一種快速檢測食品添加劑(日落黃、胭脂紅)聯(lián)合毒性方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種快速檢測食品添加劑(日落黃、胭脂紅)聯(lián)合毒性方法。該方法針對食品添加劑日落黃、胭脂紅的化合結構及其對細胞毒性作用的實驗結果，篩選表征日落黃、胭脂紅聯(lián)合細胞毒性的特異性指標：細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH，通過高內(nèi)涵分析系統(tǒng)對六個指標檢測分析，根據(jù)特異性指標的分析結果鑒定其聯(lián)合毒性。本發(fā)明方法對檢測過程進行了優(yōu)化，具有快速、可靠、重復性好、特異性強等優(yōu)點，可以為食品添加劑日落黃、胭脂紅的正確使用提供理論依據(jù)，對保證食品添加劑的正確使用和食品安全具有重要意義。
【專利說明】
一種快速檢測食品添加劑(日落黃、胭脂紅)聯(lián)合毒性方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于食品安全領域，涉及一種快速檢測食品添加劑(日落黃、胭脂紅)聯(lián)合毒性的方法，具體涉及一種一次性快速檢測兩種食品添加劑:日落黃、胭脂紅同時添加產(chǎn)生的毒性效應。
【背景技術】
[0002]食品添加劑是所有加工食品配料中的重要組成部分之一，可以使加工食品增加營養(yǎng);提高色、香、味、形等感官質(zhì)量和內(nèi)在質(zhì)量;防止食品腐敗變質(zhì);改善食品的加工條件等。目前所使用的添加劑的使用標準是依據(jù)單一物質(zhì)的毒性而制定的，而食品行業(yè)中食品添加劑都是聯(lián)合使用的，實際生活中人類每天攝取多種食品，一種食品添加劑在允許使用范圍內(nèi)是安全的，而幾種同時使用時，可能會產(chǎn)生相加、協(xié)同、拮抗等形式的聯(lián)合作用，存在著使單一物質(zhì)的毒性作用增強的危險性。目前尚未有標準的評測兩種及以上的食品添加劑毒性的方法，因此亟需建立一種操作簡便、可以快速準確地評測食品添加劑聯(lián)合毒性的現(xiàn)代化檢測方法。
[0003]高內(nèi)涵分析(high content analysis，HCA)是一種基于細胞表型分析的高效新藥篩選技術，能夠在保持細胞結構和功能完整的前提下，同時檢測被篩樣品對細胞的形態(tài)、生長、周期、迀移、凋亡、代謝途徑及信號傳導等方面的影響，實現(xiàn)化合物多種生物活性和毒性的早期、快速、高通量檢測。具有操作簡單、快速高效、實時監(jiān)測、高靈敏性、短時間獲得豐富數(shù)據(jù)信息等優(yōu)點。目前該技術主要用于單一化合物(新藥物)篩選等方面，而對食品添加劑(日落黃、胭脂紅)聯(lián)合毒性的快速檢測方法未有報道和公開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供了一種鑒別食品添加劑(日落黃、胭脂紅)聯(lián)合毒性方法，特別是一種一次性快速檢測日落黃、胭脂紅聯(lián)合毒性的方法。
[0005]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案如下:
[0006]該方法包括以下步驟:
[0007]步驟(I).在預鋪細胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細胞(人肝癌細胞)以5X 14個/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0008]步驟(2).取出步驟(I)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160yL/孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5\待測樣品，培養(yǎng)時間為7211;同時設立加入4(^17孔的細胞培養(yǎng)液作陰性對照(即設立步驟(I)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板棄掉培養(yǎng)液后加入160yL/孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為72h，作陰性對照)；
[0009]所述的待測樣品為日落黃、胭脂紅混合液，最終濃度依照食品包裝袋上的劑量添加；
[0010]步驟(3).取出步驟(2)培養(yǎng)后的96孔板，加50μ?ν孔的活細胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0011 ]所述的活細胞染料溶液為Hoechst 34580，Mitotracker orange，IysoTrackerDeep Red三種染料的混合液，三者的最終濃度比值為1:2:1;
[0012]步驟(4).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%的多聚甲醛；
[0013]步驟(5).在步驟(4)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0014]所述的透膜緩沖液為含質(zhì)量百分比0.1%TritonX-100的PBS緩沖液；
[0015]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標記的細胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih;
[0016]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測Hoechst34580標記的細胞核，第二通道選擇“FITC”檢測FITC標記的細胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測Mitotracker orange標記的線粒體膜電位(活細胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測lysoSensor Blue標記的溶酶體PH值;普通光源下檢測細胞總數(shù);選擇20倍物鏡，每孔采集10個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析；
[0017]步驟(8).采用MetaXpress分析軟件對步驟(7)檢測到的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進行定位和定量分析，并以細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個參數(shù)判定食品添加劑日落黃、胭脂紅的聯(lián)合毒性；
[0018]判定該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合使用有細胞毒性的標準:溶酶體PH與陰性對照組(加入細胞培養(yǎng)液組)差異顯著(P<0.05)，以及其它五個指標中的任一指標或多個指標與陰性對照組差異顯著(P<0.05)，即可判定該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合使用有細胞毒性。注:如果細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位五個指標中的任一指標或多個指標與陰性對照組差異顯著(P<0.05)，而溶酶體PH與陰性對照組差異不顯著(P>0.05)，該次檢測無效，需要重新對樣品進行檢測；如果細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個指標都與陰性對照組差異不顯著(P>0.05)，則表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合使用無細胞毒性;如果溶酶體PH單一指標與陰性對照組差異顯著(P<0.05)，則表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合使用具有潛在的細胞毒性，需要進一步進行分析鑒定。
