(2-(乙烯基磺?；┮已?基）乙氧基）乙基4-硝基苯磺酸酯（2)]，且通過與TBAF反應(yīng)進(jìn)行 19F-氟化。19F-DEG-VS被用 作18F-DEG-VS偶聯(lián)物的反應(yīng)條件和HPLC位置的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物。
[0124] 首先評估19F-DEG_VS和cRGDyC肽（具有游離SH基）以及cRGDyK肽（具有自游離NH 2 基）的冷反應(yīng)(參見圖SAhcRGDyC和cR⑶yK均與19F-DEG-VS反應(yīng)，然而，cRGDyK只在pH高于 8.5過夜溫育后反應(yīng)，相比之下，在pH7.0和30分鐘溫育的條件下cRGDyC即反應(yīng)(圖2B)。
[0125] 巰基化NT也充分地與19F-DEG_VS反應(yīng)。然而，由于其與本發(fā)明的NT類似物中存在的 一個巰基和一個氨基反應(yīng)，當(dāng)在高pH(例如，pH 9.0)進(jìn)行反應(yīng)時獲得兩種產(chǎn)品[19F-DEG-VS-NT和（19F-DEG-VS) 2-NT ](圖 3A和3B)。
[0126]放射化學(xué)
[0127] 將VS-合成子的18F標(biāo)記在各種溶劑、濃度和溫度條件下進(jìn)行測試。代表性的結(jié)果示 于表1。裝載10毫克的前體，基于HPLC積分計算出的 18F-DEG-VS放射性標(biāo)記產(chǎn)率為90%產(chǎn)率。 進(jìn)一步增加前體裝載量僅使產(chǎn)率略增加至95% (見表1)。粗標(biāo)記反應(yīng)的代表性放射HPLC示 蹤示于圖1B</8F-DEG-VS表現(xiàn)出良好的體外穩(wěn)定性，并且在roS中溫育后，在HPLC純化后4小 時，放射化學(xué)純度仍超過99 % (圖2C)。
[0128] 對于18F反應(yīng)，在相同的反應(yīng)器中使等摩爾量的cRGDyC和cRGDyK與 18F-DEG-VS溫 育。在這種情況下，只能觀察到來自cRGDyC和18F-DEG-VS的產(chǎn)物（圖2B)。沒有來自cRGDyK/ 18F-DEG-VS產(chǎn)物證實了該反應(yīng)針對巰基相對于氨基的選擇性。因此，即使在高pH，18F-DEG-VS在游離氨基存在下選擇性地標(biāo)記巰基。
[0129] 18F-DEG-VS也有效地與巰基化NT反應(yīng)。19F_合成中所見的(F-DEG-VS) 2-NT副產(chǎn)物在 放射性標(biāo)記反應(yīng)中未觀察到，如HLPC所示（圖3C)。在PBS中溫育后，在HPLC純化后5小時， 18F-DEG-VS-NT的放射化學(xué)純度仍大于95%。為了比較 18F-DEG-VS與巰基特異性馬來酰亞胺 類試劑，還制備了 18F-FBEM，據(jù)顯示其分別與c(RGDyC)和巰基化NT有效地反應(yīng)(圖11)。
[0130] 體外細(xì)胞結(jié)合親和力
[0131] 使用競爭性細(xì)胞結(jié)合檢測比較了 19F-DEG-VS-NT與NT(8_13)的受體結(jié)合親和性（圖 4)。兩種肽均以劑量依賴的方式抑制了 125I-NT(8-13)結(jié)合到NTR1陽性HT-29細(xì)胞。比較了 19F-DEG-VS-NT的 IC5〇值（2 · 03 ± 0 · 22nmo 1 /L)和NT (8-13)的 I C5〇值（2 · 12 ± 0 · 26nmo 1 /L)。結(jié) 果清楚地表明，F(xiàn)-DEG-VS-NT對NTR1有與NT (8-13)類似的體外受體結(jié)合親和力。
[0132] 生物分布和顯微PET成像
[0133] 在HT-29異種移植物(NTR1陽性）中的18F-DEG-VS-NT靶向神經(jīng)降壓素受體1(NTR1) 的功效在多個時間點（注射后〇.5、1和2小時）用顯微PET進(jìn)行評價。如圖5A所示。對于 18F-DEG-VS-NT，HT-29腫瘤在高的腫瘤對背景對比度下清晰可見，且腫瘤攝取在注射后0.5、1和 2 小時分別為130±0·17%ID/g、0·96±0·29%ID/g和0·63±0·20%ID/g。相比較而言，18F-FBEM-NT也顯示出明顯的在腫瘤中的攝?。?.13±0.08%ID/g)，但在注射后2小時顯著低 于 18F-DEG-VS-NT的觀察值(pzO.OHhWF-FBEM-NT在注射后2小時的肝和腎攝取分別為 0 · 28 ± 0 · 03 % ID/g和0 · 64 ± 0 · 02 % ID/g。相較于 18F-FBEM-NT，18F-DEG-VS-NT顯示出優(yōu)良的 腫瘤對背景的對比度和低的腹部背景(圖13)。
