猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒的三重實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒的三重實(shí)時(shí)熒光 定量PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV)，也稱為非洲綠猴病毒 (African Green Monkey virus)，是一種可影響至少33種非洲靈長(zhǎng)目的逆轉(zhuǎn)錄病毒。SIV與 與HIV病毒在基因序列上有較高的同源性，非人靈長(zhǎng)類感染SIV后，出現(xiàn)類似AIDS的發(fā)病機(jī) 制和臨床癥狀表現(xiàn)，可在感染病毒后出現(xiàn)免疫系統(tǒng)的損害和多系統(tǒng)多器官組織的病變，SIV 在恒河猴體內(nèi)分布較為廣泛，可累及包括免疫系統(tǒng)在內(nèi)的多個(gè)系統(tǒng)。
[0003] 猴D型反轉(zhuǎn)錄病毒(simian type-Dretro virus，SRV)屬反轉(zhuǎn)錄病毒科、D型反轉(zhuǎn)錄 病毒屬，與猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)同為猴獲得性免疫缺 陷綜合征（SAIDS)的一種致病病毒。目前已發(fā)現(xiàn)的SRV有5個(gè)血清型：SRV-1，2，3，4，5。SRV主 要的靶細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，感染后可造成淋巴細(xì)胞耗竭，誘發(fā)免疫缺陷。各型SRV的發(fā)生有其 種屬性和群體性，一旦傳入易感猴群，可使80%以上的猴發(fā)病致死。
[0004] 猴T淋巴細(xì)胞白血病病毒（simian T-lymphotropic virus，STLVl)，與人T淋巴白 血病病毒(human T-lymphotropic virus，HTLV)統(tǒng)稱為靈長(zhǎng)類嗜T淋巴細(xì)胞病毒(primate T-lymphotropic virus，PTLV)，均屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒屬。猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒最初從亞洲 和非洲猴體內(nèi)分離到，人工繁殖猴和野生猴均可被STLV1感染，但無臨床癥狀表現(xiàn)。受STLV1 感染的非洲綠猴出現(xiàn)了與受HTLV感染的人相似的貧血癥，并且STLV1與人的HTLV的遺傳同 源性高達(dá)90-95%，有研究證明我國(guó)野生和飼養(yǎng)恒河猴血清廣泛存在STLV1抗體。STLV1病毒 主要侵害猴的免疫系統(tǒng)，引起免疫器官的病變或免疫機(jī)能紊亂，從而干擾實(shí)驗(yàn)研究，是SPF 猴必須排除的幾種病毒之一。
[0005] 多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)是在熒光定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一個(gè)新技術(shù)，它強(qiáng)調(diào)在 同一個(gè)反應(yīng)體系里同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)。最近已有多項(xiàng)研究將多重定量PCR技術(shù)應(yīng)用于病毒 檢測(cè)領(lǐng)域。Weyer CT等建立了對(duì)非洲馬瘟9種血清型分子分型的定性檢測(cè)的三重實(shí)時(shí)熒光 PCR方法;Haines FJ等建立了同時(shí)檢測(cè)古典豬瘟和非洲豬瘟多重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法;許 建明等建立了同時(shí)檢測(cè)三種魚類彈狀病毒的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，結(jié)果顯示多重PCR體系 與單一擴(kuò)增結(jié)果在靈敏度和特異性方面基本相同。但是到目前為止，尚無報(bào)道有同時(shí)檢測(cè) SIV、SRV1和STLV1的試劑盒。
[0006] 對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒而言，被該類病毒感染的動(dòng)物常產(chǎn)生免疫抑制，導(dǎo)致血清中特異 性抗體水平偏低，造成抗體檢測(cè)出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，實(shí)時(shí)定量PCR通過直接對(duì)感染動(dòng)物的病原 體核酸特定片段進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增中熒光信號(hào)的強(qiáng)度變化，從而達(dá)到檢測(cè)目的。該方法的 優(yōu)勢(shì)在于，直接對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的核酸進(jìn)行檢測(cè)，提高了檢測(cè)的特異性;而對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒核 酸特定片段的擴(kuò)增和放大，提高了檢測(cè)的敏感性。