[0019]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明針對食品添加劑日落黃、胭脂紅的化合結構篩選了表征日落黃、胭脂紅的聯(lián)合細胞毒性的六個特異性指標，具有較好的特異性;本發(fā)明進行了重復性驗證，利用棋盤法做了 100個濃度組合，每個組合重復3次，證明了該方法具有較好的重復性;本發(fā)明根據(jù)細胞染料的特性進行了混合比例優(yōu)化，從而使普通方法需要進行四次操作才能完成的實驗指標而現(xiàn)在只需要操作一次，使試劑使用量、檢測時間等方面都大為減少，一定程度上也減少了出錯的概率;本發(fā)明建立了快速檢測食品添加劑日落黃、胭脂紅的聯(lián)合細胞毒性方法，可以為食品添加劑日落黃、胭脂紅的正確使用提供理論依據(jù)，對保證食品添加劑的正確使用和食品安全具有重要意義。
【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的分析。
[0021]實施例1
[0022]步驟(I).到超市采集XXX牌糖果，XXX牌乳品飲料，將糖果放入乳品飲料，攪勻后測得日落黃、胭脂紅的劑量，分別為0.08g/L、0.09g/L。
[0023]步驟(2).在預鋪細胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細胞(人肝癌細胞)以5X 14個/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0024]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40μ?ν孔5 X待測樣品(日落黃、胭脂紅混合液)，日落黃、胭脂紅的終濃度分別為0.08g/L、0.09g/L，培養(yǎng)時間為72h;同時設立加入40yL/孔的細胞培養(yǎng)液作陰性對照；
[0025]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0026]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0027]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0028]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標記的細胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0029]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測Hoechst 34580標記的細胞核，第二通道選擇“FITC”檢測FITC標記的細胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測Mitotracker orange標記的線粒體膜電位(活細胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測lysoSensor Blue標記的溶酶體PH值;普通光源下檢測細胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析；
[0030]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進行定位和定量分析，并以細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結果顯示，添加0.08g/L日落黃、0.09g/L胭脂紅后，細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對照無顯著性差異(P>0.05)，表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合添加是無細胞毒性的。
[0031]實施例2
[0032]步驟(I).到超市采集兩種風味的調(diào)味品，混勻后測得日落黃、胭脂紅的劑量，分別為0.36g/kg、0.41g/kg。
[0033]步驟(2).在預鋪細胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細胞(人肝癌細胞)以5X 14個/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0034]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40μ?ν孔5 X待測樣品(日落黃、胭脂紅混合液)，日落黃、胭脂紅的添加量分別為0.36g/kg、0.41g/kg，培養(yǎng)時間為72h;同時設立加入40yL/孔的細胞培養(yǎng)液作陰性對照；
[0035]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0036]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0037]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0038]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標記的細胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0039]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測Hoechst 34580標記的細胞核，第二通道選擇“FITC”檢測FITC標記的細胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測Mitotracker orange標記的線粒體膜電位(活細胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測lysoSensor Blue標記的溶酶體PH值;普通光源下檢測細胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析；
[0040]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進行定位和定量分析，并以細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結果顯示，添加0.36g/kg日落黃、0.41g/kg胭脂紅后，細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對照無顯著性差異(P>0.05)，表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合添加是無細胞毒性的。
[0041 ] 實施例3
[0042]步驟(I).到火鍋店采集兩種風味的調(diào)味品，混勻后測得日落黃、胭脂紅的劑量，分別為0.32g/kg、0.34g/kg。
[0043]步驟(2).在預鋪細胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細胞(人肝癌細胞)以5X 14個/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0044]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40μ?ν孔5 X待測樣品(日落黃、胭脂紅混合液)，日落黃、胭脂紅的添加量分別為0.328/1^、0.348/1^，培養(yǎng)時間為7211;同時設立加入4(^17孔的細胞培養(yǎng)液作陰性對照；
