專(zhuān)利名稱(chēng)：有效檢測(cè)hiv－1和hiv－2的寡核苷酸逆轉(zhuǎn)錄引物及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)的檢測(cè)生物樣品核酸序列的方法，特別是檢測(cè)來(lái)源于感染性微生物的序列的方法。
全世界數(shù)百萬(wàn)人感染有人免疫缺陷病毒(HIV)。因此，HIV感染成了嚴(yán)重的社會(huì)健康問(wèn)題。HIV感染經(jīng)過(guò)污染的血液制品傳播，這就意味著迫切需要能夠在患者的樣品中檢測(cè)出少量HIV RNA的篩選方法。而且，改進(jìn)的HIV感染治療方法有效性的提高意味著感染患者的早期檢測(cè)非常重要，以便開(kāi)始進(jìn)行適宜的治療。
因此，本領(lǐng)域中需要可用于診斷和篩選的高度敏感的HIV的檢測(cè)方法。
本發(fā)明提供一種逆轉(zhuǎn)錄生物樣品中人免疫缺陷病毒(HIV)RNA的方法，此方法包括(a)用一種寡核苷酸與來(lái)源于上述樣品的RNA接觸，條件是其中所述的寡核苷酸引發(fā)與上述RNA的至少一部分互補(bǔ)的DNA的合成；其中所述的寡核苷酸選自下列寡核苷酸組成的組(i)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列1>、(ii)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列2>、(iii)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列3>、(iv)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列4>、或者(v)上述的任意組合。
另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)生物樣品中人免疫缺陷病毒(HIV)RNA存在的方法，此方法包括(a)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用來(lái)源于樣品的RNA作為一種模板，并且用一種寡核苷酸產(chǎn)生HIV-特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，此寡核苷酸與RNA中所包括的核苷酸序列互補(bǔ)，它在此為一種引物，其中的引物選自由下列組成的組(i)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列1>、
(ii)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列2>、(iii)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列3>、(iv)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列4>、或者(v)上述任意的組合；(b)擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)物以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；以及(c)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；其中擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出顯示樣品中HIVRNA的存在。
擴(kuò)增可以通過(guò)任何方法完成，優(yōu)選聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。本發(fā)明HIV-特異性逆轉(zhuǎn)錄引物的使用提供了一種用于檢測(cè)樣品(優(yōu)選血漿)中HIV-1和/或HIV-2的敏感的方法。
再一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)生物樣品中HIV-1、HIV-2、或其組合的試劑盒，其中試劑盒包括一種逆轉(zhuǎn)錄引物，該引物選自由下列組成的組(a)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列1>、(b)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列2>、(c)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列3>、(d)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列4>、或者(e)上述任意的組合。
此試劑盒還可以包括用于逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)的試劑和說(shuō)明。
附


圖1是用溴化乙錠染色的4％瓊脂糖凝膠的顯影說(shuō)明，它顯示應(yīng)用(a)隨機(jī)六聚體引物(泳道2-10)；或(b)隨機(jī)六聚體引物和LTR8RT的混合物(泳道12-20)作為一種逆轉(zhuǎn)錄引物而獲得的HIV-1-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道1含有標(biāo)記物，泳道22、24和26為對(duì)照樣品。
附圖2是用溴化乙錠染色的4％瓊脂糖凝膠的顯影說(shuō)明，它顯示應(yīng)用(a)隨機(jī)六聚體引物和POL3RT的混合物(泳道2-10)或(b)LTR8RT和POL3RT的混合物(泳道12-20)作為一種逆轉(zhuǎn)錄引物而獲得的HIV-1-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道1含有標(biāo)記物，泳道22、24和26為對(duì)照樣品。
