[0081] PCR體系及反應(yīng)條件如（1)所述。
[0082] 2、陽(yáng)性質(zhì)粒的制備
[0083] 分別將含有SIV gag基因、SRV15'LTR基因以及STLVlgag基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為95- 139bp片斷分別克隆至pMD18T載體(Takara)，具體操作過程如下：
[0084] (1)在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5yL。
[0085] pMD18-T Vector lyL
[0086] 目的基因 PCR產(chǎn)物 lyL
[0087] ddH20 3yL
[0088] (2)加入 δμL(等量）的 Solutions
[0089] (3)16。(：反應(yīng)3〇11^11。
[0090] (4)全量（lOyL)加入至100yL DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min。
[0091] (5)42°C加熱45s，再在冰中放置lmin。
[0092] (6)加入890yLS0C培養(yǎng)基，37 Γ振蕩培養(yǎng)60min。
[0093] (7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計(jì)數(shù)白色、 藍(lán)色菌落。
[0094] (8)挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大小。結(jié)果如圖1所示。
[0095] (9)將篩選鑒定出的陽(yáng)性克隆重組菌株增殖培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒分別 命名為 pMD18-SIV，pMD18-SRVl，pMD18-STLVl。
[0096] (10)利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，按照常規(guī)試算公式：C=[(NX6.02 X 1023)/(MWX109)計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，其中N為質(zhì)粒濃度，單位為ngAiL，C為每微升質(zhì)粒提取溶 液中所含目的基因拷貝數(shù);MW為克隆質(zhì)粒分子量。
[0097] 實(shí)施例2
[0098]三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立
[0099]根據(jù)三種病毒的基因序列設(shè)計(jì)探針，序列如下：
[0100] SIV(猴免疫缺陷病毒)基因探針：
[0101] sI-p:5 '-(FAM)-CTCCTCTGCCGCTAGATGGTG-(BHQ1-3)-3 '
[0102] SRV1(猴逆轉(zhuǎn)D型病毒)基因探針：
[0103] SR-P:5，-(CY5)-CTCCAGGTTTCCTACTGTTGGT-(BHQ2-3)-3 '
[0104] STLV(猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒I型)基因探針：
[0105] ST-P:5，-(HEX)-ACAGGCCATTAAGCAA-(BHQ1-3)-3 '
[0106] 采用單因子濃度梯度實(shí)驗(yàn)法逐一改變實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中各組分濃度，以優(yōu) 化實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，最終確定三重實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)檢測(cè)三種病毒的反應(yīng)體系如下：
[0107] -步法：RT-PCR反應(yīng)液 12 · 5yL，Taq酶0 · 5yL，RTMIX 0 · 5yL，引物混合液（200nmo 1/ L，分別包含三種病毒的特異性引物比例為1:1:1)共3yL，探針混合液（100nm〇l/L，分別包含 三種病毒的特異性熒光探針，比例為1:1:1)共3yL，提取的樣本核酸5yL作為反應(yīng)模板，去 RNAase Free水補(bǔ)足至25yL。
[0108] PCR的反應(yīng)條件參數(shù)為：反轉(zhuǎn)錄50°C30min;95°C5min熱啟動(dòng)，之后以95°C15s，55°C 25s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。使用ABI7500熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。
[0109] 實(shí)施例3
[0110] 將已標(biāo)定拷貝數(shù)的病毒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，濃度分別為108-102c〇pie S/mL進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，以病毒核酸拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以CT值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2、3、4所示，三 種病毒核酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別具有良好的純屬關(guān)系。SIV、SRV1和STLV1的擴(kuò)增效率(E)和相關(guān) 系數(shù)(r2)分別為：98.908%，0·989;95· 115%，0·990;96·465%，0·998。