[0045]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0046]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0047]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0048]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標記的細胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0049]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測Hoechst 34580標記的細胞核，第二通道選擇“FITC”檢測FITC標記的細胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測Mitotracker orange標記的線粒體膜電位(活細胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測lysoSensor Blue標記的溶酶體PH值;普通光源下檢測細胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析；
[0050]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進行定位和定量分析，并以細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結果顯示，添加0.32g/kg日落黃、0.34g/kg胭脂紅后，細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對照無顯著性差異(P>0.05)，表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合添加是無細胞毒性的。
[0051 ] 實施例4
[0052]步驟(I).到超市采集兩種風味的調(diào)味料，混勻后測得日落黃、胭脂紅的劑量，分別為0.29g/kg、0.32g/kg0
[0053]步驟(2).在預鋪細胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細胞(人肝癌細胞)以5X 14個/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0054]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40μ?ν孔5 X待測樣品(日落黃、胭脂紅混合液)，日落黃、胭脂紅的添加量分別為0.298/1^、0.328/1^，培養(yǎng)時間為7211;同時設立加入4(^17孔的細胞培養(yǎng)液作陰性對照；
[0055]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0056]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0057]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0058]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標記的細胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0059]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測Hoechst 34580標記的細胞核，第二通道選擇“FITC”檢測FITC標記的細胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測Mitotracker orange標記的線粒體膜電位(活細胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測lysoSensor Blue標記的溶酶體PH值;普通光源下檢測細胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析；
[0060]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進行定位和定量分析，并以細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結果顯示，添加0.29g/kg日落黃、0.32g/kg胭脂紅后，細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對照無顯著性差異(P>0.05)，表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合添加是無細胞毒性的。
[0061 ] 實施例5
[0062]步驟(I).實驗室配制出的巧克力粉及乳飲料，將巧克力粉放入乳飲料混合攪勻后，測得最后日落黃、胭脂紅的劑量，分別為1.仏凡、1.98/1。
[0063]步驟(2).在預鋪細胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細胞(人肝癌細胞)以5X 14個/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0064]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40μ?ν孔5 X待測樣品(日落黃、胭脂紅混合液)，日落黃、胭脂紅的終濃度分別為1.lg/L、l.9g/L，培養(yǎng)時間為72h;同時設立加入40yL/孔的細胞培養(yǎng)液作陰性對照；
[0065]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0066]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0067]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0068]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標記的細胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0069]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測Hoechst 34580標記的細胞核，第二通道選擇“FITC”檢測FITC標記的細胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測Mitotracker orange標記的線粒體膜電位(活細胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測lysoSensor Blue標記的溶酶體PH值;普通光源下檢測細胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析；
