PC機(jī)相連。在低放大倍數(shù)對(duì)準(zhǔn)每個(gè)取樣切片的SNc區(qū)域后，在高放大倍數(shù)(100×浸油，數(shù)值孔徑1.4)進(jìn)行分析。這使得當(dāng)焦點(diǎn)在組織中移動(dòng)時(shí)能在密集生長(zhǎng)的觀察區(qū)域清楚地觀察到單個(gè)細(xì)胞，所述組織憑視覺(jué)切成薄片并用分辨率為0.5μm的指針測(cè)微計(jì)來(lái)測(cè)定。進(jìn)行計(jì)算機(jī)化、均一的系統(tǒng)隨機(jī)小量取樣(切片厚度6-9um)；在完整黑質(zhì)區(qū)的已知部分中對(duì)滿足立體學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的取樣量中的有核神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。正如以前的報(bào)道所述(Chan等，J.Pharmacol.Exp.Ther.280439)，如果在細(xì)胞體和/或其樹(shù)突中顯示Nissi染色的核周質(zhì)和TH免疫反應(yīng)性，則對(duì)黑質(zhì)神經(jīng)元計(jì)數(shù)。在光轉(zhuǎn)換Dil信號(hào)的系列切片中，對(duì)含有Dil的TH+神經(jīng)元計(jì)數(shù)(在3,600×評(píng)價(jià))。確定在不同類(lèi)別中每次估計(jì)標(biāo)記神經(jīng)元總數(shù)的誤差系數(shù)。獲得的計(jì)數(shù)獨(dú)立于處理過(guò)程中組織的任何二維變化，如收縮，其在z軸測(cè)定。將不同時(shí)間點(diǎn)(幾小時(shí)到60天)以黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的總數(shù)對(duì)時(shí)間作圖，從回歸曲線(r2＝0.97)發(fā)現(xiàn)每周該腦區(qū)產(chǎn)生175個(gè)新神經(jīng)元，這是小鼠中黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元總數(shù)的約1％。
表征了數(shù)個(gè)到達(dá)黑質(zhì)致密部不同部分的Dil標(biāo)記細(xì)胞的遷移流(以前未知，圖9)。采用熒光顯微鏡細(xì)胞計(jì)數(shù)的修改程序，測(cè)定了每個(gè)確定遷移流中細(xì)胞的總數(shù)。在飲水長(zhǎng)期給藥(1mg/ml，見(jiàn)上述實(shí)施例，或通過(guò)重復(fù)腹膜注射BrdU)動(dòng)物中的BrdU標(biāo)記，證實(shí)了Dil標(biāo)記神經(jīng)元的確是新產(chǎn)生的這一解釋。而且，在一些同時(shí)顯示從紋狀體中神經(jīng)末端區(qū)逆行轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞體標(biāo)記(FluoroGold)的TH+黑質(zhì)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)Dil和/或BrdU，支持了“新”神經(jīng)元是有功能的并對(duì)投射神經(jīng)元產(chǎn)生適當(dāng)神經(jīng)元突起的證據(jù)。12.標(biāo)記室管膜干細(xì)胞的后代包括數(shù)個(gè)腦區(qū)中不同表型的神經(jīng)元使用上述體內(nèi)熒光標(biāo)記程序，我們鑒定了Dil標(biāo)記細(xì)胞鑒定為神經(jīng)元的數(shù)個(gè)腦區(qū)。這些區(qū)域包括海馬的數(shù)部分(包括齒狀回的顆粒層(圖10))、皮層和皮層下結(jié)構(gòu)如丘腦下區(qū)和黑質(zhì)網(wǎng)狀部中推測(cè)的含有γ-氨基丁酸(GABA)的神經(jīng)元以及縫腦核中5-羥色氨神經(jīng)元和藍(lán)斑中去甲腎上腺素能神經(jīng)元。13.體外產(chǎn)生遺傳修飾的干細(xì)胞遺傳修飾的干細(xì)胞通過(guò)如上培養(yǎng)干細(xì)胞然后用表達(dá)質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染這些干細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。對(duì)于每次轉(zhuǎn)染，在含有200ul培養(yǎng)基(見(jiàn)上)的12×75mm圓錐形管(15ml)中加入4ug DNA(該方法用Clontech的質(zhì)粒CMV-GFP建立，以綠色熒光蛋白(GFP)作為報(bào)告基因)，并輕輕混合。在含有200ul培養(yǎng)基的第二個(gè)圓錐形管中加入15ul脂轉(zhuǎn)染胺試劑并輕輕振蕩混合。然后將第二溶液加入第一溶液中使兩溶液混合，于室溫孵育45分鐘以形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。然后向含DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的管中加入1.6ml培養(yǎng)基，并將該溶液鋪在細(xì)胞(已小心除去大部分培養(yǎng)基)上。將細(xì)胞孵育12小時(shí)，然后將培養(yǎng)基用無(wú)DNA的正常培養(yǎng)基更換。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)在熒光顯微鏡下檢測(cè)GFP。這些干細(xì)胞可克隆化擴(kuò)增產(chǎn)生遺傳修飾的未分化干細(xì)胞球。