[0134] 18F-DEG-VS-NT的NTR1特異性通過阻斷實驗確認(rèn)，其中放射示蹤劑與過量未標(biāo)記的 NT(8-13)共注射。從圖5A中可以看出，在未標(biāo)記的NT(8-13)存在時的NTR1腫瘤攝取(在注射 后0.5、1和2小時分別為0.47%10/^、0.15%10/^和0.04%10/^)在所有時間點均顯著低于 沒有NT(8-13)阻斷的情形(p<0.01)。腎攝取從注射后0.5小時的6.82 ± 2.90 % ID/g迅速下 降到注射后2小時的0.17±0.01%ID/g?；诔上穹治?，腫瘤與腎之比、腫瘤與肝之比和腫 瘤與肌肉之比在注射后2小時分別為3.69± 1.50、10.33±4.01和27.12±5.46。在注射后2 小時，腫瘤表現(xiàn)出比腎、肝和肌肉中顯著更高的攝取。包括心臟和肺的其他器官在注射后2 小時基本為背景水平。
[0135] 除了顯微PET研究，發(fā)明人還使用攜帶HT-29腫瘤的小鼠的單獨組在注射18F-DEG-VS-NT后2小時進(jìn)行了生物分布研究。如圖5B所示。腫瘤和腎攝取為0.86 ± 0.09 % ID/g和 0.46±0.05%ID/g。在注射后2小時，腫瘤表現(xiàn)出比在腎、肝和肌肉中顯著更高的攝?。▓D 5B)。包括心臟和肺的其他器官在注射后2小時基本為背景水平。
[0136] 代謝穩(wěn)定性研究
[0137] 在注射后1小時在小鼠尿中以及在肝臟、腎臟和HT-29腫瘤勻漿物中測定18F-DEG-VS-NT的代謝穩(wěn)定性。HPLC的色譜圖示于圖6中。無損 18F-DEG-VS-NT的保留時間為18.50分 鐘。對于腫瘤在約20分鐘處發(fā)現(xiàn)主代謝物峰，而對于尿液、腎臟和肝臟樣本在13至15分鐘和 17分鐘發(fā)現(xiàn)了兩個主代謝物峰。整個研究過程中沒有觀察到顯著脫氟。對 18F-FBEM-NT的代 謝穩(wěn)定性也進(jìn)行了研究。無損18F-FBEM-NT的保留時間為19.02分鐘。除了 15至21分鐘之間的 多個峰，對于腫瘤、腎和肝在約5分鐘處發(fā)現(xiàn)了主要峰。發(fā)明人還合成了 18F-DEG-VS-c (RGDyC)和18F-FBEM-c(RGDyC)，并分析了它們的尿代謝物。不同于不穩(wěn)定的NT肽，c(RGDyC) 在體內(nèi)是穩(wěn)定的。因此， 18F-DEG-VS-c (RGDyC)給出了對應(yīng)于在尿中排出的無損的經(jīng)標(biāo)記的 肽的單峰(圖10)</8F-FBEM-c(RGDyC)也給出了主峰，還有其它的峰（圖12)。
[0138] 本發(fā)明的某些方面的簡要討論
[0139]累積的證據(jù)表明，神經(jīng)降壓素受體在癌癥生長和存活中起關(guān)鍵作用（16，19)。事實 上，NTR已被提出作為有潛力的人胰腺癌、乳腺癌，頭頸部癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌的標(biāo) 志物（19-28)。
[0140] 因此，為得到NTR表達(dá)譜或個體腫瘤的"指紋"的顯像劑的發(fā)展可能導(dǎo)致有效的早 期診斷和癌癥患者的定制治療方案。神經(jīng)降壓素是NTR的十三肽配體，其在血漿中迅速被內(nèi) 源性肽酶代謝。為了提高體內(nèi)穩(wěn)定性，已經(jīng)開發(fā)了各種NT類似物。例如，近來開發(fā)了一些放 射性標(biāo)記的神經(jīng)降壓素類似物，作為用于神經(jīng)降壓素受體陽性腫瘤的成像和治療的有價值 的工具(29-35)。雖然在這些初步的研究中已經(jīng)獲得了令人鼓舞的結(jié)果，這些試劑的相對高 的腎攝取和次優(yōu)的腫瘤對組織對比度需要進(jìn)一步改善，尤其是在放射性標(biāo)記的選擇方面。 以前，發(fā)明人已經(jīng)表明，通過用 18F代替64Cu使肽類PET探針的藥物動力學(xué)取得了顯著改善 (36,37)。事實上，作為常用的PET放射性同位素之一， 18F也可以容易地在醫(yī)療回旋加速器中 大量制造，其對于成像應(yīng)用具有110分鐘的理想半衰期（1)。因此，發(fā)明人致力于開發(fā)用于 NTR靶向成像的18F標(biāo)記的PET探針。