[0007] 根據(jù)靶基因種內(nèi)高度保守、種間高度特異的選擇原則，經(jīng)過序列BLAST比對(duì)分析， SIV的gag基因、SRV1的5'LTR基因、STLV1的gag基因作為檢測(cè)靶基因的理想候選者。本發(fā)明 選取這三種基因作為靶基因，設(shè)計(jì)引物和探針，對(duì)設(shè)計(jì)的多對(duì)引物探針組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選 優(yōu)化，獲得最佳引物探針組合，建立了三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 基于以上不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒的三重實(shí)時(shí)熒 光定量PCR檢測(cè)方法及其專用引物、探針和基于該方法提供相應(yīng)的試劑盒。該試劑盒可用于 猴逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)。具體涉及同時(shí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)猴的猴免疫缺陷病毒（SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄病毒 (SRV1)和猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒1型(STLV1)。
[0009] 一種能同時(shí)檢測(cè)猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法所需引物對(duì) 及探針，
[0010] 猴免疫缺陷病毒siv:
[0011] 上引物SI-F:如序列表Seq.Nol所示，
[0012] 下引物SI-R:如序列表Seq.N〇2所示，
[0013] 探針SI-P:如序列表Seq.N〇3所示；
[0014] 猴逆轉(zhuǎn)D型病毒SRV1:
[0015] 上引物SR-F:如序列表Seq.No4所示，
[0016] 下引物SR-R:如序列表Seq · No5所示，
[0017] 探針SR-P:如序列表Seq.No6所示；
[0018] 猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒I型STLV1:
[0019] 上引物ST-F:如序列表Seq.No7所示，
[0020] 下引物ST-R:如序列表Seq · No8所示，
[0021] 探針ST-P:如序列表Seq.No9所示。
[0022] 本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：
[0023] 1、一種能同時(shí)檢測(cè)猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法陽性對(duì)照 品的制備方法，包括如下步驟，
[0024] 步驟(l)PCR模板的制備:SIV、SRV1、STLV1保守區(qū)基因序列的合成。
[0025] 步驟(2)以步驟(1)中合成的各序列為模板，分別以上引物SI-F、下引物SI-R，上引 物SR-F、下引物SR-R，上引物ST-F、下引物ST-R為引物，進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增；
[0026] 步驟(3)陽性對(duì)照品pMD18-SIV，pMD18-SRVl，pMD18-STLVl的制備：
[0027]步驟(2)中，目的基因的PCR反應(yīng)體系如下：
[0028] 引物各2yL，2XTaq MasterMix 15yL，模板5yL，超純水補(bǔ)足至30yL。
[0029] PCR的反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄 5〇￡€3〇11^11;951€51^11熱啟動(dòng)，95°(：158,55 1€258,72°(：延 伸15s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin;
[0030] 步驟(3)中，陽性對(duì)照品的制備過程，包括如下步驟:將步驟(2)中所得PCR產(chǎn)物分 別與克隆載體pMD-18-T vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a，獲得陽性克隆菌株，并制 備質(zhì)粒 pMD18-SIV，pMD18-SRVl，pMD18-STLVl 作為陽性對(duì)照品。
[0031] 2、如上所述一種能同時(shí)檢測(cè)猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的陽性對(duì)照 品，PMD18-SIV，如序列表569.勖10所示4]\?)18-51^1，如序列表569.化11所示$]\0)18- STLV1，如序列表Seq.Nol2所示。
[0032] 3、一種能同時(shí)檢測(cè)猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法，PCR反應(yīng) 體系如下：
[0033] RT-PCR反應(yīng)液12.5yL，Taq酶0 · 5yL，RTMIX 0 · 5yL，引物混合液（200nmol/L，分別包 含三種病毒的特異性引物比例為1:1:1)共3此，探針混合液（100nm 〇l/L，分別包含三種病毒 的特異性熒光探針，比例為1:1:1)共3yL，提取的樣本核酸5yL作為反應(yīng)模板，去RNAase Free水補(bǔ)足至25yL;