[0111] 實(shí)施例4
[0112] 方法的靈敏度試驗(yàn)
[0113] 將含有目標(biāo)病毒基因的克隆質(zhì)粒進(jìn)行標(biāo)定，拷貝數(shù)調(diào)至SIV(108C〇pies/mL)、SRVl (108copies/mL)和STLV1 (108copies/mL)后分別進(jìn)行梯度稀釋（103-108copies/ml)，每個(gè)稀 釋度做3個(gè)平行，反應(yīng)條件按上述優(yōu)化后的參考值進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)。以CT值作為縱 坐標(biāo)，以樣品拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)PCR儀自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，當(dāng)將檢測(cè)CT域值設(shè)為40 個(gè)循環(huán)值時(shí)，則所建立的三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法能檢測(cè)到各病毒核酸樣本的下限均 可達(dá)到10 3copies/ml，說(shuō)明敏感性良好。結(jié)果如圖5、圖6、圖7所示。
[0114] 實(shí)施例5
[0115] 特異性試驗(yàn)
[0116] 分別以含有51￥、511^1、51^1、猴8病毒(8￥)和猴麻疹病毒(1^)的陽(yáng)性血清或全血 樣本作為參照進(jìn)行目標(biāo)病毒的熒光定量RT-PCR檢測(cè)，同時(shí)觀察標(biāo)準(zhǔn)品及陰性照有無(wú)擴(kuò)增曲 線生成，以此驗(yàn)證本方法的特異性。結(jié)果顯示，3種病毒均能特異地識(shí)別相應(yīng)模板，并不與其 它參考病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，說(shuō)明特異性較好。結(jié)果如圖8所示。
[0117] 實(shí)施例6
[0118] 重復(fù)性試驗(yàn)
[0119] 將不同稀釋濃度的各病毒樣本（106、105、104)51￥、51^1、511^1按照上述條件進(jìn)行 熒光定量RT-PCR檢測(cè)，每種病毒每個(gè)稀釋度重復(fù)6次，分別計(jì)算CT值、標(biāo)準(zhǔn)差(s)以及變異系 數(shù)(CV)。不同核酸濃度各自樣本的檢測(cè)CT值標(biāo)準(zhǔn)在1.12-2.3之間，變異系數(shù)均低于1%，說(shuō) 明具有較好的重復(fù)性。
[0120] 實(shí)施例7
[0121] 實(shí)踐應(yīng)用
[0122] 利用建立的三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法對(duì)采集的18份樣品進(jìn)行了 SIV、SRV1和STLV1 核酸的篩查，共檢測(cè)到SI V 1份、SRV10份、STLV12份。利用單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn) 證，符合率為100%，顯示本發(fā)明方法具有良好的可靠性和實(shí)用性。
[0123] 實(shí)施例8
[0124] 試劑盒的組裝
[0125] 試劑盒中陰性對(duì)照品為ddH20，并包含病毒核酸(DNA/RAN)提取試劑、實(shí)時(shí)熒光定 量PCR擴(kuò)增所需的RT-PCR預(yù)混液、Taq酶、引物和探針等試劑。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種能同時(shí)檢測(cè)猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法所需引物對(duì)及 探針，其特征在于， 猴免疫缺陷病毒SIV: 上引物SI-F:如序列表Seq.Nol所示， 下引物SI-R:如序列表Seq.No2所示， 探針SI-P:如序列表Seq. No3所示； 猴逆轉(zhuǎn)D型病毒SRV1: 上引物SR-F:如序列表Seq. No4所示， 下引物SR-R:如序列表Seq. No5所示， 探針SR-P:如序列表Seq. No6所示； 猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒I型STLV1: 上引物ST-F:如序列表Seq. No7所示， 下引物ST-R:如序列表Seq. No8所示， 探針ST-P:如序列表Seq. No9所示。2. -種能同時(shí)檢測(cè)猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法陽(yáng)性對(duì)照品的 制備方法，其特征在于，包括如下步驟， 步驟(1 )PCR模板的制備:SIV、SRV1、STLV1保守區(qū)基因序列的合成； 步驟(2)以步驟（1)中合成的基因各序列為模板，分別以上引物SI-F、下引物SI-R，上引 物SR-F、下引物SR-R，上引物ST-F、下引物ST-R為引物，進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增； 步驟(3 )陽(yáng)性對(duì)照品 pMD 18-SI V，pMD 18-SRV1，pMD 18-STLV1 的制備： 步驟(2)中，目的基因的PCR反應(yīng)體系如下： 引物各2 yL，2XTaq