專(zhuān)利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的肽和編碼這些肽的多核苷酸以及攜帶這些肽的嵌合蛋白。本發(fā)明還涉及一種用于分離這些肽或嵌合蛋白的方法和用于治療流感嗜血桿菌感染的疫苗組合物。
背景技術(shù)：
流感嗜血桿菌(Hi)是一種革蘭氏陰性球桿菌和嚴(yán)格的人類(lèi)共生體。流感嗜血桿菌菌株(Hi)或是包裹在多糖內(nèi)莢膜或是沒(méi)有莢膜，因而也就相應(yīng)地分為可分型的(有莢膜)和不可分型的(沒(méi)有莢膜)菌株。
帶有莢膜的致病原流感嗜血桿菌(Hi)主要，但并非唯一地導(dǎo)致六歲以下兒童的侵襲性疾病。例如，流感嗜血桿菌b型(Hib)是在兒童中引發(fā)腦(脊)膜炎和其它侵襲性疾病的一個(gè)主要原因?？笻ib感染已經(jīng)有了有效的疫苗，它以產(chǎn)生多糖莢膜的抗體為基礎(chǔ)，并因而對(duì)不可分型的流感嗜血桿菌(ntHi)引發(fā)的感染無(wú)效。
不可分型的流感嗜血桿菌(ntHi)是主要定居菌株而且，盡管鮮有侵襲性，但是它仍是絕大多數(shù)粘膜疾病，包括中耳炎、竇炎、慢性結(jié)膜炎和慢性下呼吸道感染或其惡化的原因。目前，大約30％，最多62％的ntHi具有青霉素抗性。帶菌狀態(tài)在兒童中估計(jì)占44％，在成年人中約占5％，并能持續(xù)數(shù)月。但是由ntHi引發(fā)的中耳炎無(wú)論致病機(jī)理，還是宿主免疫反應(yīng)，現(xiàn)在均沒(méi)有完全弄清楚。
中耳炎是兩歲以下兒童中的較常見(jiàn)疾病?；颊咴谥卸幱辛黧w的出現(xiàn)并伴隨有急性的局部或全身性疾病的征兆。急性的征兆包括耳痛、耳干、聽(tīng)力喪失而全身性癥狀有發(fā)熱、無(wú)力、興奮、厭食、嘔吐或腹瀉。肺炎鏈球菌和不可分型的流感嗜血桿菌(ntHi)是導(dǎo)致該癥狀的最主要細(xì)菌，大約分別占所培養(yǎng)細(xì)菌的25-50％和15-30％。另外，ntHi引起53％的復(fù)發(fā)性中耳炎。1歲和3歲的兒童分別有大約60％和80％有該病的至少一種癥狀(峰值約為10個(gè)月)。
已有證據(jù)表明，對(duì)ntHi存在保護(hù)性免疫。然而，表位的抗原漂移(外膜蛋白P2,P4,P6)在ntHi逃避宿主免疫防御的能力上扮演著重要的角色。
因此，需要另外一種有效的抗流感嗜血桿菌的疫苗，尤其抗無(wú)莢膜流感嗜血桿菌的疫苗，其不受當(dāng)前應(yīng)用的Hi多糖疫苗的影響。
菌毛是發(fā)現(xiàn)于ntHi表面的附屬物，在慢性中耳炎兒童的中耳和鼻咽處收獲的細(xì)菌中100％有菌毛。包含菌毛蛋白(一種衍生自ntHi的菌毛的絲狀蛋白)的疫苗已有報(bào)道(WO 94/26304)。菌毛蛋白和ntHi外膜蛋白P5同源，此P5蛋白已經(jīng)成為另一項(xiàng)專(zhuān)利申請(qǐng)的主題(EP680765)。P5樣蛋白這種菌毛蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生和細(xì)菌表面發(fā)生相互作用的抗體并為殺菌性蛋白(WO94/26304)。該蛋白已經(jīng)純化并顯示出能夠誘導(dǎo)針對(duì)各種不同的ntHi的免疫反應(yīng)。
從細(xì)菌外膜分離菌毛蛋白的現(xiàn)有方法既煩瑣又耗時(shí)。一種在其它種細(xì)菌中使用的策略是生產(chǎn)天然蛋白的相對(duì)較短的線性肽。然而這種方法使用價(jià)值有限，因?yàn)檫@類(lèi)改變的免疫原的抗體常常不能識(shí)別天然病原體。
LB1(f)是一個(gè)有19個(gè)氨基酸的肽(SEQ ID NO:5)，它衍生自菌株ntHi1128上P5樣菌毛蛋白的序列(占據(jù)117位精氨酸到135位甘氨酸之間的區(qū)段)。該肽最初通過(guò)分析P5樣菌毛蛋白的一級(jí)序列而鑒定為潛在的B細(xì)胞表面表位。用包括LB1(f)肽、連接肽和T細(xì)胞表面表位的菌毛蛋白嵌合肽(稱為L(zhǎng)B1肽)免疫動(dòng)物，可誘導(dǎo)針對(duì)P5樣菌毛蛋白的免疫應(yīng)答和減少動(dòng)物接觸ntHi后ntHi的體內(nèi)定居(見(jiàn)US5,843,464),LB1肽在體內(nèi)具有免疫原性，其抗血清可與變性的或天然的菌毛蛋白發(fā)生免疫應(yīng)答。因此該肽可作為有效的免疫原，因?yàn)樗墚a(chǎn)生識(shí)別并結(jié)合其天然結(jié)構(gòu)上的表位的抗體。這部分是由于合成的LB1(f)肽可以模擬菌毛蛋白中肽的卷曲螺旋型二級(jí)結(jié)構(gòu)。
在疫苗中僅使用一種流感嗜血桿菌的蛋白質(zhì)抗原的問(wèn)題是，保護(hù)作用可能很大程度上被限制在同源菌株的攻擊上[Bakaletz等(1997)疫苗15:955-961；Haase等(1991)感染與免疫．59:1278-1284；Sirakova等(1994)感染與免疫.62:2002-2020]。ntHi外膜蛋白的抗原多樣性意味著，開(kāi)發(fā)針對(duì)ntHi異源性微生物的廣譜有效疫苗需要新的策略。
如下，本發(fā)明涉及LB1(f)肽作為疫苗的更有效應(yīng)用，該疫苗是針對(duì)廣泛的能表達(dá)P5樣菌毛蛋白(或該蛋白的天然變體)的流感嗜血桿菌異源株。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供各種ntHi菌株之P5樣菌毛蛋白的新鑒定的抗原性亞單位肽(LB1(f)肽)。另一目的是提供攜帶這些肽并在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)ntHi的免疫應(yīng)答的嵌合多肽、和編碼這些肽或多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及分離這些肽或嵌合多肽的方法、在生物樣品中檢測(cè)這些肽存在的方法，以及在流感嗜血桿菌感染的治療中應(yīng)用的疫苗組合物。
LB1(f)肽包含長(zhǎng)約13到約22個(gè)氨基酸的多肽。這些肽可分為三組(其中一組包含2個(gè)亞組)。嵌合多肽包含共價(jià)結(jié)合至載運(yùn)蛋白(其另可作為一種T細(xì)胞表位)的一或多個(gè)LB1(f)肽單位。該載運(yùn)蛋白優(yōu)選來(lái)自流感嗜血桿菌，使它也能誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)針對(duì)流感嗜血桿菌(包括不可分型的流感嗜血桿菌)的免疫原性應(yīng)答。
參考以下附圖和詳述可以更全面理解本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述

圖1質(zhì)粒pMGMCS。給出了多克隆位點(diǎn)的DNA序列。
圖2質(zhì)粒pRIT 14588。
圖3質(zhì)粒LPD-LB1-A。
圖4質(zhì)粒LPD-LB1-Ⅱ。LB1(f)肽的1組(LB1-GR1)、2組(LB1-GR2)的DNA和氨基酸序列用箭頭表示。這些箭頭將LB1(f)肽包括在P5樣菌毛蛋白中其天然的前后序列中。
圖5質(zhì)粒LPD-LB1-Ⅲ。LB1(f)肽的1組(LB1-GR1)、2組(LB1-GR2)和3組(LB1-GR3)的DNA和氨基酸序列用箭頭表示。這些箭頭將LB1(f)肽包括在P5樣菌毛蛋白中其天然的前后序列中。LB1(f)多肽(稱為L(zhǎng)PD-LB1(f)2,1,3)從第一位的甲硫氨酸延伸到終止密碼子前的C-末端組氨酸殘基。
圖6丙烯酰胺凝膠，經(jīng)考馬斯亮蘭染色顯示以下質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物。
泳道1．分子量標(biāo)準(zhǔn) 2．pMGMCS 3．pRIT145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(純化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量標(biāo)準(zhǔn)圖7丙烯酰胺凝膠的Western Blot(使用兔抗-LB1抗血清)顯示以下質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物
泳道1．分子量標(biāo)準(zhǔn) 2．pMGMCS 3.pRIT 145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(純化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量標(biāo)準(zhǔn)圖8丙烯酰胺凝膠的Western Blot(使用單克隆抗-LPD抗體)顯示以下質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物泳道1．分子量標(biāo)準(zhǔn) 2．pMGMCS 3．pRIT 145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(純化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量標(biāo)準(zhǔn)圖9丙烯酰胺凝膠的Western Blot(使用含6個(gè)組氨酸的純化標(biāo)簽的抗體)顯示以下質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物泳道1．分子量標(biāo)準(zhǔn) 2．pMGMCS 3．pRIT 145884．LPD-LB1-A 5．LPD-LB1-Ⅱ 6．LPD-LB1-Ⅲ7．LPD-LB1-Ⅲ(純化的LPD-LB1(f)2,1,3)8．分子量標(biāo)準(zhǔn)圖10被動(dòng)轉(zhuǎn)移/攻擊實(shí)驗(yàn)。通過(guò)對(duì)五個(gè)同齡組的被動(dòng)免疫毛絲鼠進(jìn)行超過(guò)35天的觀察得出的平均鼓膜炎癥指數(shù)。平均鼓膜炎癥值1.5處的間斷水平線表示僅由腺病毒引起的炎癥。超過(guò)該水平線的值表示由ntHi引起的炎癥。-安慰劑組；○-LB1；■-LPD；◇-PD；△-LPD-LB1(f)2,1,3。
圖11條形圖顯示5只對(duì)腺病毒無(wú)免疫力的毛絲鼠，在實(shí)驗(yàn)全程中，根據(jù)耳鏡檢查和鼓室壓測(cè)量發(fā)現(xiàn)或懷疑有滲出的中耳總數(shù)的百分率。時(shí)間值從ntHi鼻內(nèi)攻擊的當(dāng)天(第0天)開(kāi)始計(jì)算。每只動(dòng)物在接受ntHi #86-028NP鼻內(nèi)攻擊前通過(guò)被動(dòng)轉(zhuǎn)移接受1∶5稀釋的特異性抗血清。各年齡組接受針對(duì)下述的抗血清 安慰劑(無(wú)菌稀釋液)LB1LPDPDLPD-LBl(f)2,1,3圖12用于被動(dòng)轉(zhuǎn)移的血清的Western blot。BlotA為抗LB1血清集合。BlotB為抗-LPD-LB1(f)2,1,3血清集合。泳道包括(1)分子量標(biāo)準(zhǔn)；(2)LPD；(3)LPD-(f)2,1,3；(4)LB1；(5)NTHi 86-028NP全外膜蛋白(OMP)制劑；(6)NTHi 1885MEE全OMP；(7)NTHi 1728MEE全OMP。
圖13研究A被動(dòng)轉(zhuǎn)移/攻擊實(shí)驗(yàn)。對(duì)5只被動(dòng)免疫的毛絲鼠進(jìn)行超過(guò)35天的觀察得出平均鼓膜炎癥的指數(shù)。攻擊用ntHi的86-028NP菌株或1885MEE菌株進(jìn)行。
圖14研究B被動(dòng)轉(zhuǎn)移/攻擊實(shí)驗(yàn)。對(duì)5只被動(dòng)免疫的毛絲鼠進(jìn)行超過(guò)35天的觀察得出平均鼓膜炎癥的指數(shù)。攻擊用ntHi的86-028NP菌株或1728MEE菌株進(jìn)行。
圖15研究A表中顯示6只對(duì)腺病毒無(wú)免疫力的毛絲鼠，在實(shí)驗(yàn)全程中，根據(jù)耳鏡檢查和鼓室壓測(cè)量發(fā)現(xiàn)或懷疑有滲出的中耳總數(shù)的百分率。時(shí)間值從ntHi鼻內(nèi)攻擊的當(dāng)天(第0天)開(kāi)始計(jì)算。每只動(dòng)物在接受ntHi#86-028NP或1885MEE鼻內(nèi)感染前通過(guò)被動(dòng)轉(zhuǎn)移接受1∶5稀釋的特異性抗血清。
圖16研究B圖中顯示6只對(duì)腺病毒無(wú)免疫力的毛絲鼠，在實(shí)驗(yàn)全程中，根據(jù)耳鏡檢查和鼓室壓測(cè)量發(fā)現(xiàn)或懷疑有滲出的中耳總數(shù)的百分率。時(shí)間值從ntHi鼻內(nèi)攻擊的當(dāng)天(第0天)開(kāi)始計(jì)算。每只動(dòng)物在接受ntHi#86-028NP或1728MEE鼻內(nèi)感染前通過(guò)被動(dòng)轉(zhuǎn)移接受1∶5稀釋的特異性抗血清。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明的肽本發(fā)明的肽涉及從歐洲和美國(guó)的各種ntHi菌株的P5樣菌毛蛋白新鑒定的LB1(f)肽。
已查明83株ntHi的P5樣菌毛蛋白的DNA序列，LB1(f)肽的肽序列也已指明。本發(fā)明的肽是幾乎出現(xiàn)在每種蛋白質(zhì)的相同區(qū)(以及相同環(huán)境中)的B細(xì)胞表位-在該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中幾乎涵蓋110到140位的區(qū)中。例如，在菌株ntHi-10567RM中，該肽就存在于117位的精氨酸到135位的甘氨酸之間。(SEQ ID NO:1)。