附圖3是用溴乙錠染色的4％瓊脂糖凝膠的顯影說(shuō)明，它顯示應(yīng)用(a)隨機(jī)六聚體引物(泳道2-13)或(b)隨機(jī)六聚體引物與POL3RT、LTR8RT、2LTRRT和2EnvRT的混合物(泳道15-26)而獲得的HIV-1-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道1含有標(biāo)記物。
附圖4是用溴乙錠染色的4％瓊脂糖凝膠的顯影說(shuō)明，它顯示應(yīng)用(a)隨機(jī)六聚體引物(泳道2-15)；或(b)隨機(jī)六聚體引物與POL3RT、LTR8RT、2LTRRT和2EnvRT的混合物(泳道16-29)而獲得的HIV-1-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道1和30含有標(biāo)記物。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)具有與HIV RNA中某些序列存在互補(bǔ)的序列的寡核苷酸用作逆轉(zhuǎn)錄的引物時(shí)，檢測(cè)生物樣品中人免疫缺陷病毒(HIV)更有效。優(yōu)選，引物的序列與HIV RNA的3’端附近的序列對(duì)應(yīng)。
許多分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和蛋白質(zhì)生物化學(xué)中的技術(shù)用于實(shí)施本發(fā)明，例如下列中所述，《現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)》，第1、II和III卷，1997(F.M.，Ausubel編)；Sambrook等，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約；《DNA克隆一種實(shí)用手冊(cè)》，第I、II卷，1985(D.N.，Glover編)；《寡核苷酸合成》，1984(M.L.，Gait編)；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》，1984(Hames和Higgins編)；《分子克隆的操作指南》；叢書(shū)，《酶學(xué)方法》(學(xué)術(shù)出版社，Inc.)；以及《蛋白質(zhì)的純化原理和操作》，第二版(Springer-Verlag，紐約)。
這里所用的“核酸”或“多核苷酸”是指任何長(zhǎng)度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脫氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脫氧核糖核苷酸。它包括單鏈和雙鏈分子，例如DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA雜交體，以及通過(guò)與氨基酸主鏈共軛堿基形成的“蛋白質(zhì)核酸”(PNA)。它還包括含有修飾堿基的核酸。
這里所用的核酸序列的“互補(bǔ)體”是指參與與原始序列沃森-克里克堿基配對(duì)的反義序列。
這里所用的“引物”是長(zhǎng)度約為5個(gè)至50個(gè)核苷酸的寡核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度為大約6個(gè)至25個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選長(zhǎng)度為大約6個(gè)至18個(gè)核苷酸，它與相關(guān)的單鏈核酸序列形成一個(gè)雙鏈體，并且可以用例如逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶使互補(bǔ)鏈發(fā)生聚合反應(yīng)。
這里所用的“分離的”核酸或多肽是指一種從它的原始環(huán)境(例如如果它是天然產(chǎn)生的，是指它的天然環(huán)境，或如果它是合成的，是指它的反應(yīng)混合物)中去除的成分。分離的核酸或多肽一般所含的與其原始成分相關(guān)的成分通常小于約50％左右，優(yōu)選小于約75％左右，特別優(yōu)選小于約90％左右。
“來(lái)源于”指定序列的核酸序列是指對(duì)應(yīng)于指定序列區(qū)域的序列。它包含與此序列同源或互補(bǔ)的序列。
內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照≌(IPC)靶核酸是指一種被克隆到質(zhì)粒載體中的合成核酸序列，此質(zhì)粒載體然后通常通過(guò)限制性?xún)?nèi)切核酸酶的作用線(xiàn)性化。一種IPC通常有多引物結(jié)合序列包圍基因探針結(jié)合區(qū)，并且它在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中充當(dāng)假陰性結(jié)果的基因?qū)φ铡?br> 優(yōu)選的內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照靶DNA的序列為5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3’<序列5>。
在此所用適宜的逆轉(zhuǎn)錄條件為一種寡核苷酸引發(fā)cDNA的合成，它包括在一定溫度下，將RNA和引物寡核苷酸與一種逆轉(zhuǎn)錄酶和核苷酸在一定溫度下保溫一定時(shí)間，以產(chǎn)生cDNA的合成。