14.在干細(xì)胞中體內(nèi)表達(dá)改變的基因如上所述，通過(guò)向側(cè)腦室注射攜帶處于RSV啟動(dòng)子控制下的報(bào)告基因LacZ的復(fù)制缺陷腺病毒，來(lái)進(jìn)行在干細(xì)胞中表達(dá)改變的基因。X-gal染色(見(jiàn)上)顯示在室管膜干細(xì)胞中表達(dá)報(bào)告基因，因此證明在干細(xì)胞中表達(dá)改變的基因的可行性?，F(xiàn)在正在產(chǎn)生攜帶啟動(dòng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(神經(jīng)元存活因子)、bc1-2(一個(gè)改善干細(xì)胞存活的基因)和nurr1(可促進(jìn)從干細(xì)胞產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元)的干細(xì)胞。15.來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的干細(xì)胞的應(yīng)用我們發(fā)現(xiàn)可從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培養(yǎng)干細(xì)胞。對(duì)于這些研究，我們使用基因組中含有LacZ基因的小鼠(Zambrowicz等，美國(guó)科學(xué)院院刊，943789)。這些小鼠在所有組織中全都表達(dá)轉(zhuǎn)基因(Zambrowicz等，美國(guó)科學(xué)院院刊，943789)。按如上所述從這些小鼠純化和培養(yǎng)干細(xì)胞。X-gal染色(見(jiàn)上)揭示轉(zhuǎn)基因的強(qiáng)表達(dá)。16.外傷引起的干細(xì)胞增殖和分化的操作在成年大鼠的中胸水平進(jìn)行椎板切除以暴露脊髓，用小手術(shù)剪橫截切斷背索，然后在背索上切一表面縱向切口以嘴狀擴(kuò)大該損傷。在其它動(dòng)物中，在頭蓋骨上鉆一洞，用鐘頭插入腦組織以產(chǎn)生損傷。在一些動(dòng)物中，在損傷之前1-10天已通過(guò)注射Dil(見(jiàn)上)標(biāo)記了室管膜細(xì)胞。在背索切口之后不同時(shí)間點(diǎn)增殖的室管膜細(xì)胞的比例的定量揭示，與未損傷的動(dòng)物相比損傷后第一天增加幾乎50倍(圖5)。第1天后，在一個(gè)月內(nèi)增殖逐漸降低至正常水平(圖5)。同樣，在腦損傷后側(cè)腦室壁的室管膜細(xì)胞增殖也極大增加。
在脊髓或腦損傷前通過(guò)注射Dil標(biāo)記了室管膜細(xì)胞的動(dòng)物中，在損傷后頭4周內(nèi)室管膜層外觀察到Dil標(biāo)記細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步持續(xù)增加(圖6)。在損傷后1周內(nèi)Dil標(biāo)記細(xì)胞在形成中的瘢痕組織中豐富，并在此保持至少1年。在損傷中形成的瘢痕組織中，絕大多數(shù)Dil標(biāo)記細(xì)胞顯示對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(一種星形細(xì)胞標(biāo)志)的免疫反應(yīng)性，表明大多數(shù)室管膜細(xì)胞后代已分化成星形細(xì)胞(圖6)。然而，在Dil標(biāo)記細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元標(biāo)志，說(shuō)明干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元所需信號(hào)在該動(dòng)物中不存在。17.增加中腦黑質(zhì)致密部中神經(jīng)發(fā)生的化合物給不同小鼠施用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP，RBI，Natick，MA，美國(guó))(用生理鹽水稀釋?zhuān)昧繛?0mg/kg，sc.)。該物質(zhì)已知對(duì)中腦多巴胺神經(jīng)元有選擇性神經(jīng)毒性，在人類(lèi)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中引起帕金森氏綜合征(Langston等，科學(xué)219979，Heikkila等?？茖W(xué)2241451)。然而，該分子也具有已知在帕金森病動(dòng)物模型中充當(dāng)神經(jīng)保護(hù)劑的化合物如尼古丁的共同結(jié)構(gòu)(Janson等，神經(jīng)科學(xué)57931)。
在我們的實(shí)驗(yàn)中，給動(dòng)物施用MPTP或載體，并分析Dil+黑質(zhì)多巴胺細(xì)胞數(shù)或向該腦區(qū)移動(dòng)的Dil+細(xì)胞遷移流的染色模式在時(shí)間過(guò)程中的改變(見(jiàn)上，研究標(biāo)記室管膜細(xì)胞后中腦黑質(zhì)致密部神經(jīng)發(fā)生的定量方法)。該處理導(dǎo)致更高的TH+/Dil+和TH+/BrdU+黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)目，表明神經(jīng)發(fā)生增加。而且，在用MPTP處理的動(dòng)物中，中腦中Dil+細(xì)胞的遷移流似乎更顯著，這可用上述修改的立體定位法來(lái)定量分析。18.室管膜干細(xì)胞的移植按如上所述從Rosa26轉(zhuǎn)基因小鼠腦或脊髓純化和培養(yǎng)室管膜干細(xì)胞。