[0141] 因為半胱氨酸在肽和蛋白質(zhì)中比賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸殘基的豐度小得多， 已使用巰基反應(yīng)性試劑對這些生物分子進(jìn)行位點選擇性修飾。此前已報道了多種巰基反應(yīng) 性 18f-合成子，其中大部帶有馬來酰亞胺基團(tuán)以便在溫和條件下與巰基偶聯(lián)加成。然而，大 多數(shù)的巰基反應(yīng)性合成子需要多步反應(yīng)，這可能是耗時且勞動密集型的。
[0142]認(rèn)識到上述問題后，發(fā)明人著手開發(fā)了基于乙烯砜的Michael加成反應(yīng)的平臺技 術(shù)。乙烯基砜化學(xué)已被證明適合于在溫和的條件下的選擇性修飾半胱氨酸殘基（15)。乙烯 基砜官能團(tuán)的水穩(wěn)定性、無副產(chǎn)物、與巰基反應(yīng)的幾乎定量的產(chǎn)率以及所形成的硫醚鍵的 化學(xué)穩(wěn)定性使得該反應(yīng)成為有吸引力的 18F標(biāo)記手段。
[0143] 本發(fā)明的基于VS的輔基被設(shè)計為親水性的，這是對于體內(nèi)應(yīng)用非常理想的屬性。 為了簡化標(biāo)記程序，最初的努力都集中在VS的一步法放射性氟化。放射性氟化反應(yīng)在MeCN/ DMS0利用共沸干燥的[18F] -TBAF進(jìn)行。據(jù)發(fā)現(xiàn)，VS-合成子向相應(yīng)的[18F]-DEG-VS的轉(zhuǎn)化極 大依賴于VS-合成子的反應(yīng)濃度和溫度。在優(yōu)化的條件下，可以在15分鐘內(nèi)得到>90%標(biāo)記 率。分離的產(chǎn)率測定為35±6%。
[0144] 因為VS還可以在高pH值與伯胺反應(yīng)（15)，發(fā)明人決定研究VS-合成子反應(yīng)在溫和 的條件下的選擇性。雖cRGDyK和cRGDyC都可與 19F-DEG-VS試劑有效反應(yīng)，cRGDyK的反應(yīng)性要 低得多，其需要過夜溫育和較高的pH值，而相比較對于cRGDyC而言只需要30分鐘溫育。然 而，使用 18F-DEG-VS試劑時，在cRGDyK和cRGDyC的等摩爾混合物中，只有cRGDyC反應(yīng)。這一結(jié) 果清楚地表明 18F-DEG-VS對于SH官能團(tuán)的化學(xué)選擇性。
[0145] 建立有效的18F-DEG-VS標(biāo)記方法后，進(jìn)行巰基化神經(jīng)降壓素的18F標(biāo)記。在35分鐘 內(nèi)，以>95%的產(chǎn)率得到 18F-DEG-VS-NT，且放射化學(xué)純度是大于99% ^F-DEG-VS-NT的比 放射性根據(jù)文獻(xiàn)方法測定(38)，其中對最終產(chǎn)物的紫外積分與標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線進(jìn)行比較，得 到 18F-DEG-VS-NT的比放射性為 19.2 ±4.3 TBq/mmol。
[0146] 因為肽的化學(xué)修飾可能顯著降低受體結(jié)合親和性，進(jìn)行了 19F-DEG-VS_NT和未修飾 的NT體外細(xì)胞結(jié)合測定。如19F-DEG-VS-NT和未修飾NT (8-13)的類似IC5Q所表明，VS-合成子 偶聯(lián)所引起的親和力下降是可以忽略不計的。18F-DEG-VS-NT的成像質(zhì)量用HT-29異種移植 物模型在體內(nèi)進(jìn)行評估，該模型已被很好地建立為具有高的NTR1表達(dá)（16)。 18F-DEG-VS-NT 具有快速的腎清除。