2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；
[0029] 圖2. SDS-PAGE檢測(cè)新型0-葡聚糖酶的純度；
[0030] 圖3.新型0-葡聚糖酶質(zhì)譜圖。
[0031] 海洋芽抱桿菌N6-2,拉下文名稱(chēng)為Bacillus sp.N6-2,2014年11月23日保藏于中 國(guó)武漢典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏地址:武漢市武昌塔挪山武漢大學(xué)，保藏號(hào)為CCTCC NO: M2014586。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施 例任何形式的限制。
[0033] 實(shí)施例1菌株N6-2的形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析
[0034] (1)形態(tài)特征
[0035] 革蘭氏染色結(jié)果顯示，菌株N6-2為革蘭氏陰性菌，且具有明顯的芽抱，菌體形態(tài)呈 現(xiàn)短桿棒狀，多是有兩個(gè)菌體相連。菌落特征為白色或者是乳黃白色，表面光滑，有突起。掃 描電鏡圖片顯示，菌株N6-2呈現(xiàn)短桿棒狀，菌體表面光滑，兩端呈現(xiàn)突起，部分剛分裂的菌 體呈現(xiàn)大豆?fàn)?，大部分菌體處于二分裂狀態(tài)，兩個(gè)菌體相連，且中間凹陷，連接處細(xì)長(zhǎng)，菌體 間有粘膜產(chǎn)生。單個(gè)菌體的大小為寬:0.9-1.5皿，長(zhǎng):1-3.7皿。
[0036] (2)生理生化反應(yīng)特征
[0037] 由于該菌為革蘭氏陰性菌，故可W用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生理生化分析。結(jié) 果見(jiàn)表1。
[0038] 表1.菌株N6-2的生理生化鑒定結(jié)果
[0039]
[0040] 注：表陰性；'V'表示陽(yáng)性
[0041] API 20E結(jié)果顯示陽(yáng)性：巧樣酸鋼利用、色氨酸水解、Kohn明膠水解、發(fā)酵利用陽(yáng) 性:薦糖產(chǎn)酸，氧化酶反應(yīng)。
[0042] (3)168 rDNA序列分析
[0043] 吸取1.5mL的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N6-2菌液，4°C，10000巧m，離屯、lOmin。棄上清液， 加入4(K)化的TE緩沖液，用槍頭將沉淀吹打均勻，加入10化的溶菌酶，混合均勻，置于37 °C水 浴中90min，4°C，1OOOO巧m，離屯、1 Omin，保留上清即為DNA溶液。
[0044] 采用16S rDNA通用引物，由上海生工生物工程合成。正向引物：27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3'，反向引物：1492R 5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3' ； 16S rDNA序列 的 PCR 條件是:95°C 預(yù)變性 5min;95°C 變性 4〇3,55°(：退火1111111，72°(：延伸9〇3，循環(huán)30次，721： 延伸IOmin。PCR反應(yīng)體系是:反應(yīng)體系：2扣L，模板DNA: 0.5化，上游引物:2化，下游引物: L，10X easy tap buffe;r:5liL，dNTP:4liL，Easy tap DNA polymerase:0.5]iL，雙蒸水：1 化L。
[0045] 用1.5%的瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，WD2000Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照試劑。 菌株N6-2的16S rDNA PCR產(chǎn)物送到北京華大基因進(jìn)行測(cè)序。序列見(jiàn)SEQl，測(cè)得菌株N6-2的 16S rDNA序列長(zhǎng)度為1409bp。
[0046] 將菌株N6-2的16S rDNA序列在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)化AST進(jìn)行分析。通過(guò) MEGA6軟件Neighbor-joining選項(xiàng)繪制發(fā)育樹(shù)：BLAST重復(fù)1000次，選擇模型核酸P-dis化nce，得到結(jié)果如圖1所示。
[0047]下載與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系較近的序列，用BioEdit軟件進(jìn)行多序列對(duì)比，與菌株 N6-2的 16S rDNA序列（1409bp)相似性比較高的菌株為BacillussafensisstrainFO-036b(T)(99.72%)、Bacillus pumilus ATCC 7061(T)(99.65%)、Bacillus altiUidinis 41KF化(T)(99.29%)通過(guò)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，可W確定為芽抱桿菌屬(Bacillus)的 細(xì)菌，且相似性最高的是沙福芽抱桿菌，可能是屬于沙福芽抱桿菌的變種，是一種新的芽抱 桿菌的變種，命名為Bacillus SP.N6-2。該圖也證明了Bacillus SP.N6-2的系統(tǒng)學(xué)地位。 [004引實(shí)施例2海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生的新型0-葡聚糖酶的分離純化