[0070]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進行定位和定量分析，并以細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結果顯示，添加1.lg/L日落黃、1.9g/L胭脂紅后，細胞總數(shù)、細胞微管蛋白、細胞核狀態(tài)、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對照無顯著性差異(P>0.05)，活細胞數(shù)量與陰性對照組差異顯著(P<0.05)。由于溶酶體PH指標與陰性對照無顯著性差異(P>0.05)，按照判斷標準，該次檢測無效，需要重新對樣品進行檢測；重新檢測結果顯示，添加1.lg/L日落黃、1.9g/L胭脂紅后，細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、線粒體膜電位與陰性對照無顯著性差異(P>0.05)，細胞微管蛋白、溶酶體PH與陰性對照差異顯著(P<0.05)，表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合添加是有細胞毒性的。
[0071 ] 實施例6
[0072]步驟(I).實驗室配制出的兩種調(diào)味品，混合測得最后日落黃、胭脂紅的劑量，分別為0.6g/kg、0.65g/kg。
[0073]步驟(2).在預鋪細胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細胞(人肝癌細胞)以5X 14個/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0074]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40μ?ν孔5 X待測樣品(日落黃、胭脂紅混合液)，日落黃、胭脂紅的添加量分別為0.68/1^、0.658/1^，培養(yǎng)時間為7211;同時設立加入4(^17孔的細胞培養(yǎng)液作陰性對照；
[0075]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0076]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0077]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0078]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標記的細胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0079]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測Hoechst 34580標記的細胞核，第二通道選擇“FITC”檢測FITC標記的細胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測Mitotracker orange標記的線粒體膜電位(活細胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測lysoSensor Blue標記的溶酶體PH值;普通光源下檢測細胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析；
[0080]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進行定位和定量分析，并以細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結果顯示，添加0.6g/kg日落黃、0.65g/kg胭脂紅后，細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管狀態(tài)、線粒體膜電位與陰性對照無顯著性差異(P>0.05)，而溶酶體PH與陰性對照差異顯著(P<0.05)，表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合添加是有潛在細胞毒性的，需要進一步分析驗證。
[0081 ] 實施例7
[0082]步驟(I).實驗室配制出的糖果料，測得最后日落黃、胭脂紅的劑量，分別為1.3g/kg、2.7g/kg0
[0083]步驟(2).在預鋪細胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細胞(人肝癌細胞)以5X 14個/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0084]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40μ?ν孔5 X待測樣品(日落黃、胭脂紅混合液)，日落黃、胭脂紅的添加量分別為1.38/1^、2.78/1^，培養(yǎng)時間為7211;同時設立加入4(^17孔的細胞培養(yǎng)液作陰性對照；
[0085]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0086]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0087]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0088]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標記的細胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0089]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測Hoechst 34580標記的細胞核，第二通道選擇“FITC”檢測FITC標記的細胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測Mitotracker orange標記的線粒體膜電位(活細胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測lysoSensor Blue標記的溶酶體PH值;普通光源下檢測細胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析；
[0090]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進行定位和定量分析，并以細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結果顯示，添加1.3g/kg日落黃、2.7g/kg胭脂紅后，細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量與陰性對照無顯著性差異(P>0.05)，而細胞核狀態(tài)、細胞微管狀態(tài)、線粒體膜電位、溶酶體PH與陰性對照差異顯著(P<0.05)，表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合添加是有細胞毒性的。
[0091 ] 實施例8
[0092]步驟(I).實驗室配制出的兩種調(diào)味品，混合測得最后日落黃、胭脂紅的劑量，分別為2.8g/kg、3.lg/kg0
[0093]步驟(2).在預鋪細胞粘附劑的96孔板上，S麗C-7721細胞(人肝癌細胞)以5X 14個/孔/10yL種板，37°C，5%CO2培養(yǎng)12h ；采用的細胞培養(yǎng)液為RPM1-1640培養(yǎng)基；
[0094]步驟(3).取出步驟(2)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160μ?ν孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40μ?ν孔5 X待測樣品(日落黃、胭脂紅混合液)，日落黃、胭脂紅的添加量分別為2.8g/kg、3.1g/kg，培養(yǎng)時間為72h;同時設立加入40yL/孔的細胞培養(yǎng)液作陰性對照；