可通過(guò)常用的方法制備核酸，此核酸包含此處或隨后公開(kāi)的序列。例如，可通過(guò)化學(xué)方法合成DNA，例如應(yīng)用Matteucci等人的“氨基亞磷酸酯載體方法”，1981，J.Am.Chem Soc.1033185，Yoo等的方法，1989，J.Biol.Chem.76417078或其它已熟知的方法。也可通過(guò)本領(lǐng)域已知的許多方法修飾此核酸。這種修飾的非限制性的實(shí)例包括甲基化，“加帽”，用一種類(lèi)似物取代一個(gè)或多個(gè)天然核苷酸，和核苷酸間修飾，諸如不帶電連結(jié)(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸鹽、氨基甲酸酯等)或帶電連結(jié)(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。核酸可包含一個(gè)或多個(gè)附加的共價(jià)連結(jié)部分，諸如蛋白(核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚左旋賴(lài)氨酸等)、嵌入劑(丫啶、補(bǔ)骨脂素等)、螯合劑(例如金屬、放射性金屬、鐵、氧化金屬等)和烷化劑。名詞“核酸”也包含PNA。此核酸可衍生自一種甲基或乙基磷酸三酯或一種烷基氨基磷酸鹽連結(jié)的形成。而且，本發(fā)明的核酸序列也可用一種標(biāo)記物進(jìn)行修飾，此標(biāo)記物可直接地或者間接地提供檢測(cè)信號(hào)。典型的標(biāo)記物包括放射性同位素、熒光分子、生物素等等。
在此所用的擴(kuò)增是指一種重復(fù)的方法，通過(guò)此方法復(fù)制核酸。適宜的擴(kuò)增方法包括聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增，但不局限于這些。
在此所用的人免疫缺陷病毒(HIV)指逆轉(zhuǎn)錄病毒屬的物種，包括HIV-1、HIV-2和SIV，以及它們的變種。本發(fā)明可檢測(cè)的HIV分離群包括HIV-1和HIV-2，但并不局限于此。
本發(fā)明提供自生物樣品逆轉(zhuǎn)錄HIV RNA的方法，此方法用于檢測(cè)生物樣品中的HIV。檢測(cè)到HIV特異擴(kuò)增產(chǎn)物表明此樣品中存在HIV RNA。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)任何常規(guī)方法獲得患者的生物樣品。適宜的生物樣品包括但不局限于血、血清、血漿、尿、乳汁、組織樣品和腦脊液。優(yōu)選血漿作為HIV RNA的來(lái)源。
可通過(guò)任意方法處理生物樣品，以便逆轉(zhuǎn)錄試劑接近RNA，特別是樣品中包含的HIV RNA。“來(lái)源于”生物樣品的RNA為開(kāi)始存在于樣品中，并且通過(guò)處理樣品而獲得接近途徑的各種RNA。優(yōu)選應(yīng)用本領(lǐng)域所熟知的任意方法提取RNA，諸如應(yīng)用硫氰酸瓜的方法，或者應(yīng)用市售的試劑或方法，諸如Gentra SystemsInc.的PureScriptθ(Minneapolis MN)?？蓱?yīng)用任意能夠分離核糖核酸酶的RNA、其它蛋白質(zhì)、和/或其它任何可干擾逆轉(zhuǎn)錄的組分的提取方法。
然后將樣品中提取的RNA與寡核苷酸引物接觸，在此寡核苷酸引發(fā)DNA合成，所合成的DNA與所提取RNA的至少一部分互補(bǔ)。寡核苷酸引物的序列來(lái)源于HIV的序列。此引物對(duì)應(yīng)于HIV RNA的區(qū)域可能為下游序列，即3’端，此區(qū)的檢測(cè)是需要的。這些區(qū)可包括，例如長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)區(qū)，此區(qū)編碼病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Pol)、Gag蛋白、Tat蛋白、包膜糖蛋白、Vif、Vpr和Vpu蛋白，以及Rev區(qū)，它編碼一種轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)成分。優(yōu)選此引物對(duì)應(yīng)于HIV基因組近3’端的序列。此引物序列可用于特異性地鑒別HIV特異分離物(例如HIV-1和HIV-2的分離物)。通過(guò)引物與來(lái)源于此分離物的RNA雜交，引物可鑒別一種特異的分離物，在此條件下它不與其他分離物的RNA雜交，即引物自身含有其分離物之間不同的序列?？商娲姆椒?，可應(yīng)用此引物的序列引發(fā)一個(gè)HIV RNA片段的合成，此片段在不同分離物之間是不同的，即分離物之間不同的序列可能為引物序列的下游序列。
根據(jù)序列保守的理論考慮、分子內(nèi)和分子間的相互作用、以及預(yù)測(cè)的擴(kuò)增子和環(huán)境序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)選擇可用于實(shí)施本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄引物。而且設(shè)計(jì)此引物和檢測(cè)系統(tǒng)，以進(jìn)行HIV基因組、多病毒種和內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照(IPC)RNA(或DNA)的聯(lián)合擴(kuò)增(和聯(lián)合檢測(cè))。
非限制性的本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄引物的實(shí)例顯示于表1中。