MasterMix 15 yL，模板5 yL，超純水補(bǔ)足至30 μΜ PCR的反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄50 °C 30 min; 95 °C 5 min熱啟動(dòng)，95 °C 15s，55 °C 25s，72°C延伸15s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin; 步驟(3)中，陽(yáng)性對(duì)照品的制備過程，包括如下步驟:將步驟(2)中所得PCR產(chǎn)物分別與 克隆載體pMD-18-T vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a，獲得陽(yáng)性克隆菌株，并制備質(zhì) 粒pMD18-SIV，pMD18-SRVl，pMD18-STLVl作為陽(yáng)性對(duì)照品。3. 如權(quán)利要求2所述的一種能同時(shí)檢測(cè)猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢 測(cè)方法陽(yáng)性對(duì)照品的制備方法，其特征在于，PMD18-SIV，如序列表Seq. NolO所示;pMD18-SRV1，如序列表Seq · No 11所示;pMD 18-STLV1，如序列表Seq · No 12所示。4. 一種能同時(shí)檢測(cè)猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法，其特征在于， PCR反應(yīng)體系如下： RT-PCR反應(yīng)液12.5 yLJaq 酶0.5 uL，RTMIX 0.5 yL，引物混合液共3 yL，其中200 nmol/L，分別包含三種病毒的特異性引物比例為1:1:1，探針混合液共3 yL，其中100 nmol/ L，分別包含三種病毒的特異性熒光探針，比例為1:1:1，提取的樣本核酸5 uL作為反應(yīng)模 板，去RNAase Free水補(bǔ)足至25 yL; PCR的反應(yīng)條件為:反轉(zhuǎn)錄50 °C 30 min; 95 °C 5 min熱啟動(dòng)，之后以95 °C 15s，55 °C 25s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。5. -種能同時(shí)檢測(cè)猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)用試劑盒，其特征 在于，包括試劑如下： 引物對(duì)及探針： 猴免疫缺陷病毒SIV: 上引物SI-F:如序列表Seq.Nol所示， 下引物SI-R:如序列表Seq.No2所示， 探針SI-P:如序列表Seq. No3所示； 猴逆轉(zhuǎn)D型病毒SRV1: 上引物SR-F:如序列表Seq. No4所示， 下引物SR-R:如序列表Seq. No5所示， 探針SR-P:如序列表Seq. No6所示； 猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒I型STLV1: 上引物ST-F:如序列表Seq. No7所示， 下引物ST-R:如序列表Seq. No8所示， 探針ST-P:如序列表Seq. No9所示； 陽(yáng)性對(duì)照品： PMD18-SIV，如序列表 Seq.NolO 所示， PMD18-SRV1:如序列表 Seq.Noll 所示， PMD18-STLV1:如序列表 Seq.Nol2 所示； 陰性對(duì)照品ddH20、病毒核酸DNA/RAN提取試劑、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增所需的RT-PCR預(yù) 混液和Taq酶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種猴三種逆轉(zhuǎn)錄病毒的三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。選擇猴免疫缺陷病毒SIV的gag基因、猴逆轉(zhuǎn)D型病毒SRV1的5ˊLTR基因、猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒Ⅰ型STLV1的gag基因保守區(qū)序列作為檢測(cè)靶序列，合成其DNA片段，并分別設(shè)計(jì)合成三對(duì)引物對(duì)及3條探針：SIV：上引物SI-F、下引物SI-R、探針SI-P，SRV1：上引物SR-F、下引物SR-R、探針SR-P，STLV1：上引物ST-F、下引物ST-R、探針ST-P，建立三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，可對(duì)三種猴逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行精確定性檢測(cè)。本發(fā)明還涉及檢測(cè)用試劑盒，具有檢測(cè)特異性高、準(zhǔn)確性高、靈敏度好的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1/70, C12N15/11, C12N15/70, C12Q1/68, C12R1/93
【公開號(hào)】CN105624332
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610087475
【發(fā)明人】李丹丹, 高慎陽(yáng), 徐義剛, 邱索平
【申請(qǐng)人】海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2016年2月17日