通過(guò)立體定位注射15ul培養(yǎng)基中的干細(xì)胞球(見(jiàn)上)將這些小鼠的未分化干細(xì)胞球移植至成年大鼠的紋狀體。兩天后殺死動(dòng)物，將腦切片，并通過(guò)上述X-gal染色分析來(lái)自Rosa26小鼠的表達(dá)LacZ的細(xì)胞的存在。移植的細(xì)胞在插入孔附近的組織中擴(kuò)散。這些細(xì)胞常常具有數(shù)個(gè)突起(圖7)。19.開(kāi)發(fā)高通量篩選影響神經(jīng)干細(xì)胞分化的物質(zhì)的檢測(cè)方法開(kāi)發(fā)了有效檢測(cè)各種物質(zhì)促進(jìn)室管膜神經(jīng)干細(xì)胞分化成特定神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元表型的能力的測(cè)試系統(tǒng)。然后這些物質(zhì)可按如上簡(jiǎn)述方法進(jìn)行體內(nèi)測(cè)定。20.成年腦神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生所有胚層組織的廣闊潛能20 a.NSC培養(yǎng)按如上所述用酶法解離側(cè)腦室的外側(cè)壁(Johansson等，細(xì)胞，9625)。培養(yǎng)基是含有20ng/ml EGF(Collaborative BiomedicalProducts)、B27補(bǔ)充物(Life Technologies)、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基(Life Technologies)。首次接種細(xì)胞之后每48小時(shí)向培養(yǎng)基中加入EGF(20ng/ml)。
20 b.RNA分析使用RNeasy(Qiagen)提取組織RNA，在制造商推薦的條件下使用Superscript II(Life Technologies)和隨機(jī)六聚物(Phannacia)在50ul反應(yīng)體積中將500 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)在存在2.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl(25℃時(shí)pH8.8)、50mM KCl、0.08％Nonidet P40、每種dNTP各0.2mM、5U Taq DNA聚合酶(Fermentas)、0.1mg/ml BSA、50pmole各寡核苷酸引物和α-32P-dCTP時(shí)進(jìn)行。為使cDNA產(chǎn)量標(biāo)準(zhǔn)化，使用β-半乳糖苷酶編碼cDNA特異的引物和核糖體蛋白L19特異的引物進(jìn)行一個(gè)半定量PCR反應(yīng)。40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃(1分鐘)，64℃(1分鐘)和72℃(1分鐘)，用下列引物對(duì)擴(kuò)增β-半乳糖苷酶正義寡核苷酸5’-TTG GAG TGA CGG CAG TTA TCT GGA-3’(SEQ.ID.NO.1)和反義寡核苷酸5’-TCA ACC ACC GCA CGA TAG AGA TTC-3’(SEQ.ID.NO.2)。25個(gè)循環(huán)后，向反應(yīng)物中加入5U Taq DNA聚合酶，并加入L19特異的寡核苷酸引物作為內(nèi)對(duì)照正義寡核苷酸5’--CCT TGG ACA GAG TCT TGATGA TCT CCT-3’(SEQ.ID.NO.3)和反義寡核苷酸5″-CTT CTC AGG AGA TACCGG GAA TCT AAG-3’(SEQ.ID.NO.4)。20c.免疫組織化學(xué)恒冷切片機(jī)切片和培養(yǎng)細(xì)胞與第一抗體在37℃孵育1小時(shí)或4℃過(guò)夜，PBS洗滌，與第二抗體室溫孵育45分鐘。20d.桑葚胚聚集和胚泡注射初次分離后4至6天內(nèi)用胰蛋白酶消化增殖的細(xì)胞球，并在1×PBS中重懸，用于聚集和顯微注射。
采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和程序，神經(jīng)干細(xì)胞與CD-1桑葚胚聚集或者注射至來(lái)自C57BL小鼠的胚泡中，并將其移植至代孕母體內(nèi)。20e.神經(jīng)干細(xì)胞在胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的整合為了分析成年神經(jīng)干細(xì)胞的分化潛能，通過(guò)將成年神經(jīng)干細(xì)胞導(dǎo)入早期胚胎環(huán)境中并跟蹤其后代的命運(yùn)，我們檢測(cè)了這些細(xì)胞形成不同組織的能力。
來(lái)自分離的成年腦和脊髓組織的多能干細(xì)胞可在一定培養(yǎng)條件下增殖。在這些條件下單個(gè)細(xì)胞增殖，其后代形成聚集細(xì)胞團(tuán)。體外培養(yǎng)幾天后，這些細(xì)胞克隆與培養(yǎng)皿脫離。當(dāng)存在促細(xì)胞分裂素如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)時(shí)，這些細(xì)胞持續(xù)增殖并形成特征性緊密聚集的球形細(xì)胞聚集體，稱(chēng)為神經(jīng)球，所有這些細(xì)胞聚集體均來(lái)自單個(gè)細(xì)胞(Reynolds等，科學(xué)2551707)。