應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)上述引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。也可加入隨機(jī)引物，諸如隨機(jī)六聚體逆轉(zhuǎn)錄引物(N6，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。應(yīng)用常規(guī)方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，諸如在《當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)》，第I、II和III卷，1997(F.M.，Ausubel編)中；在美國(guó)專(zhuān)利5,322,770中；Young等在J.Clin.Microbiol.31(4)882(1993)中；Myers等在《生物化學(xué)》30(3)7661(1991)中；或者序列號(hào)＿＿，代理號(hào)2094/0E287的待審專(zhuān)利申請(qǐng)中所述的方法。
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，可通過(guò)常規(guī)方法分離并回收cDNA產(chǎn)物或其它產(chǎn)物。優(yōu)選擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物或其它產(chǎn)物?？蓱?yīng)用任意方法進(jìn)行擴(kuò)增，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增和核酸單堿基擴(kuò)增，但并不僅僅限制于這些。優(yōu)選應(yīng)用PCR。通常將含有所有為實(shí)施PCR而必需的組分的反應(yīng)混合物(包括HIV-特異擴(kuò)增引物)直接加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物。然后應(yīng)用所用引物對(duì)指定的條件完成擴(kuò)增。例如在序列號(hào)＿＿，代理號(hào)2094/0E285的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)和下面實(shí)施例中公開(kāi)了適宜的擴(kuò)增引物對(duì)。
擴(kuò)增后，應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任意方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，包括瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳；在載體上獲得擴(kuò)增產(chǎn)物(例如參見(jiàn)下面的實(shí)施例1)，然后進(jìn)行比色檢測(cè)；ECi檢測(cè)；熒光、放射性同位素檢測(cè)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，但并不僅僅限制于這些?？稍谑袌?chǎng)上獲得用于這些檢測(cè)方法的試劑，例如Molecular Probes、Eugene、Oregon和Ortho Clinical Diagnostics，Rochester，NY。
檢測(cè)到HIV-特異擴(kuò)增產(chǎn)物表明樣品中存在HIV RNA。當(dāng)應(yīng)用凝膠電泳時(shí)，通過(guò)其大小確定HIV-特異擴(kuò)增產(chǎn)物，正如根據(jù)與反應(yīng)中所用擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)的序列在HIV RNA中的定位所預(yù)測(cè)的一樣。
本發(fā)明提供檢測(cè)生物樣品中HIV RNA的試劑盒，它包含上面表1中所示的一個(gè)或多個(gè)逆轉(zhuǎn)錄引物。此試劑盒還包含用于逆轉(zhuǎn)錄的試劑，以及例如通過(guò)PCR檢測(cè)HIV cDNA的附加試劑。
下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說(shuō)明，并不是來(lái)限制本發(fā)明。方法1、樣品制備應(yīng)用硫氰酸瓜或PureScriptθRNA分離試劑(Gentra Systems，Minneapolis MN)制備血漿樣品的RNA。對(duì)廠家用于體液的技術(shù)方案進(jìn)行改進(jìn)，包括應(yīng)用40g糖原而不是用20g作為載體以促進(jìn)病毒RNA的沉淀。另外，在大多數(shù)情況下，進(jìn)行RNA的異丙醇沉淀，并用乙醇沖洗此RNA球后，將此RNA球再懸浮于RT緩沖混合物中，而不是將其懸浮于廠家所提供的RNA水合溶液中。
2、逆轉(zhuǎn)錄通過(guò)將100U重組Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)(GibcoBRL，Gaithersburg，Maryland)加入到50L溶液中，該溶液含有50mM Tris-HCl(PH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM的每種dNTP(PharmaciaBiotech)、4M隨機(jī)六聚體(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)和/或特異性逆轉(zhuǎn)錄引物，以及20單位RNA酶抑制劑(Promega，Madison，Wisconsin)的焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶液，來(lái)催化由RNA合成cDNA。在42EC保溫30分鐘后，在100EC進(jìn)行RT反應(yīng)5分鐘，以破壞RT的活性。將每個(gè)反應(yīng)冷卻1分鐘，然后以16000xg微量離心4秒。
