專利名稱：一種同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞內活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測，具體地說是一種同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法。
背景技術：
活性氧(ROS)與還原型谷胱甘肽(GSH)是細胞內信號轉導過程中的兩類重要信號分子，與細胞內氧化還原狀態(tài)密切相關?；钚匝踔饕侵赣赏庠葱匝趸瘎┗蚣毎麅扔醒醮x過程中產生的一類具有很高生物活性的氧分子，如O2-，NO，H2O2，OH等。當機體處于應激狀態(tài)、細胞缺氧、受損或細胞凋亡時，細胞內活性氧過量生成。還原型谷胱甘肽是細胞內含量最多的一種強還原劑，主要功能在于可清除體內過量的活性氧類物質，防止蛋白巰基氧化，并維持細胞內的氧化-還原平衡。對細胞活性氧和還原型谷胱甘肽進行測定是研究氧自由基與應激反應、及與人類疾病相關性的重要指標。
目前用于活性氧和還原型谷胱甘肽的檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)，熒光法，酶學法以及流式細胞儀等。這些方法雖各有所長，但總體而言，所需樣品用量大，靈敏度不高，且不能對兩種物質進行同時檢測。微流控芯片(又稱芯片實驗室)是近幾年發(fā)展起來的一項嶄新的分析技術，它能將生化反應過程中的不同操作單元基本集成在一塊只有幾平方厘米大小的芯片上完成，具有分析速度快、樣品用量小、易于集成等特點，被稱為21世紀最為重要的前沿技術之一。原則上它適用于對核酸、蛋白和小分子等的分離分析，并有可能用于對細胞內復雜組分如活性氧和還原型谷胱甘肽的分析測定。利用微流控芯片對細胞活性氧和還原型谷胱甘肽進行同時測定，目前國內外未見報導。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種樣品用量少、檢測靈敏度較高、可同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法，本發(fā)明在微流控芯片上實現(xiàn)了對兩種物質的同時測定，分析時間僅用27秒，樣品用量非常少(3-4uL)，且檢測靈敏度較高(amol-zmol)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為
一種同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法，采用微流控芯片對細胞活性氧和還原型谷胱甘肽同時測定，微流控芯片電泳采用的緩沖液濃度為20-50mM，緩沖液pH值為8.0-10.1，分離電壓為200-450V/cm，檢測點距進樣通道和分離通道交叉處為1.0-3.0cm。
具體操作內容包括微流控芯片設計，細胞內活性氧與谷胱甘肽熒光標記和提取方法，微流控芯片電泳分離條件和微流控芯片激光誘導熒光檢測方法。
本發(fā)明以微流控芯片為技術平臺，以微流控芯片-激光誘導熒光為檢測手段，所選激光激發(fā)波長為473nm，檢測波長520nm；采用探針DHR-123和NDA分別來標記細胞內活性氧和還原型谷胱甘肽，采用有機溶劑(高氯酸和乙晴混合液)來提取細胞內活性氧和還原型谷胱甘肽；所述高氯酸和乙晴混合液的重量濃度為3.3％高氯酸與乙腈按體積比1∶1混合，其中高氯酸與乙晴的體積比為1∶1微流控芯片的芯片材料可采用玻璃、石英或其它芯片材料；芯片設計最好采用雙T型結構，樣品進樣采用夾切方式來確保進樣容積的準確性；緩沖液可為磷酸緩沖液、硼砂緩沖液等，最好為硼砂緩沖液；本發(fā)明的優(yōu)點為1.本發(fā)明的檢測方法樣品用量非常少(3-4uL)，在微流控芯片上實現(xiàn)了對兩種物質(細胞內活性氧和還原型谷胱甘肽)的同時測定，分析時間僅用27秒，且檢測靈敏度較高(amol-zmol)，所優(yōu)化的微流控芯片電泳條件適用范圍較寬(主要包括緩沖液濃度，pH值，電泳進樣和分離電壓等條件)。
2.本發(fā)明提供了一通用型的細胞活性氧和還原型谷胱甘肽的芯片檢測方法，適用于引起機體氧化應激時細胞氧化還原狀態(tài)變化的監(jiān)測，并可適用于不同類型細胞如腫瘤細胞、紅細胞、神經元及胚胎等的檢測，實驗操作方便易行，具有可操作性。


圖1為本發(fā)明所采用微流控芯片結構示意圖；圖2為本發(fā)明微流控芯片激光誘導熒光光路設計圖；圖3為NB4細胞中活性氧和還原型谷胱甘肽的微流控芯片電泳圖；圖4為K562細胞中活性氧和還原型谷胱甘肽的微流控芯片電泳圖，其中坐標分別代表相對熒光強度(mV)和遷移時間(s)。
具體實施例方式
實施例
1.微流控芯片設計本發(fā)明實施所采用微流控芯片設計如下圖1所示，所采用玻璃芯片為雙T型結構，圖中四個圓孔分別代表不同溶液池，其中2為緩沖液進樣池，4為緩沖液廢液池，1為樣品池，3為樣品廢液池，5為檢測點。芯片的分離通道長8.5cm(從緩沖液池至十字交叉處為0.5cm，從十字交叉處至分離廢液池為8.0cm)，進樣通道長為1.0cm(從樣品池至十字交叉處和從十字交叉處至樣品廢液池均為0.5cm)，通道的橫截面近似為半橢圓形，上寬為50μm，檢測點距十字交叉處為1.0cm。
2.微流控芯片激光誘導熒光檢測器微流控芯片-激光誘導熒光檢測器所選用激光激發(fā)波長為473nm，檢測波長為520nm，采用單點共聚焦檢測方式，微流控芯片激光誘導熒光光路設計圖見圖2，其中6為物鏡，7為半反半透鏡，8為分光鏡，9為第一帶通濾光片，10為凸透鏡，11為針孔，12為光電倍增管，13為芯片，14為第二帶通濾光片，15為激光，16為電感耦合器件。