經(jīng)對(duì)比排列，來(lái)自歐洲和美國(guó)的ntHi菌株肽序列可歸為相同的三組，其中有一些變化。第1組肽[或LB1(f)1]占這些肽的71％，包含約19個(gè)氨基酸，且與SEQ IN NO:1所示肽的同源性不低于75％。第2組肽[或LB1(f)2]占這些肽的19％，包含19-22個(gè)氨基酸，且與SEQ ID NO:2所示肽的同源性不低于75％。該組可再分為2個(gè)亞組，第2a組[或LB1(f)2a]實(shí)例如SEQ ID NO:2；第2b組[或LB1(f)2b]實(shí)例如SEQ ID NO:4。第3組肽[或LB1(f)3]占這些肽的10％，包含13個(gè)氨基酸(如SEQ ID NO:3所示)。
肽(以及多肽和多核苷酸)的序列同一性可利用如UWGCG軟件包計(jì)算，它提供BESTFIT程序用于計(jì)算同源性(一致性)，優(yōu)選它的默認(rèn)設(shè)置。[Deveraux等，核酸研究.12:387-395(1984)]。
所分析的83株ntHi中，來(lái)自所有62個(gè)美國(guó)菌株和所有21個(gè)歐洲菌株的LB1(f)肽歸至第1-3組。表1顯示分析的所有的ntHi菌株，它們各自的LB1(f)肽所歸屬的組別。表2,3和4分別列出了第1,2和3組的各種LB1(f)肽。表5列出了第1,2a,2b和3組LB1(f)肽的代表性實(shí)例。
先前已知的LB1(f)肽的序列(SEQ ID NO:5)屬于第1組。盡管已知這種肽是有效免疫原，并可提供對(duì)ntHi所致中耳炎的保護(hù)作用，但直到現(xiàn)在才清楚該有效肽存在三種不同的抗原形式，它們有可能通過(guò)組合提供針對(duì)所有表達(dá)P5樣菌毛蛋白的流感嗜血桿菌的保護(hù)性免疫原。
本發(fā)明的肽涉及第1,2a,2b和3組的代表肽(分別為SEQ ID NO:1,2,4和3)以及這些肽的抗原性相關(guān)變體?！翱乖韵嚓P(guān)變體”可以是天然變體(如表2,3和4中所列出的肽)或與P5樣菌毛蛋白上LB1(f)之抗原決定位點(diǎn)免疫學(xué)相似的人工修飾變體。這類(lèi)人工修飾變體可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的化學(xué)合成或重組DNA誘變技術(shù)制備(參見(jiàn)如Sambrook等“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(1989)第15章冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。所述肽的抗原性相關(guān)變體應(yīng)與SEQ ID NO:1-4之一的氨基酸序列有至少75％的同一性(更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少95％的同一性)，而且仍與不可分型的流感嗜血桿菌上P5樣菌毛蛋白的相應(yīng)抗原決定位點(diǎn)免疫學(xué)相似。本發(fā)明中“與ntHi上P5樣菌毛蛋白的相應(yīng)抗原決定位點(diǎn)免疫學(xué)相似”指能誘導(dǎo)特異性識(shí)別全P5樣菌毛蛋白中野生型LB1(f)序列(表2、3和4所列)之一的抗體的肽(變體)，和/或指能被具有上述抗體(特異性識(shí)別全P5樣菌毛蛋白中野生型LB1(f)序列(表2、3和4所列)之一的抗體)相同免疫特異性的抗體識(shí)別的肽(變體)。在第一個(gè)定義中，所述肽變體能獨(dú)自或與載體分子一起誘導(dǎo)所述抗體。第二個(gè)定義中，所述肽變體應(yīng)能依靠其自身或與載體分子一起被識(shí)別。所述抗原性相關(guān)肽變體并不包括SEQ ID NO:5所示的肽(此前確定的ntHi-1128株上P5樣菌毛蛋白的LB1(f)肽)和SEQ ID NO:6所示的肽(此前確定的ntHi上P5樣菌毛蛋白的LB1(f)樣肽)。
抗原性相關(guān)變體可能有氨基酸的增加、插入、替換或刪除。優(yōu)選的變體是與所述相比有保守性(優(yōu)選單個(gè))氨基酸替換的那些。
本發(fā)明的肽涉及共價(jià)連接(可任選其間包含間隔臂氨基酸)以形成單肽的上述LB1(f)肽的組合。進(jìn)行這類(lèi)組合時(shí)可使用SEQ ID NO:5和6?；瘜W(xué)合成或重組表達(dá)這些肽的方法為領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知[參見(jiàn)如Sambrook等(1989)]。所述任選間隔臂氨基酸應(yīng)優(yōu)選在所述肽的每一側(cè)不超過(guò)18個(gè)氨基酸，并應(yīng)優(yōu)選由P5樣菌毛蛋白之LB1(f)肽的天然相鄰序列中的氨基酸組成(例如，如果兩個(gè)LB1(f)肽相連，第一個(gè)LB1(f)肽或N-末端LB1(f)肽可在其天然C-末端相鄰序列中有9個(gè)氨基酸連接至第二個(gè)LB1(f)肽或是C-末端LB1(f)肽的天然N-末端相鄰序列中9個(gè)氨基酸)。一或多個(gè)LB1(f)肽可以以這種方式相連。優(yōu)選1-10個(gè)LB1(f)肽相連，更優(yōu)選1-5個(gè)相連，再更優(yōu)選1-3個(gè)相連。更優(yōu)選來(lái)自每一LB1(f)組的至少一種LB1(f)肽以此方式相連。還要優(yōu)選相連的LB1(f)肽是SEQ ID NO:2,3和5所示的肽。一旦這三種抗原性不同的肽發(fā)生組合，就能形成一種具有更廣泛保護(hù)性的免疫原。
本發(fā)明的多肽本發(fā)明的多肽涉及上述肽，其共價(jià)連接至載體多肽以形成LB1(f)嵌合多肽，所述載體多肽至少含有一種T-細(xì)胞表位(例如破傷風(fēng)毒素、白喉毒素、CRM197、布氏疏螺旋體sensu lato的OspA、匙孔血藍(lán)蛋白，流感嗜血桿菌P6蛋白、流感嗜血桿菌P5樣菌毛蛋白、流感嗜血桿菌OMP26、流感嗜血桿菌蛋白D、或流感嗜血桿菌脂蛋白D)。這種嵌合多肽包含至少一種本發(fā)明的LB1(f)肽。優(yōu)選所述嵌合多肽包含1-10種LB1(f)肽，更優(yōu)選1-5種，再更優(yōu)選1-3種。這些肽可與載體多肽發(fā)生N-末端或C-末端連接，或N-末端和C-末端均連接。優(yōu)選該載體多肽來(lái)自流感嗜血桿菌，使其成為良好的免疫原性載體，并同時(shí)具有針對(duì)其自身的保護(hù)效應(yīng)和/或同時(shí)提供流感嗜血桿菌衍生的T-細(xì)胞表位來(lái)源。所述嵌合肽還可任選地包含一個(gè)作為純化標(biāo)簽的肽序列(如組氨酸標(biāo)簽或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽)以有助于隨后的多肽純化。任選的短肽間隔臂序列可引入所述嵌合多肽的元件之間(如以上本發(fā)明的肽中所指定)。
所述載體多肽優(yōu)選使用流感嗜血桿菌的OMP26(WO 97/01638)、或流感嗜血桿菌的P6蛋白(Nelson,M.B.等，(1998)感染與免疫56,128-134)。
最優(yōu)選所述載體多肽使用不可分型的流感嗜血桿菌的D蛋白(PD)或脂蛋白D(LPD-D蛋白的脂化形式)。PD是42kDa的人IgD結(jié)合性外膜蛋白，該蛋白目前所知的所有流感嗜血桿菌菌株中高度保守(WO 91/18926)。PD和LPD均已能在大腸桿菌中表達(dá)。
LPD是流感嗜血桿菌的致病因子，它能激發(fā)大鼠抗血清中針對(duì)ntHi的殺菌活性。流感嗜血桿菌的LPD和重組表達(dá)的LPD等價(jià)體因此能作為良好的免疫原性載體，并具有針對(duì)其自身的保護(hù)效應(yīng)。所述非脂化形式(PD)因便于加工而更便于使用，而且也是本發(fā)明的潛在載體多肽。LPD因其固有的佐劑特性(即，其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白血病介素的能力以及其刺激B細(xì)胞增殖的能力)而具有較強(qiáng)免疫原性(WO 96/32963)。PD不具有固有的佐劑特性，因此優(yōu)選將它們偶聯(lián)至具有佐劑特性的物質(zhì)如(但不限于)氫氧化鋁或是磷酸鋁。針對(duì)LPD應(yīng)答的抗體可能對(duì)可分型或不可分型的Hi菌株都有保護(hù)作用。它因此代表了一種附載其它Hi抗原(如LB1(f)肽)以獲得針對(duì)該生物體的更有效疫苗的重要載體分子。LPD除了能增強(qiáng)對(duì)LB1(f)肽抗原的免疫應(yīng)答外，還可作為同時(shí)針對(duì)不可分型和可分型的Hi的保護(hù)性抗原。
優(yōu)選將三種LB1(f)肽連接到該載體多肽上每組LB1(f)一種。優(yōu)選所用LB1(f)肽為SEQ ID NO:2,3，和5所示的肽，并優(yōu)選將它們通過(guò)C-末端連接至所述載體多肽，連接順序?yàn)镾EQ ID NO:2(第2組肽)、SEQ ID NO:5(第1組肽)、SEQ ID NO:3(第3組肽)。這類(lèi)連接至LPD的多肽中已知的有LPD1-LB1(f)2,1,3。這三種抗原性不同的肽一旦組合，就會(huì)形成具有更廣泛保護(hù)性的免疫原。
盡管所述嵌合多肽并不必需純化標(biāo)簽，但必要時(shí)優(yōu)選組氨酸標(biāo)簽序列，并優(yōu)選其位于該多肽的C-末端。
一種優(yōu)選的LPD1-LB1(f)2,1,3嵌合多肽的序列示于圖5。殘基1-19為蛋白D的信號(hào)序列。可將該信號(hào)序列除去以制備所述嵌合多肽中的PD。
本發(fā)明的多肽能以任何適當(dāng)?shù)姆绞街苽洹＿@類(lèi)多肽包括重組產(chǎn)生的多肽、化學(xué)合成的多肽、或通過(guò)這些方法的聯(lián)合運(yùn)用產(chǎn)生的多肽。制備這類(lèi)多肽的方式為本領(lǐng)域所熟知，方法的實(shí)例示于實(shí)施例部分。
本發(fā)明的多核苷酸本發(fā)明的多核苷酸涉及表6-8所示LB1(f)肽的野生型多核苷酸序列。它們也涉及本發(fā)明多肽的野生型DNA序列-即構(gòu)建嵌合多肽的基因，其中使用載體多肽的野生型基因序列和LB1(f)肽的野生型多核苷酸序列。這類(lèi)多核苷酸示于表5。所述可任選的間隔臂氨基酸的DNA序列并非本發(fā)明必需，但如果該間隔臂氨基酸來(lái)自LB1(f)肽的天然相鄰區(qū)，則優(yōu)選(但非必需)使用這些間隔臂的天然DNA序列。
本發(fā)明的多核苷酸還涉及可衍生自本發(fā)明肽的氨基酸序列和可通過(guò)簡(jiǎn)并密碼子的假想使用衍生自本發(fā)明多核苷酸的DNA序列。這一點(diǎn)為本領(lǐng)域所熟知，在不同表達(dá)宿主中密碼子使用的知識(shí)也是本領(lǐng)域熟知，其有助于使本發(fā)明的肽和多核苷酸的重組表達(dá)最優(yōu)化。
本發(fā)明還提供互補(bǔ)于所有上述多核苷酸的多核苷酸。
當(dāng)用本發(fā)明的多核苷酸重組制備本發(fā)明的多肽時(shí)，該多核苷酸可能本身包括成熟多肽的編碼序列；或在閱讀框架中包括成熟多肽的編碼序列和其它編碼序列，如編碼前導(dǎo)或分泌肽的序列，前-或原-或前原蛋白序列、或其它融合肽組分的編碼序列(如在圖5中的氨基酸殘基1-19，LPD的天然信號(hào)序列)。例如，可編碼有助于融合多肽純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明這方面的特定優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是有6個(gè)組氨酸的肽(如pQE載體(Qiagen.Inc)中所含以及Gentz等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(1989)86:821-824所述)或一個(gè)HA標(biāo)簽，或谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶。還優(yōu)選與其天然信號(hào)序列融合的LPD(圖5中氨基酸殘基1-19)。多核苷酸還可包含非編碼的5’和3’序列，比如轉(zhuǎn)錄的、非翻譯序列，剪接和多聚腺苷化信號(hào)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)和穩(wěn)定mRNA的序列。
載體，宿主細(xì)胞，表達(dá)本發(fā)明還涉及包含一種多核苷酸或本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體進(jìn)行遺傳工程改造的宿主細(xì)胞，以及本發(fā)明的肽或多肽的重組制備。還可使用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)從本發(fā)明之DNA構(gòu)建體衍生的RNA制備這類(lèi)蛋白質(zhì)。
重組制備中，宿主細(xì)胞可經(jīng)遺傳改造引入針對(duì)本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)或其部分。可用多種常規(guī)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(如Davis等，“分子生物學(xué)的基本方法”(1986),Sambrook等，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)中所述的方法將多核苷酸引入宿主細(xì)胞，如磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)載(transvection)，顯微注射，陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，刮取裝載(scrape loading)，沖擊導(dǎo)入(ballisticintroduction)或感染。