3、PCR擴(kuò)增于一種PE9600熱循環(huán)器(Perkin-Elmer)中，在含25mM Tris-HCl、3mMMgCl2、0.725mM EDTA、54mM KCl、3.72mM NaCl、40M DTT、108g/ml明膠(IV型)、9.5％甘油、0.02％Tween 20、0.02％NP40、小牛胸腺DNA(2g)、1.2mM的每種dNTP、0.4M每種引物、10份線(xiàn)性化內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照(IPC)質(zhì)粒DNA和16U的Taq聚合酶的100L溶液中進(jìn)行PCR。將Taq、TP1-12和TP4-9的單克隆抗體加入此反應(yīng)，它們與Taq聚合酶的摩爾比分別為50∶1和5∶1，這樣使抗體與Taq聚合酶的摩爾比為55∶1，這些抗體的制備方法公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利5,338,671中。在96EC進(jìn)行初變性3分鐘后，40輪的擴(kuò)增在96EC進(jìn)行5秒，并在68EC進(jìn)行40秒。循環(huán)結(jié)束時(shí)，在103EC進(jìn)行一種熱后步驟5分鐘，以滅活Taq聚合酶。所用的擴(kuò)增引物顯示于下面表2中。
表2
4、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)可通過(guò)(i)凝膠電泳，然后進(jìn)行溴化乙錠染色；也可通過(guò)(ii)在擴(kuò)增過(guò)程中應(yīng)用5’-生物素標(biāo)記的引物(有義鏈)來(lái)檢測(cè)PCR的產(chǎn)物。在這種情況中，通過(guò)雜交到寡核苷酸探針而捕獲此擴(kuò)增產(chǎn)物，此寡核苷酸探針與膠乳顆粒共價(jià)連接，這些膠乳顆粒沉積在一種流通膜(SureCellθtests，Ortho ClinicalDiagnostics，Rochester，NY)的表面。HIV-1探針為5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr)<序列號(hào)11>和5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列號(hào)12>；HIV-2探針為5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列號(hào)13>。將探針/產(chǎn)物復(fù)合體與鏈霉親和素(SA)-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合物反應(yīng)，它可催化一種染料前體氧化轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N染料(藍(lán)色)。將顏色強(qiáng)度與顏色標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)視覺(jué)對(duì)藍(lán)色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分(0-10)。所有視覺(jué)顏色得分＞3者被認(rèn)為是陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例1應(yīng)用HIV-特異引物或隨機(jī)引物的逆轉(zhuǎn)錄效率應(yīng)用本發(fā)明HIV-特異引物或隨機(jī)六聚體逆轉(zhuǎn)錄引物(N6，PharmaciaBiotech)進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)，以比較來(lái)源于人血漿樣品的HIV RNA的逆轉(zhuǎn)錄效率。
稀釋人血漿，使每100L中含有1000份HIV RNA，這樣每個(gè)反應(yīng)中大約含有100份HIV RNA。用硫氰酸胍從血漿中提取RNA。將此RNA球溶解在26L焦碳酸二乙酯處理水中。
此逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物包含13L RNA、10L逆轉(zhuǎn)錄混合物(它含有first-strand緩沖劑、0.1M DTT、20U RNA酶(Promega，Madison，WI)、0.4mM的每種dNTP和200單位Moloney Murine Leukemia Virus(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶)。然后根據(jù)被檢測(cè)的條件加入另外2L下面的引物混合物(它們均為50M)，這些引物混合物為(1)2LN6隨機(jī)引物；(2)1LN6隨機(jī)引物+1LLTR8RT引物；(3)1LN6隨機(jī)引物+1LPOL3RT引物；(4)1LLTR8RT+1LPOL3RT。將此逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42EC保溫30分鐘；加熱至100EC保持5分鐘；然后在冰上冷卻1分鐘。然后將75L PCR主混合物加入含cDNA的反應(yīng)混合物中，在下面的條件下進(jìn)行PCR在96EC預(yù)熱3分鐘，在96EC進(jìn)行5輪解鏈，然后在62EC進(jìn)行退火和擴(kuò)增5秒，然后在96EC進(jìn)行35輪解鏈，并在68EC進(jìn)行退火和擴(kuò)增40秒。然后在4％瓊脂糖凝膠中解析擴(kuò)增產(chǎn)物，并用溴化乙錠顯色。
結(jié)果如附