3.細胞樣品制備以人急性早幼粒白細胞系NB4細胞為例，細胞培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于5％CO2培養(yǎng)箱37度培養(yǎng)。收集細胞，于1000rpm離心5分鐘，棄上清，細胞沉淀用PBS溶液(pH 7.4)重懸后離心，細胞計數(shù)后待用。
4.細胞內活性氧和還原型谷胱甘肽熒光標記和提取方法分別采用DHR-123和NDA對細胞內活性氧和還原型谷胱甘肽進行熒光標記，針對活性氧，DHR-123標記濃度為20-30uM。由于NDA與還原型谷胱甘肽反應很快，實驗中將NDA加入運行緩沖液中達終濃度0.1-0.5mM來動態(tài)標記谷胱甘肽。實驗中所用細胞密度在1×105/mL左右，首先將20uM的DHR-123染料加入細胞培養(yǎng)液中作用20-30分鐘，然后將細胞懸液用PBS洗滌三次(800轉，6分鐘)，棄上清，保留沉淀，然后加入與沉淀部分等體積的的高氯酸/乙晴混合液(3.3％)，經高速(12,000轉)離心5分鐘。后棄上清，再重復上述步驟兩次，保留細胞沉淀，待檢。
5.微流控片電泳分離條件每次運行前，需要將芯片通道分別用水、0.1M氫氧化鈉和緩沖液進行沖洗。上樣時盡量保持4個緩沖池液面處于同一水平位置，然后插入電極。見圖1，在進樣過程中，將樣品廢液池3接地，施加+200V電壓于樣品池1，緩沖液池2和緩沖廢液池4分別施加150V和600V電壓，進樣時間12s。分離過程中，緩沖廢液池4接地，樣品池1和樣品廢液池3分別施加2kV電壓，在緩沖池2上施加+3kV電壓。首先對微流控芯片電泳分離條件如緩沖液、pH、分離電壓等條件進行考察。經優(yōu)化選擇的電泳條件為硼砂緩沖液20-50mM，緩沖液pH值范圍8.0-10.1，分離電壓200-450V/cm。
6.應用實例圖3和圖4分別為NB4細胞和K562細胞中活性氧和還原型谷胱甘肽的微流控芯片電泳圖，電泳圖中峰1和峰2分別代表細胞活性氧和還原型谷胱甘肽。整個分離時間僅用27s，實際樣品消耗量僅用3-4uL，且檢測靈敏度較高。表1為微流控芯片檢測活性氧和谷胱甘肽的主要性能指標.表中可見其檢測靈敏度較高，對活性氧和谷胱甘肽檢測可達pmol和amol水平。
表1.微流控芯片檢測活性氧和還原型谷胱甘肽的主要性能指標(Table 1.Linearity，reproducibility，and detection limits of ROS and GSH)

權利要求
1.一種同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法，其特征在于采用微流控芯片對細胞活性氧和還原型谷胱甘肽同時測定，微流控芯片電泳采用的緩沖液濃度為20-50mM，緩沖液pH值為8.0-10.1，分離電壓為200-450V/cm，檢測點距進樣通道和分離通道交叉處為1.0-3.0cm。
2.按照權利要求1所述同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法，其特征在于以微流控芯片為技術平臺，以微流控芯片-激光誘導熒光為檢測手段，所選激光激發(fā)波長為473nm，檢測波長520nm。
3.按照權利要求1或2所述同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法，其特征在于所述微流控芯片為雙T型結構。
4.按照權利要求1所述同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法，其特征在于所述緩沖液為硼砂緩沖液。
5.按照權利要求1所述同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法，其特征在于采用探針DHR-123和NDA分別來標記細胞內活性氧和還原型谷胱甘肽，采用高氯酸和乙晴混合液來提取細胞內活性氧和還原型谷胱甘肽。
6.按照權利要求5所述同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法，其特征在于所述高氯酸和乙晴混合液的重量濃度為3.3％高氯酸與乙腈按體積比1∶1混合，其中高氯酸與乙晴的體積比為1∶1。
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞內活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測，具體地說是一種同時測定細胞活性氧與還原型谷胱甘肽的檢測方法，采用微流控芯片對細胞活性氧和還原型谷胱甘肽同時測定，微流控芯片電泳采用的緩沖液濃度為20－50mM，緩沖液pH值為8.0－10.1，分離電壓為200－450V/cm，檢測點距進樣通道和分離通道交叉處為1.0－3.0cm。本發(fā)明的檢測方法樣品用量非常少(3－4uL)，在微流控芯片上實現(xiàn)了對細胞內活性氧和還原型谷胱甘肽的同時測定，分析時間僅用27秒，且檢測靈敏度較高(amol－zmol)。
文檔編號G01N21/64GK1940550SQ20051004728
公開日2007年4月4日 申請日期2005年9月28日 優(yōu)先權日2005年9月28日
發(fā)明者秦建華, 葉囡楠, 姜雷, 謝敏豪, 林炳承 申請人:中國科學院大連化學物理研究所