為了最初檢測(cè)成年動(dòng)物來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞是否能在極早期胚胎發(fā)生微環(huán)境中存活，首先將單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞球或許多酶法解離的單個(gè)細(xì)胞與8細(xì)胞致密桑葚胚聚集，并使其在體外繼續(xù)發(fā)育至早期胚泡期。因?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞是從全部表達(dá)來(lái)自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的Rosa26小鼠培養(yǎng)的，所以這些細(xì)胞在固定和染色之后可容易地鑒定。在早期胚泡中許多神經(jīng)干細(xì)胞表現(xiàn)出在滋養(yǎng)外胚層上的附著和增殖(圖11A)。然而，少許細(xì)胞能摻入桑葚胚細(xì)胞中，并且可在發(fā)育中的胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中發(fā)現(xiàn)(圖11B)。由于這些細(xì)胞能成功地與8細(xì)胞期桑葚胚集聚并在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中存活至發(fā)育的早期胚泡期，所以可合理地推測(cè)這些細(xì)胞可能，至少部分地，對(duì)胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形成有貢獻(xiàn)，也可能對(duì)其他組織有貢獻(xiàn)。通過(guò)將神經(jīng)干細(xì)胞直接顯微注射至早期胚泡中可獲得這些細(xì)胞對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)更有效的貢獻(xiàn)。20f.成年神經(jīng)干細(xì)胞可有助于產(chǎn)生嵌合小鼠胚胎為了測(cè)試成年神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生不同組織的能力，將注射了10-20個(gè)單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞的C57/BL6胚泡轉(zhuǎn)移至代孕母體中，并使其發(fā)育至胚胎第11天。胚胎在多聚甲醛中固定，然后用X-gal組織化學(xué)和β-半乳糖苷酶抗體的免疫組化分析lacZ表達(dá)。其他胚胎用RT-PCR檢測(cè)β-半乳糖苷酶mRNA的存在。
檢查染色的E11胚胎全樣載片，以檢測(cè)來(lái)自Rosa26小鼠成年神經(jīng)干細(xì)胞的β-半乳糖苷酶的存在，結(jié)果顯示所分析的胚胎中存在不同程度的嵌合。同窩幼崽中，嵌合程度有很大的變異，在所有幼崽中總是有幾個(gè)胚胎完全沒(méi)有表達(dá)lacZ的細(xì)胞。嵌合胚胎與未嵌合胚胎大小相似，而且沒(méi)有出現(xiàn)明顯的解剖異常。圖11給出了一個(gè)顯示高度嵌合的胚胎和一個(gè)未注射的野生型C57/BL6對(duì)照。初步檢查來(lái)自注射胚泡的胚胎揭示了來(lái)自Rosa26的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)腹側(cè)脊髓、中腦、眼、心臟和許多其他內(nèi)臟器官和組織有顯著的貢獻(xiàn)。顯示來(lái)自Rosa26的神經(jīng)干細(xì)胞較少貢獻(xiàn)的胚胎主要在中腸-后腸連接區(qū)域或心臟中出現(xiàn)染色。在野生型胚胎中常常在聽(tīng)泡和臍靜脈區(qū)域觀察到相對(duì)低水平的內(nèi)源性染色。然而，在所檢查的野生型胚胎的其他區(qū)域沒(méi)有觀察到另外的內(nèi)源性活性。免疫組織化學(xué)標(biāo)記與β-半乳糖苷酶抗血清區(qū)域的重疊證實(shí)了嵌合胚胎中的X-gal染色特異性。野生型胚胎中顯示內(nèi)源性β-半乳糖苷酶樣活性的區(qū)域并不被β-半乳糖苷酶抗血清標(biāo)記。
另外，為了用另一種獨(dú)立的方法測(cè)試來(lái)自Rosa26的細(xì)胞的貢獻(xiàn)，使用RT-PCR在從注射了成年神經(jīng)干細(xì)胞的E11胚胎或從未注射的野生型對(duì)照分離的總RNA中分析β-半乳糖苷酶mRNA的存在。該分析中所用的胚胎橫向切開(kāi)成三部分胚胎的頭部(包括鰓弓)，胸部(鰓弓以下，臍帶以上)和尾部(包括臍帶區(qū)、后肢和尾)。使用β-半乳糖苷酶基因特異的寡核苷酸引物擴(kuò)增每個(gè)胚胎部分的cDNA。在PCR反應(yīng)中還加入兩個(gè)檢測(cè)L19 mRNA(一種核糖體蛋白)特異的其他寡核苷酸引物作為內(nèi)對(duì)照。在來(lái)自未注射胚胎的樣品中沒(méi)有檢測(cè)到β-半乳糖苷酶mRNA，而注射胚胎主要在頭部和含有心臟和中腸的胸區(qū)中觀察到中等信號(hào)。lacZ表達(dá)的這種分布與其他胚胎全樣載片染色檢測(cè)到的β-半乳糖苷酶基因產(chǎn)物表達(dá)模式一致。20g.成年神經(jīng)干細(xì)胞可參與所有胚層組織的產(chǎn)生圖12和13分別顯示在注射了成年神經(jīng)干細(xì)胞的胚胎組織中觀察到最大嵌合程度的嵌合胚胎切片的例子。成年神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)E11小鼠胚胎中一些外胚層來(lái)源的組織有重要貢獻(xiàn)。顱區(qū)內(nèi)，在脊髓的腹側(cè)和中間區(qū)域、端腦終板、間腦漏斗、眼睛的視柄、視網(wǎng)膜層和晶狀體、內(nèi)耳蝸、和鼻板中貢獻(xiàn)最為明顯。然而相比之下胸部區(qū)域內(nèi)，在來(lái)自外胚層的組織中很少能觀察到成年神經(jīng)干細(xì)胞的貢獻(xiàn)，尤其是表皮中。