[0034] PCR 的反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄 5〇￡€3〇!1^11;951€51^11熱啟動(dòng)，之后以95°(：158,55 1€258， 共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
[0035] 4、一種能同時(shí)檢測(cè)猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)用試劑盒，包 括試劑如下，
[0036]引物對(duì)及探針：
[0037] 猴免疫缺陷病毒SIV:
[0038] 上引物SI-F:如序列表Seq.Nol所示，
[0039] 下引物SI-R:如序列表Seq.N〇2所示，
[0040] 探針SI-P:如序列表Seq.N〇3所示；
[0041 ] 猴逆轉(zhuǎn)D型病毒SRV1:
[0042] 上引物SR-F:如序列表Seq · No4所示，
[0043] 下引物SR-R:如序列表Seq.No5所示，
[0044] 探針SR-P:如序列表Seq.No6所示；
[0045] 猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒I型STLV1:
[0046] 上引物ST-F:如序列表Seq · No7所示，
[0047] 下引物ST-R:如序列表Seq. No8所示，
[0048] 探針ST-P:如序列表Seq.No9所示；
[0049] 陽性對(duì)照品：
[0050] PMD18-SIV，如序列表 Seq.NolO 所示，
[0051] ?]\?)18-51^1:如序列表569.吣11所示，
[0052] pMD18-STLVl:如序列表 Seq.Nol2 所示；
[0053]陰性對(duì)照品ddH20、病毒核酸DNA/RAN提取試劑、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增所需的RT-PCR預(yù)混液和Taq酶。
[0054]本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于，能同時(shí)檢測(cè)SIV、SRV1和STLV1三種病毒，直接對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的 核酸進(jìn)行檢測(cè)，提高了檢測(cè)的特異性;而對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸特定片段的擴(kuò)增和放大，提高 了檢測(cè)的敏感性。
【附圖說明】
[0055]圖1為三種重組陽性質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果圖。
[0056]圖2為SIV病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0057]圖3為SRV1病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0058]圖4為STLV1病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0059] 圖5為SIV三重qRT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖。
[0060] 圖6為SRV1三重qRT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖。
[0061 ] 圖7為STLV1三重qRT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖。
[0062] 圖8為SIV、SRV1和STLV1三重qRT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0063]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0064] 實(shí)施例1
[0065] 目的基因的合成
[0066]根據(jù)GenBank公布的三種病毒中的序列，結(jié)合生物信息學(xué)手段，確定以SIV的gag基 因、SRV1的5'LTR基因、STLV1的gag基因保守區(qū)序列作為檢測(cè)靶序列，合成其DNA片段，基因 合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)完成。病毒基因序列如表1所示。
[0067] 表1:三種病毒的DNA序列
[0068]
[0069] 實(shí)施例2 [0070]特異性引物的合成
[0071]根據(jù)合成的三種病毒的基因序列，合成特異性引物，序列如表2所示。
[0072]表2:特異性引物序列
[0073]
[0074] 實(shí)施例3
[0075] 陽性質(zhì)粒的制備
[0076] 1、PCR擴(kuò)增目的基因
[0077] (1)擴(kuò)增 SIV 基因：
[0078] PCR反應(yīng)體系：引物各2yL，2XTaq MasterMix 15yL，模板5yL，超純水補(bǔ)足至30yL。
[0079] PCR 的反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄 5〇￡€3〇!1^11;951€51^11熱啟動(dòng)，之后以95°(：158,55 1€258， 72°C延伸15s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin。
[0080] (2)SRV1、STLV基因的擴(kuò)增