[0049] (1)菌株的發(fā)酵：
[0050] 取海洋芽抱桿菌N6-2菌株，接種于含有種子培養(yǎng)基的試管中，在28°C的搖床中 150巧m，培養(yǎng)28h;將上述培養(yǎng)后的菌株按4%(v/v)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C， 150rpm搖床培養(yǎng)80h;取菌株發(fā)酵液，離屯、，去掉發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，并調(diào)節(jié)其pH在7.0， 即為粗制發(fā)酵樣品。
[0051] (2)超濾截留：
[0052] 取海洋芽抱桿菌N6-2發(fā)酵液，在SOOOrpm下離屯、，除掉菌體與部分雜質(zhì)。依次用分 子量為5040曰、3040曰、1040曰、化0曰、340曰的濾膜，截留發(fā)酵液，將發(fā)酵液分成3~化0曰、5~ 101^)曰、10~301^)曰、30~501^)曰的組分，電泳檢測(cè)。
[0053] (3)硫酸錠沉淀法濃縮：
[0054] 取步驟(2)所述的10~30kDa組分，置于冰浴之中，緩慢向其中加入硫酸錠固體粉 末，使其水溶液濃度達(dá)到30%，4°C靜置化，lOOOOrpm，離屯、lOmin，沉淀作為雜蛋白，遺棄，取 上清取，向其中緩慢加入硫酸錠固體粉末，使其水溶液濃度達(dá)到65 %，4°C靜置2h， lOOOOrpm，離屯、IOmin，取沉淀，棄上清。沉淀用50mmol/L的pH7.96S徑甲基氨基甲燒鹽酸鹽 (Tris-HCl)緩沖液溶解，裝入3W)a透析袋，置于相同緩沖液中透析，地，化，1化換一次等濃 度緩沖液，既獲得硫酸錠飽和濃度在30 % -65 %的組分。
[0055] (4)離子交換色譜法提取新型0-葡聚糖酶
[0056] 1. Q離子交換層析
[0057] 取步驟(3)所述的硫酸錠飽和濃度30%-65%的組分，過(guò)Q離子交換層析柱，上樣緩 沖液為50mmol/L的抑7.96S徑甲基氨基甲燒鹽酸鹽(化18-肥1)緩沖液，每次上樣量為51111^， 洗脫液為含Imol/L化Cl的化is-HCl上樣緩沖液，洗脫液W100% (v/v)的濃度進(jìn)行洗脫，流 速為3mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，收集各峰，將穿透Ql組分脫鹽后真空冷凍干燥保存；
[0化引2. CM離子交換層析
[0059] 取收集的穿透峰Ql，過(guò)CM離子交換柱，上樣緩沖液為25mmol/L的抑9.0氨氧化鋼甘 氨酸緩沖液(化OH-Glycine)，每次上樣量2mL，洗脫液為含Imol/L化Cl的氨氧化鋼甘氨酸 上樣緩沖液，洗脫液Wl〇〇%(v/v)的濃度進(jìn)行洗脫，流速為3mL/min，收集各峰，將穿透峰Cl 組分脫鹽后真空冷凍干燥保存，即為海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生的新型0-葡聚糖酶。
[0060] 實(shí)施例3海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生的新型0-葡聚糖酶的純度檢測(cè)
[0061 ] 1.Protein-PAK ? 60疏水性的蛋白分析柱檢測(cè)純度
[0062] 取經(jīng)CM柱收集的穿透峰Cl,過(guò)Protein-PAK ? 60疏水性蛋白分析柱，上樣量為化 L，流動(dòng)相為水，峰圖結(jié)果顯示為單一峰。
[0063] 2. SDS-PAGE電泳檢測(cè)新型0-葡聚糖酶的純度
[0064] 基于現(xiàn)有SDS-PAGE技術(shù)，將超濾膜截留（I號(hào)樣品）、硫酸錠沉淀30%-65% (2號(hào)樣 品）、CM離子交換峰Cl(3,4號(hào)樣品）、Q離子交換穿透峰Ql(5號(hào)樣品）進(jìn)行12%的SDS-PAGE凝 膠電泳檢測(cè)。紅框顯示就是海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生的新型0-葡聚糖酶。見(jiàn)圖2。
[0065] 實(shí)施例4ESI質(zhì)譜檢測(cè)新型0-葡聚糖酶的分子量
[0066] 將穿透峰Cl水溶液通過(guò)Cole化rmer 74900注射累打入ESI-MS進(jìn)行分析。（此實(shí)驗(yàn) 由中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所協(xié)助完成)檢測(cè)結(jié)果顯示海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生 的新型e-葡聚糖酶的分子量是24kDa。見(jiàn)圖3。
[0067] 實(shí)施例5海洋芽抱桿菌N6-2產(chǎn)生的新型0-葡聚糖酶的N端序列分析
[0068] 1.采用Edman降解法(此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白測(cè)序?qū)嶒?yàn)室協(xié)助完 成)測(cè)得N6-2產(chǎn)生的新型0-葡聚糖酶的N端15個(gè)氨基酸的序列是STGGS FYEPF NNYNT。
[00例 2.新型0-葡