在來(lái)自限定的胚胎內(nèi)胚層的組織中也可觀察到成年神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)高度嵌合的貢獻(xiàn)。這主要在咽部中觀察到，包括前腸、舌、口腔、咽囊和甲狀腺。在胸區(qū)中，對(duì)來(lái)源于內(nèi)胚層的組織的貢獻(xiàn)也主要在食道、氣管、肺芽、胃、腸、胰臟和肝中明顯。
幾個(gè)中胚層來(lái)源的組織也顯示成年神經(jīng)干細(xì)胞的高水平貢獻(xiàn)。這些組織包括脊索、包含心臟心房和心室壁的心肌膜、背主動(dòng)脈、生殖嵴原基和中腎小管。然而，同樣重要的是，注意到成年神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)發(fā)育中的骨骼肌和骨骼的貢獻(xiàn)相對(duì)低。20h.組織特異性細(xì)胞類(lèi)型的分化為了分析嵌合胚胎中發(fā)現(xiàn)的來(lái)自成年神經(jīng)干細(xì)胞的lacZ表達(dá)細(xì)胞是否分化成它們所整合組織的典型細(xì)胞類(lèi)型，我們研究了正常組成這些組織的細(xì)胞的區(qū)別細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)。采用Tuj1、HB9、酪氨酸羥化酶(TH)、Sonic hedgehog(Shh)、平滑肌肌動(dòng)蛋白和結(jié)蛋白特異的單克隆抗體，我們使用雙免疫組化染色顯示β-半乳糖苷酶的重疊表達(dá)(圖12和13)。這些抗體分別檢測(cè)β-微管蛋白III(特異于軸突微管蛋白)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、多巴胺神經(jīng)元、在腹側(cè)脊髓中發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)生Shh的細(xì)胞、襯在許多動(dòng)靜脈內(nèi)的平滑肌、和心肌及骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的中間纖維?？墒褂闷渌贵w檢測(cè)胰腺的分泌胰島素或胰高血糖素的細(xì)胞與β-半乳糖苷酶的共定位。討論細(xì)胞的死亡是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的共同因素。不同疾病影響不同的細(xì)胞類(lèi)型，例如帕金森癥中的多巴胺神經(jīng)元、肌萎縮性側(cè)索硬化癥中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、多發(fā)性硬化癥中的少突膠質(zhì)細(xì)胞。在其他情況下，例如中風(fēng)或腦外傷，可影響特定的區(qū)域幾種不同細(xì)胞類(lèi)型。目前，臨床實(shí)踐中還沒(méi)有在神經(jīng)系統(tǒng)中刺激產(chǎn)生新細(xì)胞的方法。已臨床檢測(cè)了人胚或動(dòng)物細(xì)胞的移植，取得了一些令人鼓舞的結(jié)果。然而，這些方法有若干問(wèn)題，主要是在倫理和免疫學(xué)方面，這使得它們非常不可能在更多的患者中應(yīng)用。最近認(rèn)識(shí)到，成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在多能干細(xì)胞群體，從而點(diǎn)燃了可在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中從患者自身干細(xì)胞刺激產(chǎn)生新細(xì)胞的希望。然而本領(lǐng)域中一些關(guān)鍵問(wèn)題仍需回答，使其難于進(jìn)展?，F(xiàn)在本發(fā)明干細(xì)胞的鑒定使得可以開(kāi)發(fā)純化、體內(nèi)定量研究、遺傳修飾這些細(xì)胞和體內(nèi)及體外用各種藥物化合物刺激這些細(xì)胞的方法。而且，本發(fā)明證明干細(xì)胞在CNS中沿著新的路徑遷移至各種神經(jīng)解剖細(xì)胞群體中，而且它們能在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。本發(fā)明還包括在不同腦區(qū)評(píng)價(jià)神經(jīng)發(fā)生的無(wú)偏定性方法，以及分析遷移至不同腦區(qū)的干細(xì)胞和其后代總數(shù)的技術(shù)?？偠灾景l(fā)明提供的進(jìn)展大大地增加了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中刺激產(chǎn)生新細(xì)胞的方法的可能性。
改變細(xì)胞中基因表達(dá)可使這些細(xì)胞產(chǎn)生特定蛋白或可防止不需要的蛋白的產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，在體內(nèi)和體外操作細(xì)胞基因在很多情況下是有益的。例如可將表達(dá)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素或任何其他蛋白質(zhì)的工程細(xì)胞移植至需要持續(xù)施用這種蛋白的個(gè)體中，以刺激例如細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)或細(xì)胞存活。因此這些細(xì)胞可用作藥物物質(zhì)的持續(xù)給藥者。用于該用途的細(xì)胞可通過(guò)例如質(zhì)?；虿《据d體的轉(zhuǎn)染進(jìn)行遺傳修飾，或者這些細(xì)胞可來(lái)自轉(zhuǎn)基因生物。