[0095]步驟(4).取出步驟(3)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細胞染料溶液，37°C孵育30min；
[0096]步驟(5).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min;其中固定液為質(zhì)量百分比4%多聚甲醛；
[0097]步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌I次，再加入10yL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min;
[0098]步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入I:1000(體積比)的FITC標記的細胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih。
[0099]步驟(8).在步驟(7)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入200yL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測Hoechst 34580標記的細胞核，第二通道選擇“FITC”檢測FITC標記的細胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測Mitotracker orange標記的線粒體膜電位(活細胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測lysoSensor Blue標記的溶酶體PH值;普通光源下檢測細胞總數(shù)。選擇20倍物鏡，每孔采集10個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析；
[0100]步驟(9).采用MetaXpress分析軟件對細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進行定位和定量分析，并以細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個參數(shù)判定食品添加劑的聯(lián)合毒性。結果顯示，添加2.8g/kg日落黃、3.lg/kg胭脂紅后，細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、線粒體膜電位、細胞微管狀態(tài)、溶酶體PH與陰性對照差異顯著(P<0.05)，表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合添加是有細胞毒性的。
【主權項】
1.一種快速檢測食品添加劑(日落黃、胭脂紅)聯(lián)合毒性方法，其特征在于該方法包括以下步驟: 步驟(I).在預鋪細胞粘附劑的96孔板上，SMMC-7721細胞以5 X 14個/孔/I OOyL種板，37°C,5% CO2培養(yǎng)12h; 步驟(2).取出步驟(I)攜有培養(yǎng)后SMMC-7721細胞的96孔板，棄掉培養(yǎng)液，然后加入160yL/孔RPM1-1640培養(yǎng)基、40yL/孔5 X待測樣品，培養(yǎng)時間為72h;同時設立加入40yL/孔的細胞培養(yǎng)液作陰性對照； 所述的待測樣品為日落黃、胭脂紅混合液，最終濃度依照食品包裝袋上的劑量添加； 步驟(3).取出步驟(2)培養(yǎng)后的96孔板，加50yL/孔的活細胞染料溶液，37 °C孵育30min； 所述的活細胞染料溶液為Hoechst 34580 ? Mi to tracker orange ? IysoTracker DeepRed三種染料的混合液，三者的最終濃度比值為1:2:1; 步驟(4).棄掉培養(yǎng)液，加10yL/孔預溫至37°C的固定液，常溫避光放置20min; 步驟(5).在步驟(4)處理后的96孔板中加入lOOyL/孔的PBS進行洗滌I次，再加入100μL/孔的透膜緩沖液，常溫避光孵育1min; 步驟(6).在步驟(5)處理后的96孔板中加入10yL/孔的PBS進行洗滌2次后，加入1000倍體積FITC標記的細胞微管蛋白抗體，常溫避光孵育Ih; 步驟(7).在步驟(6)處理后的96孔板中加入10yL/孔的I3BS進行洗滌2次后，加入200μL/孔的PBS，然后使用ImageXpress Micro成像高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)檢測，檢測條件如下:第一通道選擇“DAPI”檢測Hoechst34580標記的細胞核，第二通道選擇“FITC”檢測FITC標記的細胞微管蛋白，第三通道選擇“Cy3”檢測Mitotracker orange標記的線粒體膜電位(活細胞)，第四通道選擇“Fura-2”檢測IysoSensor Blue標記的溶酶體PH值;普通光源下檢測細胞總數(shù);選擇20倍物鏡，每孔采集10個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析； 步驟(8).采用MetaXpress分析軟件對步驟(7)檢測到的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH進行定位和定量分析，并以細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH參數(shù)形式表示，根據(jù)MetaXpress分析軟件分析的細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個參數(shù)判定食品添加劑日落黃、胭脂紅的聯(lián)合毒性。2.如權利要求1所述的一種快速檢測食品添加劑(日落黃、胭脂紅)聯(lián)合毒性方法，其特征在于步驟(4)其中固定液為質(zhì)量百分比4%的多聚甲醛。3.如權利要求1所述的一種快速檢測食品添加劑(日落黃、胭脂紅)聯(lián)合毒性方法，其特征在于步驟(5)所述的透膜緩沖液為含質(zhì)量百分比0.1 %Triton X-100的PBS緩沖液。4.如權利要求1所述的一種快速檢測食品添加劑(日落黃、胭脂紅)聯(lián)合毒性方法，其特征在于步驟(8)判定某劑量下日落黃、胭脂紅聯(lián)合使用有細胞毒性的標準如下: ①若溶酶體PH與陰性對照組差異不顯著(P>0.05)，但是細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位五個指標中的任一指標或多個指標與陰性對照組差異顯著(P<0.05)，則該次檢測無效，需要重新對樣品進行檢測； ②若溶酶體PH與陰性對照組差異顯著(P<0.05),且細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位五個指標中的任一指標或多個指標與陰性對照組差異顯著(P<0.05)，則判定該劑量下日落黃、胭脂紅聯(lián)合使用有細胞毒性； ③若細胞總數(shù)、活細胞數(shù)量、細胞核狀態(tài)、細胞微管蛋白、線粒體膜電位、溶酶體PH六個指標都與陰性對照組差異不顯著(P>0.05)，則表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合使用無細胞毒性； ④若溶酶體PH單一指標與陰性對照組差異顯著(P<0.05)，則表明該劑量的日落黃、胭脂紅聯(lián)合使用具有潛在的細胞毒性，需要進一步進行分析鑒定。
【文檔編號】C12Q1/02GK105907836SQ201610243853
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月11日
【發(fā)明人】曲道峰, 韓劍眾, 董雨婷
【申請人】浙江工商大學