有益效果。實(shí) 施例2-11所采用的實(shí)時(shí)real-time PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為：2X SYBR Green PCR Master Mix 10uL，上游引物和下游引物各0.4uL，待檢樣品cDNA模板2uL，ddH20 7.2uL。反應(yīng)程序 為:①預(yù)變性95°Clmin，②然后95°C10sec，退火62°C30sec，延伸72°Clmin，重復(fù)40個(gè)循環(huán)， ③以每5秒升高0.5 °C的速度，從60 °C升至95 °C，獲得產(chǎn)物的特異性溶解峰。
[0036] 實(shí)施例1 :HIV-1野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒的構(gòu)建
[0037] (1)將經(jīng)測(cè)序鑒定不含耐藥突變的逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列（長度1. lkb，相對(duì)HXB2位置： 2243-3304)與pUCm-19載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA，測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒連接正確，獲 得HIV-1野生型克隆質(zhì)粒，稀釋至0.01ng/uL。
[0038] (2)通過人工定點(diǎn)突變的方法，分別對(duì)HI V-1野生型克隆質(zhì)粒中對(duì)應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄基因第 41、65、70、184、210、215位氨基酸的堿基進(jìn)行突變，獲得1411^、067叭1(651?、1(701?、1(7(^、 118伙、]?1841、1^101、了215￥、了215?位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒，稀釋至0.011^/1^。
[0039] 實(shí)施例2: ASPCR方法檢測(cè)M41L位點(diǎn)的特異度和靈敏度
[0040] (1)分別以HIV-ι野生型克隆質(zhì)粒、M41L位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用M41L位點(diǎn)野 生型擴(kuò)增引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.21進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖1-(1)所示， 野生型模板的擴(kuò)增曲線呈S型增長，其熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)CT值為24.8， 突變型模板沒有擴(kuò)增曲線，其熒光信號(hào)未到達(dá)設(shè)定閾值，無 CT值，二者區(qū)別明顯，擴(kuò)增特異 性較高。
[0041 ] (2)分別以HIV-ι野生型克隆質(zhì)粒、M41L位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用M41L位點(diǎn)突 變型擴(kuò)增引物SEQIDN0.2和SEQIDN0.21進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果如圖l-(2)所示， 野生型模板沒有擴(kuò)增曲線，其熒光信號(hào)未到達(dá)設(shè)定閾值，無 CT值，突變型模板的擴(kuò)增曲線呈 S型增長，其熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)CT值為24.1，二者區(qū)別明顯，擴(kuò)增特異 性較高。
[0042] (3)取HIV-1野生型克隆質(zhì)粒和M41L位點(diǎn)突變型質(zhì)粒以不同比例混合，制備不同比 例M41L突變樣本，得到1 %突變樣本、5%突變樣本、10%突變樣本。分別以上述1 %突變樣 本、5%突變樣本、10%突變樣本為模板，利用M41L位點(diǎn)突變型擴(kuò)增引物SEQ ID N0.2和SEQ ID NO.21進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖1-(3)所示，10%突變樣本的擴(kuò)增曲線呈典型S 型增長曲線，CT值為30.4,本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度可達(dá)10%突變樣本。
[0043]實(shí)施例3: ASPCR方法檢測(cè)D67N位點(diǎn)的特異度和靈敏度
[0044] (1)分別以HIV-1野生型克隆質(zhì)粒、D67N位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用D67N位點(diǎn)野 生型擴(kuò)增引物SEQIDN0.3和SEQIDN0.21進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果如圖2-(l)所示， 該引物對(duì)特異性擴(kuò)增HIV-1野生型序列。
[0045] (2)分別以HIV-1野生型克隆質(zhì)粒、D67N位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用D67N位點(diǎn)突 變型擴(kuò)增引物SEQIDN0.4和SEQIDN0.21進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果如圖2-(2)所示， 該引物對(duì)特異性擴(kuò)增D67N位點(diǎn)突變型序列。
[0046] (3)以D67N位點(diǎn)1%-10%突變樣本為模板，利用D67N位點(diǎn)突變型擴(kuò)增引物SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 21進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖2-(3)所示，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10% 突變樣本。
[0047]實(shí)施例4:ASPCR方法檢測(cè)K65R位點(diǎn)的特異度和靈敏度
[0048] (1)分別以HIV-1野生型克隆質(zhì)粒、K65R位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用K65R位點(diǎn)野 生型擴(kuò)增引物SEQIDN0.5和SEQIDN0.21進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果如圖3-(l)所示， 該引物對(duì)特異性擴(kuò)增HIV-1野生型序列。