圖1和2中所示，應(yīng)用HIV-特異逆轉(zhuǎn)錄引物，不論是單獨(dú)使用，還是與隨機(jī)六聚體引物一起使用，都可使檢測(cè)到的HIV-1-特異擴(kuò)增產(chǎn)物顯著地增多。將附
圖1的泳道2-10(僅應(yīng)用隨機(jī)引物)與附
圖1泳道12-20(LTR8RT+隨機(jī)引物)、附圖2的泳道2-10(POL3RT+隨機(jī)引物)和附圖2的泳道12-20(LTR8RT+POL3RT)進(jìn)行比較。還觀察了應(yīng)用100M或200M隨機(jī)引物時(shí)的結(jié)果。實(shí)施例2患者樣品中HIV RNA的檢測(cè)進(jìn)行下面的研究，應(yīng)用隨機(jī)六聚體逆轉(zhuǎn)錄引物和聯(lián)合應(yīng)用隨機(jī)引物與HIV-特異逆轉(zhuǎn)錄引物對(duì)患者樣品中HIV RNA的檢測(cè)進(jìn)行比較。
從CD4 T細(xì)胞計(jì)數(shù)大于500的患者中采集HIV陽(yáng)性血漿樣品，這表明他們是無(wú)癥狀的，并且其病毒含量比較低。
按照上面實(shí)施例1中所述的方法，從血漿樣品中提取RNA。將13L的這種RNA溶液稀釋于15L水中。將每個(gè)樣品分為12L的二等份，以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照上面實(shí)施例1所述的方法制備這2個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物。每個(gè)混合物或者包含2L的100M隨機(jī)引物+1L水，或者包含2L的100M隨機(jī)引物+1L 50M的HIV特異引物混合物，此混合物含有等量下面的引物(1)POL3RT；(2)LTR8RT；(3)2LTRRT和(4)2EnvRT。按照上面實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)。
通過(guò)在4％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行凝膠電泳，并用溴乙錠染色而檢測(cè)HIV特異擴(kuò)增產(chǎn)物，并且也可通過(guò)上述SureCellθ比色法進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果附圖3和4顯示的是通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物。表3是通過(guò)相對(duì)值表示用比色法檢測(cè)的HIV特異擴(kuò)增產(chǎn)物。IPC表示內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照≌引物。
樣品3和10中，在隨機(jī)六聚體引物中加入HIV特異逆轉(zhuǎn)錄引物比單獨(dú)應(yīng)用隨機(jī)引物所引起的擴(kuò)增反應(yīng)的程度大。在應(yīng)用HIV特異逆轉(zhuǎn)錄引物的樣品中用比色法檢測(cè)的產(chǎn)物的量也較多。
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中僅用隨機(jī)引物時(shí)，既沒(méi)有用凝膠電泳，也沒(méi)有用比色法檢測(cè)樣品16、20和22。但當(dāng)一起應(yīng)用隨機(jī)引物和HIV特異逆轉(zhuǎn)錄引物時(shí)，這些樣品為陽(yáng)性。
這些結(jié)果表明本發(fā)明的方法和組合物在篩選患者和供血者的HIV時(shí)可減少假陰性結(jié)果的發(fā)生率。
前面提到的所有專(zhuān)利、申請(qǐng)、論文、出版物和試驗(yàn)方法在這里全部作為參考文獻(xiàn)引用。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)上面本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行一些改變。這些顯見(jiàn)的改變均是在所附權(quán)利要求書(shū)允許的全部預(yù)期范圍內(nèi)進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種逆轉(zhuǎn)錄生物樣品中人免疫缺陷病毒(HIV)RNA的方法，所述方法包括(a)用一種寡核苷酸與來(lái)源于上述樣品的RNA接觸，其中所述的寡核苷酸引發(fā)DNA的合成，所述DNA與上述RNA的至少一部分互補(bǔ)；其中所述的寡核苷酸選自下列寡核苷酸組成的組(i)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列號(hào)1>、(ii)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列號(hào)2>、(iii)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列號(hào)3>、(iv)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列號(hào)4>、和(v)上述的任意組合。
2.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的樣品選自由血液、血清、血漿、尿、唾液和腦脊液組成的組。
3.一種如權(quán)利要求1所述的方法，它還包括(b)回收所述的cDNA。