18F-DEG-VS-NT主要在注射后30分鐘在腎臟中積累（6.82± 2.90% ID/ g)，且迅速下降到注射后1小時的1.19 ± 0.49 % ID/g和注射后2小時的0.17 ± 0.01 % ID/g。 由于在所有主要器官里的活性快速降低，在注射后2小時得到了高的腫瘤與器官比，包括腫 瘤/肌肉（27.12±4.56)、腫瘤/肝臟（10.33±4.01)和腫瘤/腎（3.69±1.50)。在阻斷實驗 中，非放射性的NT肽在所有時間點顯著(p<0.01)抑制了 18F-DEG-VS-NT的腫瘤攝?。▓D5A)， 這清楚地表明了這種成像劑的受體特異性。由于示蹤劑具有在腹部區(qū)域非常低的攝取，發(fā) 明人還進(jìn)行了生物分布研究，以便更準(zhǔn)確地確定在肝、腎、小腸、脾、胃和其他器官或組織中 的攝取。如圖5B所示，在這些器官的攝取量接近背景水平，這與來自顯微PET掃描得到的高 對比度腫瘤圖像良好關(guān)聯(lián)。由于在所有主要器官里的活性快速降低，如生物分布研究所計 算，在注射后2小時得到了高的腫瘤對器官比，包括腫瘤/肌肉（30.65±22.31)、腫瘤/肝臟 (11.86± 1.98)和腫瘤/腎（1.91 ±0.43)。由于NT肽具有兩個潛在的反應(yīng)位點，還合成了 (AC)-NT，它也可以用18F-DEG-VS有效地進(jìn)行標(biāo)記。仍然需要確定這個新的試劑是否具有 與 18f-deg-vs-nt類似的腫瘤靶向能力。
[0147] 盡管本發(fā)明的一個方面是開發(fā)新的用于肽的巰基特異性18F-放射性標(biāo)記方法和組 合物及其通過PET成像的評價，進(jìn)行了與現(xiàn)有的馬來酰亞胺類試劑的直接體內(nèi)比較，以便展 示新開發(fā)的標(biāo)記方法的潛在優(yōu)點。因此，還合成了馬來酰亞胺類試劑，即 18f-fbem-nt，以用 于直接比較成像品質(zhì)和代謝穩(wěn)定性。如圖12所示，18F-FBEM-NT是涉及5個步驟的更復(fù)雜的合 成:氟化、水解、羧基活化、與馬來酰亞胺衍生物反應(yīng)、以及與Cys-NT偶聯(lián)。相比較而言， 18F-DEG-VS-NT的合成僅涉及兩個步驟:合成子的氟化和與Cys-NT偶聯(lián)。在PET成像方面更重要 的是，與 18F-DEG-VS-NT相比，18F-FBEM-NT顯示出顯著更高的背景和更低的對比度。為了確 定所觀察到的與 18f-fbem-nt相比的18f-deg-vs-nt的更低的腹部背景和高腫瘤攝取是否由 代謝差異所引起，進(jìn)行了代謝穩(wěn)定性研究。如圖6所示， 18f-deg-vs-nt和18f-fbem-nt都展示 出一些體內(nèi)代謝物。然而，對于 18f-fbem-nt在大約5分鐘發(fā)現(xiàn)了主要代謝物峰，但18f-deg-VS-NT沒有。盡管如此，由于NT在人類和嚙齒類動物中的半衰期短(39，40 )，不能僅基于上述 實驗得出結(jié)論。在進(jìn)一步的嘗試中，發(fā)明人將兩個合成子與代謝更穩(wěn)定的c(RGDyC)肽偶聯(lián)， 并研究了 18F-FBEM-c (RGDy C)和18F-DEG-VS-c (RGDy C)的尿代謝。如圖 10和 12 所示，18F-FBEM-c(RGDyC)在尿中具有對于18F-DEG-VS-c(RGDyC)未見的其它代謝物。該實驗表明，本發(fā)明的 基于VS的合成子在體內(nèi)比基于馬來酰亞胺的合成子更穩(wěn)定。因此，在 18f-deg-vs-nt的研究 中觀察到的代謝物可能主要由NT肽的降解造成，而不是合成子本身。雖然馬來酰亞胺類合 成子如 18F-FBEM根據(jù)文獻(xiàn)報道預(yù)計可能不穩(wěn)定，它們在18F成像研究的時間范圍內(nèi)可能仍表 現(xiàn)良好。發(fā)明人得出的結(jié)論是，相比于 18f-fbem-nt，所觀察到的18f-deg-vs-nt在動物模型 中的優(yōu)異對比度值得考慮將此試劑向?qū)θ说腘TR靶向成像進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化。
[0148] 本發(fā)明現(xiàn)將參照所示附圖的特定示例性實施例詳細(xì)描述。
[0149] 實施例1
[0150] 在該說明性