適當(dāng)宿主的代表性實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞，如腦膜炎球菌，鏈球菌，葡萄球菌，大腸桿菌，鏈霉菌和枯草芽孢桿菌的細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞和曲霉細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅S2細(xì)胞和球粘蟲(chóng)SF9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO,COS,HeLa,C127,3T3,BHK,HEK293和Bowes黑素瘤細(xì)胞；植物細(xì)胞。
可應(yīng)用各種表達(dá)系統(tǒng)。這類(lèi)系統(tǒng)包括染色體系統(tǒng)、附加體系統(tǒng)、和病毒衍生的系統(tǒng)，如來(lái)源于細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件的載體，來(lái)源于病毒如桿狀病毒、SV40等乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、豬α皰疹病毒I型以及逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以及來(lái)源于以上之組合的載體，如來(lái)源于質(zhì)粒和粘粒、噬菌粒等噬菌體基因元件的載體。這些表達(dá)系統(tǒng)可能含有調(diào)節(jié)并引起表達(dá)的控制區(qū)。一般可利用適于在宿主中維持、繁殖或表達(dá)多核苷酸以產(chǎn)生多肽的任何系統(tǒng)或載體。適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄锌捎帽姸嘁阎统Ｒ?guī)的技術(shù)中的任何一種插入表達(dá)系統(tǒng)中，所述技術(shù)如Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(同上)所示。
所翻譯的蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、胞質(zhì)周?chē)g隙、或胞外環(huán)境中，可將適當(dāng)信號(hào)摻入目的多肽中。這些信號(hào)對(duì)所述多肽而言可能是內(nèi)源性的(圖5中氨基酸殘基1-19)或它們可能是異源信號(hào)。
重組表達(dá)的肽/多肽的純化本發(fā)明的肽或多肽可自重組細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)已知方法回收并純化，所述方法有硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選利用高效液相層析進(jìn)行純化。當(dāng)所述多肽在分離或純化期間變性后，可利用蛋白質(zhì)折疊的已知技術(shù)再生其活性構(gòu)象。
盡管載體上LB1(f)嵌合多肽的基因序列可以用組氨酸標(biāo)簽序列進(jìn)行標(biāo)記，以便于該多肽的純化，但是它并非本發(fā)明的必需元件，因?yàn)闆](méi)有組氨酸標(biāo)簽的多肽仍可以用上述技術(shù)之一純化。
實(shí)施例3描述了LPD-LB1(f)(第2組/第1組/第3組)(或LPD-LB1(f)2,1,3)嵌合多肽的純化方法。LPD-LB1(f)嵌合多肽在C-末端含有3個(gè)或多個(gè)LB1(f)肽時(shí)比只含一個(gè)LB1(f)肽更易純化。這是因?yàn)樵贑-末端只含有一個(gè)LB1(f)肽的多肽可測(cè)得有部分的降解，而在C-末端含有3個(gè)LB1(f)肽的多肽則沒(méi)有發(fā)生降解。當(dāng)發(fā)生部分降解后，可通過(guò)在純化過(guò)程中加一步精細(xì)陰離子交換步驟而使全長(zhǎng)多肽與已降解多肽分離開(kāi)來(lái)。
抗體本發(fā)明的肽和多肽，或表達(dá)它們的細(xì)胞均可作為免疫原用以產(chǎn)生對(duì)野生型LB1(f)肽具有免疫特異性的抗體，術(shù)語(yǔ)“免疫特異性的”指所述抗體對(duì)本發(fā)明的肽或多肽的親和力遠(yuǎn)大于對(duì)現(xiàn)有領(lǐng)域中其它相關(guān)多肽的親和力。
可應(yīng)用常規(guī)以抗原免疫動(dòng)物的方法將所述肽或多肽投予動(dòng)物，優(yōu)選非人類(lèi)的體內(nèi)，收集血液，分離血清并利用與該肽發(fā)生反應(yīng)的抗體而獲得針對(duì)所述肽或多肽的抗體。含此抗體的血清或IgG可在分析這種蛋白時(shí)使用。制備單克隆抗體時(shí)，可使用經(jīng)傳代細(xì)胞系培養(yǎng)而產(chǎn)生抗體的任何技術(shù)。實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(kohler,G.和Milstein,C.，自然(1975)256:495-497)，trioma技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，今日免疫學(xué)(Immunology Today)(1983)4:72)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，單克隆抗體和癌癥治療，77-96頁(yè)，Alan R.Liss,Inc.,1985)。
用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,946,778)也適用于產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明肽或多肽的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因鼠，或其它生物體包括其它哺乳動(dòng)物可以用來(lái)表達(dá)人源化的抗體。
上述抗體可用于分離或鑒定表達(dá)此肽的克隆，或通過(guò)親和層析純化本發(fā)明的肽或多肽。
本發(fā)明的肽或多肽還可用于產(chǎn)生對(duì)流感嗜血桿菌的感染進(jìn)行被動(dòng)免疫治療的多克隆抗體。優(yōu)選人的免疫球蛋白，因?yàn)楫愒椿拿庖咔虻鞍卓赡軙?huì)誘導(dǎo)對(duì)其外源免疫原性組分的良好免疫應(yīng)答。多克隆抗血清可從所述肽或多肽用上述任一種方式所免疫的個(gè)體中獲得。然后富集免疫球蛋白組分。例如，特異于所述蛋白質(zhì)之表位的免疫球蛋白可通過(guò)免疫親和層析技術(shù)用本發(fā)明的肽或多肽富集?？贵w自抗血清特異地吸附至含有所述肽的表位的免疫吸附劑上，然后作為富集的免疫球蛋白級(jí)分從該免疫吸附劑上洗脫。
疫苗對(duì)ntHi-1128菌株的LB1(f)肽的此前研究表明，這種肽可作為免疫原用于開(kāi)發(fā)抗流感嗜血桿菌疾病的亞單位疫苗，特別是能夠防止或減少對(duì)急性中耳炎和由不可分型的流感嗜血桿菌株所致疾病的易感。本發(fā)明因發(fā)現(xiàn)了LB1(f)肽的三個(gè)主要組而擴(kuò)大了此項(xiàng)工作的范圍。這三組的不同之處在于不同組的菌株之間不太可能獲得有效的交叉保護(hù)。因此本發(fā)明通過(guò)對(duì)各組之實(shí)例的應(yīng)用來(lái)提供針對(duì)可表達(dá)P5樣菌毛蛋白之流感嗜血桿菌(優(yōu)選ntHi)的更有效且全面的疫苗。
相應(yīng)地，本發(fā)明另一方面是包含免疫有效量的至少一種本發(fā)明肽或多肽的疫苗組合物。優(yōu)選該組合物還應(yīng)包含一種可藥用的賦形劑。疫苗的制備概述于疫苗設(shè)計(jì)(“亞單位和佐劑方法”(Powell M.F. & Newman M.J.編)(1995)Plenum Press New York)。
另外，本發(fā)明的肽和多肽優(yōu)選在本發(fā)明的疫苗制劑中有佐劑輔助。合適的佐劑包括鋁鹽，例如氧化鋁凝膠(明鞏)或磷酸鋁，但也可為鈣，鐵或鋅，或?；睦野彼峄蝓；奶堑牟蝗苄詰腋∫?，多糖的陽(yáng)離子或陰離子衍生物，或多聚磷腈。其它已知的佐劑包括含有CpG的寡核苷酸。這類(lèi)寡核苷酸的特征是CpG二核苷酸未甲基化。這類(lèi)寡核苷酸已是眾所周知并述于如WO96/02555。
其它優(yōu)選佐劑是那些能優(yōu)先誘導(dǎo)TH1型免疫應(yīng)答的佐劑。高水平的TH1型細(xì)胞因子更易誘導(dǎo)對(duì)所選抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答，而高水平的TH2型細(xì)胞因子更易誘導(dǎo)對(duì)所選抗原的體液免疫應(yīng)答。合適的佐劑系統(tǒng)包括，例如單磷酸脂質(zhì)A，優(yōu)選3-脫-O-?；瘑瘟姿嶂|(zhì)A(3D-MPL)，或(3D-MPL)與鋁鹽的組合。CpG寡核苷酸也優(yōu)先誘導(dǎo)TH1應(yīng)答。一種強(qiáng)化系統(tǒng)包含單磷酸脂質(zhì)A和皂甘衍生物的組合，特別是QS21和3D-MPL的組合(如WO 94/00153所公開(kāi))，或一種弱反應(yīng)組合物，其中Q21用膽固醇猝滅(如WO 96/33739所公開(kāi))。一種包含QS21 3D-MPL和維生素E之水包油乳劑的特有效佐劑制劑在WO 95/17210中有述，而且也是一種優(yōu)選的制劑。
本發(fā)明的另一方面涉及在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括用本發(fā)明中肽或多肽以有效量接種該哺乳動(dòng)物，所述有效量足以產(chǎn)生針對(duì)流感嗜血桿菌疾病的抗體和/或T-細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而保護(hù)在群體中保護(hù)該動(dòng)物。本發(fā)明另一方面涉及在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其中包括通過(guò)載體指導(dǎo)本發(fā)明多核苷酸的體內(nèi)表達(dá)，從而運(yùn)送本發(fā)明的肽或多肽，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體保護(hù)該動(dòng)物遠(yuǎn)離疾病。
本發(fā)明另一方面涉及一種免疫/疫苗制劑(組合物)，當(dāng)將這種制劑投予哺乳動(dòng)物宿主后，在該宿主體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)于LB1(f)肽或多肽的免疫應(yīng)答，其中該組分包括LB1(f)肽或多肽的基因，或LB1(f)肽或多肽本身。疫苗的制劑還可包含一種合適的載體。LB1(f)疫苗組合物優(yōu)先經(jīng)口、鼻內(nèi)或非胃腸道(包括皮下，肌肉，靜脈，皮內(nèi)，穿皮注射)給藥。適于非胃腸道給藥的制劑包括可能含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使該制劑與受者血液等滲的溶劑的水相和非水相無(wú)菌注射液；可能含懸浮劑或增稠劑的水相和非水相無(wú)菌懸浮液。制劑應(yīng)存于單元?jiǎng)┗蚨鄤┤萜?，如密封的安瓿瓶和管形瓶中，并可能凍干貯存，只需新鮮加入無(wú)菌液體賦形劑就可以使用。所述疫苗制劑也可包括上述佐劑。用量取決于疫苗的特異性活性并可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)輕易測(cè)定。
本發(fā)明另一方面涉及包含本發(fā)明多核苷酸的免疫/疫苗制劑。這類(lèi)技術(shù)為領(lǐng)域內(nèi)已知，如參見(jiàn)Wolff等，科學(xué)(1990)247:1465-8。
本發(fā)明的肽或多肽可與流感嗜血桿菌的其它蛋白質(zhì)抗原一起作為多價(jià)亞單位疫苗給藥，以獲得更高的抗菌活性。它們也可與多糖抗原如流感嗜血桿菌b的PRP莢膜多糖(優(yōu)選偶聯(lián)至一種蛋白質(zhì))。與其它蛋白質(zhì)的表位組合給藥時(shí)，LB1(f)肽或多肽可以作為混合物單獨(dú)給藥，或作為偶聯(lián)物或遺傳融合的多肽給藥。偶聯(lián)物可通過(guò)偶聯(lián)蛋白質(zhì)物質(zhì)的常規(guī)技術(shù)獲得。本發(fā)明的肽或多肽可以與其它生物體的抗原(如有莢膜或無(wú)莢膜的細(xì)菌、病毒、真菌、和寄生蟲(chóng))聯(lián)合使用。例如，本發(fā)明的肽或多肽與中耳炎或其它疾病所涉及的其它微生物抗原聯(lián)合使用很有效。這些微生物包括肺炎鏈球菌，A族釀膿鏈球菌，金黃色葡萄球菌，呼吸道合胞病毒和粘膜炎布蘭漢氏球菌。
由于本發(fā)明的多肽本身包含P5樣菌毛蛋白，本發(fā)明的另一優(yōu)先方面為在疫苗制劑中包含來(lái)自不同的LB1(f)組的兩種或更多種P5樣菌毛蛋白。
由俄亥俄州立大學(xué)Dr.L.Bakaletz在毛絲鼠動(dòng)物模型中對(duì)本發(fā)明的肽或多肽作為抗ntHi所致中耳炎的潛在疫苗進(jìn)行了評(píng)價(jià)。該模型模擬兒童中耳炎的發(fā)展，是建立在每隔一周的連續(xù)鼻內(nèi)給予腺病毒和ntHi的基礎(chǔ)上。在這些條件中，細(xì)菌在鼻咽處定居后，可通過(guò)咽鼓管侵入到中耳。一旦如此，ntHi將增殖并誘導(dǎo)類(lèi)似于兒童體內(nèi)的炎癥過(guò)程。