4.一種檢測(cè)生物樣品中人免疫缺陷病毒(HIV)RNA存在的方法，所述方法包括(a)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用來(lái)源于樣品的RNA作為一種模板，并且用一種寡核苷酸產(chǎn)生HIV-特異性逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，此寡核苷酸與RNA中所包括的核苷酸序列互補(bǔ)，它在此為一種逆轉(zhuǎn)錄引物，其中所述的逆轉(zhuǎn)錄引物選自由下列組成的組(i)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列號(hào)1>、(ii)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列號(hào)2>、(iii)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列號(hào)3>、(iv)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列號(hào)4>、和(v)上述任意的組合；(b)擴(kuò)增所述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；以及(c)檢測(cè)所述擴(kuò)增產(chǎn)物；其中所述擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)表明樣品中HIV RNA的存在。
5.一種如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的樣品選自由血液、血清、血漿、尿、唾液和腦脊液組成的組。
6.一種如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的擴(kuò)增是通過(guò)一種選自聚合酶鏈反應(yīng)、連接酶鏈反應(yīng)和鏈置換擴(kuò)增的方法進(jìn)行的。
7.一種如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的檢測(cè)是通過(guò)一種選自擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳、擴(kuò)增產(chǎn)物在固體載體上的捕獲和擴(kuò)增產(chǎn)物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的方法進(jìn)行的。
8.寡核苷酸5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列號(hào)1>。
9.寡核苷酸5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列號(hào)2>。
10.寡核苷酸5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列號(hào)3>。
11.寡核苷酸5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列號(hào)4>。
12.一種HIV特異逆轉(zhuǎn)錄引物，它包含寡核苷酸5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列號(hào)1>。
13.一種HIV特異逆轉(zhuǎn)錄引物，它包含寡核苷酸5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列號(hào)2>。
14.一種HIV特異逆轉(zhuǎn)錄引物，它包含寡核苷酸5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列號(hào)3>。
15.一種HIV特異逆轉(zhuǎn)錄引物，它包含寡核苷酸5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列號(hào)4>。
16.一種檢測(cè)生物樣品中HIV-1、HIV-2或其組合的試劑盒，所述試劑盒包含一種逆轉(zhuǎn)錄引物，它選自下列組成的組(a)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列號(hào)1>、(b)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列號(hào)2>、(c)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列號(hào)3>、(d)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列號(hào)4>、(e)上述任意的組合。
17.一種如權(quán)利要求1所述的方法，它還包含用隨機(jī)六聚體寡核苷酸同時(shí)與來(lái)源于所述樣品的RNA接觸，條件是其中所述的隨機(jī)六聚體寡核苷酸引發(fā)DNA的合成，所述DNA與上述RNA的至少一部分互補(bǔ)。
18.一種如權(quán)利要求4所述的方法，其中在步驟(a)中隨機(jī)六聚體寡核苷酸也用作逆轉(zhuǎn)錄引物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)人的生物樣品中人免疫缺陷病毒的方法和試劑盒。還描述了寡核苷酸逆轉(zhuǎn)錄引物在這種檢測(cè)人免疫缺陷病毒的方法和試劑盒中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1271020SQ0010539
公開(kāi)日2000年10月25日 申請(qǐng)日期2000年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月2日
發(fā)明者D·R·帕特森, J·A·普斯卡斯, K·宋, J·M·林南 申請(qǐng)人:奧索臨床診斷有限公司