含有根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因生物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。而且，通過(guò)使用質(zhì)?；虿《据d體以及反義DNA或RNA片段誘導(dǎo)異?；虮磉_(dá)，可在生物體中原位改變基因表達(dá)。在某些情況下，使用缺乏某種基因或產(chǎn)生更低水平該基因產(chǎn)物的細(xì)胞可能是有價(jià)值的。例如在不同個(gè)體之間移植細(xì)胞或組織受到細(xì)胞表面某些蛋白表達(dá)的限制，這些蛋白可誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)排斥移植物。這是一個(gè)主要問(wèn)題，尤其是兩個(gè)個(gè)體是不同物種時(shí)。解決該問(wèn)題的一個(gè)方法是產(chǎn)生缺乏誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)排斥之基因的遺傳修飾細(xì)胞或動(dòng)物。在體內(nèi)或體外操作細(xì)胞基因表達(dá)的其他重要意義包括誘導(dǎo)未分化細(xì)胞向某種細(xì)胞命運(yùn)分化或通過(guò)抑制內(nèi)在或外在的細(xì)胞死亡信號(hào)刺激該細(xì)胞的存活。而且，通過(guò)導(dǎo)入某些基因有可能使細(xì)胞永生化，并產(chǎn)生具有特定特征的克隆細(xì)胞系。因?yàn)槌赡曛袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)干細(xì)胞的本質(zhì)和定位不清楚，所以以前難于遺傳修飾這些細(xì)胞，特別是在體內(nèi)。在細(xì)胞培養(yǎng)物中純化干細(xì)胞方法的發(fā)明可允許進(jìn)行各種遺傳操作，例如用質(zhì)?；虿《颈磉_(dá)載體轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，或從轉(zhuǎn)基因生物中純化細(xì)胞，或用例如反義DNA或RNA片段抑制基因表達(dá)。干細(xì)胞的體內(nèi)定位允許在這些細(xì)胞中用例如病毒載體原位改變基因表達(dá)。
上文還顯示成年腦的干細(xì)胞可有助于在嵌合小鼠胚胎中形成來(lái)自所有胚層的多種組織。這些神經(jīng)干細(xì)胞的后代表達(dá)它們所整合組織的特異性標(biāo)志，而且這些標(biāo)志在神經(jīng)系統(tǒng)中不表達(dá)。它們以有功能的方式整合和分化。也許最令人震驚的例子是神經(jīng)干細(xì)胞后代常常對(duì)心臟有巨大貢獻(xiàn)；明顯解剖正常的跳動(dòng)的心臟展示了這些細(xì)胞的功能性。細(xì)胞分化的后生控制特異組織中這些干細(xì)胞來(lái)源的祖細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)可能不是自身決定的，而是由這些細(xì)胞暴露于可重復(fù)的一組外部信號(hào)來(lái)決定的，事實(shí)上，在描述神經(jīng)干細(xì)胞后代的特征時(shí)，有越來(lái)越多的證據(jù)說(shuō)明外來(lái)生長(zhǎng)因子可直接改變神經(jīng)干細(xì)胞的命運(yùn)，從而改變之后的分化。如果來(lái)自嚙齒類(lèi)動(dòng)物海馬的克隆干細(xì)胞群體瞬時(shí)暴露于睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)之中，它們將以神經(jīng)元為代價(jià)產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞；如果它們瞬時(shí)暴露于甲狀腺素(T3)中，它們將以神經(jīng)元為代價(jià)產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞。用胚胎或成年神經(jīng)干細(xì)胞得到相同結(jié)果(Johe等.Genes Dev.103129)。這些數(shù)據(jù)提示生長(zhǎng)因子直接影響干細(xì)胞的命運(yùn)導(dǎo)致可形成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞的產(chǎn)生。使用克隆培養(yǎng)的神經(jīng)脊細(xì)胞可觀察到類(lèi)似的結(jié)果；BMP2誘導(dǎo)自主神經(jīng)元的產(chǎn)生；膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)神經(jīng)膜細(xì)胞命運(yùn)，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)誘導(dǎo)平滑肌分化(Shah等，細(xì)胞77349；Shah等.細(xì)胞85331)。這些數(shù)據(jù)提示基因表達(dá)的區(qū)域差別可能不導(dǎo)致分子水平不同的神經(jīng)干細(xì)胞群體，而且神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)內(nèi)在的不同可通過(guò)暴露于外部信號(hào)中容易地被改變。成年神經(jīng)干細(xì)胞是缺乏譜系限制還是脫分化？在早期胚胎中的移植實(shí)驗(yàn)已確定了細(xì)胞限制于某種譜系的時(shí)間點(diǎn)。特定基因組合的表達(dá)確定了特定的命運(yùn)。體外實(shí)驗(yàn)已證明成年神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的潛能。