疫苗評(píng)價(jià)中，毛絲鼠主動(dòng)免疫后，經(jīng)鼻內(nèi)途徑接種ntHi；甚至已有腺病毒的預(yù)感染時(shí)，它們因太老而幾乎無(wú)一發(fā)生了中耳炎。另一種可替換的攻擊途徑是直接將細(xì)菌穿過(guò)顱骨接種至中耳(大泡)。也可使用被動(dòng)轉(zhuǎn)移/攻擊方法以避免穿大泡的攻擊。
對(duì)于所有這些攻擊，可以通過(guò)(穿過(guò)外耳的)耳鏡觀察或耳室壓的測(cè)定分別評(píng)估中耳的炎癥程度或中耳壓力的變化及中耳內(nèi)流體的出現(xiàn)，從而給疾病的嚴(yán)重性打分。疫苗的效率通過(guò)嚴(yán)重性和/或炎癥時(shí)間的減少以及耳部和鼻咽部定居量的減少而評(píng)價(jià)。
在早先的實(shí)驗(yàn)中，ntHi-1128株的LB1以及LPD的保護(hù)效率在主動(dòng)免疫及大泡內(nèi)的攻擊后可以評(píng)估。重復(fù)地，用LB1免疫可保護(hù)毛絲鼠免患中耳炎，其指征是耳炎時(shí)間的縮短，嚴(yán)重性的減小，和耳部和鼻咽部定居的減少。單獨(dú)用LPD免疫可保護(hù)毛絲鼠抵抗中耳炎，但單獨(dú)用LB1免疫不可，且沒(méi)有重復(fù)性。
本發(fā)明的疫苗可以進(jìn)一步通過(guò)檢驗(yàn)本發(fā)明的肽或多肽是否能夠抑制ntHi粘附毛絲鼠的喉上皮細(xì)胞，和它們是否能抑制ntHi體內(nèi)定居于鼻咽部。ntHi-1128的LB1肽在抑制ntHi粘附毛絲鼠喉上皮細(xì)胞時(shí)有劑量依賴效應(yīng)(可能因?yàn)樗莕tHi結(jié)合的直接立體抑制物)，并減少鼻咽灌洗液中的ntHi。鼻咽部的定居是發(fā)生中耳炎必需的起始步驟，因此這種對(duì)定居的抑制還將有助于抑制中耳炎的發(fā)展。
診斷試驗(yàn)/試劑盒本發(fā)明也涉及將本發(fā)明的肽或多肽，和抗這些肽或多肽的抗體作為診斷試劑的應(yīng)用。LB1(f)肽的檢測(cè)將提供一種在許多疾病中輔助診斷或確診流感嗜血桿菌性疾病的診斷工具。
用于診斷的生物樣品可以來(lái)自受試者的細(xì)胞，如血清、血液、尿液、唾液、組織活檢標(biāo)本、痰、灌洗液。
與表6-8中的核苷酸序列之一相同或完全相同的本發(fā)明多核苷酸可以作為cDNA和基因組DNA雜交的探針或作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)(PCR)的引物，以分離編碼P5樣菌毛蛋白的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆。這類(lèi)雜交技術(shù)為領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知。這些核苷酸序列通常與參照序列有80％相同，優(yōu)選90％相同，更優(yōu)選95％相同。探針通常包含至少15個(gè)核苷酸。優(yōu)選這類(lèi)探針有至少30個(gè)核苷酸，甚至可能有至少50個(gè)核苷酸。特別優(yōu)選的探針為30-50個(gè)核苷酸。采用此方法，可在生物樣品中檢測(cè)流感嗜血桿菌，而在特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下，出現(xiàn)在樣品中的一或多株特定流感嗜血桿菌株可用表6-8中的野生型多核苷酸序列確定。
因此本發(fā)明另一方面涉及疾病診斷試劑盒，特別是診斷流感嗜血桿菌性疾病的診斷試劑盒，其包括
(a)本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選表6-8中的核苷酸序列；(b)互補(bǔ)于(a)的序列的核苷酸序列；(c)本發(fā)明的LB1(f)肽，優(yōu)選SEQ ID NO:1-4的肽；或(d)抗本發(fā)明的LB1(f)肽，優(yōu)選SEQ ID NO:1-4的肽的抗體。
優(yōu)選在任何這類(lèi)試劑盒中，(a),(b),(c)或(d)可能包含一種基本組分。
所舉例的文獻(xiàn)已引入本文作參考。
本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例說(shuō)明。
實(shí)施例以下實(shí)施例除非另有詳述，均用眾所周知的且是本領(lǐng)域常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)施。
實(shí)施例均為舉例說(shuō)明，并非限制本發(fā)明。
實(shí)施例1測(cè)定各種ntHi菌株中LB1(f)肽的氨基酸序列的變異性1a)ntHi分離物的培養(yǎng)-為PCR分析準(zhǔn)備樣品53個(gè)ntHi分離物得自俄亥俄州立大學(xué)Dr.L.Bakaletz；30個(gè)ntHi分離物得自Dr.A.Forsgren of Malmo，瑞典。
將每一ntHi分離物的0.1ml培養(yǎng)液涂布于Gelose巧克力瓊脂(GCA)上。樣品的純度可通過(guò)固相化的培養(yǎng)基來(lái)控制(Petri平板中的TSA-胰蛋白胨瓊脂)。此培養(yǎng)皿于35℃溫育24小時(shí)。平板上的菌落用5ml已過(guò)濾過(guò)的TSB(胰蛋白胨肉湯+3μg/μl NAD；+3μg/μl Hemine+1％馬血清)重新懸浮。50mlTSB液體培養(yǎng)基與2.5ml培養(yǎng)基一起接種，并于35℃溫育。當(dāng)培養(yǎng)液濃度達(dá)108細(xì)胞/ml時(shí)，取10ml培養(yǎng)液于4℃以10,000rpm離心10分鐘。去除上清液，細(xì)胞用生理緩中液洗滌，再于4℃以10,000rpm離心15分鐘。重新懸浮的細(xì)胞終濃度為109細(xì)胞/ml。該細(xì)胞在95-100℃煮沸10-15分鐘，然后直接放置在冰上。樣品于-70℃凍存，以備經(jīng)PCR擴(kuò)增DNA。
1b)PCR擴(kuò)增P5樣菌毛蛋白基因的DNA片段菌毛蛋白基因片段的擴(kuò)增在實(shí)施例1a)的ntHi制品上實(shí)施。取200μl ntHi制品于室溫以14,200rpm離心3分鐘。去掉全部上清。將細(xì)胞重懸于25μl ADI中，95℃煮沸10分鐘，以14,200rpm離心3分鐘。取5μl上清用于PCR反應(yīng)。
DNA擴(kuò)增用特異性引物進(jìn)行
NTHi-01:-5’-ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC-3’NTHi-02:-5’-CCA-AAT-GCG-AAA-GTT-ACA-TCA-G-3’PCR反應(yīng)混合物包括細(xì)胞抽提液上清，5.0μl；引物NTHi-01(1/10),1.0μl；引物NTHi-02(1/10),1.0μl；DMSO,2.0μl；dNTP混合物，4.0μl；10X緩沖液，5.0μl；ADI,31.5μl；Taq聚合酶，0.5μl。
PCR循環(huán)條件如下(94℃ 1分鐘；50℃ 1分鐘；72℃ 3分鐘)共25個(gè)循環(huán)，最后以72℃ 10分鐘終止。此反應(yīng)可通過(guò)3％瓊脂糖凝膠在TBE緩中液中的電泳監(jiān)控。
用于鑒別特定ntHi的P5樣菌毛蛋白LB1(f)肽屬于哪組的引物如下(它們用于與上述條件相似的反應(yīng)中)。
第1組NTHi-01:5’-ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC-3’NTHi-GR1:5’-GTG-GTC-ACG-AGT-ACC-G-3’第2組NTHi-01:5’-ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC-3’NTHi-GR2bis:5’-TCT-GTG-ATG-TTC-GCC-TAG-3’第3組NTHi-01:5’-ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC-3’NTHi-GR3:5’-CTA-TCG-ATG-CGT-TTA-TTA-TC-3’1c)DNA純化PCR反應(yīng)中的DNA片段用PCR Clean Up試劑盒(Boehringer Marnnheim)純化。在該方案的最后，用25μl重蒸水經(jīng)兩次洗脫將純化的PCR產(chǎn)物從硅膠樹(shù)脂上洗脫下來(lái)。
純化產(chǎn)物經(jīng)3％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色分析。該DNA隨后可用于測(cè)序。
1d)DNA測(cè)序用ABI自動(dòng)測(cè)序儀、ABI-PRISM-DNA測(cè)序試劑盒(采用TerminatorPCR循環(huán)測(cè)序)，和Amplitaq DNA聚合酶FS(來(lái)自Perkn Elmer)進(jìn)行。
所用PCR反應(yīng)混合物如下混合物(來(lái)自試劑盒)，8.0μl；DNA(大約1μg),3.0μl；引物(如下)1/5或1/10,1.0μl；ADI,8.0μl。
所用測(cè)序引物如下NTHi-03:5’-AGG-TTA-CGA-CGA-TTT-CGG-3’或NTHi-04:5’-CGC-GAG-TTA-GCC-ATT-GG-3’或NTHi-05:5’-AAA-GCA-GGT-GCT-TTA-G-3’或NTHi-06:5’-TAC-TGC-GTA-TTC-TGC-ACC-3’或NTHi-03:5’-AGG-TTA-CGA-CGA-TTT-CGG-3’NTHi-04:5’-CGC-GAG-TTA-GCC-ATT-GG-3’NTHi-05:5’-AAA-GCA-GGT-GTT-GCT-TTA-G-3’NTHi-06:5’-TAC-TGC-GTA-TTC-TTA-TGC-ACC-3’NTHi-14:5’-GGT-GTA-TTT-GGT-GGT-TAC-C-3’NTHi-15:5’-GTT-ACG-ACG-ATT-ACG-GTC-G-3’PCR循環(huán)測(cè)序條件如下(96℃ 30秒；50℃ 15秒；60℃ 4分鐘)共25個(gè)循環(huán)，最后以72℃ 10分鐘結(jié)束。
制備PCR產(chǎn)物并通過(guò)以下進(jìn)行分析在PCR測(cè)序反應(yīng)中加80μl ADI至反應(yīng)物終體積為100μl；在該DNA溶液中加等體積的酚/氯仿。樣品在4℃以14,500rpm離心3分鐘，然后去掉頂層的水相。酚/氯仿步驟和離心步驟再重復(fù)一次。然后加入10μl 3M NaAc(pH4.8)和220μl 100％乙醇(在室溫的條件下)，并混勻。樣品于-20℃放置5分鐘，然后在4℃以14,000rpm離心20分鐘。去掉乙醇上清液，沉淀用70％乙醇1ml懸浮(在室溫下)。在4℃以14,000rpm離心10分鐘，如上述去掉上清液。沉淀在空氣中干燥，冷凍過(guò)夜。用以下溶液溶解沉淀甲酰胺100％去離子水，5倍體積；0.5M EDTA,pH8.00,1倍體積；攪拌幾秒鐘后上樣至測(cè)序膠。
1e)匯總的結(jié)果和結(jié)論對(duì)各種ntHi分離物中P5樣菌毛蛋白的LB1(f)肽的序列分析示于表1。通過(guò)使LB1(f)肽對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:5,2或3(分別為第1,2，或3組LB1(f)肽的代表)進(jìn)行對(duì)齊排列而確定分組。所測(cè)的LB1(f)肽必需與某一組的代表肽具有至少75％的相同性才能被歸類(lèi)于這一組。表2,3和4分別顯示第1,2和3組LB1(f)肽序列的對(duì)齊排列序列。表5顯示第1、2a、2b和3組的代表性LB1(f)肽相互之間的對(duì)齊排列。
表6-9分別顯示表2-5中LB1(f)肽的DNA序列。
表1
所調(diào)查的ntHi菌株的總列表以及它們各自的P5樣菌毛蛋白LB1(f)肽序列的歸類(lèi)(菌株1-53來(lái)自L.Bakaletz；菌株54-83來(lái)自A.Forsgren)。*指明一ntHi歐洲株，所有其它菌株均分離自美國(guó)。菌株1885和1128可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得(編號(hào)分別為ATCC#55431和55430)。