[0049] (2)分別以HIV-1野生型克隆質(zhì)粒、K65R位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用K65R位點(diǎn)突 變型擴(kuò)增引物SEQIDN0.6和SEQIDN0.21進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果如圖3-(2)所示， 該引物對(duì)特異性擴(kuò)增K65R位點(diǎn)突變型序列。
[0050] (3)以K65R位點(diǎn)1%-10%突變樣本為模板，利用K65R位點(diǎn)突變型擴(kuò)增引物SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 21進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖3-(3)所示，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10% 突變樣本。
[0051 ]實(shí)施例5: ASPCR方法檢測(cè)K70R位點(diǎn)的特異度和靈敏度
[0052] (1)分別以HIV-1野生型克隆質(zhì)粒、K70R位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用K70R位點(diǎn)野 生型擴(kuò)增引物SEQIDN0.7和SEQIDN0.21進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果如圖4-(l)所示， 該引物對(duì)特異性擴(kuò)增HIV-1野生型序列。
[0053] (2)分別以HIV-1野生型克隆質(zhì)粒、K70R位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用K70R位點(diǎn)突 變型擴(kuò)增引物SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.21進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖4-(2)所示， 該引物對(duì)特異性擴(kuò)增K70R位點(diǎn)突變型序列。
[0054] (3)以K70R位點(diǎn)1%-10%突變樣本為模板，利用K70R位點(diǎn)突變型擴(kuò)增引物SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 21進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖4-(3)所示，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10% 突變樣本。
[0055]實(shí)施例6: ASPCR方法檢測(cè)K70E位點(diǎn)的特異度和靈敏度
[0056] (1)分別以HIV-1野生型克隆質(zhì)粒、K70E位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用K70E位點(diǎn)野 生型擴(kuò)增引物SEQIDN0.9和SEQIDN0.21進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果如圖5-(l)所示， 該引物對(duì)特異性擴(kuò)增HIV-1野生型序列。
[0057] (2)分別以HIV-1野生型克隆質(zhì)粒、K70E位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用K70E位點(diǎn)突 變型擴(kuò)增引物SEQIDN0.10和SEQIDN0.21進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果如圖5-(2)所 示，該引物對(duì)特異性擴(kuò)增K70E位點(diǎn)突變型序列。
[0058] (3)以K70E位點(diǎn)1%-10%突變樣本為模板，利用K70E位點(diǎn)突變型擴(kuò)增引物SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO.21進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖5-(3)所示，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10% 突變樣本。
[0059] 實(shí)施例7 :ASPCR方法檢測(cè)M184V位點(diǎn)的特異度和靈敏度
[0060] (1)分別以HIV-ι野生型克隆質(zhì)粒、M184V位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用M184V位點(diǎn) 野生型擴(kuò)增引物3即1[)勵(lì).11和3四 1[)勵(lì).21進(jìn)行^￡11-^郵？0?檢測(cè)。結(jié)果如圖6-(1)所 示，該引物對(duì)特異性擴(kuò)增HIV-1野生型序列。
[0061 ] (2)分別以HIV-ι野生型克隆質(zhì)粒、M184V位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用M184V位點(diǎn) 突變型擴(kuò)增引物SEQIDN0.12和SEQIDN0.21進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果如圖6-(2)所 示，該引物對(duì)特異性擴(kuò)增M184V位點(diǎn)突變型序列。
[0062] (3)以M184V位點(diǎn)1%-10%突變樣本為模板，利用M184V位點(diǎn)突變型擴(kuò)增引物SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.21進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖6-(3)所示，檢測(cè)靈敏度可達(dá) 10%突變樣本。
[0063]實(shí)施例8:ASPCR方法檢測(cè)M184I位點(diǎn)的特異度和靈敏度
[0064] (1)分別以HIV-1野生型克隆質(zhì)粒、M184I位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用M184I位點(diǎn) 野生型擴(kuò)增引物3即1[)勵(lì).13和3四 1[)勵(lì).21進(jìn)行^￡11-^郵？0?檢測(cè)。結(jié)果如圖7-(1)所 示，該引物對(duì)特異性擴(kuò)增HIV-1野生型序列。
[0065] (2)分別以HIV-1野生型克隆質(zhì)粒、M184I位點(diǎn)突變型質(zhì)粒為模板，利用M184I位點(diǎn) 突變型擴(kuò)增引物SEQIDN0.14和SEQIDN0.21進(jìn)行real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果如圖7-(2)所 示，該引物對(duì)特異性擴(kuò)增M184I位點(diǎn)突變型序列。
[0066] (3)以M184I位點(diǎn)1%-10%突變樣本為模板，利用M184I位點(diǎn)突變型擴(kuò)增引物SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.21進(jìn)行r