因此在最初考慮時(shí)自然會(huì)推測(cè)成年神經(jīng)干細(xì)胞為了產(chǎn)生不同的細(xì)胞系需經(jīng)過(guò)脫分化。然而，值得注意的是，在賦予細(xì)胞某種譜系標(biāo)識(shí)和限制性所涉及的許多基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中瞬時(shí)表達(dá)。在組織發(fā)育之后，譜系決定基因的表達(dá)可能不是必須的，因?yàn)楦杉?xì)胞群體可被物理限制于該特定組織中，而且該分子環(huán)境可賦予新細(xì)胞組織特異性命運(yùn)。因此，成年中樞神經(jīng)干細(xì)胞可能已喪失其神經(jīng)定向。對(duì)定位于成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的干細(xì)胞全能性的闡明可幫助我們開(kāi)始理解成年神經(jīng)干細(xì)胞或一般干細(xì)胞離開(kāi)其靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)入增殖期以產(chǎn)生具有確定細(xì)胞命運(yùn)的后代所必需的復(fù)雜分子事件。有跡象表明其它干細(xì)胞群體在成年動(dòng)物中比在胚胎中可能具有更寬的分化潛能。例如，移植至腦的造血干細(xì)胞可產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞。這就產(chǎn)生了這種可能性，不同成年組織中的干細(xì)胞可能十分相似并具有接近胚胎干細(xì)胞的潛能。事實(shí)上，在成年生物中可能僅存在一種基本的干細(xì)胞群體。
為了更直接地說(shuō)明來(lái)自成年腦側(cè)腦室壁的神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞潛能，我們將這些細(xì)胞置于早期胚泡微環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中最初來(lái)自所有三個(gè)胚層的多種器官和組織有貢獻(xiàn)。
綜上所述，本發(fā)明將使得在CNS不同疾病中開(kāi)發(fā)新的治療策略成為可能，這些疾病不僅包括具有神經(jīng)變性緩慢進(jìn)程的疾病(包括Alzheimer病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化癥)，也包括頭和脊髓急性外傷的臨床表現(xiàn)以及腦血管疾病。我們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞可轉(zhuǎn)化成數(shù)種不同的神經(jīng)元表型(多巴胺神經(jīng)元、GABA神經(jīng)元、5-羥色氨能神經(jīng)元)以及完全不同的組織類(lèi)型，除了細(xì)胞損失是疾病發(fā)生關(guān)鍵的上述疾病之外，這還開(kāi)辟了可能的新應(yīng)用領(lǐng)域，包括抑郁癥和其它精神病，以及心臟手術(shù)。
本文引用了各種出版物，其公開(kāi)內(nèi)容以參考文獻(xiàn)方式完整并入本文。本發(fā)明不限于旨在闡明本發(fā)明各個(gè)方面的具體實(shí)施方案的范圍，功能上等同的方法和組成成分均包括在本文的范圍內(nèi)。的確除了本文顯示和描述的之外，根據(jù)以上的描述和附圖，本發(fā)明的各種修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。這些修飾應(yīng)當(dāng)包括在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)。
序列表<110>Neuronova AB<120>純化細(xì)胞的方法<130>neuronovapct<140>9802264-3<141>1999-06-24<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因的PCR引物<400>1ttggagtgac ggcagttatc tgga<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因的PCR引物<400>2tcaaccaccg cacgatagag attc<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因的PCR引物<400>3ccttggacag agtcttgatg atctcct<210>4<211>27<213>人工序列<220><223>人工序列的描述大腸桿菌β-半乳糖基因的FCR引物<400>4cttctcagga gataccggga atctaag
權(quán)利要求
1.分離的室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)表面蛋白Notch 1以及至少一種選自Notch 2，Notch 3，CAR(結(jié)合腺病毒的跨膜蛋白)和CFTR(囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白)的表面蛋白，而且該細(xì)胞還含有至少一個(gè)纖毛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞，其來(lái)源于哺乳動(dòng)物，例如嚙齒類(lèi)動(dòng)物或人。