表2第1組的各種肽序列N1128RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1380MEE RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1885R RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1562MEE RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1563MEE RSDYKFYEDANGTRDHKKGN180NP RSDYKFYEDANGTRDHKKGN217NP RSDYKFYEDANGTRDHKKGN284NP RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1666MEE RSDYKFYEDANGTRDHKKGN1230MEE RSDYKFYEDANGTRDHKKGNTHI-501 RSDYKFYEDANGTRDHKKGNTHI-507 RSDYKFYEDANGTRDHKKGNTHI-565 RSDYKFYEDANGTRDHKKGNTHI-603 RSDYKFYEDANGTRDHKKGNTHI-608 RSDYKFYEDANGTRDHKKGN287NP RSDYKFYEDANGTRDHKKGN86028LM RSDYKFYEDANGTRDHKKGN86028NP RSDYKFYEDANGTRDHKKGN152NP RSDYKFYEDADGTRDHKKGN1234MEE RSDYKFYDDANGTRDHKKGN182NP RSDYKFYDDANGTRDHKKGN90100RM RSDYKFYEDENGTRDHKKGN90100 RSDYKFYEDENGTRDHKKGN10567RM RSDYKFYEAANGTRDHKKGN1060MEE RSDYKFYEAANGTRDHKKGN172NP RSDYKFYEAANGTRDHKKGN1199MEE RSDYKFYEAANGTRDHKKGN10568LM RSDYKFYEAANGTRDHKKGN90121RM RSDYKFYEAANGTRDHKKGN86027NP RSDYKFYEVANGTRDHKKGNTHI-486 RSDYKFYEVANGTRDHKKGN1712MEE RSDYKFYEVANGTRDHKKGNTHI-503 RSDYKFYEAANGTRDHKKGNTHI-476 RSDYKFYEEANGTRDHKKGN166NP RSDYKFYNDANGTRDHKKSN1182MEE RSDYKFYNDANGTRDHKKSN1848NP RSDYKFYEVANGTRDHKKSN1371MEE RSDYKFYEVANGTRDHKKSNTHI-498 RSDYKFYEVANGTRDHKKSNTHI-606 RSDYKFYEVANGTRDHKKSN1848L RSDYKFYEVANGTRDHKKSNTHI-567 RSDYKFYEDANGTRDRKTGNTHI-484 RSDYKFYEDANGTRKHKEGN10559RM RSDYKLYEVANGTRDHKKSNTHI-601 RSDYKFYEVANGTRDHKQSNTHI-481 RSDYKFYEVANGTRDHKQSNTHI-482 RSDYKFYEVANGTRDHKQSN1370MEE RSDYKFYEVANGTRDHKQSN226NP RSDYKFYEEANGTRDHKRSNTHI-480 RSDYKFYEDANGTRERKRGN1657MEE RSDYKFYEVANGTRERKKGN267NP RSDYKFYEVANGTRERKKGNTHI-490 RSDYKFYEVANGTRERKKGNTHI-494 RSDYKFYEVANGTRERKKGN214NP RSDYKFYEVPNGTRDHKQSN250NP RSDYKRYEEANGTRNHDKGN1521RSDYKRYEEANGTRNHDKGNTHI-605 RSDYKRYEEANGTRNHDKGNTHI-499 RSDYEFYEAPNSTRDHKKG表3第2組的各種肽序列N1715MEE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGEN1714MEE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGEN86027RM RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGEN297NP RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGEN266NP RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGEN1885MEE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGENTRI-546 RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGENTHI-604 RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGENTHI-492 RSDYKLYNKNSS-NSTLKNLGENTHI-502 RSDYKLYDKNSSSN-TLKKLGENTHI-506 RSDYKLYNKNSS-NSTLKNLGEN1236MEE RSDYKLYNKNSS---TLKDLGENTHI-500 RSDYKLYNKNSS---TLKDLGENTHI-183 RSDYKLYNKNSS---TLKDLGEN165NP RSDYKLYNKNSSN-TLKDLGENTHI-495 RSDYKLYNKNSSD-ALKKLGE表4第3組的各種肽序列N1729MEE RSDYKFYDNKRIDNTHI-504 RSDYKFYDNDRIDNTHI-544 RSDYKFYDNKRIDNTHI-600 RSDYKFYDNKRIDN1728MEE RSDYKFYDNKRIDN10548LM RSDYKFYDNKRIDN10547RM RSDYKFYDNKRIDN105678R RSDYKFYDNKRID表5第1、2a、2b和3組的各種肽序列N1128RSDYKFYEDANGTRDHKKG---N1715MEE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGENTHI-183 RSDYKLYNKNSS---TLKDLGEN1729MEE RSDYKFYDN------KRID---表6第1組的各種基因序列N1128 CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1380MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1885R CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1562MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1563MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN180NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN217NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN284NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1666MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1230MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-501CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-507CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-565CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-603CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-608CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN287NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN86028LMCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN86028NPCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN152NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAGACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1234MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT182NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN90100RMCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGAAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN90100 CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGAAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN10567RMCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1060MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN172NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1199MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAATGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN10568LMCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN90121RMCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN86027NPCGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-486CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1712MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-503CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTNTHI-476CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN166NP CGTTCTGATTATAAATTTTATAATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTN1182MEECGTTCTGATTATAAATTTTATAATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTN1848NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTN1371MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTNTHI-498CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTNTHI-606CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTN1848L CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTNTHI-567CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCGCAAGACAGGTNTHI-484CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTAAGCACAAGGAAGGTN10559RMCGTTCTGATTATAAACTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGTNTHI-601CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGTNTHI-481CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGTNTHI-482CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGTN1370MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGTN226NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAGAAGTNTHI-480CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAGAGGTN1657MEECGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAAAGGTN267NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAAAGGTNTHI-490CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAAAGGTNTHI-494CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAAAGGTN214NP CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTCCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGTN250NP CGTTCTGATTATAAACGTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTAACCACGACAAAGGTN1521 CGTTCTGATTATAAACGTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTAACCACGACAAAGGTNTHI-605CGTTCTGATTATAAACGTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTAACCACGACAAAGGTNTHI-499CGTTCTGATTATGAATTTTATGAAGCTCCAAACAGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT表7第2組的各種基因序列N1715MEECGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN1714MEECGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN86027RMCGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN297NP CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN266NP CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN1885MEECGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAANTHI-546CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAANTHI-604CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAANTHI-492CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---AATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAANTHI-502CGTTCTGACTATAAATTGTACGATAAAAATAGTAGTAGTAAT---ACTCTTAAAAAACTAGGCGAANTHI-506CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---AATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAAN1236MEECGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAANTHI-500CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAANTHI-183CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAAN165NP CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAAT------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAANTHI-495CGTTCTGACTATAAATTATACAATAAAAATAGTAGTGAT------GCTCTTAAAAAACTAGGCGAA表8第3組的各種基因序列N1729MEECGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATNTHI-504CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATNTHI-544CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATNTHI-600CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATN1728MEECGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATN10548LMCGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATN10547RMCGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGATN105678RCGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGAT表9第1、2a、2b和3組的各種基因序列N1128 CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGTN1715MEECGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAANTHI-183CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAAN1729MEECGTTCTGACTATAAATTCTACGATAAT------------------AAACGCATCGAT該研究表明所測(cè)83株ntHi分離物上P5樣菌毛蛋白的LB1(f)肽可分為三組，且ntHi的美國(guó)和歐洲分離株均包括在這種分類(lèi)中。
實(shí)施例2在大腸桿菌中表達(dá)LPD-LB1(f)肽融合多肽材料資源1)表達(dá)載體pMG1表達(dá)載體pMG1是pBR322的衍生物，其中導(dǎo)入了λ噬菌體中用于轉(zhuǎn)錄和翻譯外源插入基因的控制元件(Young等，(1983)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)80,6105-6109)。另外，氨芐青霉素抗性基因換成卡那霉素抗性基因。
該載體包含λ啟動(dòng)子PL、操縱子OL和兩個(gè)用于減弱轉(zhuǎn)錄的極性效應(yīng)的位點(diǎn)(NutL和NutR)。將含有PL啟動(dòng)子的載體導(dǎo)入溶原性大腸桿菌以穩(wěn)定該質(zhì)粒DNA。溶原性菌株的基因組中整合了有復(fù)制缺陷的λ噬菌體DNA。作為染色體的λ噬菌體DNA指導(dǎo)cI抑制蛋白的合成，該蛋白可以結(jié)合載體的OL抑制子，阻止RNA聚合酶結(jié)合PL啟動(dòng)子和因此所致的插入基因的轉(zhuǎn)錄。AR58表達(dá)菌株的cI基因包含一個(gè)溫度敏感性突變，使PL指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄可通過(guò)溫度變化來(lái)調(diào)節(jié)，即升高培養(yǎng)溫度使抑制物失活，則外源蛋白質(zhì)的合成得以啟動(dòng)。該表達(dá)系統(tǒng)使得對(duì)外源蛋白質(zhì)特別是那些可能對(duì)細(xì)胞有毒害的蛋白質(zhì)的合成可以進(jìn)行控制。
2)表達(dá)載體pMGMCSpMG1中BamHⅠ和XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn)之間的核苷酸序列被一多克隆位點(diǎn)DNA片段(MCS)所替代，產(chǎn)生pMGMCS表達(dá)載體(圖1)。
在MCS序列的3’末端加一個(gè)多組氨酸序列，以使融合至一個(gè)6組氨酸尾的蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達(dá)。
編碼NS1的最開(kāi)始三個(gè)氨基酸(Met-Asp-Pro)的序列也出現(xiàn)在該載體上，位于BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn)之前。
3)載體pRIT 14588的構(gòu)建從pMGMCS載體產(chǎn)生pRIT 14588表達(dá)載體的克隆策略概述于圖2。用分別在5’和3’端包含BamHⅠ和NcoⅠ限制性位點(diǎn)的引物經(jīng)PCR從pHIC348載體擴(kuò)增脂蛋白D的基因(Janson等，(1991)感染與免疫59,119-125)。然后將BamHⅠ/NcoⅠ片段插入pMGMCS的BamHⅠ和NcoⅠ位點(diǎn)之間。
脂蛋白D基因的產(chǎn)物含有其天然信號(hào)序列，但最開(kāi)始的三個(gè)氨基酸已被NS1的Met-Asp-Pro取代。
用pRIT14588將LB1(f)肽導(dǎo)入脂蛋白基因的3’末端。所用LB1(f)肽如下第1組，ntHi-1128(SEQ ID NO:5)；第2組，ntHi-1715MEE(SEQ IDNO:2)；第3組，ntHi-1729MEE(SEQ ID NO:3)。
4)大腸桿菌菌株AR58用來(lái)生產(chǎn)蛋白D載運(yùn)蛋白的AR58溶原性大腸桿菌菌株是標(biāo)準(zhǔn)的NIH大腸桿菌K12菌株N99(F-su-galK2,lacZ-thr-)的衍生物。它包含一個(gè)缺陷的溶原性λ噬菌體(galE::TN10,λKiL-cI857DH1)。KiL-表型阻止宿主大分子合成的關(guān)閉。cI857突變?yōu)閏I抑制子提供一種溫度敏感性損傷。DH1缺失除去了λ噬菌體的右側(cè)操縱子和宿主的bio,uvr3以及chlA位點(diǎn)。通過(guò)用預(yù)先生長(zhǎng)在SA500衍生物(galE::TN10,λKiL-cI857DH1)上的P1噬菌體原種轉(zhuǎn)導(dǎo)N99就可產(chǎn)生AR58菌株(Mott等(1985)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，82,88-92)，用四環(huán)素來(lái)篩選導(dǎo)入了缺陷的溶原性噬菌體的N99菌株(編碼四環(huán)素抗性的TN10轉(zhuǎn)座子出現(xiàn)在galE基因的鄰區(qū))。
實(shí)施例2a)脂蛋白D-第1組LB1(f)之融合體的產(chǎn)生該構(gòu)建的目的是將LB1(f)肽的19個(gè)殘基從3’方向克隆至pRIT 14588的多克隆位點(diǎn)上NcoⅠ位點(diǎn)處。在緊鄰NcoⅠ位點(diǎn)3’處，導(dǎo)入兩個(gè)甘氨酸殘基，使LB1(f)肽的基因和LPD基因在同一框架內(nèi)。在這兩個(gè)甘氨酸殘基后面導(dǎo)入編碼LB1(f)肽N末端8個(gè)天然殘基(來(lái)自P5樣菌毛蛋白)的DNA序列，其后為L(zhǎng)B1(f)DNA序列，再往后是編碼LB1(f)肽C末端5個(gè)天然殘基的DNA序列。該質(zhì)粒(稱為L(zhǎng)PD-LB1-A)示于表3，其制備如下用NcoⅠ和SpeⅠ酶切pRIT 14588，并將該線性大片段去磷酸化。LB1(f)基因用以下引物從ntHi-1128P5樣菌毛蛋白基因擴(kuò)增引物L(fēng)B-Baka-01(5’-含有一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn))5’-CTA-GCC-ATG-GAT-GGT-GGC-AAA-GCA-GGT-G-3’引物L(fēng)B-Baka-05(3’-含有一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn))5’-CAC-TAG-TAC-GTG-CGT-TGT-GAC-GAC-3’PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用NcoⅠ和SpeⅠ酶切。將LB1(f)DNA片段純化，再連接至酶切的pRIT 14588上的NcoⅠ和SpeⅠ位點(diǎn)。將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌AR58中，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于固體培養(yǎng)基(BP)LBT+卡那霉素(50μg/ml)。平板于30℃培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)。為了啟動(dòng)LPD-LB1(f)嵌合多肽的表達(dá)，將培養(yǎng)溫度在4小時(shí)內(nèi)從30℃換成39℃。表達(dá)在12.5％的丙烯酰胺凝膠上監(jiān)控(用考馬斯亮蘭染色和/或Western Blot觀察)。該嵌合多肽的分子量約為44kDa。
實(shí)施例2b)第2組LPD-LB1(f)+第1組LB1(f)之融合體的產(chǎn)生質(zhì)粒(稱為L(zhǎng)PD-LB1-Ⅱ)示于表4，其制備如下用NcoⅠ酶切質(zhì)粒LPD-LB1-A，并使該線性DNA去磷酸化。第2組LB1(f)肽的基因用如下引物從ntHi-1715MEE的P5樣菌毛蛋白基因擴(kuò)增引物NT1715-11NCO(5’含有一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn))5’-CAT-GCC-ATG-GAT-GGC-GGT-AAA-GCA-GGT-GGT-GCT-3’引物NT1715-12NCO(3’含有一個(gè)NcoⅠ位點(diǎn))5’-CAT-GCC-ATG-GCA-CGT-GCT-CTG-TGA-TG-3’PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物用NcoⅠ酶切。將LB1(f) DNA片段純化，再連接至酶切的LPD-LB1-A質(zhì)粒之開(kāi)放性NcoⅠ位點(diǎn)上(5’于第1組LB1(f)肽的基因)。將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌AR58中，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于固體培養(yǎng)基(BP)LBT+卡那霉素(50μg/ml)上。平板于30℃培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)。為了啟動(dòng)LPD-LB1(f)2,1嵌合多肽的表達(dá)，將培養(yǎng)溫度在4小時(shí)內(nèi)從30℃換成39℃。表達(dá)在12.5％的丙烯酰胺凝膠上監(jiān)控(用考馬斯亮蘭染色和/或Western Blot觀察)。該嵌合多肽的分子量約為50kDa。
實(shí)施例2C)脂蛋白D-第2組LB1(f)+第1組LB1(f)+第3組LB1(f)的融合體的產(chǎn)生質(zhì)粒(稱為L(zhǎng)PD-LB1-Ⅲ)示于表5，其制備如下質(zhì)粒LPD-LB1-Ⅱ用SpeⅠ酶切，使該線性DNA去磷酸化。ntHi-1929MEE的第3組LB1(f)肽的基因通過(guò)與以下引物雜交而制備引物NT1729-18SPE(在5’端含有一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn))5’-CTA-GTC-GTT-CTG-ACT-ATA-AAT-TCT-ACG-ATA-ATA-AAC-GCA-TCG-ATA-GTA-3’引物NT1729-19SPE(在3’端含有一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn))5’-CTA-GTA-CTA-TCG-ATG-CGT-TTA-TCG-TAG-AAT-TTA-TAG-GCA-GAA-CGA 3’雜交的DNA包含第3組LB1(f)肽的基因并在其兩端各有一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn)。將LB1(f) DNA片段連接至酶切的LPD-LB1-Ⅱ質(zhì)粒之開(kāi)放性SpeⅠ位點(diǎn)上(3’于第1組LB1(f)肽的基因)。將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌AR58中，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于固體培養(yǎng)基(BP)LBT+卡那霉素(50μg/ml)上。平板于30℃培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)。為了啟動(dòng)LPD-LB1(f)2,1,3嵌合多肽的表達(dá)，將培養(yǎng)溫度在4小時(shí)內(nèi)從30℃換成39℃。表達(dá)在12.5％的丙烯酰胺凝膠上監(jiān)控(用考馬斯亮蘭染色和/或Western Blot觀察)。該嵌合多肽的分子量約為53kDa。
實(shí)施例2d)對(duì)嵌合多肽表達(dá)的定性以上嵌合多肽的表達(dá)可以在12.5％的丙烯酰胺凝膠上監(jiān)控，其用以下任一方法觀察a)考馬斯亮蘭染色的凝膠(圖6)b)WESTERN BLOT1)使用兔抗LB1抗體(圖7)2)使用單克隆抗-LPD抗體(圖8)3)使用抗6-組氨酸純化標(biāo)簽的抗體(圖9)如上所示，每一嵌合多肽均可在大腸桿菌中有效表達(dá)。
實(shí)施例3嵌合多肽的純化純化LPD-LB1(f)2,1,3(用圖5所示的構(gòu)建體表達(dá))可通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)大腸桿菌在磷酸鹽緩沖液(50mM,pH7.0)中洗滌并重懸。在3％Empigen存在的條件下，通過(guò)4℃輕微渦旋過(guò)夜使細(xì)胞裂解。溶液在BeckmanJA10轉(zhuǎn)頭上以8,000rpm離心30分鐘。上清液在50mM磷酸鹽緩沖液，500mM NaCl,pH7.0中稀釋4倍。第一步純化可在Qiagen NTA Ni++柱上完成，因?yàn)樵摱嚯牡腃-末端有6組氨酸標(biāo)簽。柱子用10mM磷酸鈉緩沖液，500mM NaCl,0.5％Empigen,pH7.5平衡，然后用在20mM的磷酸鈉緩沖液，0.5％Empigen,pH7.0中的咪唑梯度(0-100mM)從柱中洗脫該多肽。隨后對(duì)各洗脫級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
下一步純化在Bio-Rad Macro-Prep 50S柱上完成。在用20mM磷酸鹽緩沖液，0.5％Empoigen,pH7.0平衡的柱上所結(jié)合的多肽用同一緩沖液中的0-500mM NaCl梯度洗脫。然后對(duì)洗脫的級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
最后一步(精加工步驟)用Sephacryl S200 HR分子排阻層析柱完成。首先將前一步驟的多肽溶液用Filtron Omega 10kDa濃縮僅濃縮。將所得溶液上樣于已用含0.5％Empigen的PBS緩沖液平衡的層析柱并洗脫。多肽的洗脫完成后對(duì)洗脫級(jí)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。
收集的級(jí)分經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾。所得蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳并考馬斯亮蘭染色后為一條純的帶，用抗LB1抗體進(jìn)行的Western Blot結(jié)果相同。檢測(cè)證實(shí)該蛋白質(zhì)在37℃ 7天后仍保持完整。
通過(guò)該方法可從每升細(xì)胞培養(yǎng)液中純化得到大約200mg多肽。
實(shí)施例4所述嵌合多肽的疫苗效率的前臨床實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4a)抗血清的產(chǎn)生針對(duì)四型抗原產(chǎn)生抗血清LPD；PD；LPD-LB1(f)2,1,3(用質(zhì)粒LPD-LB1-Ⅲ重組制得)；LB1(融合至麻癥病毒的T-細(xì)胞隨機(jī)表位的第1組LB1(f)肽融合蛋白，此肽的序列為RSDYKFYEDANGTRDHKKGPSLKLLSLKGVIVHRLEGVE四個(gè)各含5只毛絲鼠的同齡組接受免疫，每一同齡組分別用以上鑒定的免疫原之一免疫。前三種抗原的劑量是10μg抗原/200μl AlPO4/20μg MPL(3-O-脫?；膯瘟柞Ｖ|(zhì)A),LB1的劑量為在完全或不完全弗氏佐劑中的10μg抗原。
每隔一個(gè)月注射三針。最后一次免疫的15天后，所有動(dòng)物經(jīng)心臟穿刺和胸廓造口術(shù)(thorectomy)放血以收集血清。血清按同齡組收集并貯存于-70℃。
抗PD-血清的效價(jià)為10-50K，抗LPD的為50K，抗LB1的為50-100K，抗-LPD-LB1(f)2,1,3的為50-100K。除了LB1肽，抗-LB1在Western Blot上也識(shí)別LPD-LB1(f)2,1,3?？?LPD和抗-PD也識(shí)別LPD-LB1(f)2,1,3。免疫金標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(用金偶聯(lián)的蛋白A)顯示，抗LB1和抗-LPD-LB1(f)2,1,3多克隆抗血清均識(shí)別ntHi86-028NP細(xì)胞的表面可接近表位，這些表位類(lèi)似于由針對(duì)P5樣菌毛蛋白的單克隆抗體所識(shí)別的表位。
另外，圖12顯示了一項(xiàng)Western Blot，其表明抗LPD-LB1(f)2,1,3血清識(shí)別來(lái)自三個(gè)ntHi菌株、代表三個(gè)LB1(f)大組的P5樣菌毛蛋白。抗LPD-LB1(f)2,1,3對(duì)這些菌株的識(shí)別遠(yuǎn)強(qiáng)于抗LB1的識(shí)別。
實(shí)施例4b)被動(dòng)轉(zhuǎn)移和攻擊該研究目的在于通過(guò)對(duì)被動(dòng)免疫的毛絲鼠實(shí)施體內(nèi)攻擊，以確定4種免疫原(或安慰劑)制劑促進(jìn)ntHi從鼻咽部清除的相對(duì)效力。
五個(gè)同齡組各含11只毛絲鼠，每只(毛絲鼠(chinchilla lanigera))均無(wú)中耳疾病，在第-7天鼻內(nèi)接種6×106TCID50的腺病毒1型。在第-1天，每一同齡組的毛絲鼠經(jīng)心臟穿刺被動(dòng)免疫1∶5稀釋的以上實(shí)施例4a所述的四種血清樣品之一。第五個(gè)同齡組(安慰劑組)經(jīng)心臟穿刺接受不含致熱原的無(wú)菌生理鹽水。注射劑量是大約5mL血清/kg動(dòng)物。
在第0天，各同齡組經(jīng)鼻內(nèi)接受ntHi的攻擊每只動(dòng)物約108cfu ntHi#86-028NP(第1組)。在公開(kāi)(de-blinding)這一被動(dòng)轉(zhuǎn)移研究之前對(duì)該研究進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。
用兩種病原體進(jìn)行的這種連續(xù)接種較近似地模仿了這些因子的天然獲得途徑以及它們?cè)谌梭w內(nèi)的協(xié)同相互作用。
該疾病的嚴(yán)重性可通過(guò)耳鏡觀察打分。分0-4個(gè)等級(jí)?？捎^察鼓膜(TM)炎癥的癥狀以獲得指數(shù)滲出物的出現(xiàn)、小血管的擴(kuò)張、氣液界面、不透明性等。
利用對(duì)變化的重復(fù)測(cè)量分析來(lái)比較超時(shí)(天數(shù))應(yīng)答模式以及這五個(gè)組(同齡組)的(左或右)耳。因?qū)γ總€(gè)動(dòng)物進(jìn)行了大量的重復(fù)觀察，而將此分析分為如下5部分1-7天，8-14天，19-21天，22-28天，和29-33天。在第-7天到第0天，第34天和第35天應(yīng)答幾乎無(wú)變化，因而未對(duì)這些時(shí)間進(jìn)行所述分析。只要有可能(即平均應(yīng)答中有非零變化時(shí))，就會(huì)進(jìn)行檢測(cè)以比較各組在這些時(shí)間點(diǎn)的平均應(yīng)答。用Tukey’s HSD檢驗(yàn)進(jìn)行所有post-hocmultiple比較。顯著性用0.05的α評(píng)估。
結(jié)果示于表10。在1-7天期間，所有組的炎癥反應(yīng)均顯著增加。在29-33天期間，所有組的炎癥反應(yīng)均顯著減少。如該數(shù)據(jù)所示，含有抗重組LPD-LB1(f)2,1,3抗體的血清在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間有助于減少TM炎癥。一種有效的疫苗原應(yīng)能使TM炎癥在整個(gè)研究期間維持在或低于1.5。LPD-LB1(f)2,1,3抗血清僅有2天使平均炎癥指數(shù)超過(guò)1.5，隨后則導(dǎo)致持續(xù)下降。
除了耳鏡檢查，還可利用鼓室壓測(cè)量(EarScan,South Daytona,FL,USA)，其測(cè)量中耳壓的變化。這兩種檢測(cè)方法可聯(lián)合使用以明示中耳內(nèi)是否有滲出。鼓室壓測(cè)量結(jié)果如果是得到B型鼓室壓圖，或中耳壓低于-100daPa，說(shuō)明耳的異常。表11顯示此分析的結(jié)果。很明顯，如果考慮到對(duì)TM炎癥以及滲出發(fā)生的預(yù)防作用的測(cè)量結(jié)果，重組LPD-LB1(f)2,1,3在該研究里效果很好。LPD-LB1(f)2,1,3的總體水平僅次于作為陽(yáng)性對(duì)照的LB1肽。但LB1肽有CFA(一種非常強(qiáng)的佐劑)輔助，故不能直接與LPD-LB1(f)2,1,3的結(jié)果比較。
對(duì)表11中數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)評(píng)估示于圖10中。此評(píng)估比較了每一接受免疫之同齡組比接受安慰劑免疫之動(dòng)物在疾病最嚴(yán)重時(shí)[共有4天，接種安慰劑的耳至少有50％有滲出(患中耳炎)]滲出百分率的減少。
4天內(nèi)(第11-14天)陽(yáng)性對(duì)照(抗-LB1/CFA)的顯著性為P＜0.001。抗LPD-LB1(f)2,1,3在第11,12,13和14天時(shí)也抑制中耳炎的發(fā)展，P值小于或等于0.001?？筆D僅在第13和14天時(shí)有顯著性，而抗LPD僅在第14天時(shí)相對(duì)于安慰劑組動(dòng)物能阻止中耳炎的發(fā)展(P值接近0.02)。
因此重組LPD-LB1(f)2,1,3多肽能顯著抑制毛絲鼠體內(nèi)經(jīng)該血庫(kù)被動(dòng)轉(zhuǎn)移的中耳炎的發(fā)展。
表10比較第11-14天期間，LB1,PD,LPD-LB1(f)213和LPD組與安慰劑組中有滲出的耳的百分率。
實(shí)施例4c)粘附抑制數(shù)據(jù)用人口咽細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)的單細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)。由免疫毛絲鼠血清對(duì)ntHi菌株粘附這些細(xì)胞的平均抑制百分率產(chǎn)生于實(shí)施例4a。利用抗LPD-LB1(f)2,1,3和LPD抗血清的結(jié)果見(jiàn)表11。抗LPD-LB1(f)2,1,3的抗血清能有效抑制第1組和第2組ntHi菌株的粘附。它也比抗-LPD抗血清對(duì)所有菌株的抑制更有效。