3.從出生后CNS組織中分離室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞的方法，該方法包括從所述CNS組織選擇性分離室管膜細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的分離室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞的方法，其特征在于室管膜組織是解離的室管膜組織并從該組織回收室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于室管膜組織用水解酶例如膠原酶、胰蛋白酶或透明質(zhì)酸酶解離，或用犬尿酸解離。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其特征在于解離室管膜組織所釋放的細(xì)胞在含有EGF和/或FGF的培養(yǎng)基中保持。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6之任一項(xiàng)的方法，其特征在于室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞的回收是通過(guò)針對(duì)至少一種室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞特征篩選單個(gè)細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于篩選存在Notch 1、至少一個(gè)纖毛并表達(dá)至少一種選自Notch 2，Notch 3，CAR和CFTR的表面蛋白的單個(gè)細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞的所述特征是室管膜細(xì)胞的體內(nèi)預(yù)先標(biāo)記。
10.含有室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞的細(xì)胞制品，該制品含有至少50％，優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％的室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的細(xì)胞制品，其特征在于至少4％的干細(xì)胞是活躍干細(xì)胞，即該細(xì)胞經(jīng)歷自我更新并是多能性的。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的細(xì)胞制品，其特征在于它是用根據(jù)權(quán)利要求3-9之任一項(xiàng)的方法制備的。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12之任一項(xiàng)的細(xì)胞制品，其包含遺傳操作的室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2的室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞，其用于醫(yī)學(xué)用途。
15.包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞和藥學(xué)上可接受載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或2的室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞在制備用于產(chǎn)生神經(jīng)組織的藥物組合物中的應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或2的室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞在制備用于產(chǎn)生非神經(jīng)組織如心臟、眼睛、內(nèi)耳、肝、腎、胰臟和其它內(nèi)分泌器官中的組織的藥物組合物中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或2的室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞在制備用于治療Alzheimer病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化癥、頭和脊髓急性外傷、腦血管疾病、肌肉疾病、心臟疾病、或眼、耳、肝、腎、胰臟或其它內(nèi)分泌器官的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞,該細(xì)胞表達(dá)表面蛋白Notch 1以及至少一種選自Notch 2,Notch 3,CAR(結(jié)合腺病毒的跨膜蛋白)和CFTR(囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白)的表面蛋白,而且該細(xì)胞還含有至少一個(gè)纖毛。本發(fā)明還涉及包含室管膜神經(jīng)CNS干細(xì)胞的各種制品包括藥物制劑,基于該制品的體內(nèi)和體外的測(cè)定,和本發(fā)明的新室管膜細(xì)胞的各種其它應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P1/16GK1307632SQ99807869
公開(kāi)日2001年8月8日 申請(qǐng)日期1999年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月25日
發(fā)明者A·M·詹森, J·福里森, C·約翰森, S·默馬, D·克拉克, M·趙, U·蘭代爾, K·德?tīng)柗?申請(qǐng)人:紐羅諾瓦股份公司