表11免疫毛絲鼠血清對(duì)ntHi菌株粘附人口咽細(xì)胞的平均抑制百分率。
實(shí)施例4d)用異源ntHi菌株進(jìn)行的被動(dòng)轉(zhuǎn)移和攻擊進(jìn)行類(lèi)似于以上實(shí)施例4b)所述的實(shí)驗(yàn)，用分屬不同LB1(f)組的ntHi菌株攻擊毛絲鼠的腺病毒共感染模型。
共132只幼齡(約300克)毛絲鼠(Chinchilla lanigera)經(jīng)耳鏡檢查或鼓室壓測(cè)量證實(shí)無(wú)任何中耳感染跡象。將它們用于抗LB1和抗-LPD-LB1(f)2,1,3抗血清的2個(gè)攻擊實(shí)驗(yàn)。2個(gè)攻擊實(shí)驗(yàn)在下文中詳述，其中所用毛絲鼠的平均體重分別為296±38g或298±42g。使動(dòng)物休養(yǎng)10天，之后經(jīng)心臟穿刺略放血以收集免疫前的血清，將其貯于-70℃?zhèn)溆谩?dòng)物在收集了免疫前的血清后至少休息7天，再接受腺病毒攻擊。
這些研究中所用的ntHi菌株是有限傳代的臨床分離物[86-028NP(第1組),1885MEE(第2組)和1728MEE(第3組)]，來(lái)自哥倫比亞兒童醫(yī)院中因患慢性中耳炎并伴有滲出而接受鼓膜壓測(cè)試和插管的患兒。將所有分離物凍存于加了20％甘油(v/v)的脫脂奶中，直到在巧克力瓊脂上劃線分離并在含有5％CO2的潮濕空氣下，于37℃培養(yǎng)18小時(shí)。腺病毒1血清型也來(lái)自哥倫比亞兒童醫(yī)院的患兒。
為了進(jìn)行兩組被動(dòng)轉(zhuǎn)移研究，將66只幼齡毛絲鼠分成6個(gè)同齡組，每組11只。收集這些毛絲鼠的天然狀態(tài)血清，用Western blot逐一檢查開(kāi)始研究前是否已有任何顯著的抗體滴度。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例4b)一樣進(jìn)行。兩個(gè)同齡組接受LB1抗血清，兩個(gè)同齡組接受LPD-LB1(f)2,1,3抗血清，還有兩個(gè)同齡組接受不含致熱原的無(wú)菌生理鹽水。觀察者既不知道接受了何種血清，也不知道哪些動(dòng)物組成一個(gè)同齡組。
毛絲鼠接受鼻內(nèi)攻擊，方式為每只鼠被動(dòng)吸入約108CFU的ntHi 86-028NP，或1885MEE(研究A)；或，ntHi 86-028NP，或1728 MEE(研究B)。選擇這三個(gè)菌株分別代表LB1(f)肽的不同序列的異源ntHi組第1組ntHi菌株86-028NP；第2組ntHi菌株1885MEE；第3組ntHi菌株1728MEE。
在實(shí)施例4b)中，從接種腺病毒到ntHi攻擊后35天，每天，或每2天通過(guò)耳鏡檢查和鼓室壓測(cè)量而盲目地評(píng)估動(dòng)物。將鼓膜炎癥的癥狀依次分為0-4+級(jí)，并用鼓室壓測(cè)量圖譜監(jiān)控中耳壓、鼓室寬度和鼓膜順應(yīng)性。當(dāng)鼓室壓檢測(cè)得到B型鼓室圖；順應(yīng)性≤0.5ml或≥1.2ml；中耳壓低于-100dapa；或鼓室寬度超過(guò)150dapa，表示有耳異常。
用Tukey’s HSD檢驗(yàn)比較接受相同NTHi菌株攻擊的各同齡組之間，自細(xì)菌攻擊后的1-35天內(nèi)的日平均鼓膜炎癥指數(shù)。每一免疫動(dòng)物同齡組，與用相同NTHi至少攻擊了7天(最多22天)的安慰劑同齡組相比，平均耳鏡檢查指數(shù)顯著偏低(p≤0.05)。耳鏡檢查定級(jí)結(jié)果示于圖13(研究A)和圖14(研究B)。LPD-LB1(f)2,1,3平均耳鏡指數(shù)顯著低于安慰劑組的天數(shù)有第13-35天(研究A，86-028NP)；第1-8天，第12-21天(研究A,1885MEE)；第8-14天，第23天(研究B,86-028NP)；第8-14天(研究B,1728MEE)。
對(duì)研究A和B中正常耳的百分比分析分別示于圖15和圖16。
特異性抗血清經(jīng)被動(dòng)轉(zhuǎn)移而抵抗中耳炎的發(fā)生的能力可以通過(guò)Z檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估。在兩個(gè)研究中，接受抗LB1血清的動(dòng)物在用NTHi 86-028NP攻擊后，未顯示任何產(chǎn)生中耳炎并伴有滲出的癥狀。與安慰劑組動(dòng)物相比，抗LPD-LB1(f)2,1,3的轉(zhuǎn)移顯著阻止中耳炎發(fā)展的天數(shù)有(在安慰劑組動(dòng)物超過(guò)50％有滲出的日子里測(cè)量)第13-21天(研究A,86-028NP)；第13-18天(研究A,1885MEE)；第13-14天(研究B86-028NP)；第9-12天(研究B,1728MEE)。
總之，用這三株ntHi分離物中的任何一株所進(jìn)行的毛絲鼠攻擊導(dǎo)致在鼻咽部開(kāi)始定居。通過(guò)耳鏡檢查和鼓室壓測(cè)量所得的評(píng)估數(shù)據(jù)說(shuō)明，接受抗LPD-LB1(f)2,1,3抗血清的同齡組相比于用相同ntHi攻擊的安慰劑組，在多日的觀察中，平均耳鏡指數(shù)顯著降低且中耳炎的發(fā)生率顯著減少。
因此，LPD-LB1(f)2,1,3可提供保護(hù)作用以抵抗因腺病毒感染而抵抗力下降的毛絲鼠由異源NTHi引起的中耳炎發(fā)展。此外，LB1也能提供保護(hù)，但這可能部分歸因于強(qiáng)效佐劑(CFA)與其的聯(lián)合使用。
雖已顯示和描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但在不背離本發(fā)明所附權(quán)利要求所述的范圍的前提下，還可進(jìn)行各種改變和修飾。例如，具有如本文所述之基本相同氨基酸序列的肽或多肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
SEQ ID NO:1RSDYKFYEAANGTRDHKKG[來(lái)自菌株ntHi-10567RM(第1組)]SEQ ID NO:2RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE[來(lái)自菌株ntHi-1715MEE(第2a組)]SEQ ID NO:3RSDYKFYDNKRID[來(lái)自菌株ntHi-1729MEE(第3組)]SEQ ID NO:4RSDYKLYNKNSSTLKDLGE來(lái)自菌株ntHi-183NP(第2b組)]SEQ ID NO:5RSDYKFYEDANGTRDHKKG[來(lái)自菌株ntHi-1128(第1組)]SEQ ID NO:6RSDYKFYEAPNSTRDXKKG[來(lái)自ntHi的P5蛋白的殘基119-137(第1組)]
權(quán)利要求
1．一種肽，其包含一或多個(gè)選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3，和SEQ ID NO.4或上述序列的任何抗原相關(guān)變體，其同源性至少為75％并能在免疫學(xué)上模擬不可分型流感嗜血桿菌P5樣菌毛蛋白的相關(guān)抗原決定位點(diǎn)，條件是該抗原相關(guān)變體不包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所提供的多肽。
2．權(quán)利要求1的肽，其包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
3．權(quán)利要求1的肽，其包括SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
4．權(quán)利要求1的肽，其包括SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
5．權(quán)利要求1的肽，其包括SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
6．一種嵌合多肽，其包含共價(jià)連接于含至少一個(gè)T細(xì)胞表位之載體多肽的一或多個(gè)權(quán)利要求1-5的肽。
7．權(quán)利要求6的嵌合多肽，其還含有一個(gè)作為純化標(biāo)簽的肽序列。
8．權(quán)利要求7的嵌合多肽，其中該純化標(biāo)簽肽序列是組氨酸標(biāo)簽序列。
9．權(quán)利要求6的嵌合多肽，其中該載體多肽是脂蛋白D。
10．權(quán)利要求6的嵌合多肽，其中所用肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO:1,2和3。
11．一種嵌合多肽，其包含三個(gè)LB1(f)亞單位和脂蛋白D，其中所用LB1(f)亞單位的氨基酸序列如SEQ ID NO:2,3和5所示。
12．權(quán)利要求11的嵌合多肽，其還包含一個(gè)組氨酸純化標(biāo)簽序列。
13．權(quán)利要求11的嵌合多肽，其中肽組分的順序自多肽N-末端開(kāi)始依次為脂蛋白D,LB1(f)亞單位(SEQ ID NO:2),LB1(f)亞單位(SEQ ID NO:5)，和LB1(f)亞單位(SEQ ID NO:3)
14．權(quán)利要求13的嵌合多肽，其中該多肽的氨基酸序列如圖5所示。
15．一種疫苗組合物，其在可藥用賦形劑中包含致免疫有效量的至少一種權(quán)利要求1-14的肽或多肽，以及一種可選擇的佐劑。
16．一種應(yīng)用，其用包含在可藥用賦形劑中的致免疫有效量的至少一種權(quán)利要求1-14的肽或多肽，和一種可選擇的佐劑，預(yù)防或治療流感嗜血桿菌病。
17．權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中該流感嗜血桿菌病為中耳炎，竇炎，結(jié)膜炎，或下呼吸道感染。
18．一種在對(duì)流感嗜血桿菌感染敏感的哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括給該哺乳動(dòng)物有效量的權(quán)利要求15的疫苗。
19．一種預(yù)防流感嗜血桿菌感染的方法，其包括給予哺乳動(dòng)物有效量的權(quán)利要求15的疫苗。
20．一種DNA或RNA分子，其編碼權(quán)利要求1-14中的一種LB1(f)肽或多肽。
21．權(quán)利要求20的DNA或RNA分子，其中該LB1(f)多肽的DNA序列如圖5所示。
22．權(quán)利要求20或21的DNA或RNA分子，其包含在一種表達(dá)載體中，其中該表達(dá)載體在適宜宿主細(xì)胞內(nèi)能產(chǎn)生上述LB1(f)肽或多肽。
23．一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求22的表達(dá)載體。
24．一種產(chǎn)生LB1(f)肽或多肽的方法，其包括在適于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，并回收該LB1(f)肽或多肽。
25．一種產(chǎn)生權(quán)利要求24的LB1(f)肽或多肽的方法，其包括裂解該宿主細(xì)胞，并經(jīng)固相化鎳柱，陽(yáng)離子交換柱，以及分子排阻層析柱純化可溶性提取物。
26．一種產(chǎn)生能生成LB1(f)肽或多肽的宿主細(xì)胞的方法，其包括用權(quán)利要求22的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，以使該宿主細(xì)胞在適當(dāng)培養(yǎng)條件下表達(dá)LB1(f)肽或多肽。
27．一種純化的抗體，其對(duì)權(quán)利要求1-5中的一種肽具有免疫特異性。
28．一種純化的抗體，其對(duì)權(quán)利要求6-14中的一種嵌合多肽具有免疫特異性。
29．一種檢測(cè)樣品中流感嗜血桿菌的存在的方法，其通過(guò)在一種指示劑存在時(shí)，使該樣品與權(quán)利要求27的抗體接觸。
30．一種檢測(cè)樣品中流感嗜血桿菌的存在的方法，其使該樣品與一種DNA探針或引物接觸，該DNA探針或引物為針對(duì)編碼流感嗜血桿菌P5樣菌毛蛋白之LB1(f)肽的野生型核酸序列而構(gòu)建，其特征在于該探針選自表6-8中所示基因序列。
31．一種診斷哺乳動(dòng)物體內(nèi)流感嗜血桿菌感染的試劑盒，其包含權(quán)利要求30的DNA探針或權(quán)利要求1-5的LB1(f)肽或權(quán)利要求27的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及可模擬不可分型流感嗜血桿菌之P5樣菌毛蛋白的抗原性的肽及其與至少一種T細(xì)胞表位的嵌合多肽,它們的編碼DNA,包含它們的宿主細(xì)胞,它們的產(chǎn)生方法,用它們制備的疫苗組合物,以及它們?cè)诹鞲惺妊獥U菌病的預(yù)防和檢測(cè)中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P27/16GK1306437SQ99807792
公開(kāi)日2001年8月1日 申請(qǐng)日期1999年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月11日
發(fā)明者勞倫·O·巴卡利茨, 約瑟夫·科恩, 蓋伊·德奎斯尼, 伊維斯·洛貝特 申請(qǐng)人:史密斯克萊·比奇曼生物公司, 俄亥俄州大學(xué)研究基金會(huì)